JP2003530839A - アルブミン融合タンパク質 - Google Patents

アルブミン融合タンパク質

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Abstract

(57)【要約】 本発明はアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含まれ、同様に、該核酸を含有するベクター、該核酸ベクターで形質転換された宿主細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質の調製方法、ならびに、上記核酸、ベクターおよび／または宿主細胞の使用方法も含まれる。さらに、本発明は、アルブミン融合タンパク質を含有する医薬組成物、および本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて疾患、障害または症状を治療、予防、あるいは改善する方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は、一般的には、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に
融合された治療用タンパク質（ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらの
断片もしくは変異体を含むが、これらに限らない）に関する。本発明はさらに、
溶解状態（溶液中）で長期の貯蔵寿命および／または長期の治療活性を示す、ア
ルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合された治療用タンパク質
（ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体を含むが
、これらに限らない）に関する。本明細書では、これらの融合タンパク質をまと
めて「本発明のアルブミン融合タンパク質」と呼ぶことにする。本発明は、治療
用のアルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、製剤およびキットを包含
する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含ま
れ、同様に、これらの核酸を含有するベクター、これらの核酸ベクターで形質転
換された宿主細胞、ならびに、これらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞
を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を調製する方法も含まれる。
【０００２】 さらに、本発明は、治療用タンパク質をアルブミンまたはアルブミンの断片も
しくは変異体に融合または結合させることによって、治療用タンパク質をin vit
roで安定化する方法に関する。
【０００３】 ヒト血清アルブミン（HSAまたはHA）は、その成熟形態では（図15または配列
番号18に示されるように）585アミノ酸からなるタンパク質であって、血清の浸
透圧の大部分に関与しており、また、内因性および外因性のリガンドのキャリア
ーとしても機能している。現在のところ、臨床用のHAはヒト血液からの抽出によ
り生産されている。微生物による組換えHA（rHA）の生産は、EP 330 451およびE
P 361 991に記載されている。
【０００４】 キャリアー分子としてのアルブミンの役割ならびにその不活性な性質は、in v
ivoでポリペプチドの担体および輸送体として使用するのに望ましい性質である
。アルブミン融合タンパク質の一成分としてのアルブミンを、各種タンパク質の
キャリアーとして使用することは、WO 93/15199、WO 93/15200、およびEP 413 6
22に提案されている。また、ポリペプチドへの融合のためにHAのＮ末端断片を使
用することもすでに提起されている（EP 399 666）。アルブミンの治療用タンパ
ク質への融合は、HAまたはその断片をコードするDNAを、治療用タンパク質をコ
ードするDNAに接合させるといった、遺伝子操作により達成しうる。次いで、融
合ポリペプチドを発現するように適切なプラスミド上に配置された融合ヌクレオ
チド配列を用いて、適切な宿主の形質転換またはトランスフェクションを行う。
発現は、in vitroで（例えば、原核もしくは真核細胞から）行うことも、in viv
oで（例えば、トランスジェニック生物から）行うこともできる。
【０００５】 インターフェロンや成長ホルモンなどの治療用タンパク質は、その天然の状態
でまたは組換え法で生産したとき、一般的に短い貯蔵寿命を示す不安定な分子で
あり、特に水溶液として製剤化したときにはそうである。投与用に製剤化した場
合のこれら分子の不安定性は、こうした分子の多くを貯蔵中ずっと凍結乾燥およ
び冷蔵しなければならないことを意味し、したがって、これらの分子の輸送およ
び／または貯蔵はやっかいである。貯蔵の問題は、医薬製剤を病院の環境外で貯
蔵し分配する必要があるときには、なおさら深刻である。また、多数のタンパク
質およびペプチド薬物は、タンパク質が容器に付着することによる損失を少なく
したり防止するために、アルブミンなどの他のタンパク質を高濃度で添加する必
要がある。このことは、IFNのようなタンパク質に関しては大きな関心事となっ
ている。こうした理由のため、多くの治療用タンパク質は高割合のアルブミンキ
ャリアー分子（100〜1000倍過剰）と組み合わせて製剤化されるが、これはその
製剤にとってコストのかかる特徴であり、好ましくない。
【０００６】 不安定なタンパク質分子の貯蔵問題に対する実際的な解決策は、これまでほと
んど提案されていない。したがって、容易に（好ましくは、最低限の貯蔵後操作
を必要とする単純な製剤を用いて）分配されるタンパク質治療用分子の安定化さ
れた持続性のある製剤が必要とされている。
【０００７】発明の概要 本発明は、一部には、治療用タンパク質を、該タンパク質および／またはその
活性を安定化するのに十分なアルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしく
は変異体に遺伝的にまたは化学的に融合させることによって、in vitroおよび／
またはin vivoにおいて、溶解状態でその治療用タンパク質の貯蔵寿命を引き延
ばすように、および／または長期間にわたりその活性を保持するように、治療用
タンパク質を安定化しうるという発見に基づいている。加えて、アルブミン融合
タンパク質またはアルブミン結合タンパク質を使用すると、容器への付着といっ
た治療用タンパク質の損失を防止できるために、大過剰のキャリアータンパク質
（例えば、融合されていないアルブミン）を用いてタンパク質溶液を製剤化する
必要性が少なくなることが判明した。
【０００８】 本発明は、アルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に融合
された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその
断片もしくは変異体）からなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明は
また、in vitroおよび／またはin vivoにおいて、溶解状態の（または医薬組成
物中の）治療用タンパク質の貯蔵寿命を長引かせ、かつ／または治療用タンパク
質および／またはその活性を安定化するのに十分である、アルブミンまたはアル
ブミンの断片（部分）もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（例えば、
ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）からなるアル
ブミン融合タンパク質を包含する。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質
をコードする核酸分子も本発明により包含され、同様に、これらの核酸を含有す
るベクター、これらの核酸ベクターで形質転換された宿主細胞、および本発明の
アルブミン融合タンパク質の調製方法ならびにこれらの核酸、ベクターおよび／
または宿主細胞の使用方法も本発明に含まれる。
【０００９】 本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および製薬上許容される希
釈剤または担体を含有する医薬製剤を包含する。そのような製剤はキットまたは
容器の中に収容される。そのようなキットまたは容器は、治療用タンパク質の延
長された貯蔵寿命に関する説明書と共に包装されうる。かかる製剤は、患者（好
ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）における疾患または症状を、該患者に
その医薬製剤を投与することによって治療、予防、改善、または診断する方法に
使用することができる。
【００１０】 他の実施形態では、本発明は、疾患または障害の予防、治療または改善方法を
包含する。好ましい実施形態では、本発明は、表１の「好適な適応症Ｙ」の欄に
挙げた疾患または障害の処置方法を包含し、この方法は、そのような治療、予防
または改善が必要な患者に、（表１の「好適な適応症Ｙ」の欄に挙げた処置すべ
き疾患または障害と同じ列にある）表１の「治療用タンパク質Ｘ」の欄に開示し
た治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）に相当する治療用タンパ
ク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を、該疾患または障害を治療
、予防または改善するのに有効な量で、投与することを含む。
【００１１】 別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗
体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）の貯蔵寿命を引き延ばす方法を
包含し、この方法は、治療用タンパク質を、該タンパク質の貯蔵寿命を引き延ば
すのに十分であるアルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に
融合または結合させることを含む。好ましい実施形態では、この方法に従って用
いられる治療用タンパク質が、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異
体に融合される。最も好ましい実施形態では、この方法に従って用いられる治療
用タンパク質が、組換えDNA法または遺伝子工学的手法により、アルブミンまた
はアルブミンの断片もしくは変異体に融合される。
【００１２】 別の実施形態では、本発明は、溶解状態（溶液中）の治療用タンパク質（例え
ば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）を安定化
する方法を包含し、この方法は、治療用タンパク質を、該タンパク質を安定化す
るのに十分であるアルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に
融合または結合させることを含む。好ましい実施形態では、この方法に従って用
いられる治療用タンパク質が、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異
体に融合される。最も好ましい実施形態では、この方法に従って用いられる治療
用タンパク質が、組換えDNA法または遺伝子工学的手法により、アルブミンまた
はアルブミンの断片もしくは変異体に融合される。
【００１３】 本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むように改変された、好ましくは、該
核酸分子によりコードされるアルブミン融合タンパク質を発現するように改変さ
れた、トランスジェニック生物を包含する。
【００１４】図面の説明 図１は、細胞培地中で最大５週間にわたり37℃でインキュベートした後に残存
しているHA-hGHの生物学的活性（Nb2細胞増殖）に基づいて、HA融合タンパク質
の貯蔵寿命の延長を示した図である。これらの条件下で、hGHは２週目までに活
性がまったく認められなくなる。
【００１５】 図２は、細胞培地中で最大３週間にわたり４℃、37℃または50℃でインキュベ
ートした後に残存しているHA-hGHの安定な生物学的活性（Nb2細胞増殖）に基づ
いて、HA融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示した図である。データは、ゼロ時
における生物学的活性に対して標準化してある。
【００１６】 図3Aおよび3Bは、Nb2細胞増殖アッセイで、HA-hGHの生物学的活性をhGHと比較
した図である。図3Aは、各種濃度のhGHまたはアルブミン融合タンパク質と共に2
4時間インキュベートした後の増殖を示し、図3Bは、各種濃度のhGHまたはアルブ
ミン融合タンパク質と共に48時間インキュベートした後の増殖を示す。
【００１７】 図４は、HA融合体を形成するために治療用タンパク質（ポリペプチドまたはそ
の断片もしくは変異体を含む）をコードするポリヌクレオチドをクローニングす
ることができる基本ベクターとして使用可能なプラスミド（pPPC0005）の地図を
示した図である。プラスミド地図の略語解： PRB1p：S. cerevisiaeプロモータ
ー；FL：融合リーダー配列；rHA：HAをコードするcDNA；ADH1t：ADH1 S. cerevi
siaeターミネーター；T3：T3配列決定プライマー部位；T7：T7配列決定プライマ
ー部位；Amp R：β-ラクタマーゼ遺伝子；ori：複製起点。本出願の優先権の基
となった仮出願では、図４に示したプラスミドがpPPC0005ではなくpPPC0006と呼
ばれていることに注意されたい。さらに、このプラスミド図には、このベクター
中のいくつかの関連する制限部位が示されなかった。したがって、本出願では、
この図をpPPC0005と呼ぶことにし、同ベクターのより多くの制限部位を示してあ
る。
【００１８】 図５は、バイアル中で48または72時間貯蔵した後の、各種濃度のHA-IFN溶液の
回復をストック溶液と比較した図である。
【００１９】 図６は、IVまたはSCでサルに投与した後のHA-α-IFN融合タンパク質の活性を
比較した図である。
【００２０】 図７は、HA-α-IFN融合タンパク質の生物学的利用能および安定性を示した図
である。
【００２１】 図８は、HA-α-IFN生産用の発現ベクターの地図を示した図である。
【００２２】 図９は、HA中のループの位置を示した図である。
【００２３】 図10は、HAループの改変の例を示した図である。
【００２４】 図11は、HAループを示した図である。
【００２５】 図12は、HAループIVを示した図である。
【００２６】 図13は、HAの三次構造を示した図である。
【００２７】 図14は、scFv-HA融合体の例を示した図である。
【００２８】 図15は、成熟型のヒトアルブミンのアミノ酸配列（配列番号18）およびそれを
コードするポリヌクレオチド（配列番号17）を示した図である。
【００２９】詳細な説明 上述したように、本発明は、一部には、治療用タンパク質、ポリペプチドまた
はペプチドを、該タンパク質およびその活性を安定化させるのに十分なアルブミ
ンの全部または一部に遺伝的に融合させるか、または化学的に結合させることに
よって、in vitroおよび／またはin vivoにおいて、溶解状態の（または医薬組
成物中の）治療用タンパク質の貯蔵寿命を引き延ばし、かつ／または治療用タン
パク質の活性を長期間保持するように治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド
、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）を安定化しうる、という発
見に基づくものである。
【００３０】 本発明は、一般的には、アルブミン融合タンパク質ならびに疾患または障害の
予防、治療または改善方法に関する。本明細書で用いる「アルブミン融合タンパ
ク質」とは、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異体）
の少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）への
融合により形成されたタンパク質をさす。本発明のアルブミン融合タンパク質は
、少なくとも治療用タンパク質の断片または変異体と少なくともヒト血清アルブ
ミンの断片または変異体とを含み、これらは互いに結合されており、好ましくは
遺伝的融合（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の全部
または一部をコードするポリヌクレオチドがアルブミンの全部または一部をコー
ドするポリヌクレオチドと同じ読み枠で連結されている核酸の翻訳により生成さ
れる）または化学的結合により互いに結合されている。治療用タンパク質および
アルブミンタンパク質は、ひとたびアルブミン融合タンパク質の一部となれば、
そのアルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」（例えば、
「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と呼ぶことが
できる。
【００３１】 一つの実施形態では、本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に記載した
もの）と血清アルブミンタンパク質と、を含む、あるいは、から成る、アルブミ
ン融合タンパク質を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質
の生物活性および／または治療活性のある断片と血清アルブミンタンパク質と、
を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。別の実施
形態では、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／または治療活性のあ
る変異体と血清アルブミンタンパク質と、を含む、あるいは、から成る、アルブ
ミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパ
ク質の血清アルブミンタンパク質成分は血清アルブミンの成熟部分である。
【００３２】 さらなる実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と血清アルブミンの生物
活性および／または治療活性のある断片と、を含む、あるいは、から成る、アル
ブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、治療用タ
ンパク質と血清アルブミンの生物活性および／または治療活性のある変異体と、
を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい
実施形態では、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は治療用タン
パク質の成熟部分である。さらに好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパ
ク質の治療用タンパク質部分は治療用タンパク質の細胞外の可溶性ドメインであ
る。別の実施形態では、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は治
療用タンパク質の活性形態である。
【００３３】 さらなる実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／また
は治療活性のある断片または変異体と、血清アルブミンの生物活性および／また
は治療活性のある断片または変異体と、を含む、あるいは、から成る、アルブミ
ン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、治療用タンパ
ク質の成熟部分と血清アルブミンの成熟部分と、を含む、あるいは、から成る、
アルブミン融合タンパク質を提供する。
【００３４】治療用タンパク質 上述したように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは遺伝的融
合または化学的結合により、互いに結合された、少なくとも治療用タンパク質の
断片または変異体と少なくともヒト血清アルブミンの断片または変異体とを含む
。
【００３５】 本明細書で用いる「治療用タンパク質」とは、１つ以上の治療活性および／ま
たは生物活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその
断片もしくは変異体をさす。本発明により包含される治療用タンパク質としては
、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生化学的薬剤があり、こ
れらに限定されない。（ペプチド、タンパク質、ポリペプチドという用語は、本
明細書では相互交換可能に用いられる。）特に「治療用タンパク質」という用語
は、抗体とそのフラグメントおよび変異体を含む。かくして、本発明のアルブミ
ン融合タンパク質は、少なくとも治療用タンパク質の断片または変異体および／
または少なくとも抗体のフラグメントまたは変異体を含みうる。さらに、「治療
用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内在性のまたは天然に存在す
る対応物をさすこともある。
【００３６】 「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療上活性」のあるタンパク質とは
、治療用タンパク質と関連した既知の生物活性および／または治療活性を１以上
保有するポリペプチド、例えば、本明細書に記載した、さもなくば、当技術分野
で知られている治療用タンパク質をさす。非限定的な例として、「治療用タンパ
ク質」は、疾患、症状または障害を治療、予防または改善するのに有用なタンパ
ク質である。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、特定の細胞型（正
常（例：リンパ球）または異常（例：癌細胞））と特異的に結合するものであり
、それゆえ、化合物（薬物または細胞毒性物質）をその細胞型へ特異的にターゲ
ッティングするために使用することができる。
【００３７】 別の非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、生物活性のあるタンパク
質、特に疾患を治療、予防または改善するのに有用な生物活性をもつタンパク質
である。治療用タンパク質がもちうる生物活性の非包括的なリストとして、免疫
応答の増強、血管形成の促進、血管形成の抑制、造血機能の調節、神経成長の刺
激、免疫応答の増強、免疫応答の抑制、または以下の「生物活性」の項に記載す
る生物活性のうちの１以上が挙げられる。
【００３８】 本明細書中で用いる「治療活性」または「活性」とは、その作用がヒトにおけ
る望ましい治療結果と一致する活性、あるいは、ヒト以外の哺乳動物または他の
種もしくは生物における所望の効果を意味しうる。治療活性はin vivoまたはin
vitroで測定可能である。例えば、望まれる効果を細胞培養でアッセイすること
ができる。一例として、hGHが治療用タンパク質である場合は、実施例１に記載
するような、hGHの細胞増殖に及ぼす影響が、治療活性を測定するためのエンド
ポイントとして用いられる。そのようなin vitroまたは細胞培養アッセイは、通
常、当技術分野で記載されるように、多くの治療用タンパク質に利用可能である
。アッセイの例には、限定するものではないが、本明細書中の「実施例」の項ま
たは表１の「代表的活性アッセイ」の欄に記載されるものが含まれる。
【００３９】 特定の治療用タンパク質のための有用なアッセイの例として、次のものが挙げ
られるが、これらに限定されるものではない：GMCSF (Eaves, A.C. and Eaves C
.J., 培地中における赤血球形成． In: McCullock EA (edt) Cell culture tech
niques - Clinics in hematology. WB Saunders, Eastbourne, pp 371-91 (1984
); Metcalf, D., International Journal of Cell Cloning 10: 116-25 (1992);
Testa, N.G., et al., 造血成長因子のためのアッセイ． In: Balkwill FR (ed
t) Cytokines, A practical Approach, pp 229-44; IRL Press Oxford 1991) EP
O (バイオアッセイ: Kitamura et al., J. Cell. Physiol. 140 p323 (1989));
ヒルジン (血小板凝集アッセイ: Blood Coagul Fibrinolysis 7(2):259-61 (19
96)); IFNa (抗ウイルスアッセイ: Rubinstein et al., J. Virol. 37(2):755-8
(1981);増殖抑制アッセイ: Gao Y, et al Mol Cell Biol. 19(11):7305-13 (19
99); および バイオアッセイ: Czarniecki et al., J. Virol. 49 p490 (1984))
; GCSF (バイオアッセイ: Shirafuji et al., Exp. Hematol. 17 p116 (1989);
マウスNFS-60細胞の増殖 (Weinstein et al, Proc Natl Acad Sci 83:5010-4 (
1986)); インシュリン (3H-グルコール摂取アッセイ: Steppan et al., Nature
409(6818):307-12 (2001)); hGH (Ba/F3-hGHR 増殖アッセイ: J Clin Endocrino
l Metab 85(11):4274-9 (2000); 成長ホルモンについての国際的基準: Horm Res
, 51 Suppl 1:7-12 (1999)); 第X因子 (第X因子活性アッセイ: Van Wijk et al.
Thromb Res 22:681-686 (1981)); 第VII因子 (プロトロンビン凝固時間を用い
た凝固アッセイ: Belaaouaj et al., J. Biol. Chem. 275:27123-8(2000); Diaz
-Collier et al., Thromb Haemost 71:339-46 (1994)), または、表１の「代表
的活性アッセイ」の欄に示したものなどである。
【００４０】 本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用
タンパク質（例えば、細胞表面および分泌タンパク質）は、１個以上のオリゴ糖
基の結合によって修飾されていることが多い。かかる修飾は、グリコシル化と呼
ばれるもので、タンパク質の物理的性質に劇的な影響を及ぼし、タンパク質の安
定性、分泌および局在において重要でありうる。グリコシル化はポリペプチド骨
格に沿った特定の位置で起こる。通常、グリコシル化には２つの主要なタイプが
ある。すなわち、O-結合オリゴ糖（Asn-X-Ser/Thr配列（ここで、Xはプロリンを
除く任意のアミノ酸である）中のセリンまたはトレオニン残基に結合）を特徴と
するグリコシル化と、N-結合オリゴ糖（Asn-X-Ser/Thr配列中のアスパラギン残
基に結合）を特徴とするグリコシル化である。通常は、N-アセチルノイラミン酸
（シアル酸ともいう）がN-結合オリゴ糖とO-結合オリゴ糖の両方の末端残基とな
る。タンパク質構造や細胞型などの変動要因が鎖内の様々なグリコシル化部位で
の炭水化物単位の数および性質に影響する。また、グリコシル化異性体が所定の
細胞型内の同一の部位に普通に存在する。
【００４１】 例えば、ヒトインターフェロンのいくつかのタイプはグリコシル化されている
。天然のヒトインターフェロン-α2はトレオニン106でO-グリコシル化され、イ
ンターフェロン-α14ではアスパラギン72でN-グリコシル化が起こる(Adolfら, J
. Biochem 276:511 (1991); Nyman TAら, J. Biochem 329:295 (1998))。天然の
インターフェロン-β1αのアスパラギン80にあるオリゴ糖は、このタンパク質の
溶解性と安定性にとって重要な役割を果たしうるが、その生物活性にとっては必
須のものではない。したがって、安定性を高めるための配列修飾を行った非グリ
コシル化類似体（インターフェロン-β1b）の遺伝子工学的作製が可能である(Ho
soiら, J. Interferon Res. 8:375 (1988); Karpusasら, Cell Mol Life Sci 54
:1203 (1998); Knight, J. Interferon Res. 2:421 (1982); Runkelら, Pharm R
es 15:641 (1998); Lin, Dev. Biol. Stand. 96:97 (1998))。インターフェロン
-γは25位と97位にN-結合オリゴ糖鎖を含むが、これらは両方とも生物活性のあ
る組換えタンパク質を効率よく生成させるのに重要であり、このタンパク質の薬
物動態学的特性に影響を及ぼす(Sarenevaら, Eur. J. Biochem 242:191 (1996);
Sarenevaら, Biochem J. 303:831 (1994); Sareneva ら, J. Interferon Res.
13:267 (1993))。例えばヒトエリトロポエチンでは、O-結合とN-結合の混合グリ
コシル化が起こり、N-結合グリコシル化は24位、38位および83位にあるアスパラ
ギン残基で起こり、一方、O-結合グリコシル化は126位のセリン残基で起こる(La
iら, J. Biol. Chem. 261:3116 (1986); Broudyら, Arch. Biochem. Biophys. 2
65:329 (1988))。
【００４２】 本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用
タンパク質、ならびにその類似体および変異体は、１以上の部位でのグリコシル
化が、その核酸配列の操作の結果として、それを発現する宿主細胞により改変さ
れるか、または他の発現条件により改変されるように、修飾することができる。
例えば、グリコシル化異性体は、グリコシル化部位の除去または導入（例えば、
アスパラギンをグルタミンで置換するといった、アミノ酸残基の置換または欠失
）により作製することができ、また、非グリコシル化タンパク質は、グリコシル
化を行わない宿主細胞（例えば、大腸菌またはグリコシル化欠損酵母）で発現さ
せることによって作製することができる。これらのアプローチは以下で詳しく説
明するが、当技術分野で公知である。
【００４３】 本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用
タンパク質には、限定されるものではないが、血漿タンパク質が含まれる。より
具体的には、以下のようなタンパク質が含まれるが、これらに限定されるもので
はない：免疫グロブリン、血清コリンエステラーゼ、α−1 アンチトリプシン、
アプロチニン、前駆体形態および活性形態にある凝固因子（フォン・ビルブラン
ト因子、フィブリノーゲン、第II因子、第VII因子、活性第VIIA因子、第VIII因
子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、c1インアクチベーター、アンチトロンビ
ンIII、トロンビン、プロトロンビン、アポ−リポタンパク質、ｃ−反応性タン
パク質およびプロテインＣなどが含まれるがこれらに限定されない）である。本
発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タン
パク質には、さらに、ヒト成長ホルモン (hGH)、α−インターフェロン、エリス
ロポイエチン (EPO)、顆粒球コロニー刺激因子 (GCSF)、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子 (GMCSF)、インスリン、一本鎖抗体、自己分泌運動因子、分散
因子、ラミニン、ヒルジン、アプラギン（applaggin）、単球走化姓タンパク質
(MCP/MCAF)、マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)、オステオポンチン、血
小板第４因子、テネイシン、ビトロネクチン、および表１に記載されたものが含
まれるがこれらに限定されない。これらのタンパク質およびこれらのタンパク質
をコードする核酸配列は、公知であり、表１に示すような、ケミカル・アブスト
ラクト・サービス・データベース(Chemical Abstracts Services Databases)(例
えば、CAS Registry)、GenBank、およびGenSeqのような公共のデータベースから
入手可能である。
【００４４】 本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する追加の
治療用タンパク質には、限定するものではないが、表１の「治療用タンパク質Ｘ
」の欄に記載した治療用タンパク質もしくはペプチド、またはその断片もしくは
変異体の１種以上が含まれる。
【００４５】 表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当す
る治療用タンパク質の非包括的リストを提供する。「治療用タンパク質Ｘ」の欄
には、治療用タンパク質分子と、そのあとの括弧内に、治療用タンパク質分子ま
たはその断片もしくは変異体を含むか、あるいは、治療用タンパク質分子または
その断片もしくは変異体から成る科学的名称および商標名が記載されている。本
明細書中で用いる「治療用タンパク質Ｘ」とは、個々の治療用タンパク質分子（
CASおよびGenBank登録番号から入手できるアミノ酸配列により規定される）をさ
すか、あるいは、その欄に記載される所定の治療用タンパク質分子と関連した治
療用タンパク質の全グループをさす。「代表的識別番号」の欄は、ケミカル・ア
ブストラクト・サービス(CAS)登録番号（米国化学会により公開）および／また
はGenBank登録番号（例えば、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のウ
ェブページ www.ncbi.nlm.nih.gov から入手可能な、遺伝子座番号、NP XXXXX (
基準配列タンパク質)、およびXP XXXXX (モデルタンパク質)識別番号）を提供し
、これらは治療用タンパク質分子または治療用タンパク質分子の断片もしくは変
異体のアミノ酸配列を含むCAS RegistryまたはGenBankデータベースへのエント
リーに相当する。これらのCASおよびGenBank登録番号のそれぞれと関連した概略
頁は、その全体を（特にそこに記載されたアミノ酸配列に関して）参照すること
により本明細書中に組み入れるものとする。「PCT／特許文献」の欄は、その治
療用タンパク質分子を記載している特許および／または公開特許出願に相当する
米国特許番号またはPCT国際公開番号を提供する。「PCT／特許文献」の欄に引用
された特許および／または公開特許出願のそれぞれは、その全体を参照すること
により本明細書に組み入れるものとする。特に、各引用「PCT／特許文献」の配
列表に示された特定のポリペプチドのアミノ酸配列、例えば各引用「PCT／特許
文献」の詳細な説明に示されたこれらのアミノ酸配列の変異体（突然変異体、断
片など）、例えば各引用「PCT／特許文献」の詳細な説明に示された治療適応症
、および各引用「PCT／特許文献」の詳細な説明（特に実施例）に示された特定
のポリペプチドの活性アッセイは、その全体を参照することにより本明細書に組
み入れるものとする。「生物活性」の欄は、治療用タンパク質分子と関連した生
物活性を記載している。「代表的活性アッセイ」の欄は、治療用タンパク質また
は治療用タンパク質Ｘ部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質の治療およ
び／または生物活性を試験するために使用できるアッセイを記載している文献を
提供する。「代表的活性アッセイ」の欄に引用された文献はそれぞれ、特に表１
の「生物活性」の欄に示された対応する生物活性をアッセイするためのその文献
に記載されたそれぞれの活性アッセイの説明に関して、その全体を参照（例えば
、「方法」の項を参照）することにより本明細書に組み入れるものとする。「好
適な適応症Ｙ」の欄は、治療用タンパク質Ｘまたは治療用タンパク質Ｘ部分を含
む本発明のアルブミン融合タンパク質により治療、予防または改善される疾患、
障害および／または症状について記載している。
【００４６】
【表１】
【００４７】 好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質は表1の対
応する行に示されているアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対
応する治療用タンパク質の治療活性および/もしくは生物活性に対応する治療活
性および/もしくは生物活性を示すことができる。(例えば、表1の「生物活性」
および「治療用タンパク質 X」列を参照せよ。)さらに好ましい実施形態におい
ては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療上活性なタンパク質部分は、表
1の「代表的識別番号」の列中に引用している参照配列の断片もしくは変異体で
あり、表1の「生物活性」列に開示されている、対応している治療用タンパク質
の治療活性および/もしくは生物活性を示すことができる。
【００４８】ポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片ならびに変異体 断片： 本発明はさらに、表1に示した治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、お
よび/もしくは本発明のアルブミン融合タンパク質の断片に向けられたものであ
る。
【００４９】 あるタンパク質のN末端から1個以上のアミノ酸が欠失し、その結果その治療用
タンパク質、アルブミンタンパク質、および/もしくはアルブミン融合タンパク
質の1種以上の生物学的機能が改変もしくは失われたとしても、その他の治療活
性および/もしくは機能的活性(例えば、生物活性、多量体化能、リガンド結合能
)を保持したままのものとすることができる。例えば、N末端に欠失のあるポリペ
プチドの抗体(それはそのポリペプチドの完全なもしくは成熟形態のものを認識
する)を誘導するおよび/もしくは結合する能力は通常は、N末端から完全なポリ
ペプチドの残基の大多数ではない数の残基を除去した場合には保持されるだろう
。完全なポリペプチドのN末端の残基を欠いているある特定のポリペプチドがそ
のような免疫活性を保持しているか否かは本明細書に記載した日常的な方法およ
び当業界で公知のその他の方法によって容易に測定することができる。N末端の
アミノ酸残基の多数が欠失した突然変異タンパク質が何らかの生物もしくは免疫
活性を保持しうるということはあり得ないことではない。実際に、たった6個の
アミノ酸残基からなるペプチドが免疫応答を引き起こしうることが多い。
【００５０】 従って、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応す
る治療用タンパク質断片には、その全長タンパク質ならびに参照ポリペプチド(
例えば、表1に開示しているような治療用タンパク質)のアミノ酸配列のアミノ末
端から1個以上の残基が欠失しているポリペプチドが含まれる。特に、N末端の欠
失は一般式m−qで示すことができ、ここでqは参照ポリペプチド(例えば、表1で
参照される治療用タンパク質)中のアミノ酸残基の総数を示す整数値であり、mは
2からq−6の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００５１】 さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対
応する血清アルブミンポリペプチドの断片には、その全長タンパク質ならびに参
照ポリペプチド(すなわち血清アルブミン)のアミノ酸配列のアミノ末端から1個
以上の残基が欠失しているポリペプチドが含まれる。特に、N末端の欠失は一般
式m−585で示すことができ、ここで585は血清アルブミン(配列番号18)のアミノ
酸残基の総数を示す整数であり、mは2から579の範囲の任意の整数と定義される
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含さ
れる。
【００５２】 その上、本発明のアルブミン融合タンパク質の断片には、その全長アルブミン
融合タンパク質ならびにそのアルブミン融合タンパク質のアミノ末端から1個以
上の残基が欠失しているポリペプチドが含まれる。特に、N末端の欠失は一般式m
−qで示すことができ、ここでqはそのアルブミン融合タンパク質のアミノ酸残基
の総数を示す整数であり、mは2からq−6の範囲の任意の整数と定義される。これ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００５３】 また、上述のとおり、参照ポリペプチド(例えば治療用タンパク質および/もし
くは血清アルブミンタンパク質)のN末端もしくはC末端から1個以上のアミノ酸を
欠失させたことによってそのタンパク質の1種以上の生物学的機能の改変もしく
は失われたとしても、その他の機能的活性(例えば生物活性、多量体化能、リガ
ンド結合能)および/もしくは治療活性は保持されたままでありうる。例えば、C
末端に欠失のあるポリペプチドの抗体(それはそのポリペプチドの完全なもしく
は成熟形態を認識する)を誘導するおよび/もしくは結合する能力は、通常は、C
末端から完全なもしくは成熟なポリペプチドの残基の大多数ではない数の残基を
除去した場合には保持されるだろう。参照ポリペプチドのN末端および/もしくは
C末端の残基を欠いているある特定のポリペプチドが治療活性を保持しているか
否かは本明細書に記載した日常的な方法および当業界で公知のその他の方法によ
って容易に測定することができる。
【００５４】 本発明はさらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分
に対応する治療用タンパク質(例えば、表1で参照される治療用タンパク質)のア
ミノ酸配列のカルボキシ末端から1個以上の残基が欠失しているポリペプチドを
提供する。特に、C末端の欠失は一般式1−nで示すことができ、ここでnは6からq
−1の範囲の任意の整数であり、ここでqは参照ポリペプチド(例えば、表1で参照
される治療用タンパク質)中のアミノ酸残基の総数を示す整数である。これらの
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００５５】 さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク
質部分に対応するアルブミンタンパク質(例えば、血清アルブミン)のアミノ酸配
列のカルボキシ末端から1個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する
。特に、C末端の欠失は一般式1−nで示すことができ、ここでnは6〜584の範囲の
任意の整数であり、ここで584は血清アルブミン(配列番号18)のアミノ酸残基の
総数を示す整数から1を引いたものである。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００５６】 さらに本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から1
個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。特に、C末端の欠失は一
般式1−nで示すことができ、ここでnは6からq−1の範囲の任意の整数であり、こ
こでqは本発明のアルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基の総数を示す整数
である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって
包含される。
【００５７】 さらに、上述のN末端もしくはC末端欠失のいずれかを組み合わせてN末端およ
びC末端欠失参照ポリペプチドを産生することができる。本発明はまた、アミノ
末端およびカルボキシル末端の双方から1個以上のアミノ酸を欠失させたポリペ
プチドをも提供し、それは参照ポリペプチド(例えば、表1で参照される治療用タ
ンパク質、もしくは血清アルブミン(例えば、配列番号18)、または本発明のアル
ブミン融合タンパク質)の一般にm−n個の残基を有するものとして示すことがで
き、ここでnおよびmは上述の整数である。これらのポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００５８】 本出願はまた、本明細書に記載の参照ポリペプチド配列(例えば、治療用タン
パク質、血清アルブミンタンパク質、もしくは本発明のアルブミン融合タンパク
質)またはその断片と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは
99%同一のポリペプチドを含んでいるタンパク質に向けられる。好ましい実施形
態においては、本出願は、N末端およびC末端に上述のとおり欠失のあるアミノ酸
配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98
%、もしくは99%同一であるポリペプチドを含んでなるタンパク質に向けられる。
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含され
る。
【００５９】 本発明の好ましいポリペプチド断片は、そのアミノ酸配列が断片である治療用
タンパク質もしくは血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療活性お
よび/もしくは機能的活性(例えば、生物活性)を示すアミノ酸配列を含んでなる
、あるいはそのアミノ酸配列からなる断片である。他の好ましいポリペプチド断
片とは、生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片とは、本発明のポ
リペプチドの活性と同一である必要はないが類似の活性を示すものである。断片
の生物活性は所望の活性の改良されたもの、もしくは望ましくない活性を低減さ
せたものを含むことができる。
【００６０】 変異体： 「変異体」とは参照核酸もしくはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドも
しくは核酸であるが、その本質的な特性は保持しているものを意味する。通常は
、変異体は全体としてその参照核酸もしくはポリペプチドに対して非常に類似し
ていて、多くの領域において同一である。
【００６１】 本明細書で用いている「変異体」とは、本発明のアルブミン融合タンパク質の
治療用タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、
もしくはアルブミン融合タンパク質であって、それぞれ治療用タンパク質(例え
ば、表１の「治療用」の列を参照されたい)、アルブミンタンパク質、および/も
しくは本発明のアルブミン融合タンパク質とは配列が異なっているが、本明細書
の他の箇所に述べられているかもしくは当業界で知られているようなそれらの少
なくとも1種の機能的および/もしくは治療的特性(例えば、表1の「生物活性」の
列に開示されているような治療活性および/もしくは生物活性)は保持しているも
のを意味する。通常は、変異体は全体として、本発明のアルブミン融合タンパク
質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質、本発明のアルブミン融
合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質、お
よび/もしくは本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と非常に類似
しており、多くの領域においては同一である。これらの変異体をコードする核酸
も本発明によって包含される。
【００６２】 本発明はまた、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク
質部分に対応する治療用タンパク質のアミノ酸配列(例えば、表1の「代表的識別
番号」の列中に開示されているアミノ酸配列、またはそれの断片もしくは変異体
)、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応する
アルブミンタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号18またはそれの断片も
しくは変異体)、ならびに/または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸
配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一
なアミノ酸配列を含んでなる、もしくはそのアミノ酸配列から成るタンパク質に
向けられる。これらのポリペプチドの断片も提供される(例えば、本明細書に記
載の断片)。本発明によって包含されるポリペプチドとしてはさらに、本発明の
アミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオ
チドによってコードされるポリペプチドがあり、そのハイブリダイゼーションは
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、6X 塩化ナトリウム
/クエン酸ナトリウム(SSC)中でフィルターに結合させたDNAと45℃でハイブリダ
イズさせ、その後0.2X SSC、0.1% SDS中で約50〜65℃で1回以上洗浄する)、高度
にストリンジェントな条件下(例えば、6X 塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(
SSC)中でフィルターに結合させたDNAと45℃でハイブリダイズさせ、その後0.1X
SSC、0.2% SDS中で約68℃で1回以上洗浄する)、またはその他の当業者には公知
のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、Ausubel, F.M.ら
編, 1989 「分子生物学の今日のプロトコール(Current Protocol in Molecular
Biology)」, Green publishing associates, Inc.,およびJohn Wiley & Sons In
c., New York, pp6.3.1-6.3.6およびp2.10.3を参照せよ)で行われる。これらの
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００６３】 本発明のクエリー(query)アミノ酸配列に対して例えば少なくとも95%「同一な
」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象とするポリペプチドのアミ
ノ酸配列が、その対象ポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各アミノ酸10
0個あたり5個までの変更を含みうることを除いてはそのクエリー配列と同一であ
ることを意図している。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも95%
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象の配列のアミノ
酸残基の5%までを挿入、欠失、または別のアミノ酸と置換することができる。参
照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末
端の位置で生じることができ、またはこれら2つの末端の間のどこでも、参照配
列内の残基の中でに個々に散在するか、もしくはその参照配列内の1つ以上の連
続した群で散在することができる。
【００６４】 実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、本発明のアルブ
ミン融合タンパク質のアミノ酸配列もしくはその断片(例えば該アルブミン融合
タンパク質の治療用タンパク質部分もしくは該アルブミン融合タンパク質のアル
ブミン部分)と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同
一か否かは、既知のコンピュータープログラムを用いて慣例的に決定することが
できる。クエリー配列(本発明の1配列)と対象配列との間の全体として最も良好
なマッチを決定するための好ましい方法は、グローバルシークエンスアラインメ
ントとも呼ばれ、Brutlagら(Comp.Appl.Biosci. 6:237-245 (1990))のアルゴリ
ズムに基づいてFASTDBコンピュータープログラムを用いて決定することができる
。配列アラインメントにおいてクエリー配列と対象配列は双方ともヌクレオチド
配列であるかもしくは双方ともアミノ酸配列である。前記グローバルシークエン
スアラインメントの結果は同一性パーセントで表される。FASTDBアミノ酸アライ
ンメントで用いられる好ましいパラメーターは以下の通りである：マトリックス
(Matrix)＝PAM 0、k-tuple＝2、ミスマッチペナルティー(Mismatch Penalty)＝1
、ジョイニングペナルティー(Joining Penalty)＝20、ランダム化グループ長(Ra
ndomization Group Length)＝0、カットオフスコア(Cutoff Score)＝1、ウイン
ドウサイズ(Window Size)＝配列の長さ、ギャップペナルティー(Gap Penalty)＝
5、ギャップサイズペナルティー(Gap Size Penalty)＝0.05、ウインドウサイズ
＝500もしくは対象アミノ酸配列の長さのうちの短い方。
【００６５】 対照配列がN末端もしくはC末端の欠失のために(内部での欠失のためではなく)
クエリー配列よりも短い場合には、結果に手動で補正を行わなければならない。
これはFASTDBプログラムが全体的な同一性パーセントを計算する際に対象配列の
N末端およびC末端の末端切断を考慮しないためである。クエリー配列と比較した
N末端およびC末端で末端切断されている対象配列については、同一性パーセント
は、対象配列のN末端およびC末端であるクエリー配列の残基数であって対応する
対象残基とマッチ/アラインメントしないものの数をクエリー配列の全塩基のパ
ーセントとして計算することによって補正する。ある残基がマッチ/アラインメ
ントしているか否かはFASTDB配列アラインメントの結果によって決定される。次
いでこのパーセンテージを、上述のFASTDBプログラムで特定のパラメーターを用
いて計算した同一性パーセントから差し引いて最終的な同一性パーセントスコア
が求められる。この最終的同一性パーセントスコアが本発明の目的で用いるもの
である。、クエリー配列とマッチ/アラインメントしない対象配列のN末端および
C末端に対する残基が、同一性パーセントスコアの手動による調整のために考慮
される。すなわち、対象配列のN末端およびC末端残基の最も遠い位置にあるもの
の外側にあるクエリー残基の位置のみである。
【００６６】 例えば、90アミノ酸残基の対象配列を100残基のクエリー配列とアラインメン
トさせて同一性パーセントを決定する。対象配列のN末端に欠失が生じており、
従ってFASTDBアラインメントはN末端の最初の10残基のマッチング/アラインメン
トを示さない。10個の対をなさない残基は配列の10%を占めることとなり(マッチ
しなかったN末端およびC末端の残基数/クエリー配列の残基の総数)、この10%はF
ASTDBプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから差し引かれる
。もし残りの90%の残基が完全にマッチしているとすれば最終的な同一性パーセ
ントは90%となろう。別の例では、90残基の対象配列を100残基のクエリー配列と
比較する。今回は欠失は内部的欠失であり、クエリーとマッチ/アラインメント
しないような対象配列のN末端およびC末端の残基はない。この場合には、FASTDB
によって計算された同一性パーセントを手動で補正はしない。再度述べれば、FA
STDBアラインメントで示された対象配列のN末端およびC末端の最後の残基の外側
に位置する残基で、クエリー配列とマッチ/アラインメントしないもののみにつ
いて手動による補正を行う。本発明の目的のためにはその他の手動による補正は
行うべきでない。
【００６７】 変異体は、その変異体と同じ長さである正常なHAもしくは治療用タンパク質と
通常は少なくとも75%(好ましくは少なくとも約80%、90%、95%、もしくは99%)の
配列同一性を有するだろう。ヌクレオチド配列レベルもしくはアミノ酸配列レベ
ルでの相同性もしくは同一性は、blastp、blastn、blastx、tblastn、およびtbl
astxプログラムで行われるアルゴリズムを用いたBLAST(Basic Local Alignment
Search Tool)分析で決定され(Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-
2268(1990)およびAltschul, J. Mol. Evol. 36:290-300(1993)、これらは参照に
より完全に組み入れる)、これらは配列類似性検索に適するように作られたもの
である。
【００６８】 BLASTプログラムに用いられている手法は、最初にクエリー配列とデータベー
ス配列間の類似のセグメントを考慮し、次いで同定された全てのマッチの統計学
的有意性を評価し、最後にあらかじめ選択した有意性の閾値を満足するマッチの
みを要約するものである。配列データベースの類似性検索の基本的事項の考察に
関しては、Altschulらの論文 (Nature Genetics 6:119-129(1994)、これは参照
により完全に組み入れる)を参照せよ。ヒストグラム、説明(description)、アラ
インメント、期待(expect)(すなわち、データベース配列に対するマッチを報告
するための統計学的有意性の閾値)、カットオフ、マトリックス、およびフィル
ターのための検索パラメーターはデフォルトの設定としている。blastp、blastx
、tblastn、およびtblastxで用いられるデフォルトスコアリングマトリックスは
BLOSUM62マトリックスである(Henikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:109
15-10919(1992)、これは参照により完全に組み入れる)。blastnについては、ス
コアリングマトリックスはM(すなわち、マッチしている残基のペアについての報
酬(reward)スコア)対N(すなわち、ミスマッチの残基についてのペナルティース
コア)の比率をによって設定され、そこではMとNのデフォルト値はそれぞれ5と−
4である。4つのblastnパラメーターは次のとおり調整することができる：Q＝10(
ギャップクリエーションペナルティー)；R＝10(ギャップエクステンションペナ
ルティー)；wink＝1(クエリーに沿ってwinkｔｈの各位置毎にワードヒット(word
hit)を作製する)；およびgapw＝16(ウインドウ(window)幅を設定しその中にギ
ャップ化されたアラインメントを作製する)。等価なBlastpパラメーターの設定
はQ＝9；R＝2；wink＝1；およびgapw＝32であった。GCGパッケージバージョン10
.0において利用可能な配列間のベストフィット比較は、DNAパラメーターGAP＝50
(ギャップクリエーションペナルティー)およびLEN＝3(ギャップエクステンショ
ンペナルティー)を用いており、タンパク質の比較における等価な設定はGAP＝8
およびLEN＝2である。
【００６９】 本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、もしくはそ
の双方に変更を含むものとすることができる。特に好ましいものは、サイレント
な置換、付加、もしくは欠失を産生するがコードされるポリペプチドの特性もし
くは活性は変えないような変更を含んだポリヌクレオチド変異体である。遺伝コ
ードの縮重によるサイレントな置換によって産生されるヌクレオチド変異体が好
ましい。さらに、ポリペプチド変異体であって、50未満、40未満、30未満、20未
満、10未満、もしくは5〜50、5〜25、5〜10、1〜5、もしくは1〜2個のアミノ酸
がどのような組み合わせでも置換、欠失、もしくは付加されているポリペプチド
変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は様々な理由、例えば、ある特定の
宿主でのコドンの発現を最適化するために(ヒトmRNA中のコドンを酵母または大
腸菌などの細菌宿主に好ましいものへと変更する)、産生することができる。
【００７０】 好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミ
ン部分をコードするポリヌクレオチドは酵母もしくは哺乳類細胞中での発現のた
めに最適化される。さらに好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融
合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは酵母もし
くは哺乳類細胞中での発現のために最適化される。またさらに好ましい実施形態
においては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
は、酵母もしくは哺乳類細胞中での発現のために最適化される。
【００７１】 また別の実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タ
ンパク質部分をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチドは、本明細書に
記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、その治療用タン
パク質をコードする野生型ポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない。さらな
る実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分を
コードするコドンを最適化したポリヌクレオチドは、本明細書に記載のストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下では、そのアルブミンタンパク質をコ
ードする野生型ポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない。別の実施形態にお
いては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするコドンを最適化したポ
リヌクレオチドは、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下では、その治療用タンパク質部分もしくはアルブミンタンパク質部分を
コードする野生型ポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない。
【００７２】 さらなる実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タ
ンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、該治療用タンパク質の天然の配
列を含んでなるものでも、またはあるいはその配列から成るものでもない。さら
なる実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタン
パク質部分をコードするポリヌクレオチドはアルブミンタンパク質の天然の配列
を含んでなるものでも、またはあるいはその配列から成るものでもない。別の実
施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドは、治療用タンパク質部分もしくはアルブミンタンパク質部分の天然の配
列を含んでなるものでも、またはあるいはその配列から成るものでもない。
【００７３】 天然の変異体は「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、それはある生物体の染色体上
の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの取りうる形態のうちの１つである
ことを意味している。(Genes II, Lewin, B.編, John Wiley & Sons, New York(
1985))。これらの対立遺伝子変異体はポリヌクレオチドレベルおよび/もしくは
ポリペプチドレベルで異なることができ、本発明に含まれる。あるいは、非天然
の変異体を突然変異誘発法、もしくは直接的合成法によって産生することができ
る。
【００７４】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の既知の方法を用いて本発明のポリペ
プチドの特徴を改善もしくは変更させるために変異体を作製することができる。
例えば、生物学的機能の実質的な損失を伴うことなく本発明のポリペプチドのN
末端もしくはC末端から1個以上のアミノ酸を欠失させることができる。例として
、Ronら(J. Biol. Chem. 268:2984-2988(1993))は、変異体のKGFタンパク質では
アミノ末端のアミノ酸残基を3個、8個、または27個を欠失させてもヘパリン結合
活性を有していたと報告した。同様に、インターフェロンγでは、このタンパク
質のカルボキシ末端から8〜10個のアミノ酸残基を欠失させると活性が10倍まで
高くなることが示された(Dobeliら, J. Biotechnology 7:199-216(1988))。
【００７５】 さらに、変異体がそれの天然のタンパク質の生物活性と類似の活性を維持して
いることが多いことは多数の証拠によって示されている。例えば、Gayleと共同
研究者ら(J. Biol. Chem. 268:22105-22111(1993))はヒトサイトカインIL-1aの
詳細にわたる突然変異分析を行った。彼らはランダムな突然変異誘発を用いて3,
500種を超える個々のIL-1a突然変異体を作製し、それらはその分子の全長にわた
って変異体当たり平均2.5個のアミノ酸の変化のあるものであった。起こりうる
各アミノ酸の位置について複数の突然変異が調べられた。研究者は「この分子の
大部分は「結合活性もしくは生物活性」にほとんど影響を与えることなく変化さ
せうる」ことを見出した。実際、3,500を超えるヌクレオチド配列を調べ、その
うち23個のユニークなアミノ酸配列のみが、野生型の活性とは著しく異なるタン
パク質を生じた。
【００７６】 さらに、あるポリペプチドのN末端もしくはC末端から1個以上のアミノ酸を欠
失させることが1種以上の生物学的機能の改変もしくは損失をもたらしたとして
も、その他の生物活性が保持されたままでありうる。例えば、欠失変異体の、そ
の分泌形態を認識する抗体を誘導および/もしくはそれと結合する能力は、N末端
もしくはC末端からその分泌形態の大多数ではない残基を除去しても保持される
ことは起こりうる。あるタンパク質のN末端もしくはC末端の残基を欠いている特
定のポリペプチドがそのような免疫原性活性を保持しているか否かは、本明細書
中に記載の日常的な方法および当業界で公知のその他の方法によって容易に決定
することができる。
【００７７】 従って、本発明はさらに、機能的活性(例えば、生物活性および/もしくは治療
活性)を有するポリペプチド変異体を含んでいる。非常に好ましい実施形態にお
いては、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応す
る治療用タンパク質の1種以上の生物活性および/もしくは治療活性に対応する機
能的活性(例えば、表1の「生物活性」の列に開示しているものなどの生物活性お
よび/もしくは治療活性)を有するアルブミン融合タンパク質の変異体を提供する
。そのような変異体は、活性にほとんど影響を及ぼさないように当業界で公知の
一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、反転、反復、および置換を含ん
でいる。
【００７８】 好ましい実施形態においては、本発明の変異体は保存的置換を有する。「保存
的置換」とは、脂肪族もしくは疎水性アミノ酸であるAla、Val、Leu、およびIle
の置換；ヒドロキシル残基SerおよびThrの置換；酸性残基AspおよびGluの置換；
アミド残基AsnおよびGlnの置換；塩基性残基Lys、Arg、およびHisの置換；芳香
族残基Phe、Tyr、およびTrpの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸Ala、Ser
、Thr、Met、およびGlyの置換などの群内での交換を意図するものである。
【００７９】 表現型としてサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスは
、例えば、Bowieら「タンパク質配列におけるメッセージの解読：アミノ酸置換
に対する寛容性(Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to
Amino Acid Substitutions)」, Science 247:1306-1310(1990)に提供されてお
り、その論文で著者らはアミノ酸配列を変化させることによる寛容性を研究する
ためには2つの主なストラテジーがあることを示している。
【００８０】 第1のストラテジーは進化の過程での自然選択によるアミノ酸置換の寛容性を
利用するものである。様々な種のアミノ酸配列を比較することによって、保存さ
れているアミノ酸を同定することができる。これらの保存されているアミノ酸は
そのタンパク質の機能にとっておそらく重要なものである。これに対して、自然
選択で置換が寛容されるアミノ酸の位置は、それらの位置がそのタンパク質の機
能にとって決定的に重要なものではないことを示している。従って、アミノ酸置
換に寛容な位置は、そのタンパク質の生物活性を維持しつつ改変することができ
よう。
【００８１】 第2のストラテジーは、遺伝子工学を用いてクローン化された遺伝子の特定の
位置にアミノ酸の変化を導入してタンパク質の機能に決定的に重要な領域を同定
するものである。例えば、部位特異的突然変異誘発もしくはアラニンスキャンニ
ング突然変異誘発(その分子の全残基において単一のアラニン突然変異を導入す
る)を用いることができる。CunninghamとWells, Science 244:1081-1085(1989)
を参照せよ。次いで、得られた突然変異分子を生物活性について試験することが
できる。
【００８２】 著者らが述べているとおり、これらの2つのストラテジーは、タンパク質がア
ミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、
タンパク質の特定のアミノ酸の位置でどのアミノ酸の変化が許容しうるものとな
りうるかということを示している。例えば、最も埋め込まれた(そのタンパク質
の3次構造内で)アミノ酸残基は非極性の側鎖を必要とするが、一方、表面の側鎖
の特徴は通常ほとんど保存されない。その上、寛容な保存的アミノ酸置換には、
脂肪族もしくは疎水性アミノ酸であるAla、Val、Leu、およびIleの置換；ヒドロ
キシル残基SerおよびThrの置換；酸性残基AspおよびGluの置換；アミド残基Asn
およびGlnの置換；塩基性残基Lys、Arg、およびHisの置換；芳香族残基Phe、Tyr
、およびTrpの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸Ala、Ser、Thr、Met、お
よびGlyの置換が含まれる。保存的アミノ酸置換に加えて、本発明の変異体には
、(i)1つ以上の非保存的アミノ酸残基の置換を含んでいるポリペプチドであって
、その置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされたものである可
能性もそうでない可能性もあるもの、または(ii)置換基を有する1つ以上のアミ
ノ酸残基の置換を含んでいるポリペプチド、または(iii)別の化合物と融合させ
た、もしくは化学的にコンジュゲートさせたポリペプチドであって、その化合物
はそのポリペプチドの安定性および/もしくは溶解性を増大させる化合物など(例
えば、ポリエチレングリコール)であるもの、(iv)例えばIgG Fc融合領域ペプチ
ドなどの、付加的アミノ酸を含んでいるポリペプチドが含まれる。そのような変
異体ポリペプチドは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００８３】 例えば、電荷を有するアミノ酸と他の電荷を有するもしくは中性のアミノ酸と
のアミノ酸置換を含んでいるポリペプチド変異体は、より凝集の少ないものなど
の特性を改良したタンパク質を産生することができる。医薬製剤の凝集は活性の
低下および凝集物の免疫原性活性によるクリアランスの増大の双方をもたらす。
Pinckardら, Clin. Exp. Immunol. 2:331-340(1967)；Robbinsら, Diabetes 36:
838-845(1987)；Clelandら, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10
:307-377(1993)を参照せよ。
【００８４】 特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の治療
用タンパク質、および/もしくはヒト血清アルブミン、および/もしくは本発明の
アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列の断片もしくは変異体を含んでなるも
のであるか、またはあるいはそれらから成るものであり、その断片もしくは変異
体は参照アミノ酸配列と比較すると、1〜5、5〜10、5〜25、5〜50、10〜50、も
しくは50〜150個のアミノ酸残基の付加、置換、および/もしくは欠失を有してい
る。好ましい実施形態においては、そのアミノ酸置換は保存的である。これらの
ポリペプチドをコードする核酸も本発明によって包含される。
【００８５】 本発明のポリペプチドはペプチド結合もしくは改変されたペプチド結合によっ
てお互いが連結されたアミノ酸からなるもの、すなわちペプチド同配体から成る
ことができ、遺伝子によってコードされる20種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含
むことができる。そのポリペプチドは、天然のプロセス、例えば翻訳後プロセシ
ングなどによって、もしくは当業界で周知の化学的改変技法によって改変するこ
とができる。そのような改変については基礎的な教科書およびより詳細なモノグ
ラフに、ならびにおびただしい量の研究論文に十分述べられている。改変はポリ
ペプチドのどこの位置でも生じさせることができ、その位置には、ペプチド骨格
、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端が含まれる。所定のポ
リペプチド中のいくつかの部位に同程度もしくは種々の程度で同じタイプの改変
が存在しうることは理解されよう。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの
改変を含むこともできる。ポリペプチドは、たとえばユビキチン化の結果として
分枝したものとすることができ、また、分岐を有するもしくは有さない環状のも
のとすることができる。環状、分枝、および分枝のある環状ポリペプチドは、翻
訳後の天然のプロセスの結果もたらされるか、もしくは合成法で作製することが
できる。改変としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フ
ラビンの共有結合による付加、ヘム部分の共有結合による付加、ヌクレオチドも
しくはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質もしくは脂質誘導体の共
有結合による付加、ホスファチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有
結合による付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性
の架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカ
ルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、
メチル化、ミリスチル化、酸化、ポリエチレングリコール修飾(pegylation)、タ
ンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(s
elenoylation)、硫酸化、アルギニル化などの転移RNAが介在するタンパク質への
アミノ酸の付加、およびユビキチン化が含まれる。(例えば、「タンパク質−構
造と分子的性質(PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES)」,第2版, T.E
.Creighton編, W.H.Freeman and Company, New York(1993)；「タンパク質の翻
訳後の共有結合性の改変(POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTE
INS)」, B.C.Johnson編, Academic Press, New York, pp.1-12(1983)；Seifter
ら, Meth. Enzymol. 182:626-646(1990)；Rattanら, Ann. N.Y.Acad.Sci. 663:4
8-62(1992)を参照せよ)。
【００８６】機能的活性 「機能的活性を有するポリペプチド」とは、ある治療用タンパク質の全長のも
の、プロタンパク質、および/もしくは成熟形態のものに伴う1種以上の既知の機
能的活性を示すことのできるポリペプチドを意味する。そのような機能的活性と
しては、限定はされないが、生物活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体と結合する(
もしくはあるポリペプチドが結合することと競合する)能力)、免疫原性(本発明
の特定のポリペプチドと結合する抗体を作製する能力)、本発明のポリペプチド
と多量体を形成する能力、およびあるポリペプチドの受容体もしくはリガンドと
結合する能力が含まれる。
【００８７】 「生物活性を有するポリペプチド」とは、本発明の治療用タンパク質の活性と
類似の、それは必ずしも同一である必要はないが、そのような活性を示す、成熟
形態のものを含むポリペプチドを意味し、その活性は特定の生物学的アッセイで
測定されるもので、用量依存性であってもそうでなくてもよい。用量依存性があ
る場合には、それは該ポリペプチドの用量依存性と同一である必要はなく、本発
明のポリペプチドと比較したときに所定の活性において実質的に類似の用量依存
性であればよい(すなわち、該候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドと比較
してより強い活性を示すか、または、せいぜい約25分の1、好ましくはせいぜい
約10分の1、最も好ましくはせいぜい約3分の1の活性を示すこととなろう)。
【００８８】 好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用タ
ンパク質(またはその断片もしくは変異体)がアルブミンと融合していない場合に
その治療用タンパク質に伴う生物活性および/もしくは治療活性の少なくとも1つ
を有するものである。
【００８９】 本発明のアルブミン融合タンパク質はその機能的活性(例えば生物活性)につい
て、当業界では公知のアッセイ法、ならびに本明細書に記載のアッセイ法を用い
て、もしくは日常的に改変して用いてアッセイすることができる。特定して述べ
れば、アルブミン融合タンパク質はその機能的活性(例えば、生物活性、もしく
は治療活性)について、表1の「代表的活性アッセイ」の列で参照するアッセイを
用いてアッセイすることができる。さらに、当業者であれば、本発明のアルブミ
ン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の断片を
、表1の対応する行で参照するアッセイを用いてその活性を日常的にアッセイす
ることができる。さらに、当業者であれば、本発明のアルブミン融合タンパク質
のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質の断片を、当業界
では公知の、および/もしくは下記の実施例の節に記載したようなアッセイを用
いてその活性を日常的にアッセイすることができる。
【００９０】 例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の、抗治療用ポリペプチド抗体お
よび/もしくは抗アルブミン抗体との結合の能力もしくは治療用タンパク質との
競合能力をアッセイしようとする1実施形態においては、当業界では公知の種々
のイムノアッセイを用いることができ、そのようなものとしては、限定はされな
いが、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着法)、「サンドイッチ」
イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、
in situイムノアッセイ(例えば金コロイド、酵素、もしくは放射性同位元素標識
を用いて)、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集ア
ッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテイ
ンAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの技法を用いた競合的および非
競合的アッセイ系が含まれる。1実施形態においては、抗体の結合は一次抗体上
の標識を検出することによって検出される。別の実施形態においては、一次抗体
は二次抗体の結合もしくは一次抗体に対する試薬を検出することによって検出さ
れる。さらなる実施形態においては、二次抗体は標識されている。イムノアッセ
イで結合を検出するためには多数の手段が当業界で知られており、それらは本発
明の範囲内に含まれる。
【００９１】 治療用タンパク質の結合パートナー(例えば、受容体もしくはリガンド)が同定
されている好ましい実施形態においては、その結合のパートナーとの、その治療
用タンパク質を融合体の治療用タンパク質部分として含んでいるアルブミン融合
タンパク質による結合は、例えば還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タ
ンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティ
ングなどの当業界で周知の手段でアッセイすることができる。総説として、Phiz
ickyら, Microbiol. Rev. 59:94-123(1995)を参照せよ。別の実施形態において
は、本発明のアルブミン融合タンパク質と生理学的に関連のあるものが、本発明
のアルブミン融合タンパク質の治療用部分に対応する治療用ポリペプチドの基質
と結合する能力は、当業界では公知の技法を用いて日常的にアッセイすることが
できる。
【００９２】 本発明のアルブミン融合タンパク質の多量体化する能力を評価する別の実施形
態においては、その多量体のその他の構成成分との会合を、例えば還元および非
還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、
およびアフィニティーブロッティングなどの当業界で周知の手段でアッセイする
ことができる。総説としては上述のPhizickyらの文献を参照せよ。
【００９３】 さらに、本明細書に記載のアッセイ(実施例および表1を参照せよ)およびその
他の当業界で公知のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質およびそれ
らの断片、変異体、および誘導体の、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療
用タンパク質部分および/もしくはアルブミン部分のいずれかに関連する生物活
性および/もしくは治療活性(in vitroもしくはin vivoでの)を引き出す能力を測
定するために日常的に適用することができる。その他の方法は当業者には公知で
あり、本発明の範囲内に含まれるものである。
【００９４】 アルブミン 上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用タンパク質の少な
くとも断片もしくは変異体を含んでなり、ならびにヒト血清アルブミンの少なく
とも断片もしくは変異体を含んでなるが、それらは、好ましくは遺伝子的な融合
もしくは化学的コンジュゲーションによってお互いに会合している。
【００９５】 ヒト血清アルブミン(HSA)およびヒトアルブミン(HA)という用語は本明細書で
は相互に交換可能なものとして用いられている。「アルブミン」および「血清ア
ルブミン」という用語はより広義であり、ヒト血清アルブミン(ならびにその断
片および変異体)ならびに他の種由来のアルブミン(ならびにその断片および変異
体)を包含する。
【００９６】 本明細書で用いている「アルブミン」とは集合的にアルブミンタンパク質もし
くはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体であって、アルブミン
の1種以上の機能的活性(例えば、生物活性)を有するものを意味する。とりわけ
、「アルブミン」とはヒトアルブミンもしくはその断片であって(EP201239、EP3
22094、WO97/24445、WO95/23857を参照せよ)、特に図15および配列番号18に示す
ヒトアルブミンの成熟形態、もしくは他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはそ
の断片、またはこれらの分子もしくはその断片の類似体もしくは変異体を意味す
る。
【００９７】 好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質に用いられ
るヒト血清アルブミンタンパク質は、配列番号18を参照して述べれば次のセット
の点突然変異のうちの1つもしくはその双方を含んでいる：Leu-407をAlaに、Leu
-408をValに、Val-409をAlaに、およびArg-410をAlaに；またはArg-410をAに、L
ys-413をGlnに、およびLys-414をGlnに(例えば、国際公開番号WO95/23857を参照
すればよいが、これは本明細書に参照によりその全体を組み入れる)。より一層
好ましい実施形態においては、上述の点突然変異の1つもしくはその双方を含ん
でいる本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Yap3pタンパク分解による切
断に対して安定性/抵抗性が改良されており、それによって酵母宿主細胞中で発
現される組換えアルブミン融合タンパク質の産生の増加が可能となる。
【００９８】 本明細書で用いられている治療用タンパク質の治療活性もしくは貯蔵寿命を長
引かせるために十分なアルブミンの部分とは、そのタンパク質の治療活性を安定
化もしくは長引かせるために十分な長さもしくは構造を有するアルブミンの部分
を意味し、それによってそのアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分
の貯蔵寿命が、非融合状態の貯蔵寿命と比較すると、長引かされるかもしくは延
長されることとなるものである。そのアルブミン融合タンパク質のアルブミン部
分は、上述のもしくは図15に示すようなHA配列の全長のものを含んでなるものと
することができ、またはその治療活性を安定化もしくは長引かせることのできる
、HA配列の1種以上の断片を含むことができる。そのような断片は長さが10個以
上のアミノ酸のものとすることができ、またはHA配列からの約15、20、25、30、
50、もしくはそれ以上の連続したアミノ酸を含むことができ、またはHAの特定の
ドメインの一部もしくは全てを含むことができる。例えば、HAの最初の2つの免
疫グロブリン様ドメインにまたがるHAの1つ以上の断片を用いることができる。
【００９９】 本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は正常HAの変異体とする
ことができる。本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分はま
た、本明細書に記載の治療用タンパク質の変異体とすることもできる。「変異体
」という用語には、挿入、欠失、および置換、それは保存的もしくは非保存的の
いずれかであるが、それらを含み、そのような変化は、膨張圧(oncotic)、有用
なリガンド結合性およびアルブミンの非免疫原性、または治療用タンパク質の治
療活性を付与する活性部位もしくは活性ドメインのうちの1つ以上のものに実質
的に変更を加えないものである。
【０１００】 特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は天然の、ヒトアルブミンの多型性
変異体およびヒトアルブミンの断片を含むことができ、例えばEP322094で開示さ
れている断片(すなわちHA(Pn)、nは369〜419である)が挙げられる。そのアルブ
ミンはいずれの脊椎動物から、特にいずれの哺乳動物から、例えばヒト、ウシ、
ヒツジ、もしくはブタ由来のものとすることができる。非哺乳動物のアルブミン
としては、限定はされないが、ニワトリおよびサケのものが含まれる。アルブミ
ン融合タンパク質のアルブミン部分は治療用タンパク質部分とは異なる動物由来
のものとすることができる。
【０１０１】 一般的に述べれば、HA断片もしくは変異体は少なくともアミノ酸100個の長さ
のものであり、好ましくは少なくともアミノ酸150個の長さのものであろう。HA
変異体は、例えばドメイン1(配列番号18のアミノ酸1-194)、2(配列番号18のアミ
ノ酸195-387)、3(配列番号18のアミノ酸388-585)、1＋2(配列番号18のアミノ酸1
-387)、2＋3(配列番号18のアミノ酸195-585)、もしくは1＋3(配列番号18のアミ
ノ酸1-194＋配列番号18のアミノ酸388-585)などのHAのドメインの少なくとも1個
全体から成るかもしくはそれを含んでなるものとすることができる。各ドメイン
それ自体は2つの相同なサブドメインすなわち1-105、120-194、195-291、316-38
7、388-491、および512-585からできており、Lys 106からGlu 119、Glu 292から
Val 315、およびGlu 492からAla 511の残基を含んでなるフレキシブルなサブド
メイン間リンカー領域を有している。
【０１０２】 好ましくは、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、HAの少
なくとも1つのサブドメインもしくはドメイン、またはその保存的に改変したも
のを含んでなる。その融合がサブドメインに基づいたものである場合には、好ま
しくは隣接するリンカーのいくつかもしくは全てが治療用タンパク質部分に連結
させるために用いられる。
【０１０３】アルブミン融合タンパク質 本発明は、アルブミン融合タンパク質、ならびに、疾病もしくは障害を治療、
予防、または改善する方法に関する。本明細書で用いる「アルブミン融合タンパ
ク質」とは、少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはその断片もしくは変
異体）に対する、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異
体）の融合により形成されるタンパク質を意味する。本発明のアルブミン融合タ
ンパク質は、少なくとも治療用タンパク質の断片または変異体と、少なくともヒ
ト血清アルブミンの断片または変異体とを含んでなり、両者は、好ましくは、遺
伝的融合（すなわち、治療用タンパク質の全部または一部をコードするポリヌク
レオチドを、アルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドとイン
フレームで結合させる、核酸の翻訳により、上記アルブミン融合タンパク質が産
生される）、あるいは、相互の化学的共役により、互いに会合させる。治療用タ
ンパク質とアルブミンタンパク質が、いったんアルブミン融合タンパク質の一部
となったら、アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」と
称することができる。
【０１０４】 一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に記載する通り
）と血清アルブミンタンパク質を含む、あるいは、これらから構成されるアルブ
ミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク
質および血清アルブミンタンパク質の生物活性および／または治療活性断片を含
む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。他
の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質
の生物活性および／または治療活性変異体を含む、あるいは、これらから構成さ
れるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、アルブミン
融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分
である。
【０１０５】 さらに別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と、血清アルブミンの
生物活性および／または治療活性断片を含む、あるいは、これらから構成される
アルブミン融合タンパク質を提供する。また別の実施形態では、本発明は、治療
用タンパク質と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性の変異体を
含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。
好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、
治療用タンパク質の成熟部分である。
【０１０６】 さらに別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／ま
たは治療活性断片または変異体と、血清アルブミンの生物活性および／または治
療活性の断片または変異体とを含む、あるいは、これらから構成されるアルブミ
ン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、治療用タンパ
ク質の成熟部分と血清アルブミンの成熟部分とを含む、あるいは、これらから構
成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。
【０１０７】 好ましくは、上記アルブミン融合タンパク質は、N末端部分としてのHAと、C末
端部分としての治療用タンパク質とを含む。これに代わり、C末端部分としてのH
Aと、N末端部分としての治療用タンパク質とを含むアルブミン融合タンパク質を
用いてもよい。
【０１０８】 他の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのN末端およびC
末端の両方に融合した治療用タンパク質を有する。好ましい実施形態では、N末
端およびC末端に融合した治療用タンパク質は、同じ治療用タンパク質である。
好ましい実施形態では、N末端およびC末端に融合した治療用タンパク質は、異な
る治療用タンパク質である。別の実施形態では、N末端およびC末端に融合した治
療用タンパク質は、同じ疾患、障害または病状（例えば、表１の「好適な適応症
Y」の列に記載した通り）を治療もしくは予防するのに用いることができる異な
る治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態では、N末端およびC末端に融
合した治療用タンパク質は、当技術分野で、一般に患者において同時に発生する
ことが知られている疾患または障害（例えば、表１の「好適な適応症Y」の列に
記載した通り）を治療もしくは予防するのに用いることができる、異なる治療用
タンパク質である。
【０１０９】 アルブミン部分が、治療用タンパク質部分のN末端および／またはC末端に融合
しているアルブミン融合タンパク質以外にも、本発明のアルブミン融合タンパク
質は、目的とする治療用タンパク質またはペプチド（例えば、表１に開示した治
療用タンパク質Ｘ）をHAの内部領域に挿入することにより、生産することができ
る。例えば、HA分子のタンパク質配列内では、多数のループまたはターンが、α
ヘリックスの終点と始点の間に存在するが、これらは、ジスルフィド結合によっ
て安定化される（図９〜11参照）。HAの結晶構造から決定されるループ（図13）
（PDBアイデンティファイアー1A06、1BJ5、1BKE、1BM0、1E7E〜1E7Iおよび1UOR
）は、大部分が、分子本体から離れて延びる。これらのループは、治療活性ペプ
チドの挿入、または内部融合に有用であり、特に、二次構造が機能的である、も
しくは、治療用タンパク質が特定の生物学的活性を有するアルブミン分子を本質
的に産生することが必要なものに有用である。
【０１１０】 ペプチドまたはポリペプチドを挿入することにより、本発明のアルブミン融合
タンパク質を産生できるヒトアルブミン構造におけるループとして、下記が挙げ
られる：Val54-Asn61、Thr76-Asp89、Ala92-Glu100、Gln170-Ala176、His247-Gl
u252、Glu266-Glu277、Glu280-His288、Ala362-Glu368、Lys439-Pro447、Val462
-Lys475、Thr478-Pro486、およびLys560-Thr566。さらに好ましい実施形態では
、ペプチドまたはポリペプチドは、成熟ヒトアルブミン（配列番号18）のVal54-
Asn61、Gln170-Ala176、および／またはLys560-Thr566ループに挿入する。
【０１１１】 挿入しようとするペプチドは、特定の生物学的活性についてスクリーニングさ
れたファージ展示もしくは合成ペプチドライブラリー、あるいは、所望の機能を
有する分子の活性部分のいずれに由来するものでもよい。加えて、特定のループ
内で、あるいは、アミノ酸の考えられるすべての組合せが表示されるHA分子の特
定のループ中にランダム化ペプチドを挿入することにより、ランダムペプチドラ
イブラリーを作製してもよい。
【０１１２】 このようなライブラリーは、以下に記載する方法の１つにより、HAまたはHAの
ドメイン断片上で作製することができる： （a）HAまたはHAドメイン断片の１以上のペプチドループ内でのアミノ酸のラ
ンダム化突然変異。このようにして、１ループ内の１以上または全部の残基を突
然変異させることができる（例えば、図10aを参照）； （b）１以上のループへの、長さXn（ただし、Xはアミノ酸であり、ｎは残基の
数である）のランダム化ペプチドのHAまたはHAのドメイン断片（すなわち、内部
融合）の置換または挿入（例えば、図10bを参照）； （c）（a）および／または（b）に加えて、N-、C-またはN-およびC末端ペプチ
ド／タンパク質融合。
【０１１３】 HAまたはHAドメイン断片は、様々な標的に対する様々なループの様々なスクリ
ーニングに由来するペプチド断片を、同じHAまたはHAドメイン断片へ融合するこ
とにより多機能性にすることができる。
【０１１４】 好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンのループに挿入されるペプチドは
、表１に開示される治療用タンパク質のペプチド断片またはペプチド変異体であ
る。さらに具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループに挿入され、長
さが、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも10、少なくとも
11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20
、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、もしくは少なくとも40アミノ酸
のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を
包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのN末端に融合され、長さが、少
なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも10、少なくとも11、少な
くとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なく
とも25、少なくとも30、少なくとも35、もしくは少なくとも40アミノ酸のペプチ
ド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する
。本発明はさらに、ヒト血清アルブミンのC末端に融合され、長さが、少なくと
も７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも
12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25
、少なくとも30、少なくとも35、もしくは少なくとも40アミノ酸のペプチド断片
またはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。
【０１１５】 一般に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのHA由来領域と１つの治
療タンパク質由来領域とを有してもよい。しかし、各タンパク質の複数の領域を
用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製することも可能である。同様
に、１以上の治療用タンパク質を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質を
作製してもよい。例えば、治療用タンパク質をHAのN-およびC末端の両方に融合
させることができる。このような形態では、治療用タンパク質部分は、同じまた
は異なる治療用タンパク質分子でよい。二官能性アルブミン融合タンパク質の構
造は、X-HA-YまたはY-HA-Xとして表示することができる。
【０１１６】 例えば、抗BlyS（商標登録）scFv-HA-IFNα-2b融合物を作製し、抗BlyS（商標
登録）によるIFNα-2bに対する免疫応答をモジュレートすることができる。これ
以外に、二（あるいは多）官能用量のHA融合物、例えば、機能や半減期に応じて
異なる比で、HA-抗BlyS（商標登録）scFv融合物またはその他のHA融合物と混合
した HA-IFNα-2b融合物を作製することもできる。
【０１１７】 また、二または多官能アルブミン融合タンパク質を作製して、HAの反対側の末
端に位置するタンパク質またはペプチドにより、融合物の治療用タンパク質部分
を標的の器官もしくは細胞タイプにターゲッティングすることもできる。
【０１１８】 公知の治療分子の融合物に代わり、典型的には、６、８、12、20もしくは25ま
たはXn（ただし、Xはアミノ酸（aa）であり、ｎは、残基の数に等しい）のラン
ダム化アミノ酸で、かつ、HAのN-、C-またはN-およびC末端、あるいは、HAのド
メイン断片との融合物として構築されたライブラリーであって、考えられるあら
ゆるアミノ酸の組合せが表示されるものをスクリーニングすることにより、上記
ペプチドを得ることができる。この手法の特に有利な点は、ペプチドをHA分子上
でin situで選択できること、従って、該ペプチドの特性を、他のいずれかの方
法で誘導した後HAに結合させたペプチドの場合と同様に変更するのではなく、選
択できることである。
【０１１９】 加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合された部分の間にリンカ
ーペプチドを含有させ、部分間の物理的距離を増加させることによって、治療用
タンパク質が、例えば、そのコグネイト受容体と結合するための接近可能性を最
大化することができる。リンカーペプチドは、その柔軟性または剛性を高めるよ
うなアミノ酸から構成することができる。
【０１２０】 リンカー配列は、プロテアーゼにより、あるいは化学的に切断が可能であり、
これによって、成長ホルモン関連成分が得られる。好ましくは、プロテアーゼは
、宿主により自然に生産されるもので、例えば、S. cerevisiaeプロテアーゼkex
2もしくは同等のプロテアーゼである。
【０１２１】 従って、前述のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、次の式：R1-L
-R2；R2-L-R1；またはR1-L-R2-L-R1（式中、R1は、少なくとも１つの治療用タン
パク質、ペプチドまたはポリペプチド配列であるが、必ずしも同じ治療用タンパ
ク質でなくてもよく、また、Lは、リンカーで、R2は血清アルブミン配列である
）を有するものでよい。
【０１２２】 好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含んでなる本発明のアルブミン融
合タンパク質は、アルブミンに融合していない状態の同じ治療用タンパク質より
貯蔵寿命が長い。貯蔵寿命とは、溶液またはその他の貯蔵組成物中の治療用タン
パク質の治療活性が、過度の治療活性の喪失を起こすことなく、安定している期
間を意味する。治療用タンパク質の多くは、非融合状態では非常に不安定である
。以下に説明するように、これら治療用タンパク質の典型的貯蔵寿命は、本発明
のアルブミン融合タンパク質に組み込んだ場合、顕著に長引かせることができる
。
【０１２３】 貯蔵寿命が「長引いた」または「延長された」本発明のアルブミン融合タンパ
ク質は、同じ貯蔵および取扱い条件を受けた標準型と比較して、優れた治療活性
を示す。標準型は、非融合の全長治療用タンパク質であると考えられる。アルブ
ミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が類似体、変異体である、あるいは
、改変されているか、または、該タンパク質についての完全な配列を含んでいな
い場合には、治療活性の延長を、上記類似体、変異体、改変ペプチドまたは不完
全配列の非融合等価物と比較することができる。例として、本発明のアルブミン
融合タンパク質は、標準型と同じ貯蔵および取扱い条件を受けた場合、所与の時
点で比較すると、標準型の治療活性の約100％、または約105％、110％、120％、
130％、150％もしくは200％以上を保持することができる。
【０１２４】 貯蔵寿命はまた、貯蔵後に保持される治療活性に関して評価し、貯蔵開始時点
の治療活性に基準化することも可能である。長引いた、または延長された治療活
性により呈示されるように、貯蔵寿命が長引いた、または延長された本発明のア
ルブミン融合タンパク質は、同じ条件を受けた同等の非融合治療用タンパク質の
治療活性と比較して、約50％、約60％、70％、80％もしくは90％以上高い治療活
性を保持することができる。例えば、実施例１に記載するように、全長HA配列に
融合されたhGHを含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、様々な温度条件下
で、５週間以上もの間、溶液中の最初の活性の約80％以上を保持することができ
る。
【０１２５】融合タンパク質の発現 本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、細菌のような微生物、あるいは
、ヒトまたは動物細胞系からの分泌により組換え分子として生産することができ
る。好ましくは、ポリペプチドは、宿主細胞から分泌される。我々は、hGHコー
ド配列をHAコード配列の5’末端または3’末端のいずれかに融合することにより
、酵母由来のプロ配列を必要とせずに、酵母からのアルブミン融合タンパク質を
分泌することが可能であることを見出した。これは、他の研究者らが、酵母にお
けるhGHの効率的分泌には、酵母由来のプロ配列が必要であることを見出してい
たことから、驚くべきことであった。
【０１２６】 例えば、Hiramatsuら（App Environ Microbiol 56：2125（1990）；Appl Envi
ron Microbiol 57：2052（1991））は、Mucor pusillusレンニン（rennin）プレ
−プロリーダーにおけるプロ配列のN末端部分が重要であることを見出した。他
の著者は、MFα-1シグナルを用いて、hGHを分泌するに際し、常にMFα-1プロ配
列を挙げた。プロ配列は、分子内シャペロンとして作用することにより、hGHの
フォールディングを助けると考えられていた。本発明は、HAまたはHA断片が、同
じ機能を果たし得ることを明らかにするものである。
【０１２７】 従って、本発明の具体的実施形態は、酵母における分泌を指令するのに有効な
シグナル配列、特に、酵母由来のシグナル配列（特に、酵母宿主に相同的なもの
）をコードするDNA構築物と、本発明の第１の態様の融合分子とを含んでなり、
シグナルと成熟ポリペプチドとの間には酵母由来のプロ配列はない。
【０１２８】 Saccharomyces cerevisiaeインベルターゼシグナルは、酵母由来のシグナル配
列の好ましい実施形態である。
【０１２９】 Poznanskyら（FEBS Lett. 239：18（1988））により作製されたタイプのコン
ジュゲート（個別に作製したポリペプチドを化学的架橋で結合する）は、考慮し
ない。
【０１３０】 本発明はまた、細胞、好ましくは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現
するように形質転換された酵母細胞を含む。形質転換した宿主細胞自体に加えて
、本発明は、栄養素培地における、これら細胞の培養物、好ましくは、モノクロ
ーナル（クローン的に同種）培養物、あるいは、モノクローナル培養物由来の培
養物を考慮する。ポリペプチドを分泌する場合には、上記培地は、細胞と一緒に
ポリペプチドを含有するが、細胞が、ろ過もしくは遠心分離により除去されてい
る場合には、細胞は含まない。多数の公知の発現系を使用することができ、この
ような発現系として、細菌（例えば、大腸菌や枯草菌）、酵母（例えば、サッカ
ロミセスセレビシエ、Kluyveromyces lactisおよびPichia pastoris、糸状真菌
（例えば、アスペルギルス属）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を挙げるこ
とができる。
【０１３１】 アルブミン融合タンパク質の生産に用いられる好ましい酵母菌株は、D88、DXY
1およびBXP10である。D88［leu2-3、leu2-122、can1、pra1、ubc4］は、親株AH2
2his+の誘導体である（DB1としても知られる；例えば、Sleepら、Biotechnology
8：42-46（1990）を参照）。上記株は、leu2突然変異を含んでおり、これは、L
EU2遺伝子を含む２ミクロン単位のプラスミドの栄養要求性選択を可能にする。D
88はまた、グルコース過剰におけるPRB1の抑制解除を示す。PRB1プロモーターは
、通常、グルコースレベルと成長段階をモニターする２つのチェックポイントに
より制御される。このプロモーターは、グルコースが欠失し、かつ定常期に入る
と、野生型酵母において活性化する。株D88は、グルコースによる抑制を示すが
、定常期に入ると誘導を維持する。PRA1遺伝子は、酵母液胞プロテアーゼである
YscAエンドプロテアーゼAをコードし、これが、ERに局在化する。UBC4遺伝子は
、ユビキチン化経路に存在し、ユビキチン依存性分解のために短命および異常な
タンパク質のターゲッティングに関与する。このubc4突然変異を単離することに
より、細胞中の発現プラスミドのコピー数を増加し、プラスミドから発現された
所望のタンパク質の発現レベルを増加させることがわかっている（例えば、国際
公開WO99/00504を参照。尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込む
ものとする）。
【０１３２】 D88の誘導体であるDXY1は、次の遺伝子型を有する：［leu2-3、leu2-122、can
1、pra1、ubc4、ura3::yap3］。D88で単離した突然変異のほかに、この株は、YA
P3プロテアーゼのノックアウトも有する。このプロテアーゼは、ほとんど二塩基
性の残基（RR、RK、KR、KK）の切断を引き起こすが、タンパク質における一塩基
性残基での切断も促進することができる。このyap3突然変異の単離は、全長HSA
生産レベルの上昇をもたらした（例えば、米国特許第5,965,386号およびKerry-W
illiamsら、Yeast 14：161-169（1998）を参照、この文献は、参照により本明細
書に全文を組み込むものとする）。
【０１３３】 BXP10は、次の遺伝子型を有する：leu2-3、leu2-122、can1、pra1、ubc4、ura
3、yap3::URA3、lys2、hsp150::LYS2、pmt1::URA3。DXY1で単離した突然変異の
ほかに、この株は、PMT1遺伝子およびHSP150遺伝子のノックアウトも有する。PM
T1遺伝子は、ドリキル-ホスフェート-D-マンノースタンパク質O-マンノシルトラ
ンスフェラーゼ（Pmt）の進化において保存されたファミリーのメンバーである
。Pmt1pの膜間トポロジーから、これは、O-連結グリコシル化に役割を有する小
胞体の不可欠な膜タンパク質であると考えられる。この突然変異は、HSA融合物
のO-連結グリコシル化を抑制／排除する働きをする（例えば、国際公開WO00/447
72を参照。尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする）
。様々な研究により、イオン交換クロマトグラフィーでは、rHAからのHsp150タ
ンパク質の分離が非効率的であることが明らかにされた。HSP150遺伝子における
突然変異は、潜在的汚染物を除去するが、この汚染物は、標準的精製技法では除
去が困難であることが証明されている。例えば、米国特許第5,783,423号参照。
尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする。
【０１３４】 所望のタンパク質は、通常の方法で、例えば、宿主染色体に挿入されるコード
配列から、あるいは、遊離プラスミド上で生産する。酵母は、通常のいずれかの
方法、例えば、電気穿孔により、所望のタンパク質のコード配列で形質転換する
。電気穿孔による酵母の形質転換方法は、BeckerおよびGuarente（1990）Method
s Enzymol. 194, 182に開示されている。
【０１３５】 好適に形質転換した細胞、すなわち、本発明のDNA構築物を含む細胞は、公知
の技法により確認することができる。例えば、発現構築物の導入により得られる
細胞を増殖させて、所望のポリペプチドを生産することができる。細胞を回収し
、溶解させた後、そのDNA内容物を分析してDNAの存在を調べることができる。そ
の際、Shouthern（1975）J. Mol. Biol. 98, 503またはBerentら（1985）Biotec
h.3、208により記載されているような方法を用いる。あるいは、抗体を用いて、
上清におけるタンパク質の存在を検出することもできる。
【０１３６】 有用な酵母プラスミドベクターとして、pRS403-406およびpRS413-416が挙げら
れ、一般に、Stratagene Cloning Systems（La Jolla, CA 92037, USA）から市
販されている。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は、酵母組込み
プラスミド（YIp）であり、酵母選択マーカーHIS3、7RP1、LEU2およびURA3を含
む。プラスミドpRS413〜416は、酵母動原体プラスミド（Ycps）である。
【０１３７】 酵母での発現用のアルブミン融合タンパク質を作製するのに好ましいベクター
としては、pPPC0005、pScCHSA、pScNHSAおよびpC4:HSAが挙げられ、これらにつ
いては実施例２に詳しく説明する。図４は、基本ベクターとして用いることがで
きるpPPC0005プラスミドのマップを示し、このプラスミドに、治療用タンパク質
をコードするポリヌクレオチドをクローニングすることにより、HA融合物を形成
することができる。これは、PRB1 S. cerevisiaeプロモーター（PRB1p）、融合
リーダー配列（FL）、DNAコードHA（rHA）およびADH1 S. cerevisiaeターミネー
ター配列を含む。融合リーダー配列の配列は、ヒト血清アルブミン（配列番号29
）のシグナルペプチドの最初の19アミノ酸と、接合因子α1プロモーター（SLDKR
、欧州特許出願第387,319号参照。尚、この文献は、参照により本明細書に全文
を組み込むものとする）の最後の５アミノ酸とから構成される。
【０１３８】 プラスミドpPPC0005、pScCHSA、pScNHSAおよびpC4:HSAは、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション（10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 2
0110-2209）に2001年４月11日に寄託され、それぞれ受託番号ATCC 、 、
、および を受けた。酵母でアルブミン融合タンパク質を発現するのに有
用な別のベクターとして、ｐSAC35ベクターがあり、これについては、Sleepら、
BioTechnology 8:42（1990）（参照により本明細書に全文を組み込まれる）に記
載されている。
【０１３９】 相補的付着末端を介してベクターに機能しうる形でDNAを結合する様々な方法
が開発されている。例えば、ベクターDNAに挿入しようとするDNAセグメントに相
補的ホモポリマー領域を付加する。次に、相補的ホモポリマーテール間の水素結
合により、上記ベクターとDNAセグメントを連結して、組換えDNA分子を形成する
。
【０１４０】 １以上の制限部位を含む合成リンカーは、DNAセグメントとベクターとの連結
する別の方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるDNAセ
グメントをバクテリオファージT4DNAポリメラーゼまたは大腸菌DNAポリメラーゼ
Iで処理する。これらの酵素が、3’, 5’-エキソヌクレアーゼ活性をもつ、突出
した一本鎖末端を除去し、その重合活性によって、くぼんだ3’末端を充填する
。
【０１４１】 従って、これら活性の組合せにより、平滑末端のDNAセグメントが生成される
。次に、平滑末端DNA分子の連結反応を触媒することができる酵素（バクテリオ
ファージT4DNAリガーゼなど）の存在下で、上記平滑末端セグメントを、モル大
過剰のリンカー分子と一緒にインキュベートする。従って、反応の産物が、その
末端にポリマーリンカー配列を保有するDNAセグメントである。これらのDNAセグ
メントを適当な制限酵素で切断した後、DNAセグメントのものと適合する末端を
生成する酵素で切断された発現ベクターに連結する。
【０１４２】 多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、International Bi
otechnologies Inc.（New Haven, CT, USA）など、多数の供給源から市販されて
いる。
【０１４３】 例えば、HA変異体を作製しようとする場合、本発明に従いDNAを修飾するのに
望ましい方法は、Saikiら（1988）Science 239, 487-491により開示されている
ポリメラーゼ連鎖反応を用いるものである。この方法では、酵素により増幅しよ
うとするDNAを２つの特定のオリゴヌクレオチドプライマーと隣接させ、これを
増幅DNAに組み込ませる。特定のプライマーは、当業者には公知の方法を用いて
、発現ベクターにクローニングするのに用いることができる制限エンドヌクレア
ーゼ認識部位を含んでいてよい。
【０１４４】 本発明を実施するに際し、アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主と
して有用であると考えられる酵母属の例として、次のものが挙げられる：ピキア
属（以前ハンセヌラ属として分類されていた）、サッカロミセス属、クルイベロ
ミセス属、アスペルギルス属、カンジダ属、トルロプシス属、トルラスポラ属、
シゾサッカロミセス属、サイテロミセス属、パキソレン属、接合酵母菌属、デバ
ロミセス属、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、フミコーラ属、ケカビ、
パンカビ、ヤロウィア属、メチニコウィア属、ロドスポリジウム属、ロイコスポ
リジウム属、ボトリオアスクス属（Botryoascus）、スポリディオボルス属、エ
ンドミコプシス属など。好ましい属は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス
属、クルイベロミセス属、ピキア属およびトルラスポラ属からなる群より選択さ
れたものである。サッカロミセス属種の例として、S. cerevisiae、S. italicus
およびS. rouxiiがある。
【０１４５】 クルイベロミセス属種の例として、K. fragilis、K. lactisおよびK. marxian
usが挙げられる。好適なトルラスポラ属種は、T. delbrueckiiである。ピキア（
ハンセヌラ）属種の例としては、P. angusta（以前はH. polymorpha）、P. anom
ala（以前は、H. anomala）およびP. pastorisがある。S. cerevisiaeの形質転
換方法は、EP 251 744、EP 258 067およびWO90/01063に概要が記載されている。
尚、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１４６】 サッカロミセス属の好ましい種の例として、S. cerevisiae、S. italicus、S.
diastaticus、ならびに、Zygosaccharomyces rouxiiが挙げられる。クルイベロ
ミセス属の好ましい種の例は、K. fragilis、K. lactisである。ハンセヌラの好
ましい種の例としては、H. polymorpha（現在はPichia angusta）、H. anomala
（現在は、Pichia anomala）、およびPichia capsulataである。ピキア属種の好
ましい別の例として、P. pastorisがある。アスペルギルス属の好ましい種の例
として、A. nigerとA. nidulansが挙げられる。ヤロウィア属の好ましい種の例
としては、Y. lipolyticaがある。多くの好ましい酵母種がATCCから入手可能で
ある。例えば、下記の好ましい酵母種がATCCから入手可能であり、アルブミン融
合タンパク質の発現に有用である：サッカロミセスセレビシエハンセン（Hansen
）、テレオモルフ株BY4743 yap3突然変異体（ATCC受託番号4022731）；サッカロ
ミセスセレビシエハンセン（Hansen）、テレオモルフ株BY4743 hsp150突然変異
体（ATCC受託番号4021266）；サッカロミセスセレビシエハンセン（Hansen）、
テレオモルフ株BY4743 pmt1突然変異体（ATCC受託番号4023792）；サッカロミセ
スセレビシエハンセン（Hansen）、テレオモルフ（ATCC受託番号20626；44773；
44774および62995）；Saccharomyces diastaticus Andrews et Gilliland ex va
n der Walt、テレオモルフ（ATCC受託番号62987）；Kluyveromyces lactis（Dom
browski）van der Walt、テレオモルフ（ATCC受託番号76492）；Pichia angusta
（Teunissonら）Kurtzman、Hansenula polymorpha de Morais et Mariaとして寄
託されたテレオモルフ、テレオモルフ（ATCC受託番号26012）；Asperigillus ni
ger van Tieghem、アナモルフ（ATCC受託番号9029）；Asperigillus niger van
Tieghem、アナモルフ（ATCC受託番号16404）；Asperigillus nidulans（Eidam）
Winter、アナモルフ（ATCC受託番号48756）；ならびに、Yarrowia lipolytica（
Wichkerhamら）van der Walt et von Arx、テレオモルフ（ATCC受託番号201847
）。
【０１４７】 サッカロミセスセレビシエの好適なプロモーターとして、PGKI遺伝子、GAL1ま
たはGAL10遺伝子、ならびに、CYCI、PHO5、TRPI、ADHI、ADH2、グリセルアルデ
ヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α接合因子フェロモン、［接合因子フェロ
モン］用の遺伝子に関連するもの、PRBIプロモーター、GUT2プロモーター、GPDI
プロモーター、5’調節領域の部分とその他のプロモーターの5’ 調節領域の部
分とのハイブリッドを含む、あるいは、上流活性化部位を有するハイブリッドプ
ロモーター（例えば、EP-A-258 067のプロモーター）が挙げられる。
【０１４８】 シゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）に用いるのに好適
な調節プロモーターは、Maundrell（1990）J. Biol. Chem. 265、10857-10864に
記載されているnmt遺伝子に由来するチアミン−抑制プロモーター、ならびに、H
offmanおよびWinston（1990）Genetics 124, 807-816に記載されているグルコー
ス抑制jbpl遺伝子プロモーターである。
【０１４９】 外来遺伝子の発現のためにピキア属を形質転換する方法は、例えばCreggら（1
993）、ならびに、様々なフィリップス（Phillips）特許（米国特許第4,857,467
号、参照により本明細書に組み込まれる）に教示されており、ピキア属発現キッ
トは、Invitrogen BV（Leek, Netherlands）、およびInvitrogen Corp.（San Di
ego, California）から市販されている。好適なプロモーターとして、AOX1およ
びAOX2がある。Gleesonら（1986）J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465には、ハ
ンセヌラ属ベクターおよび形質転換に関する情報が記載され、好適なプロモータ
ーは、MOX1とFMD1である。また、EP 361,991号、Fleerら（1991）ならびに、Rho
ne-Poulenc Rorerによるその他の出版物には、クルイベロミセス種において外来
タンパク質を発現させる方法、その際の好適なプロモーターがPGKIであることが
教示されている。
【０１５０】 転写終結シグナルは、転写終結およびポリアデニル化の適正なシグナルを含む
真核生物の遺伝子の3’隣接配列であるのが好ましい。好適な3’隣接配列は、例
えば、用いられる発現制御配列に自然に連結した遺伝子の配列、すなわち、プロ
モーターと一致するものでよい。あるいは、これらの配列は異なっていてもよく
、その場合、サッカロミセスセレビシエADHI遺伝子の終結シグナルが好ましい。
【０１５１】 所望のアルブミン融合タンパク質は、初めに分泌リーダー配列で発現させるこ
とができ、このリーダー配列は、選択された酵母で有効な任意のリーダーでよい
。サッカロミセスセレビシエで有用なリーダーとして、接合因子αポリペプチド
（MFα-1）に由来するものと、EP-A-387 319のハイブリッドリーダーがある。こ
のようなリーダー（またはシグナル）を酵母で切断した後、成熟アルブミンを周
囲培地へと放出させる。さらにこのようなリーダーとして、JP 62-096086（9110
36516として特許された）に開示されたサッカロミセスセレビシエイベルターゼ
（SUC2）のリーダー、酸性ホスファターゼ（PH05）、MFα-1の前配列、０グルカ
ナーゼ（BGL2）およびキラー毒素；S. diastaticusグルコアルニラーゼII；S. c
arlsbergensisα-ガラクトシダーゼ（MEL1）；K. lactisキラー毒素；ならびに
、カンジダグルコアルニラーゼなどが挙げられる。
【０１５２】アルブミン融合タンパク質の別の組換え的および合成的生産方法 本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含むベクター、宿主細胞、ならびに、合成および組換え技法によるアルブ
ミン融合タンパク質の生産に関する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミ
ド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターでよい。レトロウイルスベクター
は、複製能力または複製欠損性のいずれでもよい。後者の場合、ウイルス増殖は
、一般に、宿主細胞を補う際にしか起こらない。
【０１５３】 本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主に
おける増殖の選択マーカーを含むベクターと結合することができる。一般に、プ
ラスミドベクターをリン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物、あるいは、荷電脂
質を含む複合体中に導入する。ベクターがウイルスである場合には、適当なパッ
ケージング細胞系を用いて、in vitroでパッケージングした後、宿主細胞に形質
転換することができる。
【０１５４】 ポリヌクレオチドインサートは、適当なプロモーターに機能しうる形で結合し
なければならない。このようなプロモーターとして、ファージλPLプロモーター
、大腸菌lac、trp、phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモー
ター、ならびに、レトロウイルスLTRのプロモーターが挙げられるが、これらに
限定されるわけではない。その他の好適なプロモーターは、当業者には公知であ
ろう。発現構築物は、さらに、転写開始、終結のための部位を有し、しかも、転
写された領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでいる。構築物が発
現した転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの開始地点に翻訳開始コ
ドンを、また、その終了地点に適切に位置する終結コドン（UAA、UGAまたはUAG
）を含んでいるのが好ましい。
【０１５５】 前述のように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むのが好
ましい。このようなマーカーとして、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、G418、グルタ
ミンシンターゼ、あるいは、真核細胞培養のためのネオマイシン耐性、ならびに
、大腸菌その他の細菌での培養のためのテトラサイクリン、カナマイシンまたは
アンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。好適な宿主の代表的例として、限定する
ものではないが、下記のものが挙げられる：大腸菌、ストレプトミセスおよびネ
ズミチフス菌細胞のような細菌細胞；酵母細胞（例えば、サッカロミセスセレビ
シエまたはPichia pastoris（ATCC受託番号201178）のような真菌細胞；ショウ
ジョウバエS2およびSpodoptera Sf9細胞のような昆虫細胞；CHO、COS、NSO、293
、およびバウズ（Bowes）黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに、植物細胞。
上記宿主細胞のための好適な培養培地および条件は、当技術分野で公知である。
【０１５６】 細菌で用いるのに好ましいベクターとして、下記のものが挙げられる：QIAGEN
Inc.から入手可能なpQE70、pQE60およびpQE-9；Stratagene Cloning Sytems, I
nc.から入手可能なpBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a
、pNH18A、pNH46A；ならびに、Pharmacia Biotech, Inc. から入手可能なptrc99
a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。好ましい真核生物ベクターとしては、
下記のものが挙げられる：Stratageneから入手可能なpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、
pXT1およびpSG；ならびに、Pharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSGおよびp
SVL。酵母系で用いるのに好ましい発現ベクターとしては、限定するものではな
いが、pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、p
PIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K.およびPAO815（すべて、Invitro
gen、Carlbad, CAから入手可能）が挙げられる。その他の好適なベクターは、当
業者には明らかであろう。
【０１５７】 一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドをシグナル配列に融合することができ、このシグナル配列が、原核または
真核細胞の特定のコンパートメントへの本発明のタンパク質の局在化を指令する
および／または原核または真核細胞からの本発明のタンパク質の分泌を指令する
。例えば、大腸菌では、周辺腔へのタンパク質の発現を指令させようとすること
ができる。細菌の周辺腔へのポリペプチドの発現を指令するために、本発明のア
ルブミン融合タンパク質と融合させることができるシグナル配列またはタンパク
質（もしくはその断片）の例として、限定するものではないが、pelBシグナル配
列、マルトース結合タンパク質（MBP）シグナル配列、MBP、ompAシグナル配列、
ペリプラズム大腸菌非耐熱性エンテロトキシンB-サブユニットのシグナル配列、
ならびに、アルカリホスファターゼのシグナル配列が挙げられる。融合タンパク
質の構築用に、タンパク質の局在化を指令する数種のベクターが市販されており
、例えば、New England Biolabsから入手可能なpMALシリーズのベクター（特に
、pMAL-pシリーズ）がある。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドア
ルブミン融合タンパク質をpelBペクチン酸リアーゼシグナル配列と融合すること
により、グラム陰性菌におけるポリペプチドの発現および精製の効率を高めるこ
とができる。米国特許第5,576,195号および第5,846,818号を参照されたい。尚、
その内容は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする。
【０１５８】 哺乳動物細胞での分泌を指令するために、本発明のアルブミン融合タンパク質
と融合させることができるシグナルペプチドの例として、限定するものではない
が、下記のものを挙げることができる：MPIF-1シグナル配列（例えば、GenBank
登録番号AAB51134のアミノ酸1-21）、スタンニオカルシン（stanniocalcin）シ
グナル配列（MLQNSAVLLLLVISASA、配列番号34）、ならびに、共通シグナル配列
（MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG、配列番号35）。バキュロウイルス発現系と一緒に用
いることができる好適なシグナル配列は、gp67シグナル配列（例えば、GenBank
受諾番号AAA72759のアミノ酸１〜19）である。
【０１５９】 選択マーカーとしてグルタミンシンターゼ（GS）またはDHFRを用いるベクター
は、それぞれ、メチオニンスルホキシミンまたはメトトレキセートの薬剤存在下
で、増幅させることができる。グルタミンシンターゼを用いたベクターの利点は
、グルタミンシンターゼ陰性である細胞系（例えば、ネズミ骨髄腫細胞系、NSO
）が利用できることである。グルタミンシンターゼ発現系は、別の阻害物質を賦
与して、内因性遺伝子の機能を阻止することにより、グルタミンシンターゼを発
現する細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞）でも機能させ
ることができる。グルタミンシンターゼ発現系およびその成分については、次に
挙げるPCT公開：WO87/04462；WO86/05807；WO89/01036；WO89/10404；およびWO9
1/06657（これらの内容は、参照により本明細書に全文を組み込む）に詳細に記
載されている。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Lonza Biologic
s. Inc.（Potsmouth, NH）から取得が可能である。ネズミ骨髄腫細胞でGS発現系
を用いるモノクローナル抗体の発現および生産については、Bio/technology 10
：169（1992）およびBibliaおよびRobinson Bioteshnol. Prog. 11：１（1995）
（これらの内容は、参照により本明細書に全文を組み込む）に記載されている。
【０１６０】 本発明はまた、本明細書に記載する前記ベクター構築物を含む宿主細胞に関し
、加えて、当業者には公知の技法を用いて、１以上の異種制御領域（例えば、プ
ロモーターおよび／またはエンハンサー）と操作可能に会合した本発明のヌクレ
オチド配列を含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒ
ト由来の細胞）などの高等真核生物細胞、または、酵母細胞のような下等真核生
物細胞でよい。あるいは、宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞でもよい
。宿主株は、挿入された遺伝子配列の発現を所望の特定様式でモジュレートする
、あるいは、遺伝子産物を所望の特定様式で修飾およびプロセッシングするもの
を選択する。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質の存在下で高め
ることができるため、遺伝子工学的に操作したポリペプチドの発現を制御するこ
とができる。さらに、様々な宿主細胞が、タンパク質の翻訳後プロセッシングお
よび修飾（例えば、リン酸化、切断）のための特性および特定の機構を備えてい
る。好適な細胞系を選択することにより、発現させる外来タンパク質の所望の修
飾およびプロセッシングを確実に達成することができる。
【０１６１】 宿主細胞への本発明の核酸および核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトラ
ンスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン系
脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、もしくはその他の
方法により実施することができる。このような方法は、多数の標準的実験マニュ
アル（Davisら、Basic methods In Molecular Biology（1986））に記載されて
いる。特に、組換えベクターを欠失した宿主細胞によって、本発明のポリペプチ
ドを実際に発現させることが考えられる。
【０１６２】 本明細書に記載するベクター構築物を含む宿主細胞を包含する以外に、本発明
はまた、脊椎動物、特に哺乳動物に由来する初代、二代目、および不死化宿主細
胞を包含する。尚、この宿主細胞は操作により、内因性の遺伝材料が欠失または
置換されており（例えば、治療用タンパク質に対応するコード配列を、治療用タ
ンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質で置換する）、および／または遺
伝材料を含有する（例えば、治療用タンパク質に対応する本発明のアルブミン融
合タンパク質のような異種ポリヌクレオチド配列を含有させる）。内因性ポリヌ
クレオチドと操作可能に会合した遺伝材料は、内因性ポリヌクレオチドを活性化
、改変および／または増幅することができる。
【０１６３】 さらに、当技術分野では公知の技法を用いて、異種ポリヌクレオチド（例えば
、アルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはその断片また
は変異体）および／または異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／または
エンハンサー）と、治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列
とを、相同組換えにより、操作可能に会合することができる（例えば、1997年６
月24日に発行された米国特許第5,641,670号；国際公開番号WO96/29411；国際公
開番号WO94/12650；Kollerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：8932-8935（19
89）；ならびに、Zijilstraら、Nature 342：435-438（1989）を参照。尚、これ
ら文献の各々は、参照により本発明に全文を組み込むものとする）。
【０１６４】 本発明のアルブミン融合タンパク質は、公知の方法により、組換え細胞培養物
から回収および精製することができる。このような方法として、硫酸アルミニウ
ムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフ
ィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラ
フィー、疎水性荷電相互作用クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーが挙げられる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を
精製に用いる。
【０１６５】 好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するもの
ではないが、以下に挙げるようなアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製
する：Q-セファロース、DEAEセファロース、poros HQ、poros DEAE、Toyopearl
Q、Toyopearl QAE、Toyopearl QEAE、Resource/Source QおよびDEAE、Fractogel
QおよびDEAEでのクロマトグラフィー。
【０１６６】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するもので
はないが、以下に挙げるようなカチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製す
る：SP-セファロース、CMセファロース、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、
トーヨーパールCM、Resource/Source SおよびCM、Fractogel SおよびCMカラム、
ならびに、それらの同等物。
【０１６７】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するもので
はないが、以下に挙げるような疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製
する：フェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル−セファロース、poros
フェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル、トーヨーパールフェニル、ブ
チル、メチル、オクチル、ヘキシルResource/Sourceフェニル、ブチル、メチル
、オクチル、ヘキシル、フラクトゲルフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘ
キシルカラム、ならびに、それらの同等物。
【０１６８】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するもので
はないが、以下に挙げるようなサイズ排除クロマトグラフィー：セファロースS1
00、S200、S300、スーパーデックス樹脂カラム、およびこれらの同等物、を用い
て精製する。
【０１６９】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するもので
はないが、以下に挙げるアフィニティークロマトグラフィー：HSAまたは「融合
標的」分子のいずれかについて選択性である、模擬色素（Mimetic Dye）アフィ
ニティー、ペプチドアフィニティーおよび抗体アフィニティーカラム、を用いて
精製する。
【０１７０】 好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、上に挙げた１
種以上のクロマトグラフィーを用いて精製する。他の好ましい実施形態では、本
発明のアルブミン融合タンパク質は、以下に挙げる１種以上のクロマトグラフィ
ーカラム：QセファロースFFカラム、SPセファロースFFカラム、Qセファロース高
性能カラム、ブルーセファロースFFカラム、ブルーカラム、フェニルセファロー
スFFカラム、DEAEセファロースFF、もしくはメチルカラムを用いて精製する。
【０１７１】 加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、国際公開番号WO00/44772（参
照により、その全文を本明細書に組み込む）に記載された方法を用いて精製して
もよい。当業者であれば、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製に用いるた
め、上記方法を容易に変更することができるだろう。
【０１７２】 本発明のアルブミン融合タンパク質は、下記のもの、化学的合成工程の産物；
例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞から、組換え技法によ
り生産した産物から回収することができる。組換え工程に用いた宿主に応じて、
本発明のポリペプチドをグルコシル化、あるいは、非グルコシル化することがで
きる。加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主媒介過程の結果とし
て、開始改変メチオニン残基を含んでいる場合もある。従って、翻訳開始コドン
によりコードされるN-末端メチオニンは、一般に、すべての真核細胞における翻
訳後に、あらゆるタンパク質から高い効率で除去されることが当技術分野では知
られている。いくつかのタンパク質については、大部分のタンパク質上のN末端
メチオニンもほとんどの原核生物で効率的に除去されるが、N末端メチオニンを
共有結合するアミノ酸の種類によっては、この原生生物除去工程は不十分である
。
【０１７３】 一実施形態では、酵母ピチア・パストリス（Pichia pastoris）を用いて、真
核生物系において本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させる。ピチア・パ
ストリスは、その唯一の炭素源として、メタノールを代謝することができるメチ
ロトローフ酵母である。メタノール代謝経路における主な段階は、O2を用いた、
メタノールのホルムアルデヒドへの酸化である。この反応は、酵素アルコールオ
キシダーゼにより触媒される。メタノールをその唯一の炭素源として代謝するた
めに、ピチア・パストリスは、部分的には、O2に対するアルコールオキシダーゼ
のアフィニティーが比較的低いために、高レベルのアルコールオキシダーゼを産
生しなければならない。その結果、主な炭素源としてメタノールに依存する生育
培地では、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子のうち一方（AOX1）のプロモー
ター領域が非常に活性が高い。メタノールの存在下で、AOX1遺伝子から生産され
たアルコールオキシダーゼは、ピチア・パストリスの全可溶性タンパク質の約30
％にまで及ぶ。Ellis, S. B.ら、Mol. Cell. Biol. 5：1111-21（1985）；Koutz
, P. J.ら、Yeast 5：167-77（1989）；Tchopp, J. F.ら、Nucl. Acids Res. 15
：3859-76（1987）を参照。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドのよう
な異種コード配列は、AOX1調節配列の全部または一部の転写調節を受けて、メタ
ノールの存在下で生育させたピチア酵母で、極めて高いレベルで発現する。
【０１７４】 一例では、主に”Pichia Protocols：Methods in Molecular Biology”, D.R.
HigginsおよびJ. Cregg編、The Humana Press, Totowa, NJ, 1998に記載されて
いるように、プラスミドベクターpPIC9Kを用いて、ピチア酵母系において、本明
細書に記載した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするDNAを発現させ
る。この発現ベクターにより、多重クローニング部位の上流に位置するPichia p
astorisアルカリホスファターゼ（PHO）分泌シグナルペプチド（すなわち、リー
ダー）に連結された強力なAOX1プロモーターによって、本発明のポリペプチドの
発現および分泌が可能になる。
【０１７５】 当業者には容易に理解されるように、考案した発現構築物が、適切に位置した
転写、翻訳、分泌（所望であれば）用のシグナルや、必要に応じてフレーム内AU
Gなどを提供するのであれば、pPIC9Kの代わりに多数の他の酵母ベクターを用い
ることができ、例えば、pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pG
APZα、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、およびPAO815が挙げら
れる。
【０１７６】 別の実施形態では、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクター（例えば、
pGAPZまたはpGAPZα）にクローニングした後、メタノールの不在下で酵母培養物
を生育させることにより、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコード
するポリヌクレオチドのような異種コード配列の高レベル発現を達成することが
できる。
【０１７７】 さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者には公知の技法を用い
て、化学的に合成することができる（例えば、Creighton, 1983, Proteins - St
ructures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co. N.Y.、およびHunkap
illerら、Nature, 310：105-111（1984））。例えば、ペプチド合成装置を用い
て、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドを合成することができる。また
、所望であれば、古典的アミノ酸以外のアミノ酸または化学的アミノ酸類似体を
、置換または付加物としてポリペプチド配列に導入してもよい。、古典的アミノ
酸以外のアミノ酸として、限定するものではないが、共通アミノ酸のD-異性体、
2,4-ジアミノブチル酸、a-アミノイソブチル酸、4-アミノイソブチル酸、Abu、2
-アミノブチル酸、g-Abu、e-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソブチ
ル酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドキ
シプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチ
ルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、
b-アラニン、フルオロ−アミノ酸；b-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-
メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸；ならびに、一般にアミノ酸類似体
など。さらに、アミノ酸は、D（右旋性）またはL（左旋性）のいずれでもよい。
【０１７８】 本発明は、公知の保護／遮断基、タンパク質分解切断、抗体分子またはその他
の細胞リガンドとの連結などを用いた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、誘導体化により、それぞれ別様に修飾される本発明のアルブ
ミン融合タンパク質を包含する。多数の化学的修飾のいずれも公知の技法により
実施することができ、このような技法として、限定するものではないが、臭化シ
アン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による
特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存
在下での代謝合成などが挙げられる。
【０１７９】 本発明に包含される別の翻訳後修飾として、例えば、N-連結またはO-連結炭水
化物鎖、N末端（またはC末端）のプロセッシング、化学成分とアミノ酸骨格との
結合、N-連結またはO-連結炭水化物鎖の化学的修飾、ならびに、原核生物宿主細
胞発現の結果としてのN末端メチオニン残基の付加または欠失。アルブミン融合
タンパク質を、酵素、蛍光、同位体またはアフィニティー標識などの検出可能な
標識で修飾することにより、該タンパク質の検出および単離を可能にすることも
できる。
【０１８０】 好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、βガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビ
ジン／ビオチン；好適な蛍光材料の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイ
ン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルア
ミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。また
、発光材料の例として、ルミノールがあり、好適な放射性材料の例としては、ヨ
ウ素（121I、123I、125I、131I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3 H）、インジウム（111In、112In、113mIn、115mIn）、テクネチウム（99Tc、99 m Tc）、タリウム（201Ti）、ガリウム（68Ga、67Ga）、パラジウム（103Pd）、
モリブデン（99Mo）、キセノン（133Xe）、フッ素（18F）、153Sm、177Lu、159G
d、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、お
よび97Rhが挙げられる。
【０１８１】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片もし
くは変異体を、マクロサイクル（macrocyclic）キレート剤と結合させるが、該
キレート剤は、ポリペプチドに対する放射性金属イオン（限定するものではない
が、177Lu、90Y、166Ho、および153Smなど）と会合する。好ましい実施形態では
、マクロサイクルキレート剤と会合する放射性金属イオンは、111Inである。別
の好ましい実施形態では、マクロサイクルキレート剤と会合する放射性金属イオ
ンは、90Yである。特定の実施形態では、マクロサイクルキレート剤は、1,4,7,1
0-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-テトラ酢酸（DOTA）である
。別の特定の実施形態では、DOTAは、リンカー分子を介して、本発明の抗体また
はそのフラグメントと結合する。DOTAをポリペプチドにコンジュゲートさせるの
に有用なリンカー分子の例は、当業者には一般に知られており、例えば、DeNard
oら、Clin Cancer Res. 4(10)：2483-90（1998）；Petersonら、Bioconjug. Che
m. 10(4)：553-7（1997）；ならびに、Zimmermanら、Nucl. Med. Biol. 26(8)：
943-50（1999）（すべて、参照により本明細書にその全文を組み込む）を参照さ
れたい。
【０１８２】 既述したように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、翻訳後プロセッシン
グのような自然の過程、あるいは、当業者には公知の化学修飾技法のいずれで修
飾してもよい。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドにおいて、同じまたは
まちまちの度合いで存在してもよいことは理解されよう。本発明のポリペプチド
は、例えば、ユビキチン化により、分枝していてもよいし、分枝を伴なう、もし
くは伴なわない環状をしていてもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプ
チドは、翻訳後の天然のプロセッシングで生じたものでも、合成方法によって得
られたものでもよい。修飾としては、下記のものが挙げられる：アセチル化、ア
シル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合
、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、結晶化、ジスルフィド
結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸
塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、
ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペギル化、タンパ
ク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫
酸化、アルギニル化やユビキチン化のようなタンパク質への転移RNA媒介による
アミノ酸添加（例えば、PROTEINS − STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 第
2版、T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York（1993）；POST-
TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson編、Academ
ic Press, New York、第１〜12頁（1983）；Seifterら、Meth. Enzymol. 182：6
26-646（1990）；Rattanら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 663：48-62（1992））。
【０１８３】 治療用タンパク質またはその断片もしくは変異体と結合する本発明のアルブミ
ン融合タンパク質および抗体をペプチドのようなマーカー配列に融合することに
より、精製を容易にすることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ
酸配列は多く市販されているが、中でも、pQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Et
on Avenue, Chatsworth, CA, 91311）に賦与されるタグのようなヘキサ−ヒスチ
ジンペプチドが挙げられる。Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：821-82
4（1989）に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タン
パク質の簡便な精製を可能にする。精製に有用なその他のペプチドタグとして、
限定するものではないが、インフルエンザ赤血球凝集素に由来するエピトープに
対応する”HA”タグ（Wilsonら、Cell 37：767（1984））、ならびに、”フラッ
グ”タグがある。
【０１８４】 さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞毒素（例えば、細胞分裂
抑制または細胞致死因子）、治療薬または放射性金属イオン（例えば、213Biの
ようなα放射体）とコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷
害因子は、細胞に有害なあらゆる因子を含む。例として、パクリタキソール、サ
イトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エ
トポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソ
ルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロ
ン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルコ
コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、お
よびプロマイシン、ならびに、それらの類似体または相同体が挙げられる。治療
薬としては、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：抗代謝物（例
えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、サイタラビン
、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロールエタ
ミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）およびロ
ムスチン（CCNU）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール
、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、ならびに、シス−ジクロロジアミン白
金（II）（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシ
ン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダク
チノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、
ならびに、アントラマイシン（AMC））、ならびに、抗有糸分裂剤（例えば、ビ
ンクリスチンおよびビンブラスチン）。
【０１８５】 本発明のコンジュゲートを用いて、所与の生物学的応答を修飾することができ
るが、治療薬または薬剤が、古典的化学的治療剤に限定されると解釈すべきでは
ない。例えば、薬剤成分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプ
チドでよい。このようなタンパク質として、例えば、下記のものを挙げることが
できる：アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素
などの毒素；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成
長因子、血小板に由来する成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ア
ポトーシス因子、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I（国際公開番号WO97/33899を
参照）、AIM II（国際公開番号WO97/34911を参照）、Fasリガンド（Takahashiら
、Int. Immunol., 6：1567-1574（1994））、VEGI（国際公開番号WO99/23105を
参照）、血栓因子または抗血管新生因子、例えば、アンジオスタチンまたはエン
ドスタチン；あるいは、生体応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイ
キン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（
G-CSF）、ならびに、その他の成長因子など。このような治療成分をタンパク質
（例えば、アルブミン融合タンパク質）にコンジュゲートするための技法は、当
技術分野ではよく知られている。
【０１８６】 また、アルブミン融合タンパク質を固体支持体に結合させることもでき、これ
は、本発明のアルブミン融合タンパク質が結合する、もしくは該タンパク質に結
合する、あるいは、該タンパク質と会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは
精製に特に有用である。このような固体支持体として、限定するものではないが
、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポ
リビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０１８７】 治療成分をコンジュゲートした、またはしていないアルブミン融合タンパク質
を単独、もしくは細胞傷害因子および／またはサイトカインと組み合わせて、治
療薬として投与することができる。
【０１８８】 さらに、本発明により、ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の増加
、あるいは、免疫原性の低下という別の利点をもたらす、本発明のアルブミン融
合タンパク質の化学的に修飾した誘導体が提供される（米国特許第4,179,337号
を参照）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレン
グリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、
デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することが
できる。アルブミン融合タンパク質は、分子内のランダム位置、あるいは、分子
内の所定の位置のいずれかで修飾されていてもよく、１、２または３以上の化学
的成分と結合していてもよい。
【０１８９】 上記ポリマーは、どんな分子量のものでもよく、分枝または非分枝のいずれで
もよい。ポリエチレングリコールについて、取扱いおよび製造を容易にするのに
好ましい分子量は、約１kDa〜約100 kDa（「約」という用語は、ポリエチレング
リコール調製物中においては、記載した分子量より多いか、または少ない分子が
存在することを意味する）の範囲にある。所望する治療プロフィール（例えば、
所望する持続放出時間、効果、もしあれば、生物活性、取扱いの容易さ、抗原性
の程度または欠如、ならびに、ポリエチレングリコールが治療用タンパク質また
は類似体に及ぼすその他既知の影響）に応じて、その他のサイズを用いてもよい
。例えば、ポリエチレングリコールは、下記のような平均分子量を有していてよ
い：約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、55
00、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,0
00、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,5
00、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,0
00、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,0
00、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、または100,000 kDa。
【０１９０】 既述のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造をしているものでよい。
分枝ポリエチレングリコールについては、例えば、米国特許第5,643,575号；Mor
purgoら、Appl. Biochem. Biotechnol. 56：59-72（1996）；Vorobjevら、Nucle
osides Nucleotides 18：2745-2750（1999）；ならびに、Calicetiら、Bioconju
g. Chem. 10：638-646（1999）に記載されている。尚、これらの文献はすべて、
参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１９１】 ポリエチレングリコール分子は、タンパク質が機能または抗原ドメインに及ぼ
す影響を考慮しながら、該タンパク質と結合しなければならない。当業者が利用
可能な多数の結合方法があり、例えば、EP 0 4010 384（PEGをG-CSFに結合）（
参照により本明細書に組み込む）が挙げられる。また、塩化トレシルを用いたGM
-CSFのPEG化（pegylation）を記載している、Malikら、Exp. Hematol. 20：1028
-1035（1992）も参照されたい。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミ
ノまたはカルボキシル基のような反応基を介したアミノ酸残基により、共有結合
させることができる。反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合でき
る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基として、リシン残基およびN末
端アミノ酸残基が挙げられ；遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基としては
、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびC末端アミノ酸残基が挙げら
れる。スルフヒドリル基は、ポリエチレングリコール分子を結合する反応基とし
ても用いることができる。治療目的には、N末端またはリシン基での結合のよう
なアミノ基での結合が好ましい。
【０１９２】 すでに示したように、ポリエチレングリコールは、多数のアミノ酸残基のいず
れかとの連結を介して、タンパク質に結合させることができる。例えば、ポリエ
チレングリコールは、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ま
たはシステイン残基との共有結合を介してタンパク質に結合させることができる
。１以上の反応ケミストリーを用いて、ポリエチレングリコールを、タンパク質
の特定のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸、またはシステイン）と、もしくはタンパク質の１種以上のアミノ酸残基
（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、
ならびに、これらの組合せ）と結合させることができる。
【０１９３】 具体的に、N末端で化学的に修飾されたタンパク質が所望される場合もある。
本発明の組成物の例として示すポリエチレングリコールを用いて、（分子量、分
枝などの）さまざまなポリエチレングリコール分子から、反応混合物におけるポ
リエチレングリコール分子とタンパク質（ポリペプチド）分子の比率、実施しよ
うとするペギル化の種類、ならびに、選択したN末端ペギル化タンパク質を取得
する方法を選択することができる。N末端ペギル化調製物を取得する（すなわち
、必要に応じて、この成分を他のモノペギル化成分から分離する）方法は、ペギ
ル化タンパク質分子の集団からN末端ペギル化物質を精製することからなる。N末
端修飾で化学的に修飾された選択性タンパク質は、還元的アルキル化によって達
成することができる。これは、特定のタンパク質での誘導体化に使用可能な各種
一次アミノ基（リシン対N末端）の示差反応性を利用するものである。適した反
応条下で、ポリマーを含むカルボニル基を有するN末端でのタンパク質の実質的
に選択性の誘導体化が達成される。
【０１９４】 前述のように、本発明のアルブミン融合タンパク質ペギル化は、複数の手段を
用いて達成できる。例えば、ポリエチレングリコールを直接、または介在リンカ
ーにより、アルブミン融合タンパク質に結合させることができる。ポリエチレン
グリコールをタンパク質に結合させるリンカーなしの方法は、Delgadoら、Crit.
Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9：249-304（1992）；Francisら、Intern. J.
of Hematol. 68：1-18（1998）；米国特許第4,002,531号；米国特許第5,349,05
2号；WO95/06058；ならびに、WO98/32466（すべて、参照により本明細書に組み
込む）に記載されている。
【０１９５】 介在リンカーなしにポリエチレングリコールを直接アミノ酸残基に結合させる
方法の１つでは、トレシル化（tresylated）MPEGを用いる。このMPEGは、トレシ
ル塩化物（CISO2CH2CF3）を用いて、モノメトキシポリエチレングリコール（MPE
G）を修飾することにより、生成される。タンパク質とトレシル化MPEGとの反応
後、ポリエチレングリコールをタンパク質のアミン基に直接結合させる。従って
、本発明は、本発明のタンパク質を2,2,2-トリフルオロエタンスルホニル基を有
するポリエチレングリコール分子と反応させることによって生成されるタンパク
質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含む。
【０１９６】 また、多数の様々な介在リンカーを用いて、ポリエチレングリコールをタンパ
ク質に結合することもできる。例えば、米国特許第5,612,460号（その全文を参
照により本明細書に組み込む）は、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合
するためのウレタンリンカーを開示している。また、リンカーによりポリエチレ
ングリコールをタンパク質に結合させたタンパク質−ポリエチレングリコールは
、MPEG-スクシン酸スクシンイミジル、1,1’-カルボニルジイミダゾールで活性
化したMPEG、MPEG-2,4,5-炭酸トリクロロペニル、MPEG-p-炭酸ニトロフェノール
、ならびに、様々なMPEG-スクシン酸塩誘導体などの化合物とタンパク質の反応
によっても生成することができる。上記以外にも、ポリエチレングリコールをタ
ンパク質に結合するための多数のポリエチレングリコール誘導体および反応ケミ
ストリーが、国際公開番号WO98/32466（その全文を参照により本明細書に組み込
む）に記載されている。本明細書に記載する反応ケミストリーを用いて、生成さ
れたペギル化タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。
【０１９７】 本発明の各アルブミン融合タンパク質に結合させるポリエチレングリコール成
分の数（すなわち、置換度）も同様に様々である。例えば、本発明のペギル化タ
ンパク質は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、12、15、17
、20個以上のポリエチレングリコール分子と結合させることができる。同様に、
平均置換度は、タンパク質１分子当たり、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５
〜７、６〜８、７〜９、８〜10、９〜11、10〜12、11〜13、12〜14、13〜15、14
〜16、15〜17、16〜18、17〜19、もしくは18〜20個の範囲のポリエチレングリコ
ール分子である。置換度を決定する方法は、例えば、Delgadoら、Crit. Rev. Th
era. Drug Carrier Sys. 9：249-304（1992）に記載されている。
【０１９８】 本発明のポリペプチドは、標準的方法により、化学的合成物および組換え細胞
培養物から回収および精製することができる。このような方法として、限定する
ものではないが、硫酸アルミニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンま
たはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙
げられる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を精製に用
いる。単離および／または精製中、ポリペプチドが変性した場合には、タンパク
質を再生する公知の方法を用いて、活性コンホメーションを再生することも可能
である。
【０１９９】 本発明のアルブミン融合タンパク質の存在および量は、当技術分野では公知の
免疫アッセイ法であるELISAを用いて決定することができる。本発明のアルブミ
ン融合タンパク質を検出／定量するのに有用なELISAプロトコルの１つは、下記
の段階を含んでなる：ELISAプレートを抗ヒト血清アルブミン抗体でコーティン
グし、プレートをブロッキングすることにより非特異的結合を阻止し、ELISAプ
レートを洗浄し、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む溶液（１以上の異な
る濃度）を添加し、次に、検出可能な標識に結合した二次抗治療用タンパク質特
異的抗体（本明細書に記載した、あるいは、当業者には公知の）を添加した後、
二次抗体の存在を検出する。上記プロトコルの別の形態では、ELISAプレートを
抗治療用タンパク質特異的抗体でコーティングし、標識された二次試薬は、抗ヒ
トアルブミン特異的抗体でよい。
【０２００】ポリヌクレオチドの使用 本明細書に記載したポリヌクレオチドの各々は、試薬として様々な方法で用い
ることができる。以下の記載は、例示として考えるべきであり、公知の技法を使
用している。
【０２０１】 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を調製する
のに有用である。以下にさらに詳しく説明するように、本発明のポリヌクレオチ
ド（アルブミン融合タンパク質をコードする）を、遺伝子工学に有用な組換えDN
A法に用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドによってコードされるアルブミン融合タンパク質を発現する細胞、細胞系、ま
たは組織を作製することができる。
【０２０２】 本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療の目的
の１つは、欠陥遺伝子を有する生物に、正常遺伝子を挿入することにより、遺伝
子欠陥を修正することである。本発明で開示されたポリヌクレオチドは、極めて
正確に、このような遺伝子欠陥をターゲッティングする手段を提供する。もう１
つの目的は、宿主ゲノムには存在しない新しい遺伝子を挿入し、これにより、宿
主細胞に新しい特性を形成することである。本発明が包含する遺伝子治療のその
他の非制限的例示について、さらに詳細が本明細書に記載されている（例えば、
「遺伝子治療」と題する節、ならびに、実施例17および18を参照）。
【０２０３】ポリペプチドの使用 本明細書に記載したポリペプチドの各々は、様々な方法で用いることができる
。以下の記載は、例示として考えるべきであり、公知の技法を使用している。
【０２０４】 本発明のアルブミン融合タンパク質は、組織の識別（例えば、ABC免疫ペルオ
キシダーゼ（Hsuら、J. Histochem. Cytochem. 29：577-580（1981）のような免
疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）のための
免疫プローブを提供する上で有用である。
【０２０５】 アルブミン融合タンパク質を用いて、生物学的サンプルにおけるポリペプチド
のレベルをアッセイすることができ、その際、当業者には公知の伝統的免疫組織
学的方法を用いる（例えば、Jalkanenら、J. Cell. Biol. 101：976-985（1985
）；Jalkanenら、J. Cell. Biol. 105：3087-3096（1987））。タンパク質遺伝
子発現を検出するのに有用なその他の方法として、酵素結合免疫吸着アッセイ（
ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）のような免疫アッセイが挙げられる
。好適なアッセイ標識は、当技術分野には公知であり、グルコースオキシダーゼ
のような酵素標識；ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、炭素（14C）、イオウ
（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（115mIn、113mIn、112In、111In）、
テクネチウム（99Tc、99mTc）、タリウム（201Ti）、ガリウム（68Ga、67Ga）、
パラジウム（103Pd）、モリブデン（99Mo）、キセノン（133Xe）、フッ素（18F
）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、1 88 Re、142Pr、105Rh、および97Ruのような放射性同位元素；ルミノールのような
発光標識；ならびに、フルオレセインやローダミンのような蛍光標識、ならびに
、ビオチンが挙げられる。
【０２０６】 本発明のアルブミン融合タンパク質は、イメージングによりin vivoで検出す
ることも可能である。タンパク質のin vivoイメージング用の標識またはマーカ
ーは、Ｘ線撮影、核磁気共鳴（NMR）または電子スピン緩和（ESR）により検出可
能なものである。Ｘ線ラジオグラフィーに好適な標識としては、検出可能な放射
線を放出するが、被験者に過度に有害でないバリウムまたはセシウムなどの放射
性同位元素が挙げられる。NMRまたはESRに好適なマーカーには、重水素のような
検出可能な特有のスピンを有するものがあり、このようなマーカーを、本発明の
アルブミン融合タンパク質を発現する細胞系に賦与した栄養素の標識により、ア
ルブミン融合タンパク質に組み込むことができる。
【０２０７】 放射性同位元素（例えば、131I、121I、99mTc、（131I、125I、123I、121I）
、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（115mIn、113m In、112In、111In）、およびテクネチウム（99Tc、99mTc）、タリウム（201Ti）
、ガリウム（68Ga、67Ga）、パラジウム（103Pd）、モリブデン（99Mo）、キセ
ノン（133Xe）、フッ素（18F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166 Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Rh）、放射線不透過物質、
あるいは、核磁気共鳴により検出可能な物質などの好適な検出可能な画像化成分
で標識したアルブミン融合タンパク質を、免疫系障害について検査しようとする
哺乳動物に導入する（例えば、非経口、皮下もしくは腹腔内に導入）。当業者に
は、被験体のサイズおよび用いたイメージング装置によって、診断画像を作成す
るのに必要な画像化成分の量を決定するということは理解されよう。ヒト被験者
に、放射性同位体成分を用いる場合には、注射する放射能の量は、通常、約５〜
20ミリキュリーの範囲の99mTcである。次に、標識したアルブミン融合タンパク
質は、好ましくは、１以上の受容体、リガンドまたは基質（本発明のアルブミン
融合タンパク質を調製するのに用いられるものに対応する）が位置する身体内の
位置（例えば、器官、細胞、細胞外空間またはマトリックス）に蓄積する。ある
いは、アルブミン融合タンパク質が、少なくとも治療用抗体のフラグメントまた
は変異体を含む場合には、標識したアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、
治療用抗体（本発明のアルブミン融合タンパク質を調製するのに用いられた）が
結合したものに対応するポリペプチド／エピトープが位置する身体内の位置（例
えば、器官、細胞、細胞外空間またはマトリックス）に蓄積する。In vivoにお
ける腫瘍イメージングについては、下記の文献に記載されている：S.W. Burchie
lら、”Immonopharmocokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragm
ents”（Tumor Imagingの第13章：The Radiochemical Detection of Cancer, S.
W. BurchielおよびB. A. Rhodes編、Masson Publishing Inc.（1982））。上記
文献に記載されているプロトコルは、本発明のアルブミン融合タンパク質と共に
用いるために、当業者が容易に改変することができる。
【０２０８】 一実施形態では、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明の
アルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および
／または抗体をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド）
を投与することにより、細胞に本発明のアルブミン融合タンパク質を特異的に送
達する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質を標的細
胞に送達する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、標的細胞に、一本
鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）もしくは二本鎖核酸（例えば
、細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピソームにより複製することができ
、転写することができるDNA）を標的細胞に送達する方法を提供する。
【０２０９】 別の実施形態では、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共に、本
発明のアルブミン融合タンパク質を投与することにより、細胞の特異的破壊（例
えば、腫瘍細胞の破壊）を行う方法を提供する。
【０２１０】 「毒素」とは、内因性細胞傷害エフェクター系、放射性同位体、ホロトキシン
、修飾された毒素、毒素の触媒サブユニットと結合してこれらを活性化する１以
上の化合物、あるいは、細胞の表面に通常は存在せず、一定の条件下で細胞の死
を引き起こすあらゆる分子または酵素を意味する。本発明の方法に従い用いるこ
とができる毒素としては、限定するものではないが、当技術分野では公知の放射
性同位体、例えば、固有または誘導内因性細胞傷害エフェクター系と結合する抗
体（またはその部分を固定および含有する補体）、チミジンキナーゼ、エンドヌ
クレアーゼ、RNase、αトキシン、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素A、
ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイ
ルスタンパク質、αサルシンおよびコレラ毒素などの化合物が挙げられる。また
、「毒素」には細胞分裂抑制または細胞致死因子、治療薬もしくは放射性金属イ
オン、例えば、213Biのようなアルファ放射体、もしくは例えば、103Pd、133Xe
、131I、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、35S、90Y、153Sm、153Gd、169Yb、51Cr
、54Mn、75Se、113Sn、90イットリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウム
、および188レニウムなど、その他の放射性同位元素；ルミノールのような発光
標的；ならびに、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標的、ならびに
、ビオチンも含まれる。特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチド
または本発明の抗体を、放射性同位元素90Yと共に投与することにより、細胞の
特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）を行う方法を提供する。別の特定の実施
形態では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を、放射性同位
元素111Inと共に投与することにより、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の
破壊）を行う方法を提供する。さらに別の特定の実施形態では、本発明は、本発
明のポリペプチドまたは本発明の抗体を、放射性同位元素131Iと共に投与するこ
とにより、特定の細胞の破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）を行う方法を提供する
。
【０２１１】 当技術分野では公知の方法を用いて、本発明のポリペプチドを標識することが
できる。このような技法として、限定するものではないが、二重特異性連結因子
が挙げられる（例えば、米国特許第5,756,065号；第5,714,631号；第5,696,239
号；第5,652,361号；第5,505,931号；第5,489,425号；第5,435,990号；第5,428,
139号；第5,342,604号；第5,274,119号；第4,994,560号；ならびに、第5,808,00
3号を参照。尚、これら文献各々の内容は、参照により本明細書にその全文を組
み込むものとする）。
【０２１２】 本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける
様々な障害の診断、治療、予防および／または予後判定に有用である。このよう
な障害には、以下に「生物活性」と題する節で記載するものが含まれる。
【０２１３】 従って、本発明は、障害の診断方法であって、（a）本発明のアルブミン融合
タンパク質を用いて、個体の細胞または体液における特定のポリペプチドの発現
レベルをアッセイし、（b）アッセイしたポリペプチドの発現レベルを標準ポリ
ペプチドのレベルと比較することを含んでなり、ここで、標準発現レベルに対す
る、アッセイしたポリペプチド発現レベルの増加または減少が障害の指標となる
、上記診断方法を提供する。癌に関しては、個体から生検した組織における比較
的高い量の転写物の存在が、疾患進行の素因を示すか、または実際の臨床的症状
の出現前に疾患を検出する手段を提供すると考えられる。このタイプのさらに決
定的な診断により、医療の専門家は、より早期に、予防措置または攻撃的治療を
用いて、癌の発生または進行を予防することができる。
【０２１４】 さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、例えば、神経障害、免
疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖障
害、および／または癌性疾患および病状などの疾患もしくは病状を治療または予
防することができる。例えば、患者に、本発明のポリペプチドを投与して、該ポ
リペプチド（例えば、インスリン）の欠失または低下レベルを補う；異なるポリ
ペプチド（例えば、ヘモグロビンBについてのヘモグロビンS、SOD、カタラーゼ
、DNA修復タンパク質など）の欠失または低下レベルを補充する；ポリペプチド
（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制物質）の活性を阻害する；ポリペプチドの活
性を活性化（例えば、受容体と結合することにより）する；遊離リガンド（例え
ば、炎症を抑制するのに用いられる可溶性TNF）について競合することにより、
膜結合受容体の活性を抑制する；あるいは、所望の応答（例えば、血管成長阻害
、増殖細胞または組織に対する免疫応答の増強）をもたらすことができる。
【０２１５】 特に、少なくとも治療用抗体のフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融
合タンパク質を用いても、疾患（本明細書の前掲およびその他の箇所に記載した
もの）を治療することができる。例えば、少なくとも治療用抗体のフラグメント
または変異体を含むアルブミン融合タンパク質を投与することにより、ポリペプ
チドを結合させる、および／または中和することができ、このポリペプチドに、
アルブミン融合タンパク質調製のために用いた治療用抗体が免疫特異的に結合し
、および／またはアルブミン融合タンパク質調製のために用いた治療用抗体が免
疫特異的に結合したポリペプチドの過剰生産を抑制する。同様に、少なくとも治
療用抗体のフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を投与し
て、膜（受容体）に結合したポリペプチドに結合させることにより、アルブミン
融合タンパク質調製のために用いた治療用抗体が免疫特異的に結合したポリペプ
チドを活性化することができる。
【０２１６】 少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者には公知の方法に
より、SDS-PAGEゲルまたは分子ふるいゲルろ過カラム上の分子量マーカーとして
用いることができる。また、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、抗体
を誘起させた後、この抗体を用いて、宿主細胞または生物学的サンプルでの形質
転換を評価する方法として、組換え細胞から得た本発明の治療用タンパク質、ア
ルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質のタンパク質発
現を測定することも可能である。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を
用いて、本明細書に記載した生物活性を試験することもできる。
【０２１７】 診断アッセイ 本発明の化合物は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける様々な障害の診断、治
療、予防および／または予後判定に有用である。このような障害として、限定す
るものではないが、表１の対応する列に、治療用タンパク質の各々について記載
したもの、ならびに、本明細書の下記標題を掲げた節で記載したものが挙げられ
る：「免疫活性」、「血液関連疾患」、「過増殖性疾患」、「腎障害」、「心血
管障害」、「呼吸器障害」、「抗脈管新生活性」、「細胞レベルでの疾患」、「
創傷治癒および上皮細胞増殖」、「神経活性および神経疾患」、「内分泌障害」
、「生殖系障害」、「感染症」、「再生」および／または「胃腸障害」（後掲）
。
【０２１８】 多数の障害に関して、そのような障害を有する個体から採取した組織、細胞ま
たは体液（血清、血漿、尿、精液、滑液または髄腋）において、「標準的」遺伝
子発現レベル、すなわち、そのような障害のない個体から採取した組織または体
液における発現レベルと比較して、実質的に変化（増加または減少）したレベル
の遺伝子発現を検出することができる。従って、本発明は、障害の診断の際に有
用な診断方法であって、個体から採取した組織、細胞または体液においてポリペ
プチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、測定した遺伝子発現レベルを
標準的遺伝子発現レベルと比較することを含んでなり、ここで、標準と比較した
遺伝子発現レベルの増加または減少が障害の指標となる、上記方法を提供する。
これらの診断アッセイは、例えば、血液サンプル、生検もしくは剖検組織につい
て、in vivoまたはin vitroで実施することができる。
【０２１９】 本発明は、遺伝子発現が増加または低下した患者が、より悪化した臨床転帰を
被るという予後判定の指標としても有用である。
【０２２０】 「ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、特定
のポリペプチド（例えば、表１に開示した治療用タンパク質に対応するポリペプ
チド）のレベル、または第1の生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチド
をコードするmRNAのレベルを、直接（例えば、絶対タンパク質レベルもしくはmR
NAレベルを測定または推定することにより）、または相対的（例えば、第２の生
物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルもしくはmRNAレベルと比較すること
により）に、定性または定量的に測定することを意味する。好ましくは、第１生
物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルもしくはmRNAレベルを測定または推
定し、標準的ポリペプチドレベルもしくはmRNAレベルと比較する。その際、標準
レベルは、障害のない個体から採取した第２生物学的サンプルから取得するか、
または障害を有していない個体の集団から得たレベルを平均化することにより決
定する。当業者には理解されるように、いったん標準的ポリペプチドレベルまた
はmRNAレベルを得れば、それを比較基準として繰返し用いることができる。
【０２２１】 「生物学的サンプル」とは、個体、細胞系、組織培養物、または、本発明のポ
リペプチド（その部分を含む）もしくはmRNAを含有するその他の供給源から取得
したあらゆる生物学的サンプルを意味する。既述したように、生物学的サンプル
としては、全長のポリペプチドまたはmRNAもしくはその断片を発現することが認
められた体液（血清、血漿、尿、滑液および髄液など）および組織に由来するも
のがある。哺乳動物から組織生検および体液を取得する方法は、当技術分野では
よく知られている。生物学的サンプルがmRNAを含有することが望ましい場合には
、組織生検が好ましい供給源である。
【０２２２】 ChomczynskiおよびSacchi, Anal. Biochem. 162：156-159（1987）に記載され
ている単一工程グアニジウム−チオシアン酸−フェノール−クロロホルム法等の
任意の好適な技法を用いて、生物学的サンプルから細胞全RNAを単離することが
できる。本発明のポリペプチドをコードするmRNAのレベルは、任意の好適な方法
を用いて、アッセイする。このような方法として、ノーザンブロット分析、S1ヌ
クレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリメラーゼ連鎖反応
と組み合わせた逆転写反応（RT-PCR）、ならびに、リガーゼ連鎖反応と組み合わ
せた（RT-LCR）が挙げられる。
【０２２３】 本発明はまた、生物学的サンプル（例えば、細胞および組織）において、本発
明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペ
プチドのレベルを検出する定量的および診断アッセイなどの診断アッセイであっ
て、ポリペプチドの正常および異常レベルの測定を含んでなる上記アッセイに関
する。従って、例えば、正常の対照組織アッセイと比較して、上記アルブミン融
合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドのレベルを
検出するための本発明による診断アッセイを用いて、腫瘍の存在を検出すること
ができる。宿主に由来するサンプルにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク
質に結合、結合される、または会合するポリペプチドのレベルを検出するのに用
いることができるアッセイ技法は、当業者にはよく知られている。このようなア
ッセイ方法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロ
ット分析およびELISAアッセイが挙げられる。生物学的サンプルにおけるポリペ
プチドレベルのアッセイは、いずれかの公知の方法を用いて、実施することがで
きる。
【０２２４】 生物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルのアッセイは、様々な技法を用
いて実施することができる。例えば、組織におけるポリペプチド発現は、古典的
な免疫組織学的方法（Jalkanenら、J. Cell. Biol. 101：976-985（1985）；Jal
kanen, M.ら、J. Cell. Biol. 105：3087-3096（1987））を用いて調べることが
できる。ポリペプチド遺伝子発現を検出するのに有用なその他の方法に、酵素結
合免疫吸着アッセイ（ELISA）やラジオイムノアッセイ（RIA）などの免疫アッセ
イがある。好適な抗体アッセイの標識は、当分野では公知であり、例えば、グル
コースオキシダーゼのような酵素標識；ヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、
イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）およびテクネチウム（99m Tc）などの放射性同位元素；フルオレセインやローダミンのような蛍光標識
、ならびに、ビオチンが挙げられる。
【０２２５】 分析しようとする組織または細胞型としては、一般に、目的とする遺伝子を発
現することがわかっているか、またはその疑いのあるもの（例えば、癌）が挙げ
られる。本明細書で使用するタンパク質単離方法は、例えば、HarlowおよびLane
（Harlow, E.およびLane, D., 1988, ”Antibodies: A Laboratory Manual”, C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）（参照
によりその全文を本明細書に組み込む）に記載されているものでよい。単離され
る細胞は、細胞培養物または患者に由来するものでよい。培養物から取得した細
胞の分析は、細胞に基づく遺伝子治療法の一環として用いることができる細胞の
評価または遺伝子発現に化合物が及ぼす影響の試験において、必要な段階である
。
【０２２６】 例えば、アルブミン融合タンパク質を用いて、本発明のアルブミン融合タンパ
ク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの存在を定量または
定性的検出することができる。これは、例えば、蛍光標的アルブミン融合タンパ
ク質を用いる、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み
合わせた免疫蛍光技法により達成することができる。
【０２２７】 好ましい実施形態では、少なくとも本明細書に開示した治療用タンパク質（例
えば、表１に開示した治療用タンパク質）と免疫特異的に結合する抗体、または
少なくとも、当技術分野では公知の抗体のフラグメントもしくは変異体を含むア
ルブミン融合タンパク質を用いて、遺伝子産物もしくはその保存変異体またはペ
プチド断片の存在を定量または定性的検出することができる。これは、例えば、
光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み合わせた、蛍光
標的抗体を用いる免疫蛍光技法により達成することができる。
【０２２８】 さらには、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法もしくは非免疫アッセイと同様に、本
発明のアルブミン融合タンパク質を組織学的に用いて、本発明のアルブミン融合
タンパク質に結合、結合される、または会合するポリペプチドのin situ検出を
実施することができる。in situ検出は、患者から組織サンプルを採取し、そこ
に本発明の標識抗体またはポリペプチドを反応させることにより達成される。標
識アルブミン融合タンパク質を生物学的サンプルに重層することにより、アルブ
ミン融合タンパク質を反応させるのが好ましい。このような手順を用いて、アル
ブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの
存在だけでなく、被検組織におけるその分布も決定することが可能である。本発
明を用いて、当業者は、非常に多様な組織学的方法（染色方法など）のうち任意
のものを改変することにより、このようなin situ検出を達成できることを容易
に認識するであろう。
【０２２９】 アルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプ
チドを検出する免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、典型的に、遺伝子産物ま
たはその保存された変異体もしくはペプチド断片と結合する能力を有する検出可
能標識化抗体の存在下で、サンプル（例えば、生物の体液、組織抽出物、新しく
採取した細胞、もしくは細胞培養物中でインキュベートしておいた細胞の溶解物
など）をインキュベートした後、当分野ではよく知られた多数の技法のいずれか
により、結合した抗体を検出することを含んでなる。
【０２３０】 生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体もしくは担体、また
は細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固相
支持体と接触させ、これに固定化する。次に、この支持体を適当なバッファーで
洗浄した後、検出可能に標識化した本発明のアルブミン融合タンパク質で処理す
る。続いて、固相支持体を再度バッファーで洗浄することにより、結合していな
い抗体またはポリペプチドを除去する。場合によっては、その後、上記抗体を標
識する。そして、固相支持体に結合した標識の量を通常の手段により検出する。
【０２３１】 「固相支持体または担体」とは、ポリペプチド（例えば、アルブミン融合タン
パク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、また
は会合するポリペプチド）と結合することのできるあらゆる支持体を意味する。
よく知られた支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セル
ロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質
は、本発明の目的に応じて、ある程度可溶性であるか、不溶性のいずれかである
。支持体材料は、結合した分子が、ポリペプチドと結合することができれば、ほ
ぼどんな構造形状をしていてもよい。従って、支持体の形状は、ビーズのように
球状でもよいし、試験管の内側面または棒の外側面のように円筒状でもよい。あ
るいは、シートや試験ストリップなどのように平板な表面をしていてもよい。好
ましい支持体として、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または
抗原と結合するのに好適なその他多数の担体を認識しており、通常の実験により
それを確認することができるだろう。
【０２３２】 所与ロットのアルブミン融合タンパク質の結合活性は、公知の方法に従って測
定することができる。当業者は、通常の実験を用いて、各測定に最適な操作条件
を決定することができるだろう。
【０２３３】 個体から得られた生物学的サンプルでのポリペプチドレベルをアッセイする以
外に、イメージングにより、ポリペプチドをin vivoで検出することも可能であ
る。例えば、本発明の一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質を用
いて、患部細胞または新生物細胞を画像化する。
【０２３４】 本発明のアルブミン融合タンパク質をin vivo画像化するための標識またはマ
ーカーには、Ｘ線撮影、NMR、MRI、CATスキャンまたはESRにより検出可能なもの
がある。Ｘ線撮影に好適な標識としては、検出可能な放射線を放出するが、被験
者に過度に有害でないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位元素が挙げられ
る。NMRおよびESRに好適なマーカーには、重水素のような検出可能な独特のスピ
ンを有するものがあり、このようなマーカーを、遺伝子操作した細胞系（もしく
は細菌または酵母菌株）の栄養源を標識して、アルブミン融合タンパク質に取り
込むことができる。
【０２３５】 さらに、その存在が検出可能な本発明のアルブミン融合タンパク質を投与して
もよい。例えば、標識抗体について述べたように、放射線非透過性またはその他
の適当な化合物で標識した本発明のアルブミン融合タンパク質を投与し、in viv
oで可視化することができる。また、このようなポリペプチドは、in vitro診断
方法にも使用することができる。
【０２３６】 放射性同位元素（例えば、131I、112In、99mTc）、放射線非透過性物質、もし
くは核磁気共鳴により検出可能な物質など、適した検出可能な画像化成分で標識
しておいたポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントを、障害について検
査しようとする哺乳動物に導入する（例えば、非経口、皮下または腹腔内経路で
）。当業者であれば、被験者の大きさや、用いるイメージング装置に応じて、診
断画像を作成するのに必要な画像化成分の量を決定することわかるであろう。放
射性同位元素成分の場合には、ヒト被験者に対して、注射される放射能の量は、
通常約５〜20ミリキュリーの範囲の99 mTcである。その後、標識されたアルブミ
ン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合され
る、または会合するポリペプチドもしくはその他の物質を含む身体内の位置に優
先的に蓄積する。in vivo腫瘍イメージングについては、S.W. Burchielら、”Im
munopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments”（T
umor Imaging第13章：The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchie
lおよびB. A. Rhodes編、Masson Publishing Inc.（1982））に記載されている
。
【０２３７】 本発明のアルブミン融合タンパク質を検出可能に標識する方法の１つは、この
タンパク質をリポーター酵素と結合させ、結合した産物を酵素免疫アッセイ（EI
A）で用いることからなる（Voller, A. “The Enzyme Linked Immunosorbent As
say（ELISA）”, 1978, Diagnostic Horizons 2：1-7, Microbiological Associ
ates Quaterly Publication, Walkersville, MD）；Vollerら、J. Clin. Pathol
. 31：507-520（1978）；Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73：482-523（1981）
；Maggio, E.（編）、1980、Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL,
；Ishikawa, E.ら、（編）、1981、Enzyme Immunoassay, Kagaku Shoin、東京）
。抗体に結合させるリポーター酵素は、好適な基質、好ましくは、発色性基質と
反応し、これによって、例えば、分光学的定量、蛍光定量もしくは視覚的手段に
より検出が可能な化学的成分を生成するようにする。抗体を検出可能に標識する
のに用いることができるリポーター酵素としては、限定するものではないが、マ
レイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ-5-ステロイ
ドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸、デヒ
ドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガ
ラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ
が挙げられる。加えて、リポーター酵素用の発色性基質を用いた比色分析方法に
より、検出を実施することもできる。さらには、同様に調製した標準物に対して
、基質の酵素反応の程度を目視比較することにより、検出を達成することも可能
である。
【０２３８】 また、アルブミン融合タンパク質を放射標識し、上記以外の各種免疫アッセイ
に用いてもよい。例えば、アルブミン融合タンパク質を放射標識することにより
、このアルブミン融合タンパク質を放射免疫アッセイ（RIA）に用いることがで
きる（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Tr
aining Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Ma
rch, 1986を参照。尚、この文献は、参照により本明細書に組み込む）。放射性
同位元素は、限定するものではないが、γカウンター、シンチレーションカウン
ター、またはオートラジオグラフィーなどの手段により、検出することができる
。
【０２３９】 また、アルブミン融合タンパク質を蛍光化合物で標識することも可能である。
蛍光標識した抗体を適正な波長の光に暴露すると、その存在を蛍光により検出す
ることができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物として、フルオレセイ
ンイソチアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィ
コシアニン、オフトアルデヒドおよびフルオレスカミンが挙げられる。
【０２４０】 これ以外にも、152Euのような蛍光放出金属、もしくはランタニドシリーズの
その他の金属を用いて、アルブミン融合タンパク質を検出可能に標識することも
できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）のようなキレート基を用いて、抗体に結合させることが
できる。
【０２４１】 さらには、アルブミン融合タンパク質を化学発光化合物に結合することにより
、検出可能に標識することもできる。次に、化学反応の過程で生ずる蛍光の存在
を検出することにより、化学発光化合物で標識したアルブミン融合タンパク質の
存在を測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例として、ルミノール、イソ
ルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジウムエステル、イミダゾー
ル、アクリジウム塩およびシュウ酸エステルがある。
【０２４２】 同様に、生物発光化合物を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質を標識
してもよい。生物発光は、生物系に認められる化学発光の１種であり、その際、
触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する。生物発光タンパク質の存在は
、ルミネセンスの存在を検出することにより測定される。標識用途に重要な生物
発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０２４３】トランスジェニック生物 本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させるトランスジェニック生物も本
発明に含まれる。トランスジェニック生物は、遺伝学的に改変された生物であり
、この生物には、組換え、外因性もしくはクローニングされた遺伝物質が伝達さ
れている。このような遺伝物質は、よくトランスジーンと呼ばれる。このトラン
スジーンの核酸配列は、コードされたタンパク質の最適な発現および分泌に必要
な１以上の転写調節配列、ならびにイントロンのようなその他の核酸配列を含ん
でいてもよい。トランスジーンは、生物、あるいは、生物が産生する産物、例え
ば、生物の乳、血液、尿、卵、毛または種子からのその回収を容易にするように
、コードされたタンパク質の発現を指令することもできる。トランスジーンは、
標的動物と同じ種または異なる種のゲノムに由来する核酸配列からなるものでよ
い。トランスジーンは、特定の核酸配列が正常に認められないゲノムの遺伝子座
、あるいは、トランスジーンの正常遺伝子座のいずれに組み込んでもよい。
【０２４４】 「生殖細胞系トランスジェニック生物」という用語は、遺伝的改変または遺伝
情報を生殖細胞系に導入することにより、トランスジェニック生物が、遺伝情報
を子孫に伝達する能力を賦与したトランスジェニック生物を意味する。このよう
な子孫が、上記の改変または遺伝情報の一部もしくは全部を実際に含んでいれば
、これら子孫もトランスジェニック生物である。前記の改変または遺伝情報は、
レシピエントが属する生物の種にとって外来であるか、特定の個体のレシピエン
トにとってのみ外来であるか、またはレシピエントがすでに持っていた遺伝情報
である可能性もある。最後のケースでは、改変または導入された遺伝子は、元来
の遺伝子とは異なる発現を呈すると考えられる。
【０２４５】 トランスジェニック生物は、トランスジェニック動物またはトランスジェニッ
ク植物でよい。トランスジェニック動物は、トランスフェクション、電気穿孔、
微量注射、胚性幹細胞および組換えウイルスおよびレトロウイルス感染などの多
様な方法により産生することができる（例えば、米国特許第4,736,866号；米国
特許第5,602,307号；Mullinsら（1993）Hypertension 22(4)：630-633；Brenin
ら（1997）Surg. Oncol. 6(2)99-110；Tuan（編）、Recombinant Gene Expressi
on Protocols, Methods in Molecular Biology、62、Humana Press（1997）を参
照）。核酸断片を組換え能力哺乳動物細胞に導入する方法は、多数の核酸分子の
共形質転換に有利であれば、どんな方法によるものでもよい。トランスジェニッ
ク動物を生産する詳細な手順については、当業者はすでに公知であり、例えば、
米国特許第5,489,743号および米国特許第5,602,307号に開示されているものがあ
る。
【０２４６】 多数の組換えまたはトランスジェニック動物が産生されており、例えば、下記
のものが挙げられる：活性型癌配列を発現するもの（米国特許第4,736,866号）
；サルSV40 T抗原を発現するもの（米国特許第5,728,915号）；インターフェロ
ン調節因子１（IRF-1）の発現を欠失させたもの（米国特許第5,731,490号）；ド
ーパミン作動性不全を呈示するもの（米国特許第5,723,719号）；血圧制御に関
与する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第5,731,489号）
；自然発症性アルツハイマー病に見られる状態との高い類似性を展示するもの（
米国特許第5,720,936号）；細胞接着を媒介する能力が低下したもの（米国特許
第5,602,307号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を有するもの（Clutterら（1996）Ge
netics 143(4)：1753-1760）；あるいは、十分なヒト抗体応答を発生する能力が
あるもの（McCarthy（1997）The Lancet 349（9049）：405）。
【０２４７】 マウスおよびラットがやはり、ほとんどのトランスジェニック実験に適した動
物ではあるが、別の動物種を用いるのが好ましい、あるいは、必要でさえある場
合もある。トランスジェニック法は、ネズミ以外の多様な動物、例えば、ヒツジ
、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシお
よびモルモットなどで用いられ、成功している（例えば、Kimら（1997）Mol. Re
prod. Dev. 46(4)：515-526；Houdebine（1995）Reprod. Nutr. Dev. 35(6)：60
9-617；Petters（1994）Reprod. Fertil. Dev. 6(5)：643-645；Schneikeら（19
97）Science 278（5346）：2130-2133；およびAmoah（1997）J. Animal Science
72(2)：578-585を参照）。
【０２４８】 トランスジェニック動物の乳への本発明のトランスジーンがコードするタンパ
ク質の分泌を指令するためには、哺乳動物上皮細胞で優先的に活性化されるプロ
モーターの制御下にトランスジーンを配置すればよい。その際、乳タンパク質を
コードする遺伝子を制御するプロモーターが好ましく、例えば、カゼイン、βラ
クトグロブリン、乳漿タンパク質、もしくはラクトアルブミンのプロモーター（
例えば、DiTullio（1992）BioTechnology 10：74-77；Clarkら（1989）BioTechn
ology 7：487-492；Gortonら（1987）BioTechnology 5：1183-1187；ならびに、
Soulierら（1992）FEBS Letts. 297：13を参照）が挙げられる。好適なトランス
ジェニック哺乳動物は、多量の乳汁を生産し、かつ乳汁分泌期間が長いもの、例
えば、ヤギ、ウシ、ラクダまたはヒツジである。
【０２４９】 また、本発明のアルブミン融合タンパク質をトランスジェニック植物、例えば
、DNAトランスジーンを核またはプラスチドゲノムに挿入した植物において発現
させることもできる。外来核酸を植物細胞またはプロトプラストに導入するのに
用いられる植物形質転換方法は当分野では公知である（例えば、実施例19を参照
）。概略については、Methods in Enzymology Vol. 153（組換えDNA Part D）19
87, WuおよびGrossman編、Academic Press and European Patent Application E
P 693554を参照。遺伝子工学的に操作した植物の生産方法についてさらに詳しく
は、米国特許第5,283,184号、米国特許第5,482,852号および欧州特許出願EP 693
554号に記載されており、これらはすべて参照により本発明に組み込む。
【０２５０】医薬または治療用組成物 本発明のアルブミン融合タンパク質またはその製剤は、非経口（例えば、皮下
または筋内）注射もしくは静脈内注入を含むあらゆる通常の方法により投与する
ことができる。治療は、単一用量、または所定時間をかけた複数回用量のいずれ
からなるものでもよい。
【０２５１】 本発明のアルブミン融合タンパク質を単独で投与することもできるが、１種以
上の許容され得る担体と一緒に医薬製剤の形態をしていることが好ましい。この
担体は、アルブミン融合タンパク質と適合性であり、かつ、その受容者に有害で
はないという点で「許容され得る」ものでなければならない。典型的には、担体
は、無菌かつ発熱物質を含まない水または食塩水である。本発明のアルブミン融
合タンパク質は、溶液中でのその貯蔵寿命が長いことから、発熱物質を含有しな
い無菌水、食塩水もしくはその他の等張液のような水性担体中の製剤に特によく
適している。例えば、本発明の医薬組成物は、水性形態の製剤として事前に調製
し、販売までに例えば、数週間、数ヶ月、あるいは、それ以上の期間置いておく
ことができる。
【０２５２】 例えば、治療用タンパク質が、hGH、EPO、α-IFNまたはβ-IFNである場合には
、アルブミン融合タンパク質を含む製剤は、水性製剤中のアルブミン融合タンパ
ク質の貯蔵寿命が引き延ばされることを考慮して、調剤することができる。表２
に示すように、ほとんどの治療用タンパク質は、水性担体を用いて製剤した後は
、不安定で貯蔵寿命も短い。前述したように、これら治療用タンパク質の多くの
貯蔵寿命は、HAとの融合後、顕著に増加または延長される。
【０２５３】
【表２】
【０２５４】 エーロゾル投与が好適な場合には、標準的方法を用いて、本発明のアルブミン
融合タンパク質をエーロゾルとして調製することができる。「エーロゾル」とい
う用語は、本発明のアルブミン融合タンパク質のあらゆるガス中（gas-borne）
懸濁相を包含し、細気管支または鼻腔に吸入させることが可能なものである。具
体的に、エーロゾルには、計量式吸入器もしくはネブライザーまたは噴霧器中で
生成し得るような本発明のアルブミン融合タンパク質小滴のガス中懸濁物がある
。さらに、エーロゾルには、空気またはその他の担体ガス中に懸濁させた本発明
の化合物の乾燥粉末組成物があり、これは、例えば吸入装置からの吹込みにより
送達することができる。GandertonおよびJones, Drug Delivery to the Respira
tory Tract, Ellis Horwood（1987）；Gonda（1990）Critical Reviews in Ther
apeutic Drug Carrier Systems 6：273-313；Raeburnら（1992）Pharmacol. Tox
icol. Methods 27：143-159を参照。
【０２５５】 また、本発明の製剤は、一つには、適正な種に由来するアルブミン融合タンパ
ク質の成分を使用するため、典型的には、非免疫原性である。例えば、ヒトに使
用する場合、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質およびアルブミン部
分の両方が、典型的にはヒト由来である。いずれか一方の成分が、ヒト由来では
ない場合には、鍵となるアミノ酸を置換してその成分をヒト化することにより、
ヒト免疫系にとって、特定のエピトープが、外来ではなく生来ヒトであるように
してもよい。
【０２５６】 製剤は、単位用量形態であるのが便利であり、製薬の分野ではよく知られた方
法のいずれを用いても調製することができる。このような方法は、アルブミン融
合タンパク質を、１以上の補助成分を構成する担体と結合させる段階を含む。一
般に、製剤は、液体担体もしくは微粉状の固体担体、あるいは、その両方と、活
性成分を均一かつ密に結合させた後、必要であれば、生成物を造形することによ
り、調製する。
【０２５７】 非経口投与に適した製剤として、下記のものが挙げられる：対象受容者に適し
た製剤にする酸化防止剤、バッファー、静菌薬および溶質を含むことができる水
性および非水性無菌注射液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含むことができる
水性および非水性無菌懸濁物。製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば
、密封されたアンプル、バイアルもしくは注射器に入った状態をしていてもよい
し、また、使用する直前に無菌液体担体、例えば、注射用の水を添加するだけで
よいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することもできる。すぐ使える（ex
temporaneous）注射溶液および懸濁液は、無菌粉末から調製することができる。
本発明のアルブミン融合タンパク質の多くが長い血清半減期を示していることか
ら、本発明の投与製剤には、治療用タンパク質の非融合標準製剤と比較して、低
いモル濃度または低い用量で治療用タンパク質部分を含有させることができる。
【０２５８】 例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が、１以上の治療用タンパク質
領域として、成長ホルモンを含んでいる場合には、天然のhGHと比較したアルブ
ミン融合タンパク質の血清半減期および貯蔵寿命が長くなっていることを考慮し
ながら、hGHの効力に対するアルブミン融合タンパク質の効力に基づいて、投与
形態を計算することができる。成長ホルモンは、１年以上の期間にわたり、典型
的には0.3〜30.0 IU／kg／週、例えば0.9〜12.0 IU／kg／週の用量で、例えば３
または７回に分けて投与する。全長GHに融合した全長HAからなるアルブミン融合
タンパク質の場合には、単位に関しては同等の用量でも、上記より大きい薬剤重
量を示すことになるが、投与頻度は、例えば、週２回、週１回以下にまで減らす
ことができる。
【０２５９】 本発明の製剤または組成物は、アルブミン融合タンパク質成分の引き延ばされ
た貯蔵寿命について記載した説明書またはパッケージ挿入書と一緒に、パッケー
ジングするか、あるいは、キットに納めることができる。例えば、このような説
明書またはパッケージ挿入書には、本発明のアルブミン融合タンパク質の引き延
ばされた、すなわち長くなった貯蔵寿命を考慮に入れて、期間、温度および光な
どの推奨される貯蔵条件について記載することができる。また、このような説明
書またはパッケージ挿入書には、例えば、管理された病院、診療所もしくは事務
所条件以外の現場での使用が必要となり得る製剤の貯蔵しやすさなど、本発明の
アルブミン融合タンパク質の具体的利点を記載することもできる。前述したよう
に、本発明の製剤は水性形態でもよく、治療活性の有意な損失を起こすことなく
、理想的ではない条件下で保存することができる。
【０２６０】 また、本発明のアルブミン融合タンパク質を栄養補給食品に含有させることも
可能である。例えば、本発明のある種のアルブミン融合タンパク質は、アルブミ
ン融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物から取得した乳または乳製
品などの天然物質に入れて投与してもよい。このような組成物はまた、アルブミ
ン融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物から取得した植物または植
物産物を含んでもよい。さらに、アルブミン融合タンパク質は、その他公知の添
加剤、担体、充填剤および稀釈剤を含む、もしくは含まない粉末または錠剤の形
態で提供することもできる。栄養補給食品については、Scott Hegenhart, Food
Product Design, Dec. 1993に記載されている。
【０２６１】 本発明はまた、製薬上許容される担体と混合して、有効量の本発明のアルブミ
ン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチド（「アルブミン融合ポリヌクレオチド」）を被験者に投与すること
により、疾患または障害（例えば、本明細書に記載した疾患または障害のいずれ
か１つ以上）を治療および／または予防する方法を提供する。
【０２６２】 アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、それぞれの患
者の臨床状態（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチ
ドだけによる治療の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画、ならびに、医療
実施者が知っているその他の要因を考慮して、好適な医療実施にかなうように、
処方・投薬する。従って、本明細書に記載する目的のための「有効用量」はこれ
らを考慮して決定する。
【０２６３】 一般的な計画案として、非経口投与されるアルブミン融合タンパク質の、用量
当たりの製薬上の合計有効量は、患者の体重の約１ug／kg／日〜10 mg／kg／日
であるが、すでに指摘したように、これは、治療によって変動する。さらに好ま
しくは、この用量は、少なくとも0.01 mg／kg／日であり、ヒトについて最も好
ましくは、ホルモンの場合、約0.01〜１mg／kg／日の範囲である。連続的に投与
する場合には、アルブミン融合タンパク質は、典型的に、約１ug／kg／時〜約50
ug／kg／時の用量速度で、１日につき１〜４回の注射により、もしくは例えば
ミニポンプを用いた連続的皮下注入により、投与する。また、静脈内バッグ（ba
g）溶液を用いることもできる。変化を観察するのに必要な治療期間、ならびに
、治療から応答が現れるまでの時間は、所望する効果に応じて違ってくるようで
ある。
【０２６４】 アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、経口、直腸、
非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ゲル、ドロップもしくは経皮
パッチによる）、口腔経路(bucally)により、あるいは、経口または鼻内スプレ
ーとして、投与することができる。「製薬上許容される担体」とは、あらゆるタ
イプの非毒性で固体、半固体または液体の充填剤、稀釈剤、被包材料もしくは製
薬補助剤を意味する。本明細書で用いる「非経口」という用語は、静脈内、筋肉
内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入などを含む投与方法を意
味する。
【０２６５】 また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは
、持続放出系により好適に投与することもできる。持続放出アルブミン融合タン
パク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、経口、直腸、非経口、槽内
、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ゲル、ドロップもしくは経皮パッチによる
）、口腔経路により、あるいは、経口または鼻内スプレーとして、投与する。「
製薬上許容される担体」とは、あらゆるタイプの非毒性で固体、半固体または液
体の充填剤、稀釈剤、被包材料もしくは製薬補助剤を意味する。本明細書で用い
る「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節
内注射および注入などを含む投与方法を意味する。持続放出アルブミン融合タン
パク質および／またはポリヌクレオチドの別の例として、好適なポリマー材料（
例えば、造形した物品、例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルの形態をし
た半透過性ポリマーマトリックスなど）、好適な疎水性材料（例えば、許容され
る油中のエマルションなど）もしくはイオン交換樹脂、ならびに、難溶性の誘導
体（例えば、難溶性の塩など）が挙げられる。
【０２６６】 持続放出マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP
58,481）、L-グルタミン酸とL-グルタミン酸γ-エチルのコポリマー（Sidmanら
、Biopolymers 22：547-556（1983））、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキシエチ
ル）（Langerら、J. Biomed. Mater. Res. 15：167-277（1981））、ならびに、
Langer, Chem. Tech. 12：98-105（1982））、エチレン酢酸ビニル（Langerら、
同上）またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988号）が挙げられる
。
【０２６７】 さらに、持続放出アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド
には、リポソームに内包された本発明のアルブミン融合タンパク質および／また
はポリヌクレオチドもある（概要は、Langer, Science 249：1527-1533（1990）
；Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lo
pez-BeresteinおよびFidler（編）、Liss, New York, pp. 317-327および353-36
5（1989）を参照）。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチ
ドを含むリポソームは、それ自体公知の方法により調製する：DE 3,218,121；Ep
steinら、Proc. Natl. Acad. Sci.（米国）82：3688-3692（1985）；Hwangら、P
roc. Natl. Acad. Sci.（米国）77：4030-4034（1980）；EP 52,322；EP 36,676
；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本国特許出願第83-118008号；米国特
許第4,485,045号および第4,544,545号；ならびにEP 102,324号参照。通常、リポ
ソームは、薄い（約200〜800オングストローム）単層型で、その脂質含有率は、
約30モル％コレステロールより大きく、選択する比率は、最適な治療用タンパク
質に応じて調節する。
【０２６８】 さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
ポリヌクレオチドは、ポンプで送達する（Langer、前掲；Sefton, CRC Crit. Re
f. Biomed. Eng. 14：201（1987）；Buchwaldら、Surgery 88：507（1980）；Sa
udekら、N. Engl. J. Med. 321：574（1989）を参照）。
【０２６９】 その他の制御された放出系について詳しくは、Langer（Science 249：1527-15
33（1990）により記載されている。
【０２７０】 非経口投与の場合、一実施形態では、アルブミン融合タンパク質および／また
はポリヌクレオチドは、一般に、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液また
はエマルション）に、所望の純度の上記タンパク質と、製薬上許容される担体、
すなわち、使用した用量および濃度で受容者に非毒性で、かつ、その他の製剤成
分と適合する担体とを混合することにより、調製する。例えば、製剤は、治療用
タンパク質に有害なことがわかっている酸化剤その他の化合物は含有しないのが
好ましい。
【０２７１】 一般に、製剤は、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド
を、液体担体もしくは微粉固体担体、またはその両方と均一かつ密に接触させる
ことにより、調製する。次に、必要であれば、得られた生成物を所望の製剤に造
形する。好ましくは、上記担体は、非経口担体であり、さらに好ましくは、受容
者の血液と等張の溶液である。このような担体の例として、水、食塩水、リンガ
ー液、およびデキストロース液が挙げられる。また、不揮発性油やオレイン酸エ
チルのような非水性ビヒクル、ならびに、リポソームも有用である。
【０２７２】 担体は、等張性や化学的安定性を増強する物質などの添加剤を少量含んでいる
のが好適である。このような物質は、用いた用量および濃度では受容者に非毒性
であり、例えば、下記のものが挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸、ならびに、その他の有機酸もしくはその塩などのバッファー；アスコル
ビン酸のような酸化防止剤；低分子量（約10残基より少ない）ポリペプチド、例
えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免
疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水ポリマー；
グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸；
単糖、二糖、ならびに、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース
もしくはデキストリンなどその他の炭水化物；EDTAのようなキレート剤；マンニ
トールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのようなカウンタ
ーイオン；および／またはポリソルベート、ポリオキサマー、またはPEGなどの
ノニオン系界面活性剤。
【０２７３】 アルブミン融合タンパク質は、典型的には、濃度が約0.1 mg／ml〜100 mg／ml
、好ましくは、１〜10 mg／ml、pHが約３〜８として上記ビヒクル中で調製され
る。前記の賦形剤、担体または安定剤のいくつかを使用するとポリペプチド塩が
生成することは理解されるであろう。
【０２７４】 治療投与に用いるどんな製剤成分も無菌にすることができる。無菌性は、無菌
ろ過膜（例えば、0.2ミクロンの膜）を介したろ過により容易に達成される。ア
ルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、一般に、無菌の進
入口を有する容器、例えば、皮下組織注射針により貫通可能なストッパーを備え
る静脈内溶液バッグもしくはバイアルに装入する。
【０２７５】 アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、通常、単位ま
たは複数回用量容器、例えば、密封されたアンプルまたはバイアルに、水溶液も
しくは再形成のための凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥製剤の例として、
10-mlバイアルを５mlの無菌ろ過１％（w/v）アルブミン融合タンパク質および／
またはポリヌクレオチド水溶液で充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入
溶液は、注射用静菌性水を用いて、凍結乾燥したアルブミン融合タンパク質およ
び／またはポリヌクレオチドを再形成することにより調製する。
【０２７６】 特定の好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質製剤は、pH 7.2で、
0.01 Mリン酸ナトリウムと、0.15 M塩化ナトリウムと、融合タンパク質１ミリグ
ラム当たり0.16 マイクロモルのオクタン酸ナトリウムと、１ミリリットル当た
り15マイクログラムのポリソルベート80とを含んでなる。別の特定の好ましい実
施形態では、アルブミン融合タンパク質製剤は、pH 7.2で、0.01 Mリン酸ナトリ
ウムと、0.15 M塩化ナトリウムと、融合タンパク質１ミリグラム当たり0.16 マ
イクロモルのオクタン酸ナトリウムと、１ミリリットル当たり15マイクログラム
のポリソルベート80とを含んでなる。pHおよびバッファーは、生理的条件と適合
するように選択し、張度調節剤として塩を添加する。オクタン酸ナトリウムは、
溶液中のタンパク質の熱安定性を高める能力があると報告されていることから、
選択した。最後に、ポリソルベートは、一般的表面活性剤として添加され、これ
は、溶液の表面張力を低下させると共に、容器密閉系へのアルブミン融合タンパ
ク質の非特異的吸着を低減する。
【０２７７】 本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレ
オチドの１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキ
ットを提供する。このような容器には、医薬または生物製品の製造、使用もしく
は販売を取り締まる政府機関により規定された形式の注意書きを備えることがで
きる。尚、このような注意書きは、当局による、ヒトへの投与のための製造、使
用および販売の承認を示すものである。加えて、アルブミン融合タンパク質およ
び／またはポリヌクレオチドは、他の治療用化合物と一緒に使用してもよい。
【０２７８】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独
、もしくはアジュバントと組み合わせて投与することができる。本発明のアルブ
ミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することがで
きるアジュバントとして、限定するものではないが、ミョウバン、ミョウバンと
デオキシコール酸塩（ImmunoAg）、MTP-PE（Biocine Corp.）、QS21（Genentech
, Inc.）、BCG（例えば、THERACYS（登録商標））、MPL、ならびに、Corynebact
erium parvumの無生育性調製物が挙げられる。特定の実施形態では、本発明のア
ルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ミョウバンと組み
合わせて投与する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク
質および／またはポリヌクレオチドは、QS-21と組み合わせて投与する。上記以
外に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一
緒に投与することができるアジュバントとして、限定するものではないが、モノ
ホスホリル脂質イムノモジュレーター、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005
、アルミニウム塩、MF-59、ならびに、ヴィロソマル（Virosomal）アジュバント
技法が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌク
レオチドと一緒に投与することができるワクチンとして、限定するものではない
が、MMR（麻疹、ムンプス、風疹）、ポリオ、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型
肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、百日咳、肺炎、インフルエンザ、ライ
ム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱、日本脳炎、ポリオ（灰白髄炎）、狂犬病、
チフス熱、および百日咳を防御するワクチンが挙げられる。このような組合せは
、同時に、例えば、混合物として、または、別々だが同時に；あるいは、逐次的
に、のいずれの方式で投与してもよい。これには、組み合わせた薬剤を治療混合
物として投与する形態、また、組み合わせた薬剤を別々だが同時に、例えば、別
々の静脈内経路を介して同じ患者に投与する処置が含まれる。「組合せ式」投与
には、さらに、最初に化合物または薬剤の１つを投与した後、次のものを投与す
る個別投与が含まれる。
【０２７９】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独
、もしくはその他の治療薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のア
ルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与す
ることができるアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド薬剤
として、限定するものではないが、化学療法薬、抗生物質、ステロイドおよび非
ステロイド系抗炎症剤、通常の免疫治療薬、および／または以下に記載する治療
薬が挙げられる。このような組合せは、同時に、例えば、混合物として、または
、別々だが同時に；あるいは、逐次的に、のいずれの方式で投与してもよい。こ
れには、組み合わせた薬剤を治療混合物として投与する形態、また、組み合わせ
た薬剤を別々だが同時に、例えば、別々の静脈内経路を介して同じ患者に、投与
する処置が含まれる。「組合せ式」投与には、さらに、最初に化合物または薬剤
の１つを投与した後、次のものを投与する個別投与が含まれる。
【０２８０】 一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌク
レオチドは、抗凝固剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と組み合わせて
投与することができる抗凝固剤として、限定するものではないが、ヘパリン、低
分子量ヘパリン、ワルファリンナトリウム（例えば、COUMADIN（登録商標））、
ジクマロール（dicumarol）、4-ヒドキシクマリン、アニシンジオン（例えば、M
IRADON（商標））、アセノクマロール（例えば、ニクマロン、SINTHROME（商標
））、インダン-1,3-ジオン、フェンプロクモン（例えば、MARCUMAR（商標））
、ビスクマ酢酸エチル（例えば、TROMEXAN（商標））、ならびに、アスピリンが
挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／または
ワルファリンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、本発明の組成
物は、ワルファリンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、本発明
の組成物は、ワルファリンおよびアスピリンと組み合わせて投与する。別の特定
の実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンと組み合わせて投与する。さらに
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み
合わせて投与する。
【０２８１】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、血栓崩壊剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と組み合わ
せて投与することができる血栓崩壊剤として、限定するものではないが、プラス
ミノーゲン、リシン−プラスミノーゲン、α2-抗プラスミン、ストレプトキナー
ゼ（例えば、KABIKINASE（商標））、抗レスプラス（antireplace）（例えば、E
MINASE（商標））、組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA、アルテバーゼ
、ACTIVASE（商標））、ウロキナーゼ（例えば、ABBOKINASE（商標））、ソール
プラーゼ（プロウロキナーゼ、一本鎖ウロキナーゼ）、ならびに、アミノカプロ
ン酸（例えば、AMICAR（商標））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の
組成物は、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびアスピリンと組み合わせ
て投与する。
【０２８２】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、抗血小板剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与
することができる抗血小板剤として、限定するものではないが、アスピリン、ジ
ピリダモール（例えば、PERSANTINE（商標））、ならびに、チクロピジン（例え
ば、TICLID（商標））が挙げられる。
【０２８３】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリ
ヌクレオチドと組み合わせた、抗凝固剤、血栓崩壊剤および／または抗血小板剤
は、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム硬化
症、心筋梗塞、一時性虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、および／または治
療を目的とする使用が考えられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融
合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせた、抗凝固剤、血栓
崩壊剤および／または抗血小板剤は、伏在移植片の閉塞の予防、血管形成術に伴
う恐れのある手術周辺血栓症の危険性の低減、非リウマチ性心房細動のような心
房細動を有する患者の発作の危険性の軽減、機械心臓弁および／または僧帽弁疾
患に関連する塞栓症の危険性の低減を目的とする使用が考えられる。その他、本
発明の治療薬を単独で、または、抗血小板剤、抗凝固剤、および／または血栓崩
壊剤と組み合わせた用途には、限定するものではないが、体外装置（例えば、血
管内カニューレ、血液透析患者における血管進入シャント、血液透析機、ならび
に、心肺バイパス機）におえける閉塞の予防がある。
【０２８４】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリ
ヌクレオチドは、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転酵素写
阻害剤（NRTI）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NNRTI）、および／または
プロテアーゼ阻害剤（PI）と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タ
ンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる
NRTIとして、限定するものではないが、RETROVIR（商標）（ジドブジン／AZT）
、VIDEX（商標）（ジダノシン／ddI）、HIVID（商標）（ザルシタビン／ddC）、
ZERIT（商標）（スタブジン／d4T）、EPIVIR（商標）（ラミブジン／3TC）、な
らびにCOMBIVIR（商標）（ジドブジン／ラミブジン）が挙げられる。本発明のア
ルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与す
ることができるNNRTIとして、限定するものではないが、VIRAMUNE（商標）（ネ
ビラピン）、RESCRIPTOR（商標）（デラビルジン）、およびSUSTIVA（商標）（
エファビレンツ）が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／ま
たはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができるプロテアーゼ阻害剤
として、限定するものではないが、CRIXIVAN（商標）（インジナビル）、NORVIR
（商標）（リトナビル）、INVIRASE（商標）（サキナビル）およびVIRACEPT（商
標）（ネルフィナビル）が挙げられる。特定の実施形態では、抗レトロウイルス
剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および
／またはプロテアーゼ阻害剤は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／ま
たはポリヌクレオチドと組み合わせて、AIDSの治療および／またはHIV感染の予
防または治療に用いることができる。
【０２８５】 これ以外のNRTIとして、下記のものが挙げられる：LONDENOSINE（商標）（F-d
dA；酸安定性アデノシンNRTI；Triangle/Abbott）；COVIRACIL（商標）（エント
リシタビン／FTC；ラミブジン（3TC）と構造的に関連するが、in vitroで活性が
３〜10倍高い；Triangle/Abbott）；dOTC（BCH-10652、これもラミブジンと構造
的に関連するが、実質的比率のラミブジン耐性単離物に対して、活性を保持する
；Biochem Pharma）；アデフォビル（Adefovir）（抗HIV療法についての承認をF
DAにより拒絶された；Gilead Sciences）；PREVEON（登録商標）（アデフォビル
ジピボキシル（Adefovir Dipivoxil、アデフォビルの活性プロドラッグ；その活
性形態は、PMEA-pp）；TENOFOVIR（商標）（ビス−POC PMPA、PMPAプロドラッグ
；Ｇilead）；DAPD/DXG（DAPDの活性代謝物；Triangle/Abbott）；D-D4FC（３TC
に関連し、AZT/3CT耐性ウイルスに対する活性を有する）；GW420867X（Glaxo We
llcome）；ZIAGEN（商標）（アバカビル（abacavir）/159U89；Glaxo Wellcome
Inc.）；CS-87（3’アジド-2’,3’-ジデオキシウリジン；WO99/66936）；なら
びに、S-アシル-2-チオエチル（SATE）含有プロドラッグ形態のβ-L-FD4Cおよび
β-L-FddC（国際公開番号WO98/17281を参照）。
【０２８６】 その他のNNRTIとして、下記のものが挙げられる：COACTINON（商標）（エミビ
リン（Emivirine）/MKC-442、HEPTクラスの効力のあるNNRTI；Triangle/Abbott
）；CAPRAVIRINE（商標）（AG-1549/S-1153、K103N突然変異を含むウイルスに対
する活性を有する次世代NNRTI；Agouron）；PNU-142721（その先祖デラビルジン
より20〜50倍高い活性を有し、K103N突然変異体に対して活性である；Pharmacia
& Upjohn）；DPC-961およびDPC-963（エファビレンツの第２世代誘導体で、K10
3N突然変異を有するウイルスに対して活性であるように設計されている；DuPont
）；GW-420867X（HBY097の25倍高い活性を有し、K103N突然変異体に対して活性
である；Glaxo Wellcome）；CALANOLIDE A（ラテックスツリーからの天然に存在
する物質；Y181CおよびK103N突然変異のいずれかまたは両方を含むウイルスに対
して活性である）；ならびに、プロポリス（Propolis）（国際公開番号WO99/498
30を参照）。
【０２８７】 前記以外のプロテアーゼ阻害剤として、下記のものが挙げられる：LOPINAVIR
（商標）（ABT378/r；Abbott Laboratories）；BMS-232632（アザペプチド；Bri
stol-Myres Squibb）；TIPRANAVIR（商標）（PNU-140690、非消化性ジヒドロピ
ロン；Pharmacia & Upjohn）；PD-178390（非ペプチドジヒドロピロン；Parke-D
avis）；BMS 232632（アザペプチド；Bristol-Myers Squibb）；L-756,423（イ
ンジナビル類似体；Merck）；DMP-450（環状尿素化合物；Avd & DuPont）；AG-1
776（プロテアーゼ阻害剤耐性ウイルスに対してin vitro活性をもつペプチド模
擬物；Agouron）；VX-175/GW-433908（アンプレナビルのリン酸プロドラッグ；V
ertex & Glaxo Welcome）；CGP61755（Ciba）；ならびに、AGENERASE（商標）（
アンプレナビル；Glaxo Wellcome Inc.）。
【０２８８】 他の抗レトロウイルス剤に、融合阻害剤／gp41結合剤がある。融合阻害剤／gp
41結合剤としては、T-20（その休止状態で、gp41と結合し、融合誘導状態への形
質転換を阻止するHIV gp41膜貫通タンパク質ectodomainの残基643-678由来のペ
プチド；Trimeris）と、T-1249（第２世代融合阻害剤；Trimeris）が挙げられる
。
【０２８９】 別の抗レトロウイルス剤に、融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストが
ある。融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストとしては、AMD3100（ビシ
クラム）、SDF-1およびその類似体、ならびに、ALX40-4C（カチオンペプチド）
、T22（18アミノ酸ペプチド；Trimeris）、T22類似体T134およびT140などのCXCR
4アンタゴニスト；RANTES(9-68)、AOP-RANTES、NNY-RANTES、およびTAK-779など
のCCR5アンタゴニスト；ならびに、NSC 651016（ジスタマイシン類似体）のよう
なCCR5/CXCR4アンタゴニストが挙げられる。また、CCR2B、CCR3およびCCR6アン
タゴニストも含まれる。また、RANTES、SDF-1、MIP-1α、MIP-1βなどのケモカ
イン受容体アゴニストも融合を阻害する。
【０２９０】 別の抗レトロウイルス剤に、インテグラーゼ阻害剤がある。インテグラーゼ阻
害剤としては、下記のものが挙げられる：ジカフェオイルキン酸（DFQA）；L-キ
コル（L-chicoric）酸（ジカフェオイル酒石酸（DCTA））；キナリザリン（QLC
）および関連アントラキノン；ZINTEVIR（商標）（AR 177、真性インテグラーゼ
阻害剤としてよりは、細胞表面で作用すると考えられるオリゴヌクレオチド；Ar
ondex）；ならびに、WO98/50347に開示されたものなどのナフトール。
【０２９１】 別の抗レトロウイルス剤として、下記のものが挙げられる：BCX-34（プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ阻害剤；Biocryst）のようなヒドロキシ尿素様化合物
；DIDOX（商標）（Molecules for Health）のようなリボヌクレオチドレダクタ
ーゼ阻害剤；VX-497（Vertex）のようなイノシンモノリン酸デヒドロゲナーゼ（
IMPDH）阻害剤；およびCellCept（ミコフェノール酸モフェチル；Roche）のよう
なミコフェノール酸。
【０２９２】 別の抗レトロウイルス剤として、下記のものが挙げられる：ウイルスインテグ
ラーゼの阻害剤、アリーレンビス（メチルケトン）化合物のようなウイルスゲノ
ム核転座の阻害剤；AOP-RANTES、NNY-RANTES、RAVTES-IgG融合タンパク質、RANT
ESの可溶性複合体およびグリコサミノグリカン(GAG)、ならびにAMD-3100などのH
IV侵入の阻害剤；ジチアン化合物のようなヌクレオキャプシドジンクフィンガー
阻害剤；HIV TatおよびRevの標的；ならびに、ABT-378のような薬理エンハンサ
ー。
【０２９３】 その他の抗レトロウイルス治療薬および補助治療薬として、下記のものが挙げ
られる：MIP-1α、MIP-1β、SDF-1α、IL-2、PROLEUKIN（商標）（アルデスロイ
キン／L2-7001；Chiron）、IL-4、IL-10、IL-12およびIL-13などのサイトカイン
およびリンホカイン；IFN-α2aのようなインターフェロン；TNF、NFкB、CM-CSF
、M-CSFおよびIL-10のアンタゴニスト；シクロスポリンおよびプレドニソンなど
、免疫活性化をモジュレートする物質；Remune（商標）（HIV免疫原）、APL 400
-003（Apollon）、組換えgp120および断片、二価（B/E）組換えエンベロープ糖
タンパク質、rgp120CM235、MN rgp120、SF-2 rgp120、gp120／可溶性CD4複合体
、デルタJR-FLタンパク質、不連続gp120 C3/C4ドメインから誘導された分枝合成
ペプチド、融合−コンピテント免疫原、ならびに、Gag、Pol、NefおよびTatワク
チンなどのワクチン；遺伝子抑制エレメント（GSE；WO98/54366）、イントラカ
イン（新しく合成されたCCR5の表面発現を阻止するため、ERにターゲッティング
された遺伝子修飾CCケモカイン）（Yangら、PNAS 94：11567-72（1997）；Chen
ら、Nat. Med. 3:1110-16（1997））などの遺伝子に基づく治療薬；抗CXCR4抗体
12G5、抗CCR5抗体2D7、5C7、PA8、PA9、PA10、PA11、PA12およびPA14、抗CD4抗
体Q4120およびRPA-T4、抗CCR3抗体7B11、抗gp120抗体17b、48d、447-52D、257-D
、268-Dおよび50.1、抗Tat抗体、抗TNF-α抗体、およびモノクローナル抗体33A
などの抗体；TCDD、3,3’,4,4’,5-ペンタクロロビフェニル、3,3’,4,4’-テト
ラクロロビフェニル、およびαナフトホフラボン（国際公開WO 98/30213参照）
などのアリール炭化水素（AH）受容体アゴニストおよびアンタゴニスト；ならび
に、γ-L-グルタミル-L-システインエチルエステル（γ-GCE；国際公開番号WO99
/56764）などの酸化防止剤。
【０２９４】 さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
ポリヌクレオチドを、抗ウイルス剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミ
ン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与すること
ができる抗ウイルス剤として、限定するものではないが、アシクロビル、リバビ
リン、アマンタジンおよびレマンチジンが挙げられる。
【０２９５】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、抗日和見感染剤と組み合わせて投与することができる。本発明の
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与
することができる抗日和見感染剤として、限定するものではないが、下記のもの
が挙げられる：TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE（商標）、DAPSONE（商標）PENT
AMIDINE（商標）、ATOVAQUONE（商標）、ISONIAZID（商標）、RIFAMPIN（商標）
、PYRAZINAMIDE（商標）、ETHAMBUTOL（商標）、RIFABUTIN（商標）、CLARITHRO
MYCIN（商標）、AZITHROMYCIN（商標）、GANCICLOVIR（商標）、FOSCARNET（商
標）、CIDOFOVIR（商標）、FLUCONAZOLE（商標）、ITRACONAZOLE（商標）、KETO
CONAZOLE（商標）、ACYCLOVIR（商標）、FAMCICOLVIR（商標）、PYRIMETHAMINE
（商標）、LEUCOVORIN（商標）、NEUPOGEN（商標）（フィルグラスチム/G-CSF）
、ならびにLEUKINE（商標）（サルグラモスチム/GM-CSF）。特定の実施形態では
、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、TRIM
ETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE（商標）、DAPSONE（商標）、PENTAMIDINE（商標）
、および／またはATOVAQUONE（商標）のいずれかと組み合わせて用いることによ
り、日和見ニューモサイティスカリニ肺炎感染を予防的に治療もしくは予防する
。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
ポリヌクレオチドは、ISONIAZID（商標）、RIFAMPIN（商標）、PYRAZINAMIDE（
商標）、および／またはETHAMBUTOL（商標）のいずれかと組み合わせて用いるこ
とにより、日和見トリ結核菌複合感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特
定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌク
レオチドは、RIFABUTIN（商標）、CLARITHROMYCIN（商標）、および／またはAZI
THROMYCIN（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見ヒト結
核菌複合感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発
明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、GANCICLOVI
R（商標）、FOSCARNET（商標）、および／またはCIDOFOVIR（商標）のいずれか
と組み合わせて用いることにより、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に
治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タン
パク質および／またはポリヌクレオチドは、FLUCONAZOLE（商標）、ITRACONAZOL
E（商標）、および／またはKETOCONAZOLE（商標）のいずれかと組み合わせて用
いることにより、日和見真菌感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の
実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオ
チドは、ACYCLOVIR（商標）、および／またはFAMCICOLVIR（商標）のいずれかと
組み合わせて用いることにより、日和見単純ヘルペスI型および／またはII型感
染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブ
ミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、PYRIMETHAMINE（商標
）、および／またはLEUCOVORIN（商標）のいずれかと組み合わせて用いることに
より、日和見トキソプラスマ感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の
実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオ
チドは、LEUCOVORIN（商標）、および／またはNEUPOGEN（商標）のいずれかと組
み合わせて用いることにより、日和見細菌感染を予防的に治療もしくは予防する
。
【０２９６】 さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
ポリヌクレオチドを、抗生物質と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融
合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することがで
きる抗生物質として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：アモ
キシシリン、β-ラクタマーゼ、アミノグリコシド、β-ラクタム（グリコペプチ
ド）、β-ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロ
スポロリン、シプロフロキサシン、エリトロマイシン、フルオロキノロン、マク
ロリド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、ラパマイシン、リファンピ
ン、ストレプトマイシン、スルフォンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリ
ム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシン。
【０２９７】 他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドを、免疫刺激剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タ
ンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる
免疫刺激剤として、限定するものではないが、レバミソール（例えば、ERGAMISO
L（商標））、イソプリノシン（例えば、INOSIPLEX（商標））、インターフェロ
ン（例えば、インターフェロンα）、およびインターロイキン（例えば、IL-2）
が挙げられる。
【０２９８】 他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドを、免疫抑制剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タ
ンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる
免疫抑制剤として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる
：ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似体、シクロホスファミド、
メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、FK-506、15-デオキシス
ペルグアリン、ならびに、T細胞に応答する機能を抑制することより作用するそ
の他の免疫抑制剤。これ以外に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／ま
たはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる免疫抑制剤として、
限定するものではないが、下記のものが挙げられる：プレドニゾロン、メトトレ
キセート、タリドミド、メトクスサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリ
ビン（BREDININ（商標））、ブレキナール、デオキシスペルグアリン、およびア
ザスピラン（SKF 105685）、ORTHOCLONE OKT（登録商標）3（ムロモノナブ-CD3
）、SANDIMMUNE（商標）、NEORAL（商標）、SANGDYA（商標）（シクロスポリン
）、PROGRAF（登録商標）（FK506、タクロリマス）、CELLCEPT（登録商標）（ミ
コフェノール酸モテフィル、その活性代謝物は、ミコフェノール酸）、IMURAN（
商標）（アザチオプリン）、グルココルチコステロイド、DELTASONE（商標）（
プレドニゾン）およびHYDELTRASOL（商標）（プレドニゾロン）などの副腎皮質
ステロイド、FOLEX（商標）およびMEXATE（商標）（メトトレキセート）、OXSOR
ALEN-ULTRA（商標）（メトクスサレン）ならびにRAPAMUNE（商標）（シロリマス
）。特定の実施形態では、器官または骨髄移植の拒絶を防止するために、免疫抑
制剤を用いることができる。
【０２９９】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドを、単独で、または１種以上の静脈内免疫グロブリン製剤と組み合わ
せて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオ
チドと組み合わせて投与することができる静脈内免疫グロブリン製剤として、限
定するものではないが、GAMMAR（商標）、IVEEGAM（商標）、SANDOGLOBLIN（商
標）、GAMMAGARD S/D（商標）、ATGAM（商標）（抗胸腺細胞グルブリン）、およ
びGAMINUNE（商標）を挙げることができる。特定の実施形態では、本発明のアル
ブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、静脈内免疫グロブリ
ン製剤と組み合わせて、移植治療（例えば、骨髄移植）に際して投与する。
【０３００】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリ
ヌクレオチドを単独で、または抗炎症剤と組み合わせて投与する。本発明のアル
ブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与する
ことができる抗炎症剤として、限定するものではないが、下記のものを挙げるこ
とができる：コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチ
ゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン、プレドニソ
ロン、プレドニソン、およびトリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症剤（例
えば、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロク
タフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロ
フェン、メクロフェナム酸塩、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプ
ロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テ
ノキシカム、チアプロフェン酸、およびトルメチン）、ならびに、抗ヒスタミン
剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリールブチル酸
誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラ
ゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、e-アセトアミドカプロン
酸、S-アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシブチル酸、アミキセトリ
ン、ベンダザク、ベンジドアミン、ブコロム、ジフェンピルアミド、ジタゾール
、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、
オキサセプロール、パラニリン、ペリソキサル、ピホキシム、プロカゾン、プロ
キサゾール、およびテニダプ。
【０３０１】 別の実施形態では、本発明の組成物は、単独で、または抗血管新生剤と組み合
わせて投与する。本発明の組成物と一緒に投与することができる抗血管新生剤と
しては、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：アンジオスタチン
（Entremed, Rockville, MD）、トロポニン-1（Boston Life Sciences, Boston,
MA）、抗侵襲因子剤（anti-Invasive Factor）、レチン酸およびその誘導体、
パクリタクセル（Taxol）、スラミン（Suramin）、メタロプロテイナーゼ-1の組
織阻害剤（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1）、メタロプロテイナー
ゼ-2の組織阻害剤、VEGI、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1（Plasmino
gen Activator Inhibitor-1）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-2、な
らびに、様々な形態の軽「d族」遷移金属。
【０３０２】 軽「d族」遷移金属には、例えば、バナジウム、モリブデン、タングステン、
チタン、ニオブ、およびタンタルの種がある。このような遷移金属種は、遷移金
属錯体を形成することもできる。上記遷移金属種の好適な錯体として、オキソ遷
移金属錯体が挙げられる。
【０３０３】 バナジウム錯体の代表例として、バナジン酸塩やバナジル錯体のようなオキソ
バナジウム錯体がある。好適なバナジン酸塩錯体として、例えば、メタバナジン
酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン酸ナトリウ
ムなどのメタバナジン酸塩およびオルトバナジン酸塩錯体が挙げられる。好適な
バナジル錯体として、例えば、アセチルアセトン酸バナジルや、一および三水和
硫酸バナジルのような水和硫酸バナジルなどの硫酸バナジルが挙げられる。
【０３０４】 タングステンおよびモリブデン錯体の代表例として、やはりオキソ錯体が挙げ
られる。好適なオキソタングステン錯体には、タングステン酸塩および酸化タン
グステン錯体がある。好適なタングステン酸塩錯体として、タングステン酸アン
モニウム、タングステン酸カルシウム、二水和タングステン酸ナトリウム、およ
びタングステン酸が挙げられる。好適な酸化タングステンとして、酸化タングス
テン（IV）および酸化タングステン（VI）がある。好適なオキソモリブデン錯体
として、モリブデン酸塩、酸化モリブデン、およびモリブデニル錯体がある。好
適なモリブデン酸塩錯体としては、モリブデン酸アンモニウムとその水和物、モ
リブデン酸ナトリムとその水和物、モリブデン酸カリウムとその水和物が挙げら
れる。好適な酸化モリブデンとして、酸化モリブデン（IV）、酸化モリブデン（
VI）およびモリブデン酸がある。好適なモリブデニル錯体には、例えば、アセチ
ルアセトン酸モリブデニルがある。その他の好適なタングステンおよびモリブデ
ン錯体として、例えば、グリセロール、酒石酸、および糖に由来するヒドロキソ
（hydroxo）誘導体が挙げられる。
【０３０５】 上記以外にも、非常に多様な抗血管新生因子を本発明に関して用いることがで
きる。その代表例として、限定するものではないが、血小板第４因子；硫酸プロ
トアミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブの殻から調製した）（Murataら
、Cancer Res. 51：22-26（1991））；硫酸化多糖ペプチドグリカン錯体（SP-PG
）（この化合物の機能は、エストロゲンやクエン酸タモキシフェンのようなステ
ロイドの存在により増強することができる）；ストーロスポリン；マトリックス
代謝のモジュレーター、例えば、プロリン類似体、シスヒドロキシプロリン、d,
L-3,4-デヒドロプロリン、チアプロリン、α,α-ジピリジル、フマル酸アミノ
プロピオニトリル；4-プロピル-5-(4-ピリジニル)-2(3H)-オキサゾロン；メトト
レキセート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；2マクログロブ
リン-血清；ChIMP-3（Pavloffら、J. Bio. Chem. 267：17321-17326, （1992）
）；キモスタチン（Tomkinsonら、Biochem J. 286：475-480、（1992））；テト
ラデカ硫酸シクロデキストリン；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン
（Ingberら、Nature 348：555-557、（1990））；金チオリンゴ酸ナトリウム（
”GST”；MatsubaraおよびZiff, J. Clin. Invest. 79：1440-1446、（1987））
；抗コラゲナーゼ血清；α2-抗プラスミン（Holmesら、J. Biol. Chem. 262(4)
：1659-1664、（1987））；ビサントレン（Bisantrene）（National Cancer Ins
titute）；ロベンザリト（Lobenzarit）二ナトリウム（N-(2)-カルボキシフェニ
ル-4-クロロアントロニル酸二ナトリウム、すなわち”CCA”；（Takeuchiら、Ag
ents Actions 36：312-316、（1992））；ならびに、BB94のようなメタロプロテ
イナーゼ阻害剤。
【０３０６】 本発明の範囲内で使用できるさらに別の抗血管新生因子として、下記のものが
挙げられる：タリドミド（Thalidomide）（Celgene, Warren, NJ）；アンジオス
タティックステロイド；AGM-1470（H. BremおよびJ. Folkman, J Pediatr. Surg
. 28：445-51（1993））；インテグリンアルファvベータ3アンタゴニスト（C. S
torgardら、 J Clin. Invest. 103：47-54（1999））；カルボキシアミノールミ
ダゾール；カルボキシアミドトリアゾール（CAI）（National Cancer Institute
, Bethesda, MD）；コンブレタスタチンA-4（CA4P）（OXiGENE, Boston, MD）；
スクアラミン（Magainin Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA）；TNP-470
（Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL）；ZD-0101 AstraZeneca（London, UK
）；APRA（CT2584）；ベネフィン、バイロスタチン-1（SC339555）；CGP-41251
（PKC412）；CM101；デキスラゾキサン（ICRF187）；DMXAA；エンドスタチン；
フラボプリジオール；ゲネステイン；GTE；ImmTher；イレッサ（Iressa）（ZD18
39）；オクトレオチド（Somatostatin）；パンレチン；ペナシルアミン；フォト
ポイント（Photopoint）；PI-88；プリノマスタート（Prinomastat）（AG-3340
）プルリチン；スラジスタ（FCE26644）；タモキシフェン（Nolvadex）；タザロ
テン；テトラチオモリブデン酸塩；キセロダ（カペシタビン）；および5-フルオ
ロウラシル。
【０３０７】 本発明の化合物と一緒に投与することができる抗血管新生剤は、限定するもの
ではないが、以下に挙げるような様々な機構により作用する：細胞外マトリック
スのタンパク質分解を阻害する；上皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能
を阻止する；増殖因子などの血管新生誘発物質の機能に対抗する；増殖上皮細胞
に発現されるインテグリン受容体を阻害する。細胞外マトリックスタンパク質分
解を妨害するもので、本発明の組成物と組み合わせて投与することができる抗血
管新生剤の例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：AG-3
340（Agouron、La Jolla, CA）、BAY-12-9566（Bayer, West Haven, CT）、BMS-
275291（Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ）、CGS-27032A（Novartis, Eas
t Hanover, NJ）、マリマスタート（Marimastat）（British Biotech, Oxford,
UK）、およびメタスタート（Metastat）（Aeterna, St-Foy, Quebec）。上皮細
胞−細胞外マトリックス接着分子の機能を阻害することにより作用するもので、
本発明の組成物と組み合わせて投与することができる抗血管新生剤の例として、
限定するものではないが、下記のものが挙げられる：EMD-121974（Merck KcgaA
Darmstadt, Germany）およびビタキシン（Vitaxin）（Ixsys, La Jolla, CA/Med
immune, Gaithersburg, MD）。血管新生誘発物質に直接対抗する、もしくは血管
新生を阻害するもので、本発明の組成物と組み合わせて投与することができる抗
血管新生剤の例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：ア
ンギオジーム（Angiozyme）（Ribozyme, Boulder, CO）、抗VEGF抗体（Genentec
h, S. San Francisco, CA）、PTK-787/ZK-225846（Novartis, Basel, Switzerla
nd）、SU-101（Sugen, S. San Francisco, CA）、SU-5416（Sugen/Pharmacia Up
john, Bridgewater, NJ）、ならびにSU-6668（Sugen）。その他の抗血管新生剤
は、間接的に血管新生を阻害する。本発明の組成物と組み合わせて投与すること
ができる、血管新生の間接的阻害剤の例としては、IM-862（Cytran, Kirkland,
WA）、インターフェロン-α、IL-2（Roche, Nutley, NJ）、およびポリ硫酸ペン
トサン（Georgetown University, Washington, DC）が挙げられる。
【０３０８】 特定の実施形態では、抗血管新生剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、
例えば、本明細書に記載する自己免疫疾患などの自己免疫疾患の治療、予防、お
よび／または改善を目的として考えられる。
【０３０９】 特定の実施形態では、抗血管新生剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、
関節炎の治療、予防、および／または改善を目的として考えられる。さらに具体
的な実施形態では、抗血管新生剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、リウ
マチ様関節炎の治療、予防、および／または改善を目的として考えられる。
【０３１０】 別の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
血管新生タンパク質、または血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチド
と組み合わせて、投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与することができ
る血管新生タンパク質の例として、限定するものではないが、酸性および塩基性
繊維芽細胞成長因子、VEGF-1、VEGF-2、VEGF-3、表皮成長因子αおよびβ、血小
板由来の上皮細胞成長因子、血小板由来の成長因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞成
長因子、インスリン様成長因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺
激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、およびNOシンターゼが挙げ
られる。
【０３１１】 別の実施形態では、本発明の組成物は、化学治療薬と組み合わせて投与する。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投
与することができる化学治療薬として、限定するものではないが、下記のものが
挙げられる：ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホス
ファミド、シクロホスファミドイフォスファミド、メルファラン（L-サルコリシ
ン）、およびクロルアンブシル）などのアルキル化剤、エチレンイミンおよびメ
チルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミンとチオテパ）、スルホン酸アルキ
ル（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（BCNU）、
ロムスチン（CCNU）、セムスチン（メチル−CCNU）、およびストレプトゾシン（
ストレプトゾトシン））、トリアゼン（例えば、ダカルバジン（DTIC；ジメチル
トリアゼノイミダゾールカルボキサミド））、葉酸類似体（例えば、メトトレキ
セート（アメトプテリン））、ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル（
5-フルオロウラシル；5-FU）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；
FudR）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））、プリン類似体および関
連阻害剤（例えば、メルカプトプリン（6-メルカプトプリン；6-MP）、チオグア
ニン（6-チオグアニン；TG）、およびペントスタチン（2’-デオキシコフォルマ
イシン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（VLB、硫酸ビンブラ
スチン））およびビンクリスチン（硫酸ビンクリスチン））、エピポドフィルロ
トキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチ
ノマイシン（アクチノマイシンD）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビド
マイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシ
ン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンC）、酵素（例えば、L-アスパラ
ギナーゼ）、生体応答調節剤（例えば、インターフェロン-αおよびインターフ
ェロン-α-2b）、白金配位化合物（例えば、シスプラチン（シス-DDP）およびカ
ルボプラチン）、アントラセネジオン（ミトキサントロン）、置換尿素（例えば
、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（N-メ
チルヒドラジン；MIH）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニソン）、プロ
ゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲス
テロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、エスト
ロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（DES）、二リン酸ジエチルスチ
ルベストロール、エストラジオール、およびエチニルエストラジオール）、抗エ
ストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（プロピオン酸テストス
テロン、およびフルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（例えば、フルトアミ
ド）、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（例えば、ロイプロリド）、その他の
ホルモンおよびホルモン類似体（例えば、メチルテストステロン、エストラムス
チン、リン酸エストラムスチンナトリウム、クロロトリアニセン、およびテスト
ラクトン）、ならびにその他（例えば、ジカルバジン、グルタミン酸およびミト
タン）。
【０３１２】 一実施形態では、本発明の組成物は、以下に挙げる薬剤の１種以上と組み合わ
せて投与する：インフリキシマブ（infliximab）（また、Remidade（商標）とし
ても知られる。Centocor, Inc.）、トロカド（Roche, RO-32-3555）、レフルノ
ミド（また、Hoechst Marion Roussel製のArava（商標）としても知られる）、
キネレト（Kineret）（商標）（Amgen, Inc.製のAnakinraとしても知られるIL-1
受容体アンタゴニスト）。
【０３１３】 特定の実施形態では、本発明の組成物は、CHOP（シクロホスファミド、ドクソ
ルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソン）、あるいは、CHOPの１以上の
成分と組み合わせて投与する。一実施形態では、本発明の組成物は、抗CD20抗体
、ヒトモノクローナル抗CD20抗体と組み合わせて投与する。別の実施形態では、
本発明の組成物は、抗CD20抗体およびCHOPと組み合わせて、もしくは抗CD20抗体
およびCHOPの１以上の成分の組合せ、特に、シクロホスファミドおよび／または
プレドニソンと一緒に投与する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、リツ
キシマブ（Rituximab）と組み合わせて投与する。さらに別の実施形態では、本
発明の組成物は、リツキシマブ（Rituximab）およびCHOPと組み合わせて、ある
いは、リツキシマブおよびCHOPのいずれか１以上の成分の組合せ、特に、シクロ
ホスファミドおよび／またはプレドニソンと一緒に投与する。特定の実施形態で
は、本発明の組成物は、トシツモマブ（tositumomab）と組み合わせて投与する
。特定の実施形態では、本発明の組成物は、トシツモマブと組み合わせて投与す
る。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、トシツモマブおよびCHOPと一
緒に、あるいは、トシツモマブおよびCHOPのいずれか１以上の成分の組合せ、特
に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニソンと一緒に投与する。上記抗
CD20抗体は、場合によっては、放射性同位元素、毒素または細胞傷害性プロドラ
ッグと結合させてもよい。
【０３１４】 別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ゼバリン（Zevalin）（商標）
と組み合わせて投与する。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、ゼバリ
ン（商標）およびCHOPと一緒に、あるいは、ゼバリン（商標）およびCHOPのいず
れか１以上の成分の組合せ、特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニ
ソンと一緒に投与する。ゼバリン（商標）は、１以上の放射性同位元素と結合さ
せてもよい。特に好ましい放射性同位元素は、90Yと111Inである。
【０３１５】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、サイトカインと組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合
タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるサイ
トカインは、限定するものではないが、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、
IL12、IL13、IL15、抗CD40、CD40L、IFN-γおよびTNF-αが挙げられる。別の実
施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチ
ドは、限定するものではないが以下に挙げるいずれかのインターロイキンと一緒
に投与することができる：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL
-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、
IL-18、IL-19、IL-20、およびIL-21。
【０３１６】 一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌク
レオチドは、TNFファミリーのメンバーと組み合わせて投与する。本発明のアル
ブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することが
できるTNF、TNF関連またはTNF様分子としては、限定するものではないが、下記
のものが挙げられる：可溶性形態のTNF-α、リンホトキシン-α（LT-α、また、
TNF-βとしても知られる）、LT-β（複雑なヘテロ三量体LT-α2-βに存在する）
、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ（国際公開
WO 96/14328）、AIM-I（国際公開WO97/33899）、エンドカイン-α（国際公開WO
98/07880）、OPG、およびニュートロカイン-α（国際公開WO98/18921）、OX40、
および神経成長因子（NGF）、ならびに、可溶性形態のFas、CD30、CD27、CD40お
よび4-IBB、TR2（国際公開WO96/34095）、DR3（国際公開WO97/33904）、DR4（国
際公開WO98/32856）、TR5（国際公開WO98/30693）、TRANK、TR9（国際公開WO98/
56892）、TR10（国際公開WO98/54202）、312C12（国際公開WO 98/06842）、およ
びTR12、ならびに、可溶性形態のCD154、CD70およびCD153。
【０３１７】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、血管新生タンパク質と組み合わせて投与する。本発明のアルブミ
ン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができ
る血管新生タンパク質としては、限定するものではないが、下記のものが挙げら
れる：欧州特許EP-399816に開示されているようなグリオーマ由来増殖因子（GDG
F）；欧州特許EP-682110に開示されているような血小板由来増殖Ａ因子（PDGF-A
）；欧州特許EP-282317に開示されているような血小板由来増殖Ｂ因子（PDGF-B
）；国際公開WO92/06194に開示されているような胎盤成長因子（PlGF）；Hauser
ら、Growth Factors, 4：259-268（1993）に開示されているような胎盤成長第２
因子（PlGF-2）；国際公開WO90/13649に開示されているような血管上皮成長因子
（VEGF）；欧州特許EP-506477に開示されているような血管上皮成長Ａ因子（VEG
F-A）；国際公開WO96/39515に開示されているような血管上皮成長第２因子（VEG
F-2）；血管上皮成長Ｂ因子（VEGF-3）；国際公開WO 96/26736に開示されている
ような血管上皮成長B-186因子（VEGF-B-186）；国際公開WO98/02543に開示され
ているような血管上皮成長Ｄ因子（VEGF-D）；国際公開WO98/07832に開示されて
いるような血管上皮成長Ｄ因子（VEGF-D）；ドイツ国特許DE19639601に開示され
ているような血管上皮成長Ｅ因子（VEGF-E）。尚、上記の参照文献は、その全文
を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３１８】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、繊維芽細胞成長因子と組み合わせて投与する。本発明のアルブミ
ン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができ
る繊維芽細胞成長因子として、限定するものではないが、FGF-1、FGF-2、FGF-3
、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-
13、FGF-14、およびFGF-15が挙げられる。
【０３１９】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、造血成長因子と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合
タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる造血
成長因子として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：顆粒球マ
クロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）（サルグラモスチム、LEUKINE（商標
）、PROKINE（商標））、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）（フィルグラスチム
、NEUPOGEN（商標））、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、CSF-1）、エ
リトロポエチン（エポエチンα、EPOGEN（商標）、PROCRIT（商標））、幹細胞
因子（SCF、cキットリガンド、スチール因子）、巨核球コロニー刺激因子、PIXY
321（GMCSF/IL-3融合タンパク質）、インターロイキン、特に、IL-1からIL-12の
いずれか１以上のインターロイキン、インターフェロン-γ、もしくはトロンボ
ポエチン。
【０３２０】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリ
ヌクレオチドは、アドレナリン作用遮断薬、例えば、アセブトロール、アテノロ
ール、ベタクソロール、ビソプロロール、カルテオロール、ラベタロール、メト
プロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール
、プロプラノロール、ソタロールおよびチモロールなどと組み合わせて投与する
。
【０３２１】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、抗不整脈薬（例えば、アデノシン、アミドアロン、ブレチリウム
、ジギタリス、ジゴキシン、ジギトキシン、ジリアゼム、ジソピラミド、エスモ
ロール、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、モリシジン、フェニトイン
、プロカインアミド、N-アセチルプロカインアミド、プロパフェノン、プロプラ
ノロール、キニジン、ソタロール、トカイニドおよびベラパミル）と組み合わせ
て投与する。
【０３２２】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、以下に挙げるような利尿薬と組み合わせて投与する：炭酸アンヒ
ドラーゼ阻害剤（例えば、アセタゾールアミド、ジクロルフェンアミド、および
メタゾールアミド）のような利尿薬、浸透圧性利尿薬（例えば、グリセリン、イ
ソソルビド、マンニトール、および尿素）、Na+-K+-2Cl-共輸送を阻害する利尿
薬（例えば、フロセミド、ブメタニド、アゾセミド、ピレタニド、トリパミド、
エタクリン酸、ムゾルイミン、およびトルセミド）、チアジドおよびチアジド様
利尿薬（例えば、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、
ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジ
ド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダプアミド、メトラゾン、お
よびキネタゾン）、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロリドおよびトリアム
テレン）、ならびに、鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト（例えば、スピロ
ノラクトン、カンレノン、およびカンレノン酸カリウム）。
【０３２３】 一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌク
レオチドは、内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬と組み合わせて
投与する。内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬としては、限定す
るものではないが、下記のものが挙げられる：127I、131Iおよび123Iのようなヨ
ウ素の放射性同位元素；HUMATROPE（商標）（組換えソマトロピン）のような組
換え成長ホルモン；PROTROPIN（商標）（ソマトレム）のような成長ホルモン類
似体；PARLODEL（商標）（ブロモクリプチン）のようなドーパミンアゴニスト；
SANDOSTATIN（商標）（オクトレオチド）のようなソマトスタチン類似体；PREGN
YL（商標）、A.P.L. （商標）およびPROFASI（商標）（絨毛性ゴナドトロピン（
CG））、PERGONAL（商標）（メノトロピン）、およびMETRODIN（商標）（ウロフ
ォリトロピン（uFSH）などの性腺刺激ホルモン製剤；FACTREL（商標）およびLUT
REPULSE（商標）（塩酸ゴナドレリン）のような合成ヒト性腺刺激ホルモン放出
ホルモン製剤；LUPRON（酢酸ロイプロリド）、SUPPRELIN（商標）（酢酸ヒスト
レリン）、SYNAREL（商標）（酢酸ナファレリン）、およびZOLADEX（商標）（酢
酸ゴセレリン）などの合成性腺刺激ホルモンアゴニスト；RELEFACT TRH（商標）
およびTHYPINONE（商標）（プロチレリン）のようなチロトロピン放出ホルモン
の合成製剤；THYROGEN（商標）のような組換えヒトTSH；L-T4（商標）、SYNTHRO
ID（商標）およびLEVOTHROID（商標）（レボチロキシンナトリウム）、L-T3（商
標）、CYTOMEL（商標）およびTRIOSTAT（商標）（リオチロインナトリウム）、
およびTHYROLAR（商標）（リオトリクス）のような甲状腺ホルモンの天然異性体
のナトリウム塩の合成製剤；6-n-プロピルチオウラシル（プロピルチオウラシル
）、1-メチル-2-メルカプトイミダゾールおよびTAPAZOLE（商標）（メチマゾー
ル）、NEO-MERCAZOLE（商標）（カルビマゾール）のような抗甲状腺化合物；プ
ロプラノロールおよびエスモロールのようなβアドレナリン作用受容体アンタゴ
ニスト；Ca2+チャネル遮断剤；デキサメタソン、ならびに、TELEPAQUE（商標）
（ヨーパン酸）およびORAGRAFIN（商標）（ヨーパン酸ナトリウム）のようなヨ
ウ素化放射線造影剤。
【０３２４】 これ以外の内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬として、限定す
るものではないが、下記のものが挙げられる：ESTRACE（商標）（エストラジオ
ール）、ESTINYL（商標）（エチニルエストラジオール）、PREMARIN（商標）、E
STRATAB（商標）、OTRHO-EST（商標）、OGEN（商標）およびエストロピペート（
エストロン）、ESTROVIS（商標）（キネストロール）、ESTRADERM（商標）（エ
ストラジオール）、DELESTROGEN（商標）およびVALERGEN（商標）（吉草酸エス
トラジオール）、DEPO-ESTRADIOL CYPIONATE（商標）およびESTROJECT LA（商標
）（シピオン酸エストラジオール）などのエストロゲンもしくはコンジュゲート
エストロゲン；NOLVADEX（商標）（タモキシフェン）、SEROPHENE（商標）およ
びCLOMID（商標）（クロミフェン）などの抗エストロゲン；DURALUTIN（商標）
（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン）、MPA（商標）およびDEPO-PROVERA（
商標）（酢酸メドロキシプロゲステロン）、PROVERA（商標）およびCYCRIN（商
標）（MPA）、MEGACE（商標）（酢酸メゲストロール）、NORLUTIN（商標）（ノ
ルエチンドロン）、ならびにNORLUTATE（商標）およびAYGESTIN（商標）（酢酸
ノルエチンドロン）などのプロゲスチン；NORPLANT SYSTEM（商標）（ノルゲス
トレルの皮下移植片）のようなプロゲステロン移植片；RU 486（商標）（ミフェ
プリストン）のような抗プロゲスチン；ENOVID（商標）（ノルエチノドレルとメ
ストラノール）、PROGESTASERT（商標）（プロゲステロンを放出する子宮内装置
）、LOESTRIN（商標）、BREVICON（商標）、MODICON（商標）、GENORA（商標）
、NELONA（商標）、NORINYL（商標）、OVACON-35（商標）およびOVACON-50（商
標）（エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）、LEVLEN（商標）、NORD
ETTE（商標）、TRI-LEVLEN（商標）およびTRIPHASIL-21（商標）（エチニルエス
トラジオール／レボノルゲストレル）LO／OVRAL（商標）およびOVRAL（商標）（
エチニルエストラジオール／ノルゲストレル）、DEMULEN（商標）（エチニルエ
ストラジオール／二酢酸エチノジオール）、NORINYL（商標）、ORTHO-NOVUM（商
標）、NORETHIN（商標）、GENORA（商標）、およびNELOVA（商標）（ノルエチン
ドロン／メストラノール）、DESOGEN（商標）およびORTHO-CEPT（商標）（エチ
ニルエストラジオール／デソゲストレル）、ORTHO-CYCLEN（商標）およびORTHO-
TRICYCLEN（商標）（エチニルエストラジオール／ノルゲスチメート）、MICRONO
R（商標）およびNOR-QD（商標）（ノルエチンドロン）、およびOVRETTE（商標）
（ノルゲストレル）のようなホルモン避妊薬。
【０３２５】 その他の内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬として、限定する
ものではないが、下記のものを挙げることができる：酢酸メテノロンおよびウン
デカン酸テストステロンなどのテストステロンエステル；TESTOJECT-50（商標）
（テストステロン）、TESTEX（商標）（プロピオン酸テストステロン）、DELATE
STRYL（商標）（テストステロンエナンタート）DEPO-TESTOSTERONE（商標）（シ
ピオン酸テストステロン）、DANOCRINE（商標）（ダナゾール）、HALOSTESTIN（
商標）（フルオキシメステロン）、ORETON METHYL（商標）、TESTRED（商標）お
よびVIRILON（商標）（メチルテストステロン）、およびOXANDRIN（商標）（オ
キサンドロロン）などの非経口および経口アンドロゲン；TESTODERM（商標）の
ようなテストステロン経皮系；ANDROCUR（商標）（酢酸シプロテロン）、EULEXI
N（商標）（フルトアミド）、およびPROSCAR（商標）（フィナステリド）などの
アンドロゲン受容体アンタゴニストおよび5-α-レダクターゼ阻害剤；CORTROSYN
（商標）（コシントロピン）のような副腎皮質刺激ホルモン製剤；ACLOVATE（商
標）（ジプロピオン酸アルクロメタソン）、CYCLOCORT（商標）（アムシノニド
）、BECLOVENT（商標）およびVANCERIL（商標）（ジプロピオン酸ベクロメタソ
ン）、CELESTONE（商標）（ベータメタソン）、BENISONE（商標）およびUTICORT
（安息香酸ベータメタソン）、DIPROSONE（商標）（ジプロピオン酸ベータメタ
ソン）、CELESTONE PHOSPHATE（商標）（リン酸ベータメタソンナトリウム）、C
ELESTONE SOLUSPAN（商標）（リン酸および酢酸ベータメタソンナトリウム）、B
ETA-VAL（商標）およびVALISONE（商標）（吉草酸ベータメタソン）、TEMOVATE
（商標）（プロピオン酸クロベータソル）、CLODERM（商標）（クロコルトロン
ピバレート）、CORTEF（商標）およびHYDROCORTONE（商標）（コルチソル（ヒド
ロコルチゾン））、HYDROCORTONE ACETATE（商標）（酢酸コルチソル（ヒドロコ
ルチゾン））、LOCOID（商標）（酪酸コルチソル（ヒドロコルチゾン））、HYDR
OCORTONE PHOSPHATE（商標）（リン酸コルチソル（ヒドロコルチゾン）ナトリウ
ム）、A-HYDROCORT（商標）およびSOLU CORTEF（商標）（スクシン酸コルチソル
（ヒドロコルチゾン）ナトリウム）、WESTCORT（商標）（吉草酸コルチソル（ヒ
ドロコルチゾン））、CORTISONE ACETATE（商標）（酢酸コルチゾン）、DESOWEN
（商標）およびTRIDESILON（商標）（デソニド）、TOPICORT（商標）（デソキシ
メタゾン）、DECADRON（商標）（デキサメタゾン）、DECADRON LA（商標）（酢
酸デキサメタゾン）、DECADRON PHOSPHATE（商標）およびHEXADROL PHOSPHATE（
商標）（リン酸デキサメタゾンナトリウム）、FLORONE（商標）およびMAXIFLOR
（商標）（二酢酸ジフロラゾン）、FLORINEF ACETATE（商標）（酢酸フルドロコ
ルチゾン）、AEROBID（商標）およびNASALIDE（商標）（フルニソリド）、FLUON
ID（商標）およびSYNALAR（商標）（フルオシノロンアセトニド）、LIDEX（商標
）（フルオシノニド）、FLUOR-OP（商標）およびFML（商標）（フルオロメトロ
ン）、CORDRAN（商標）（フルランドレノリド）、HALOG（商標）（ハルシノニド
）、HMS LIZUIFILM（商標）（メドリゾン）、MEDROL（商標）（メチルプレドニ
ソロン）、DEPO-MEDROL（商標）およびMEDROL ACETATE（商標）（酢酸メチルプ
レドニソン）、A-METHAPRED（商標）およびSOLUMEDROL（商標）（スクシン酸メ
チルプレドニソロンナトリウム）、ELOCON（商標）（モメタゾンフロエート）、
HALDRONE（商標）（酢酸パラメタゾン）、DELTA-CORTEF（商標）（プレドニソロ
ン）、ECONOPRED（商標）（酢酸プレドニソロン）、HYDELTRASOL（商標）（リン
酸プレドニソロンナトリウム）、HYDELTRA-T.B.A（商標）（プレドニソロンテブ
テート）、DELTASONE（商標）（プレドニソン）、ARISTOCORT（商標）およびKEN
ACORT（商標）（トリアムシノロン）、KENALOG（商標）（トリアムシノロンアセ
トニド）、ARISTOCORT（商標）およびKENACORT DIACETATE（商標）（二酢酸トリ
アムシノロン）、ならびにARISTOSPAN（商標）（トリアムシノロンヘキサアセト
ニド）などの副腎皮質ステロイドおよびその合成類似体；CYTADREN（商標）（ア
ミノグルテチミド）、NIZORAL（商標）（ケトコナゾール）、MODRASTANE（商標
）（トリロスタン）、およびMETOPIRONE（商標）（メチラポン）などの副腎皮質
ステロイドの生合成および作用の阻害剤；ウシ、ブタまたはヒトインスリンもし
くはそれらの混合物；インスリン類似体；HUMULIN（商標）およびNOVOLIN（商標
）のような組換えヒトインスリン；ORAMIDE（商標）およびORINASE（商標）（ト
ルブタミド）、DIABINESE（商標）（クロルプロパミド）、TOLAMIDE（商標）お
よびTOLINASE（商標）（トラザミド）、DYMELOR（商標）（アセトヘキサミド）
、グリベンクラミド、MICRONASE（商標）、DIBETA（商標）およびGLYNASE（商標
）（グリブリド）、GLUCOTROL（商標）（グリピジド）、およびDIAMICRON（商標
）（グリクラジド）、GLUCOPHAGE（商標）（メトフォルミン）、シグリタゾン、
ピオグリタゾン、およびαグルコシダーゼ阻害剤などの経口血糖低下剤；ウシま
たはブタグルカゴン；SANDOSTATIN（商標）（オクトレオチド）のようなソマト
スタチン；ならびに、PROGLYCEM（商標）（ジアゾキシド）のようなジアゾキシ
ド。
【０３２６】 一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌク
レオチドは、子宮運動性（motility）障害の治療薬と組み合わせて投与する。子
宮運動性障害の治療薬として、限定するものではないが、次のものが挙げられる
：抱合卵胞ホルモン（例えば、PREMARIN（登録商標）およびESTRATAB（登録商標
））、エストラジオール（例えば、CLIMARA（登録商標）およびALORA（登録商標
））、エストロピペート、およびクロロトリアニセンのようなエストロゲン薬剤
；プロゲスチン薬剤（例えば、AMEN（登録商標）（メドロキシプロゲステロン）
、MICRONOR（登録商標）（酢酸ノレチドロン）、PROMETRIUM（登録商標）プロゲ
ステロン、および酢酸メゲストロール）；ならびに、例えば、抱合卵胞ホルモン
／メドロキシプロゲステロン（例えば、PREMPRO（商標）およびPREMPHASE（登録
商標））および酢酸ノルエチンドロン／エチニルエストラジオール（例えば、FE
MHRT（商標））のようなエストロゲン／プロゲステロン。
【０３２７】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、鉄欠損症および低色性貧血を治療するのに有効な薬剤と組み合わ
せて投与する。このような治療薬として、限定するものではないが、次のものが
挙げられる：硫酸第一鉄（硫酸鉄、FEOSOL（商標））、フマル酸第一鉄（例えば
、FEOSTAT（商標））、グルコン酸第一鉄（例えば、FERGON（商標））、多糖−
鉄錯体（例えば、NIFEREX（商標））、鉄デキストラン注射（例えば、INFED（商
標））、硫酸銅、ピロキシジン、リボフラビン、ビタミンＢ12、シアンコバラミ
ン注射（例えば、REDISOL（商標）、RUBRAMIN PC（商標））、ヒドロキソコバラ
ミン、葉酸（例えば、FOLVITE（商標））、ロイコボリン（フォリン酸、5-CHOH4
PteGlu、シトロボラム（citroborum）因子）もしくはWELLCOVORIN（ロイコボリ
ンのカルシウム塩）、トランスフェリンまたはフェリチン。
【０３２８】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリ
ヌクレオチドは、精神障害を治療するのに用いられる薬剤と組み合わせて投与す
る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒
に投与することができる精神薬として、限定するものではないが、下記のものが
挙げられる：抗精神病薬（例えば、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、ク
ロザピン、フルフェナジン、ハロペリドール、ロキサピン、メソリダジン、モリ
ンドン、オランザピン、ペルフェナジン、ピモジド、ケチアピン、リスペリドン
、チオリダジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、およびトリフルプロマジ
ン）、抗躁病薬（例えば、カルバマゼピン、ジバルプロエックスナトリウム、炭
酸リチウム、クエン酸リチウム）、抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、アモ
キサピン、ブプロピオン、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ドキ
セピン、フルボキサミン、フルオキセチン、イミプラミン、イソカルボキサジド
、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、パロキセチ
ン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシプロミン、ト
ラゾドン、トリミプラミン、およびベンラファキシン）、抗不安薬（例えば、ア
ルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパ
ム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、およびプラゼパム）、ならびに、
刺激薬（例えば、d-アンフェタミン、メチルフェニデート、およびペモリン）。
【０３２９】 他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、神経障害を治療するのに用いられる薬剤と組み合わせて投与する
。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に
投与することができる神経薬として、限定するものではないが、下記のものが挙
げられる：抗痙攣薬（例えば、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトスキシミド
、フェノバルビタル、フェニトイン、プリミドン、バルプロ酸、ジバルプロック
スナトリウム、フェルバメート、ガパペンチン、ラモトリギン、レベチラセタム
、オキシカルバゼピン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、ジアゼパム、
ロラゼパム、およびクロナゼパム）、抗パーキンソン病薬（例えば、レボドパ／
カルビドパ、セレギリン、アマンチジン、ブルモクリプチン、ペルゴリド、ロピ
ニロール、プラミペキソール、ベンズトロピン；ビペリデン；エトプロパジン；
プロシクリジン；トリヘキシフェニジル、トルカポン）ならびにALS治療薬（例
えば、リルゾール）。
【０３３０】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、血管拡張薬および／またはカルシウムチャネル遮断薬と組み合わ
せて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオ
チドと一緒に投与することができる血管拡張薬として、限定するものではないが
、下記のものが挙げられる：アンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤（例えば
、パラベリン、イソクススプリン、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル
、エナラプリル、エナラプリラト、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプ
リル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプ
リル、およびニリドリン）、ならびに、硝酸塩（例えば、二硝酸イソソルビド、
一硝酸イソソルビド、およびニトログリセリン）。本発明のアルブミン融合タン
パク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるカルシウ
ムチャネル遮断薬の例として、限定するものではないが、アムロジピン、ベプリ
ジル、ジルチアゼム、フェロジピン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピ
ン、ニフェジピン、ニモジピン、およびベラパミルを挙げることができる。
【０３３１】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリ
ヌクレオチドは、胃腸障害の治療薬と組み合わせて投与する。本発明のアルブミ
ン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができ
る胃腸障害の治療薬として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる
：H2ヒスタミン受容体アンタゴニスト（例えば、TAGAMET（商標）（シメチジン
）、ZANTAC（商標）（ラニチジン）、PEPCID（商標）（ファモチジン）、および
AXID（商標）（ニザチジン））；H+, K+ ATPアーゼの阻害剤（例えば、PREVACID
（商標）（ランソプラゾール）およびPRILOSEC（商標）（オメプラゾール））；
ビスマス化合物（例えば、PEPTO-BISMOL（商標）（サブサリチル酸ビスマス）お
よびDE-NOL（商標）（サブクエン酸ビスマス））；各種制酸薬；スクラルファー
ト；プロスタグラジン類似体（例えば、CYTOTEC（商標）（ミソプロストール）
）；ムスカリン性コリン作用アンタゴニスト；緩下薬（例えば、サーファクタン
ト緩下薬、刺激緩下薬、塩水および浸透圧性緩下薬）；下痢止め剤（例えば、LO
MOTIL（商標）（ジフェノキシレート）、MOTOFEN（商標）（ジフェノキシン）、
およびIMODIUM（商標）（塩酸ロペラミド）、SANDOSTATIN（商標）（オクトレオ
チド）のようなソマトスタチンの合成類似体、制吐薬（例えば、ZOFRAN（商標）
（オンダンセトロン）、KYTRIL（商標）（塩酸グラニセトロン）、トロピセトロ
ン、ドラセトロン、メトクロプラミド、クロルプロマジン、ペルフェナジン、プ
ロクロルペラジン、プロメタジン、チエチルペラジン、トリフルプロマジン、ド
ムペリドン、ハロペリドール、ドロペリドール、トリメトベンザミド、デキサメ
タソン、メチルプレドニソロン、ドロナビノールおよびナビロン）；D2アンタゴ
ニスト（例えば、メトクロプラミド、トリメトベンザミドおよびクロルプロマジ
ン）；胆汁塩；ケノデオキシコール酸；ウルソデオキシコール酸；ならびに、パ
ンクレアチンおよびパンクレリパーゼのような膵酵素製剤。
【０３３２】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌ
クレオチドは、例えば、放射線治療など、その他の治療または予防方法と組み合
わせて投与する。
【０３３３】 本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む医薬組成物の１以上
の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する
。場合によっては、このような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使用ま
たは販売を取り締まる政府機関により規定された形式の注意書きを備え付けるこ
とができる。このような注意書きは、ヒトへの投与を目的とする製造、使用また
は販売について、当局による承認を表すものである。
【０３３４】遺伝子治療 本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物を遺伝子治療プロトコ
ルの一環として使用することにより、治療に有効な用量のアルブミン融合タンパ
ク質を送達することができる。細胞への核酸のin vivo導入のための好ましい手
法は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベク
ターを使用するものである。ウイルスベクターによる細胞の感染には、標的細胞
が高い比率で、核酸を取り込むという利点がある。その上、例えば、ウイルスベ
クターに含まれるcDNAにより、ウイルスベクター内でコードされた分子は、ウイ
ルスベクターの核酸を取り込んだ細胞に効率的に発現する。
【０３３５】 レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、in vivoでア
ルブミン融合タンパク質をコードする外来性核酸分子を輸送するための組換え遺
伝子送達系として用いることができる。これらのベクターは、細胞への核酸の効
率的送達を達成し、輸送された核酸は、宿主の染色体DNAに安定して組み込まれ
る。複製能欠損レトロウイルスだけを生産する特殊細胞系（「パッケージング細
胞」と呼ぶ）の開発により、遺伝子治療用のレトロウイルスの有用性が高まった
ことから、欠損レトロウイルスは遺伝子治療を目的とする遺伝子輸送における使
用のために特性付けられている（詳しくは、例えば、Miller, A, D.（1990）Blo
od 76：27 1を参照）。複製欠陥レトロウイルスをビリオンにパッケージングし
、このビリオンを用いて、標準的技法で、ヘルパーウイルスの使用により、標的
細胞を感染させることができる。組換えレトロウイルスの生産プロトコル、なら
びに、このようなウイルスで細胞をin vitroまたはin vivoで感染させるプロト
コルについては、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M.ら
（編）Greene Publishing Associates, （1989）, Sections 9.10-9.14、ならび
に、その他の標準的実験室マニュアルに記載されている。
【０３３６】 本発明で有用な別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルス由来のベクタ
ーを使用する。アデノウイルスのゲノムを操作して、目的の遺伝子産物をコード
および発現するが、正常な溶菌ウイルス生活環で複製するその能力については不
活性化させることができる。例えば、Berknerら、BioTechiniques 6：616（1988
）；Rosenfeldら、Science 252：431-434（1991）；およびRosenfeldら、Cell 6
8：143-155（1992）を参照されたい。アデノウイルス株Ad 5 d1324型またはその
他のアデノウイルス株（例えば、Ad2、Ad3、Ad7など）に由来する好適なアデノ
ウイルスベクターは、当業者には公知である。組換えアデノウイルスは、それら
が非分裂細胞に感染することができない特定の状況で有利であり、上皮細胞（Ro
senfeldら、（1992）前掲）などの非常に多種の細胞を感染させるのに用いるこ
とができる。さらに、ウイルス粒子は、精製および濃縮に対して安定しており、
これらを実施しやすいため、前述のように、修飾することにより、感染のスペク
トルに影響を与えることもできる。しかも、導入されたアデノウイルスDNA（お
よびそこに含まれる外来DNA）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれず、エピソ
ームのままであるため、導入されたDNAが、宿主ゲノムに組み込まれた状態（例
えば、レトロウイルスDNA）における挿入突然変異誘発の結果起こり得る潜在的
な問題を回避することができる。さらに、アデノウイルスゲノムが外来DNAを保
有する容量は、他の遺伝子送達ベクター（Berknerら、前掲：Haj-Ahmandら、J.
Virol. 57：267（1986））と比較して、大きい（８キロベースまで）。
【０３３７】 別の実施形態では、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞による対象
ヌクレオチド分子の取込みのために、エンドサイトーシス経路を利用する。この
タイプの遺伝子送達系の例として、リポソーム誘導系、ポリ−リシンコンジュゲ
ート、および人工ウイルスエンベロープがある。代表的実施形態では、本発明の
アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子は、表面に陽電荷を有し（例え
ば、リポフェクチン）、かつ（場合に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する
抗体をタグとして有するリポソーム中に捕獲することができる（Mizunoら、（19
92）No Shinkei Geka 20：547-5 5 1；PCT公開番号 WO91/06309；日本国出願第1
047381号；ならびに、欧州特許公開番号EP-A-43075）。
【０３３８】 本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子送達系は、多
数の方法のいずれかにより、患者に導入することができる。例えば、遺伝子送達
系の医薬製剤を全身的に、例えば、静脈内注射により導入すると、標的細胞への
タンパク質の特異的形質導入が起こる。これは、遺伝子送達ビヒクルにより達成
されるトランスフェクションの特異性、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節
配列による細胞タイプまたは組織タイプ発現、あるいは、これらの組合せから、
主として起こるものである。他の実施形態では、組換え遺伝子の初期送達は、動
物への導入がかなり限局化されるなど、さらに制限される。例えば、遺伝子送達
ビヒクルをカテーテル（例えば、米国特許第5,328,470号）または定位注射（例
えば、Chenら（1994）PNAS 91：3 054-3 057）により導入することができる。遺
伝子治療構築物の医薬製剤は、主に、許容される稀釈剤中の遺伝子送達系からな
るもの、または、遺伝子送達ビヒクルを包埋した低速放出マトリックスを含むも
ののいずれでもよい。アルブミン融合タンパク質が組換え細胞、例えば、レトロ
ウイルスベクターからインタクトで生産できる場合には、医薬製剤は、アルブミ
ン融合タンパク質を生産する１以上の細胞を含んでいてもよい。
【０３３９】 その他の遺伝子治療法 また、障害、疾患および症状を治療または予防する遺伝子治療法も本発明に包
含される。このような遺伝子治療法は、核酸（DNA、RNAおよびアンチセンスDNA
またはRNA）配列を動物に導入し、本発明のアルブミン融合タンパク質の発現を
達成することに関する。この方法は、標的組織による融合タンパク質の発現に必
要なプロモーターおよびその他の遺伝エレメントに機能的に結合した本発明のア
ルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを必要とする。このよう
な遺伝子治療および送達技法は、当業界では公知であり、例えば、WO90/11092（
参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３４０】 従って、例えば、ex vivoで、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーターを含むポリヌクレオチド（
DNAまたはRNA）で、患者からの細胞を操作した後、この操作された細胞を患者に
投与することにより、本発明の融合タンパク質で治療することができる。このよ
うな方法は、当技術分野では公知である。例えば、Belldegrun, A.ら、J. Natl.
Cancer Inst. 85：207-216（1993）；Ferrantini, M.ら、Cancer Research 53
：1107-1112（1993）；Ferrantini, M.ら、J. Immunology 153：4604-4615（199
4）；Kaido, T.ら、Int. J. Cancer 60：221-229（1995）；Ogura, H.ら、Cance
r Research 50：5102-5106（1990）；Santodonato, L.ら、Human Gene Therapy
7：1-10（1996）；Santodonato, L.ら、Gene Therapy 4：1246-1255（1997）；
およびZhang, J.-F.ら、Cancer Gene Therapy 3：31-38（1996）を参照。尚、こ
れらの文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。一実施形態では、操
作される細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は、動脈や、動脈を囲む組織への直
接注射により、またはカテーテル注射により、患者に再導入することができる。
【０３４１】 以下にさらに詳しく説明するように、ポリヌクレオチド構築物は、動物の細胞
に、注射可能な物質を送達するあらゆる方法、例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚
、肺、肝臓など）の間隙への注射などにより送達することができる。ポリヌクレ
オチド構築物は、製薬上許容される液体または水性担体中で送達してもよい。
【０３４２】 一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドは、裸ポリヌクレオチドとして送達する。「裸」ポリヌクレオチド、DNA
またはRNAという用語は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポ
フェクチン、または沈降剤のように、細胞への侵入を補助、促進または容易にす
べく作用する送達ビヒクルも含まない配列を意味する。しかし、本発明のアルブ
ミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、リポソーム製剤およびリ
ポフェクチン製剤中において送達することもでき、これらの製剤は、当業者によ
く知られた方法で調製することができる。このような方法は、例えば、米国特許
第5,593,972号、第5,589,466号、および第5,580,859号に記載されており、これ
らの文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３４３】 遺伝子治療方法で用いられるポリヌクレオチドベクター構築物は、宿主ゲノム
には組み込まず、しかも、複製を可能にする配列も含まない構築物であるのが好
ましい。好適なベクターとして、Stratageneから入手可能なpWLNEO、pSV2CAT、p
OG44、pXT1およびpSG；Pharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL
；ならびに、Invitrogenから入手可能なpEF1/V5、pcDNA3.1、およびpRc/CMV2が
ある。その他の好適なベクターは、当業者には容易に理解されよう。
【０３４４】 当業者には公知のあらゆる強力なプロモーターを用いて、ポリヌクレオチド配
列を発現させることができる。好適なプロモーターとして、下記のものが挙げら
れる：アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモータ
ー；サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターのような異種プロモーター；呼
吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモーター；MMTプロモーター、メタロチネインプ
ロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミン
タンパク質；ApoAIプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチ
ミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；
レトロウイルスLTR；b-アクチンプロモーター；ならびに、ヒト成長ホルモンプ
ロモーター。また、このプロモーターは、本発明のアルブミン融合タンパク質の
治療タンパク質部分に対応する遺伝子用の天然のプロモーターでもよい。
【０３４５】 他の遺伝子治療とは異なり、標的細胞にネイキッド核酸配列を導入する主な利
点の１つは、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。様々な
研究から、非複製DNA配列を細胞に導入することにより、６ヶ月までの間、所望
のポリペプチドを生産できることがわかっている。
【０３４６】 ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織の間隙空間に送達することができ、
そのような組織として、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、
リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸
、神経系、眼、腺、および結合組織が挙げられる。組織の間隙空間には、細胞間
、液体、器官組織の細網繊維間のムコ多糖類、血管または室の壁内の弾性繊維、
繊維組織のコラーゲン繊維、あるいは、筋細胞を覆う結合組織内または骨の小腔
中の同じマトリックスがある。同様に、循環血漿や、リンパチャネルのリンパ液
が占める空間もある。以下に述べる理由から、筋組織の間隙空間への送達が好ま
しい。上記構築物は、これらの細胞を含む組織への注射により好適に送達するこ
とができる。これらは、分化している永続型非分裂細胞に送達し、発現させるが
、送達および発現は、例えば、血液または皮膚繊維芽細胞の幹細胞のような非分
化、もしくは完全には分化していない細胞に実施してもよい。in vivo筋肉細胞
は、特に、ポリヌクレオチドを取り込み、発現する能力が高い。
【０３４７】 裸核酸配列の注射に際しては、DNAまたはRNAの有効用量は、約0.05 mg／kg体
重から50 mg／kg体重の範囲である。好ましくは、用量は、約0.005 mg／kg〜20
mg／kg、さらに好ましくは、約0.05 mg／kg〜5 mg／kgの間である。もちろん、
当業者には理解されるように、この用量は、注射する組織部位に応じて変わる。
核酸配列の適切かつ有効な量は、当業者が容易に決定することができ、治療しよ
うとする症状および投与経路に応じて異なる。
【０３４８】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への注射という非経口経路である。しか
し、それ以外の非経口経路を用いてもよく、そのような経路として、肺または気
管支組織、喉もしくは鼻粘膜への送達専用のエーロゾル剤の吸入がある。加えて
、裸DNA構築物は、手術で用いられるカテーテルにより、血管形成中に動脈に送
達することができる。
【０３４９】 裸ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、送達部位での直接針注射、
静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、ならびに、いわゆる「遺伝子銃」など
、当業者には公知のあらゆる方法により送達される。これらの送達方法は、当技
術分野では公知である。
【０３５０】 上記構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェ
クチン、沈降剤などの送達ビヒクルと共に送達することも可能である。このよう
な送達方法は、当技術分野では公知である。
【０３５１】 特定の実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム製剤として複合
体化する。本発明で使用するリポソーム製剤には、カチオン（陽電荷）、アニオ
ン（陰電荷）および中性製剤がある。しかし、カチオンリポソームとポリアニオ
ン核酸との間に緊密な電荷複合体を形成することができることから、カチオンリ
ポソームが好ましい。カチオンリポソームは、プラスミドDNA（Felgnerら、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA（1987）84：7413-7416。参照により本明細書に組み込
まれる）；mRNA（Maloneら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1989）86：6077-608
1。参照により本明細書に組み込まれる）；ならびに、精製された転写因子（Deb
sら、J. Biol. Chem. （1990）265：10189-10192。参照により本明細書に組み込
まれる）の細胞内送達を機能形態で媒介することが明らかにされている。
【０３５２】 カチオンリポソームは容易に入手可能である。例えば、N[1-2,3-ジオレイロキ
シ]プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOTMA）リポソームが特に有用で
あり、GIBCO BRL（ニューヨーク州グランドアイランド）から、Lipofectinの商
標で市販されている（再度Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1987）84
：7413-7416を参照。参照により本明細書に組み込まれる）。その他の市販され
ているリポソームには、トランスフェクタース（DDAB/DOPE）およびDOTAP/DOPE
（Boehringer）がある。
【０３５３】 その他のカチオンリポソームは、当技術分野ではよく知られた技法を用いて、
容易に入手可能な材料から調製することができる。例えば、DOTAP（1,2-ビス（
オレオイロキシ）-3-（トリメチルアミノ）プロパン）リポソームの合成につい
て記載したPCT公開番号WO90/11092（参照により本明細書に組み込まれる）を参
照されたい。DOTMAリポソームの調製については、文献に説明されており、例え
ば、P. Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1987）84：7413-7417を参照
されたい。尚、この文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。類似し
た方法を用いて、その他のカチオン脂質材料からリポソームを調製することも可
能である。
【０３５４】 同様に、アニオンおよび中性リポソームは、例えば、Avanti Polar Lipids（
アラバマ州バーミンガム）などから容易に入手可能であり、また、容易に入手可
能な材料から調製することもできる。このような材料として、中でも、ホスファ
チジル、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオ
イルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール
（DOPG）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）が挙げられる
。また、これらの材料を、DOTMAおよびDOTAP出発材料と適当な比率で混合しても
よい。上記材料を用いたリポソームの調製方法は当業者には公知である。
【０３５５】 例えば、市販されているジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、およびジオレオイルホスファチジ
ルエタノールアミン（DOPE）を様々な組合せで用いることにより、コレステロー
ルを添加して、または添加せずに、通常のリポソームを調製することができる。
従って、例えば、超音波処理バイアルへの窒素ガス流下で、各々50 mgのDOPGお
よびDOPCを乾燥することにより、DOPG/DOPC小胞を調製することができる。サン
プルを真空ポンプ下に一晩置き、翌日脱イオン水で水和する。次に、最大設定で
、逆転カップ（槽タイプ）プローブを備えたヒートシステムズ（Heat Systems）
モデル350ソニケーターを用いて、キャップしたバイアル中でサンプルを２時間
超音波処理すると同時に、この槽を15ECで循環させる。あるいは、超音波処理せ
ずに、陰荷電小胞を作製して、多層小胞を生成することができ、または、ヌクレ
オポア（nucleopore）膜を介した押し出しにより作製して、別々のサイズの単層
小胞を生成することもできる。その他の方法は、当技術分野において公知であり
、利用可能である。
【０３５６】 上記リポソームは、多層小胞（MLV）、小さな単層小胞（SUV）、もしくは大き
な単層小胞（LUV）からなり、SUVが好ましい。当技術分野において公知の方法を
用いて、様々なリポソーム−核酸複合体を作製することができる。例えば、Stra
ubingerら、Methods of Immunology（1983）、101：512-527（参照により本明細
書に組み込まれる）を参照。例えば、核酸を含むMLVは、ガラス管の壁に薄いフ
ィルム状のリン脂質を付着させた後、被包しようとする物質の溶液で水和するこ
とにより、作製することができる。SUVは、MLVの超音波処理を長引かせて、単層
リポソームの均質な集団を形成することにより作製する。捕獲しようとする物質
をあらかじめ形成させたMLVの懸濁体に添加した後、超音波処理する。カチオン
脂質を含むリポソームを用いる場合には、乾燥した脂質フィルムを無菌水、もし
くは10 mM トリス／NaClのような等張バッファー溶液などの適当な溶液中に再懸
濁させ、超音波処理してから、前調製したリポソームをDNAと直接混合する。リ
ポソームとDNAは、陽荷電リポソームとカチオンDNAとの結合により、非常に安定
した複合体を形成する。SUVは、小さな核酸断片を用いて得られる。LUVは、当技
術分野ではよく知られた多数の方法により、作製される。一般に用いられる方法
として、下記のものが挙げられる：Ca2+-EDTAキレート化（Papahadjopoulosら、
Biochim. Biophys. Acta（1975）394：483；Wilsonら、Cell 17：77（1979））
；エーテル注射（Deamer, D.およびBangham, A., Biochim. Biophys. Acta 443
：629（1976）；Ostroら、Biochim. Biophys. Res. Commun. 76：836（1977）；
Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：3348（1979））；デタージェント
透析（Enoch, H.およびStrittmatter, P.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：14
5（1979））；ならびに、逆相蒸発（REV）（Fraleyら、J. Biol. Chem. 255：10
431（1980）；Szoka, F.およびPapahadjopoulos. D., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 75：145（1978）；Schaefer-Ridderら、Science 215：166（1982））。尚、
これらの文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３５７】 一般に、DNAとリポソームの比は、約10：１〜約１：10の間である。好ましく
は、この比は、約５：１〜約１：５の間である。さらに好ましくは、この比は、
約３：１〜約１：３の間である。さらにまた好ましくは、この比は約１：１であ
る。
【０３５８】 米国特許第5,676,954号（参照により本明細書に組み込む）は、カチオンリポ
ソームキャリアーと複合体化した遺伝材料のマウスへの注射を報告している。ま
た、米国特許第4,897,355号、第4,946,787号、第5,049,386号、第5,459,127号、
第5,589,466号、第5,693,622号、第5,580,859号、第5,703,055号、および国際公
開番号WO94/9469（これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み込む）は
、DNAを細胞および哺乳動物にトランスフェクトするのに用いるカチオン脂質を
提供する。米国特許第5,589,466号、第5,693,622号、第5,580,859号、第5,703,0
55号、および国際公開番号WO94/9469は、DNA−カチオン脂質複合体を哺乳動物に
送達する方法を提供する。
【０３５９】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする配列か
らなるRNAを含むレトロウイルス粒子を用いて、細胞をex vivoまたはin vivoで
操作する。レトロウイルスプラスミドベクターが得られるレトロウイルスとして
、限定するものではないが、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス
、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、テナガザ
ル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、ならびに
、哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられる。
【０３６０】 レトロウイルスプラスミドベクターを用いて、パッケージング細胞系を形質導
入し、プロデューサー細胞系を形成する。トランスフェクトすることができるパ
ッケージング細胞の例として、限定するものではないが、Miller, Human Gene T
herapy 1：5-14（1990）（参照によりその全文を本明細書に組み込む）に記載さ
れているように、PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、RCR
E、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞系が挙げられる。ベクターは、
当技術分野では公知のあらゆる手段を用いて、パッケージング細胞を形質導入す
ることができる。このような手段として、限定するものではないが、エレクトロ
ポレーション、リポソームの使用、CaPO4沈降がある。別の実施形態では、レト
ロウイルスプラスミドベクターをリポソームに被包するか、あるいは、脂質に結
合させた後、宿主に導入する。
【０３６１】 プロデューサー細胞系は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。このよう
なレトロウイルスベクター粒子を用いて、in vivoまたはin vitroのいずれかで
真核生物細胞を形質導入することができる。形質導入された真核生物細胞は、本
発明の融合タンパク質を発現する。
【０３６２】 他の実施形態では、アデノウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドを用
いて、細胞をex vivoまたはin vivoで操作する。アデノウイルスは、それが本発
明の融合タンパク質をコードおよび発現すると同時に、正常の溶菌ウイルス生活
環において複製する能力に関しては不活性化されるように、操作することができ
る。アデノウイルス発現は、宿主細胞染色体へのウイルスDNAの組込みを必要と
せずに達成されるため、挿入突然変異誘発に関する懸念が軽減される。さらに、
アデノウイルスは、優れた安全プロフィールで、長年にわたり腸溶性生ワクチン
として用いられている（Schwartzら、Am. Rev. Respir. Dis. 109：233-238（19
74））。最後に、アデノウイルス媒介遺伝子輸送が、多くの実験例で証明されて
おり、一例として、コットンラットの肺へのα-1-アンチトリプリシンおよびCFT
Rの輸送が挙げられる（Rosenfeld, M. A.ら（1991）Science 252：431-434；Ros
enfeldら（1992）Cell 68：143-155）。さらに、アデノウイルスをヒト癌におけ
る誘発因子（causative agent）として証明しようとする広範な実験は一様に否
定的であった（Green, M.ら（1979）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：6606）。
【０３６３】 本発明で有用な好適なアデノウイルスベクターについては、例えば、Kozarsky
およびWilson, Curr. Opin. Genet. Devel. 3：499-503（1993）；Rosenfeldら
、Cell 68：143-155（1992）；Engelhardtら、Human Genet. Ther. 4：759-769
（1993）；Yangら、nature Genet. 7：362-369（1994）；Wilsonら、Nature 365
：691-192（1993）；および米国特許第5,652,224号に記載されている。尚、これ
らの文献は参照により本明細書に組み込むものとする。例えば、アデノウイルス
ベクターAd2が有用であり、ヒト293細胞で増殖させることができる。これらの細
胞は、アデノウイルスのE1領域を含み、E1aおよびE1bを構成的に発現し、E1aお
よびE1bは、ベクターから欠失された遺伝子の産物を提供することにより、欠陥
アデノウイルスを補完する。Ad2以外にも、他の多様なアデノウイルス（例えば
、Ad3、Ad5およびAd7）も本発明では有用である。
【０３６４】 好ましくは、本発明で用いるアデノウイルスは複製能欠損性である。複製能欠
損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するのに、ヘルパーウイルスおよび／ま
たはパッケージング細胞系の助けを必要とする。こうして得られたウイルスは、
細胞を感染させる能力があり、プロモーターに機能的に結合した目的のポリヌク
レオチドを発現することができるが、ほとんどの細胞で複製することができない
。複製能欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：E1a、E1b、E3、E4、E2a、またはL
1〜L5のいずれか１以上、もしくは全部または一部を欠失させてもよい。
【０３６５】 特定の他の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて、細胞をex vi
voまたはin vivoで操作する。AAVは、感染性粒子を生産するのに、ヘルパーウイ
ルスを必要とする、天然に存在する欠陥ウイルスである（Muzyczka, N., Curr.
Topics in Microbiol. Immunol. 158：97（1992））。このウイルスはまた、そ
のDNAを非分裂細胞に組み込むことができる数少ないウイルスの１つでもある。A
AVの300という少ない塩基対を含むベクターをパッケージし、組み込むことがで
きるが、外因性DNAのための空間は、約4.5 kbに限られている。このようなAAVの
調製および使用方法は当技術分野では公知である。例えば、米国特許第5,139,94
1号、第5,173,414号、第5,354,678号、第5,436,146号、第5,474,935号、第5,478
,745号、および第5,589,377号を参照されたい。
【０３６６】 例えば、本発明で使用するのに好適なAAVベクターとして、DNA複製、キャプシ
ド形成、および宿主細胞組込みに必要な配列すべてが挙げられる。ポリヌクレオ
チド構築物は、標準的クローニング方法、例えば、Sambrookら、Molecular Clon
ing：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press（1989）に記載されてい
る方法を用いて、AAVベクターに挿入する。次に、組換えAAVベクターをヘルパー
ウイルスに感染しているパッケージング細胞に標準的方法、例えば、リポフェク
ション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降などのいずれかを用いて、トランスフ
ェクトする。好適なヘルパーウイルスとして、アデノウイルス、サイトメガロウ
イルス、ワクシナウイルス、もしくはヘルペスウイルスがある。いったんパッケ
ージング細胞がトランスフェクトされ、感染したら、ポリヌクレオチド構築物を
含む感染性AAVウイルス粒子を生産する。これらのウイルス粒子を用いて、ex vi
voまたはin vivoのいずれかで真核生物細胞を形質導入する。形質導入された細
胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、本発明の融合
タンパク質を発現することになる。
【０３６７】 遺伝子治療の別の方法は、相同的組換えにより、異種対照領域と、内因性ポリ
ヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードする）を機能的に結
合することからなる（例えば、1997年６月24日発行された米国特許第5,641,670
号；1996年９月26日に公開された国際公開番号WO96/29411；1994年８月４日に公
開された国際公開番号WO94/12650；Kollerら、Poc. Natl. Acad. Sci. USA 86：
8932-8935（1989）；およびZijlstraら、Nature 342：435-438（1989）を参照。
尚、これらの文献は、参照により本明細書に組み込む）。この方法は、標的細胞
に存在するが、正常に細胞に発現されない、もしくは所望レベルより低いレベル
で発現される遺伝子の活性化を含む。
【０３６８】 当分野では公知の標準的技法を用いて、標的配列が隣接して位置するプロモー
ターを含むポリヌクレオチド構築物を作製する。好適なプロモーターについては
、本明細書に記載する。標的配列は、内因性配列によるプロモーター・標的配列
の相同的組換えを可能にするように、内因性配列に十分相補的なものである。標
的配列は、所望の内因性ポリヌクレオチド配列の5’末端に十分近接させ、相同
的組換え時に、プロモーターが内因性配列と機能的に結合するようにする。
【０３６９】 プロモーターおよび標的配列は、PCRを用いて増幅することができる。好まし
くは、増幅したプロモーターは、5’および3’末端で別々の制限酵素部位を含む
。好ましくは、第１標的配列の3’末端は、増幅プロモーターの5’末端と同じ制
限酵素部位を有し、第２標的配列の5’末端は、増幅プロモーターの3’末端と同
じ制限部位を有する。増幅プロモーターおよび標的配列を一緒に消化および連結
させる。
【０３７０】 プロモーター・標的配列構築物は、ネイキッドポリヌクレオチドとしてか、あ
るいは、既に詳しく記載したように、リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子
、全ウイルス、リポフェクション、沈降剤などのトランスフェクション促進剤と
一緒に細胞に送達する。Pプロモーター・標的配列は、直接針注射、静脈内注射
、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などのいずれの方法でも送達すること
ができる。これらの方法については、以下にさらに詳しく説明する。
【０３７１】 プロモーター・標的配列構築物は、細胞によって取り込まれる。構築物と内在
性配列との間の相同的組換えは、内在性配列がプロモーターの制御下におかれる
ように起こる。その後、このプロモーターが、内在性配列の発現を駆動する。
【０３７２】 本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、タンパ
ク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含んでいてよい。典型的には、シグナ
ル配列は、コード領域の5’末端に向けて、または5’末端で発現させようとする
ポリヌクレオチドのコード領域に位置する。シグナル配列は、目的とするポリヌ
クレオチドに対して同一源であっても異種であってもよいし、トランスフェクト
させる細胞に対して同一源であっても異種であってもよい。加えて、シグナル配
列は、当分野では公知の方法を用いて、化学的に合成することも可能である。
【０３７３】 治療効果をもたらすのに十分な量の１以上の分子の発現を達成するのであれば
、前記ポリヌクレオチド構築物のいずれかを投与するあらゆる様式を用いること
ができる。このような様式として、下記のものが挙げられる：直接針注射、全身
注射、カテーテル注入、バイオリスティック（biolistic）注射器、粒子加速器
（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー、その他の市販され
ている貯蔵材料、浸透圧ポンプ（例えば、アルザ（Alza）ミニポンプ）、経口ま
たは座薬固形（錠剤もしくは丸薬）医薬製剤、ならびに、手術中のデカントもし
くは局所適用。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのネイキッドリン酸カル
シウム沈降プラスミド、あるいは、門脈へのタンパク質コーティングプラスミド
の直接注射により、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現が起こった（Ka
nedaら、Science 243：375（1989））。
【０３７４】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体化させた本発明のアルブミン融合タンパク質を、動脈領域への直
接注射により、または、動脈領域内に局所的に投与する。動脈領域内への組成物
のに局所的投与とは、動脈内に数センチメートル、好ましくは、数ミリメートル
で上記組成物を注射することを意味する。
【０３７５】 局所投与の別の方法では、手術による創傷内または周辺に、本発明のポリヌク
レオチド構築物を接触させる。例えば、患者が手術を受けると、創傷内部の組織
表面にポリヌクレオチド構築物を塗布するか、あるいは、該構築物を創傷内部の
組織領域に注射し得る。
【０３７６】 全身投与に有用な治療組成物として、本発明の標的送達ビヒクルと複合体化さ
せた本発明の融合タンパク質が挙げられる。全身投与に用いるのに好適な送達ビ
ヒクルは、ビヒクルを特定部位にターゲッティングするためのリガンドを含むリ
ポソームからなる。特定の実施形態では、全身投与に用いるのに好適な送達ビヒ
クルは、ビヒクルを特定部位にターゲッティングするための本発明のアルブミン
融合タンパク質を含むリポソームを含む。
【０３７７】 全身投与の好ましい方法は、静脈内注射、エーロゾル、経口および経皮（局所
）送達を含んでなる。静脈注射は、当分野では標準的な方法を用いて、実施する
ことができる（例えば、Striblingら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189：11277
-11281, 1992参照。尚、この文献は、参照により本明細書に組み込む）。経口送
達は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、動物の腸内の消化酵素による分解に
耐えることができるキャリアーと複合体化することにより、実施することができ
る。このようなキャリアーの例として、当分野では公知のものなどを含む、プラ
スチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。局所送達は、本発明のポリヌクレオ
チド構築物を、皮膚に浸透可能な親油性試薬（例えば、DMSO）と混合することに
より、実施することができる。
【０３７８】 送達しようとする物質の有効量の決定は、例えば、該物質の化学構造および生
物活性、動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な症状およびその重篤度
、ならびに、投与経路など、多数の要因に応じて変動する。治療の頻度は、一投
与当たりのポリヌクレオチド構築物の量、ならびに、被験体の健康状態および病
歴など、多数の要因に応じて変動する。正確な投与量、投与回数、および投与タ
イミングは、担当の医師または獣医により決定される。
【０３７９】 本発明のアルブミン融合タンパク質は、あらゆる動物、好ましくは、哺乳動物
および鳥類に投与することができる。好ましい動物として、ヒト、イヌ、ネコ、
マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられるが、中で
もヒトが特に好ましい。
【０３８０】生物活性 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１以上の生物活性を試験するアッセ
イに用いることができる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポ
リヌクレオチドが、特定のアッセイで活性を呈示する場合には、該融合タンパク
質に対応する治療タンパク質は、上記生物活性に関連する疾患に関与している可
能性がある。従って、この融合タンパク質を用いて、関連する疾患を治療するこ
とができる。
【０３８１】 分泌されたタンパク質ファミリーのメンバーは、例えば、細胞シグナル伝達に
関連する生物活性に関与していると考えられる。従って、本発明のアルブミン融
合タンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分泌された
ポリペプチドの異常活性に関連する疾患および／または障害の診断、予後判定、
予防および／または治療に用いることができる。
【０３８２】 好ましい実施形態では、EPO、免疫グロブリン、ヒルジン、アプラギン（appla
ggin）、血清コリンエステラーゼ、α-1 アンチトリプシン、アプロチニンおよ
び前駆体形態および活性形態の凝固因子（例えば、これらに限定されないが、フ
ォン・ビルブラント因子、フィブリノーゲン、第II因子、第VII因子、活性第VII
A因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、c1インアクチベーター、
アンチトロンビンIII、トロンビンおよびプロトロンビン、アポ−リポタンパク
質、ｃ−反応性タンパク質およびプロテインＣ）ならびに/またはその断片およ
び/もしくはその変異体に対応する治療用タンパク質部分を含む本発明のアルブ
ミン融合タンパク質を使用して、止血（出血を止める）または血栓崩壊（血餅溶
解）活性を改変し、および/または血液に関連する疾患または心血管障害、なら
びに/または、以下に「血液関連疾患」、「抗脈管新生活性」および/もしくは「
心血管障害」として記載する疾患、障害または症状を治療、予防、診断、予後判
定および／または検出できる。
【０３８３】 好ましい実施形態では、インターフェロンα、G-CSF、GM-CSF、分散因子、MCP
/MCAF、M-CSFならびに/またはそれらの断片および/もしくはは変異体に対応する
治療用タンパク質を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、免疫系の
疾患もしくは障害、または以下に「免疫活性」、「感染症」および/もしくは「
過増殖性疾患」として記載するような疾患、障害または症状を治療、予防、診断
、予後判定および/または検出することができる。
【０３８４】 好ましい実施形態では、ヒト成長ホルモン、ならびに/またはその断片および/
もしくはその変異体に対応する治療用タンパク質部分を含む本発明のアルブミン
融合タンパク質を使用して、先端肥大症、成長障害、成長障害および内因性成長
ホルモン補充、成長ホルモン欠損症、成長障害および成長遅延、２歳以上の子供
におけるプラーダーヴィリ症候群；成長不全；閉経後オステオポローシス;火傷;
悪液質;癌悪液質;小人症;代謝異常;肥満症;腎不全;ターナー症候群；線維筋痛症
;骨折治療;フレイルティーまたは以下に「内分泌障害」、「創傷治癒および上皮
細胞増殖」および/もしくは「過剰増殖性疾患」として記載されたものを含むが
これらに限定されない成長ホルモン欠損に関連する疾患、障害および/または症
状を治療、予防、診断、予後判定および/または検出することができる。
【０３８５】 好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、下記の疾患および障害の
診断、予後判定、予防および／または治療に用いることができる：内分泌系（例
えば、以下の「内分泌障害」の項を参照）、神経系（例えば、以下の「神経障害
」の項を参照）、免疫系（例えば、以下の「免疫活性」の項を参照）、呼吸器系
（例えば、以下の「呼吸器障害」の項を参照）、心臓血管系（例えば、以下の「
心血管障害」の項を参照）、生殖系（例えば、以下の「生殖系障害」の項を参照
）、ならびに消化器系（例えば、以下の「胃腸障害」の項を参照）に関する疾患
および／または障害、細胞増殖に関する疾患および／または障害（例えば、以下
の「過増殖性疾患／癌」の項を参照）、および／または血液に関する疾患または
障害（例えば、以下の「血液関連疾患」の項を参照）。
【０３８６】 好ましい実施形態では、本発明は、表１の「好適な適応症Ｙ」列に記載した疾
患または障害を治療する方法であって、このような治療、予防または改善が必要
な患者に、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列（治療しようとする疾患または障害
が、表１の「好適な適応症Ｙ」列に記載されるのと同じ列中）に開示された治療
タンパク質に対応する治療タンパク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパ
ク質を、上記疾患または障害を治療、予防または改善するのに有効な量投与する
ことを含んでなる方法を包含する。
【０３８７】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、本発明の
治療タンパク質部分に対応する遺伝子を発現させる組織に関連する疾患および／
または障害を診断および／または予後判定することができる。
【０３８８】 従って、本発明の融合タンパク質、および本発明のアルブミン融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、プロホルモン活性
化、神経伝達物質活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、ならびに細胞
移動などの活性に関する疾患および／または障害の診断、検出および／または治
療に有用である。
【０３８９】 さらに一般的には、本発明の融合タンパク質、および本発明のアルブミン融合
タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下に記載する系に関連する疾患
および／または障害の診断、予後判定、予防および／または治療に有用である。
【０３９０】免疫活性 本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドは、例えば、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動
員（化学走性）を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患、障害および
／または病状を治療、予防、診断、および／または予後するのに有用である。免
疫細胞は、造血と呼ばれる過程を通して成長し、多能性幹細胞から、骨髄性（血
小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系（ＢおよびＴリ
ンパ球）細胞を生産する。これら免疫疾患、障害、および／または症状の病因は
、癌のように遺伝的、体因性のものと、後天性（例えば、化学的治療または毒素
により）もしくは感染性の何らかの自己免疫疾患であると考えられる。さらに、
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーもしくは
検出因子として用いることができる。
【０３９１】 別の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、免疫系の疾患または
障害を治療する、および／または本発明のポリペプチドを発現させる組織と関連
する細胞により生じた免疫応答を阻害もしくは増強することができる。
【０３９２】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、先天性および後天性いずれの免疫不
全も含む、免疫不全の治療、予防、診断および／または予後判定に有用である。
免疫グロブリンレベルＢ細胞機能および／またはＢ細胞数が減少するＢ細胞免疫
不全の例としては、下記のものが挙げられる：Ｘ連鎖性無γグロブリン血症（ブ
ルトン症）、Ｘ連鎖性乳児無γグロブリン血症、高IgMを伴なうＸ連鎖性免疫不
全、高IgMを伴なう非Ｘ連鎖性免疫不全、Ｘ連鎖性リンパ増殖症候群（XLP）、先
天性および後天性無γグロブリン血症を含む無γグロブリン血症、成人性無γグ
ロブリン血症、遅発性無γグロブリン血症、異常γグロブリン血症、低γグロブ
リン血症、非特定（unspecified）低γグロブリン血症、劣性無γグロブリン血
症（スイス型）、選択的IgM欠損症、選択的IgA欠損症、選択的IgＧサブクラス欠
損症、IgＧサブクラス欠損症（IgA欠損症を伴なうかまたは伴なわない）、IgMの
増加を伴なうIg欠損症、IgMの増加を伴なうIgGおよびIgA欠損症、正常または増
加Igを伴なう抗体欠損症、Ig重鎖欠失、κ鎖欠損症、Ｂ細胞リンパ増殖障害（BL
PD）、分類不能原発性免疫不全（CVID）、分類不能型免疫不全（CVI）（後天性
）、ならびに、乳児一時性低γグロブリン血症。
【０３９３】 特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブ
ミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、毛細管拡張性失調
症、もしくは毛細管拡張性失調症に関連する病状を治療、予防、診断および／ま
たは予後判定する。
【０３９４】 Ｔ細胞および／もしくはＢ細胞機能ならびに／または数が減少する先天性免疫
不全の例として、限定するものではないが、次のものが挙げられる：ディジョー
ジ異常症、重症複合型免疫不全（SCID）（限定するものではないが、Ｘ連鎖性SC
ID、常染色体劣性SCID、アデノシンデアミナーゼ欠損症、プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼ（PNP）欠損症、II型MHC欠損症（裸リンパ球症候群）、ウィスコッ
ト・アルドリッチ症候群、および毛細管拡張性失調症）、胸腺低形成、III, IV
鰓弓症候群、22q11.2欠失、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠
損症（NK）、特発性CD4+T-リンパ球減少、主要Ｔ細胞欠損（非特定）を伴う免疫
不全、ならびに、細胞性免疫の非特定免疫不全。
【０３９５】 特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブ
ミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ディジョージ異常
症またはディジョージ異常症に関連する病状を治療、予防、診断および／または
予後判定する。
【０３９６】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、治療、予防、診断および／または予後判
定することができるその他の免疫不全としては、下記のものを挙げることができ
る：慢性肉芽腫性病変、チェディアック-東症候群、白血球グルコース6フォスフ
ェートデヒドロゲナーゼ欠損症、Ｘ連鎖性リンパ増殖症候群（XLP）、白血球接
着不全症、補体成分欠損症（C1、C2、C3、C4、C5、C7、C8および／またはC9欠損
症など）、細網発育不全、胸腺リンパ無形成−無形成症、胸腺腫を伴なう免疫不
全、重症先天性白血球減少、免疫不全を伴なう形成不全、新生児好中球減少症、
短肢小人症、ならびに、Igsを伴なうネゼロフ症候群複合型免疫不全。
【０３９７】 好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、免疫不全および
／または前記の免疫不全に関連する病状を治療、予防、診断および／または予後
判定することができる。
【０３９８】 好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全症の個体にお
ける免疫応答性を高める薬剤として用いることができる。特定の実施形態では、
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全症の個体に
おける免疫応答性を高める薬剤として用いることができる。
【０３９９】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫障害の治療、予防、診断お
よび／または予後判定に有用である。多くの自己免疫障害は、免疫細胞が自己を
外来物質と不適切に認識することから発生する。この不適切な認識により、免疫
応答が起こり、宿主組織の破壊を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の
増殖、分化または化学走性を阻害することができる本発明の融合タンパク質およ
び／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが
、自己免疫障害を予防する有効な治療薬になると考えられる。
【０４００】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドにより治療、予防、診断および／または予後判定が
可能な自己免疫疾患または障害として、限定するものではないが、以下に挙げる
１以上のものが含まれる：全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、強直性
脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性
貧血、溶血性貧血、血小板減少症、自己免疫性血小板減少性紫斑症、自己免疫新
生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑症、紫斑症（例えば、ヘーノホ−シ
ェーライン紫斑症）、自己免疫性血球減少症、グッドパスチャー症候群、尋常性
天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病（甲状腺機能亢進症）、ならびに、インス
リン耐性糖尿病。
【０４０１】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防および／または診断が
可能な自己免疫成分を有すると考えられる別の疾患として、限定するものではな
いが、下記のものを挙げることができる：II型コラーゲン誘発性関節炎、抗リン
脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リ
ウマチ性心臓疾患、腎炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、レーター病、ス
ティフマン症候群、自己免疫性肺炎、自閉症、ギヤン−バーレ症候群、インスリ
ン依存性糖尿病、ならびに、自己免疫性炎症性眼障害。
【０４０２】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防、診断および／または
予後判定が可能な、自己免疫成分を有すると考えられる別の疾患として、限定す
るものではないが、下記のものを挙げることができる：抗コラーゲン抗体を伴な
う強皮病（多くの場合、例えば、核小体およびその他の核抗体を特徴とする）、
混合性結合組織疾患（多くの場合、例えば、抽出可能な核抗原（リボ核タンパク
質）に対する抗体を特徴とする）、多発性筋炎（多くの場合、例えば、非ヒスト
ンANAを特徴とする）、悪性貧血（多くの場合、例えば、抗旁細胞、ミクロソー
ム、および内因子抗体を特徴とする）、特発性アジソン病（多くの場合、例えば
、体液および細胞性副腎細胞傷害性を特徴とする）、不妊症（多くの場合、例え
ば、抗精子抗体を特徴とする）、糸球体腎炎（多くの場合、例えば、糸球体基底
膜抗体または免疫複合体を特徴とする）、水疱性類天疱瘡（多くの場合、例えば
、基底膜中のIgGおよび補体を特徴とする）、シェーグレン症候群（多くの場合
、例えば、多様な組織抗体、および／または特定の非ヒストンANA（SS-B）を特
徴とする）、糖尿病（多くの場合、例えば、細胞媒介および体液膵島細胞抗体を
特徴とする）、ならびに、アドレナリン性薬剤耐性（喘息または嚢胞性線維症を
伴なうアドレナリン性薬剤耐性など）（多くの場合、例えば、βアドレナリン性
受容体抗体を特徴とする）。
【０４０３】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防、診断および／または
予後判定が可能な、自己免疫成分を有すると考えられるその他の疾患として、限
定するものではないが、下記のものを挙げることができる：慢性活性肝炎（多く
の場合、例えば、平滑筋抗体を特徴とする）、原発性胆汁性肝硬変（多くの場合
、例えば、ミトコンドリア抗体を特徴とする）、その他の内分泌腺不全（例えば
、特定の組織抗体を特徴とする場合もある）、白斑（多くの場合、例えば、メラ
ニン細胞抗体を特徴とする）、脈管炎（多くの場合、例えば、脈管壁中のIgおよ
び補体および／または低血清補体を特徴とする）、心筋梗塞後（post-MI）（多
くの場合、例えば、心筋抗体を特徴とする）、心臓切開症候群（多くの場合、例
えば、心筋抗体を特徴とする）、じんま疹（多くの場合、例えば、IgEに対するI
gGおよびIgM抗体を特徴とする）、アトピー性皮膚炎（多くの場合、例えば、IgE
に対するIgGおよびIgM抗体を特徴とする）、喘息（多くの場合、例えば、IgEに
対するIgGおよびIgM抗体を特徴とする）、ならびに、その他多数の炎症性、肉芽
腫性、変性、および萎縮性障害。
【０４０４】 好ましい実施形態では、例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発
明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、自己免
疫性疾患および障害および／または前記の疾患および障害に関連する病状を治療
、予防、診断および／または予後判定する。具体的な好ましい実施形態では、本
発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを用いて、リウマチ様関節炎を治療、予防、診断および
／または予後する。
【０４０５】 別の具体的な好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、全
身性エリテマトーデスを治療、予防および／または診断する。別の具体的な好ま
しい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、特発性血小板減少紫斑
症を治療、予防および／または診断する。
【０４０６】 別の具体的な好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、Ig
Aニューロパシーを治療、予防および／または診断する。
【０４０７】 好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、自己免疫性疾患
および障害および／または前記の疾患および障害に関連する病状を治療、予防、
診断および／または予後判定する。
【０４０８】 好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを免疫抑制剤として用いる
。
【０４０９】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血細胞の疾患、障害および／また
は病状の治療、予防、予後判定および／または診断に有用である。本発明のアル
ブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを用いて、多能性幹細胞などの造血細胞の分化および増
殖を増加することにより、特定（もしくは多）タイプの造血細胞の減少に関連す
る疾患、障害および／または病状を治療または予防することができる。このよう
な疾患、障害および／または病状として、限定するものではないが、白血球減少
症、好中球減少症、貧血および血小板減少症がある。あるいは、本発明の融合タ
ンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを用いて、多能性幹細胞などの造血細胞の分化および増殖を増加する
ことにより、特定（もしくは多）タイプの造血細胞の増加に関連する疾患、障害
および／または病状（限定するものではないが、組織増加症など）を治療または
予防することができる。
【０４１０】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、喘息（特にアレルギー性喘息）のような
アレルギー性反応および病状を治療、予防、診断および／または予後判定するこ
ともできる。さらに、これらの分子を用いて、アナフィラキシー、抗原分子に対
する過敏症、もしくは血液群不適合を治療、予防、予後判定および／または診断
することができる。
【０４１１】 加えて、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、IgE媒介アレルギー性反応を治
療、予防、診断および／または予後判定することもできる。このようなアレルギ
ー性反応として、限定するものではないが、喘息、鼻炎および湿疹がある。特定
の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、IgE濃度をin vitroまた
はin vivoでモジュレートする。
【０４１２】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性症状の診断、予後判定、予防お
よび／または治療に用途を有する。例えば、本発明の融合タンパク質および／ま
たは本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症
性応答に関与する細胞の活性化、増殖および／または分化を阻害することができ
、これらの分子を用いて、慢性および急性炎症性症状を予防および／または治療
することができる。このような炎症性症状として、限定するものではないが、例
えば、下記のものが挙げられる：感染に関連する炎症（例えば、敗血性ショック
、敗血症、もしくは全身性炎症性応答症候群）、虚血−再灌流損傷、内毒素、致
死疾患（lethality）、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカ
イン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、サイトカイン（例えば、TNFま
たはIL-1.）の過剰生産、呼吸障害（例えば、喘息およびアレルギー）；胃腸障
害（例えば、炎症性腸疾患）；癌（例えば、胃、卵巣、肺、膀胱、肝臓および乳
房）；CNS障害（例えば、多発性硬化症；虚血性脳損傷および／または卒中、外
傷性脳損傷、神経変性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）
；AIDS関連痴呆；およびプリオン病）；心血管障害（例えば、アテローム硬化症
、心筋炎、心臓血管病、および心肺バイパス合併症）；ならびに、炎症を特徴と
するその他多くの疾患、病状および障害（例えば、肝炎、リウマチ様関節炎、痛
風、外傷、膵炎、サーコイドーシス、皮膚炎、腎虚血−再灌流損傷、グレーブス
病、全身性エリテマトーデス、糖尿病、および同種異系移植拒絶）。
【０４１３】 炎症は、基礎的な防御機構であるため、炎症性障害は、身体のほぼあらゆる組
織に影響を及ぼし得る。従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組織特異的炎症
性障害の治療に用途を有する。このような障害として、限定するものではないが
、下記のものを挙げることができる：副腎炎、肺胞炎、胆管炎、盲腸炎、亀頭炎
、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮頚炎、胆嚢炎、声帯炎、
蝸虫炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、
耳管炎、結合組織炎、毛包炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、
迷路炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋
炎、筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱周囲炎
、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、ポリオ、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎
、強膜炎、強膜脈絡膜炎、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑
膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃炎、尿道炎、および膣炎。
【０４１４】 特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブ
ミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、器官移植片拒絶および対
移植片病の診断、予後判定、予防および／または治療に有用である。器官拒絶は
、免疫応答を介した移植組織の宿主細胞破壊により起こる。同様に、免疫応答は
、GVHDにも関与し、この場合、外来移植細胞は、宿主組織を破壊する。本発明の
ポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレオチド、および／またはそれらのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、免疫応答、特に、Ｔ細胞の活性化、増殖、分
化、または化学走性を阻害することから、器官拒絶もしくはGVHDを予防するのに
有効な治療薬になると考えられる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク
質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドは、免疫応答、特に、Ｔ細胞の活性化、増殖、分化、または化学走性を阻害
することから、実験上のアレルギーおよび超急性異種移植片拒絶を予防するのに
有効な治療薬になると考えられる。
【０４１５】 他の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、
血清疾患、連鎖球菌後糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、および免疫複合体誘導性
脈管炎の診断、予後判定、予防および／または治療に有用である。
【０４１６】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、感染因子を治療、検出および
／または予防することができる。例えば、免疫応答を高める、特に、Ｂおよび／
またはＴ細胞の増殖活性化および／または分化を増加することにより、感染性疾
患を治療、検出および／または予防することができる。免疫応答は、既存の免疫
応答を増強するか、あるいは、新しい免疫応答を開始する、いずれかにより、高
めることができる。その他にも、本発明の融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を必ず
しも誘発することなく、感染病原体(agent)、（感染病原体を列挙した適用の項
を参照）を直接阻害することも可能である。
【０４１７】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗原に対する免
疫応答性を増強するワクチンアジュバントとして用いる。特定の実施形態では、
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍特異的免疫応答性を増強するアジ
ュバントとして用いる。
【０４１８】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗ウイルス免疫
応答性を増強するアジュバントとして用いる。本発明の組成物をアジュバントと
して用いることにより増強することができる抗ウイルス免疫応答には、本明細書
に記載した、もしくは当分野では公知のウイルスおよびウイルス関連の疾患また
は症状が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして
用いて、AIDS、髄膜炎、デング熱、EBVおよび肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からな
る群より選択されるウイルス、疾患、もしくは症候に対する免疫応答を増強する
。別の特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、HIV/
AIDS、呼吸器合胞体ウイルス、デング熱、ロタウイルス、日本Ｂ型脳炎、インフ
ルエンザＡおよびＢ型、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂
犬病、ジュニン（Junin）、チクングンヤ（Chikungunya）、リフトバレー熱、単
純ヘルペス、および黄熱からなる群より選択されるウイルス、疾患、もしくは症
状に対する免疫応答を増強する。
【０４１９】 別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗細菌または抗
真菌免疫応答性を増強するアジュバントとして用いる。本発明の組成物をアジュ
バントとして用いることにより増強することができる抗細菌または抗真菌免疫応
答には、本明細書に記載した、もしくは当分野では公知の細菌または真菌、ある
いは、細菌または真菌関連の疾患または症状が含まれる。特定の実施形態では、
本発明の組成物をアジュバントとして用いて、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス
中毒、およびB型髄膜炎からなる群より選択される細菌または真菌、疾患、もし
くは症状に対する免疫応答を増強する。
【０４２０】 別の特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、コレ
ラ菌(Vibrio cholerae)、らい菌(Mycobacterium leprae)、チフス菌(Salmonella
typhi)、パラチフス菌(Salmonella paratyphi)、Meisseria meningitidis、肺
炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、B群連鎖球菌、赤痢菌(Shigella spp.)
、腸毒素産生性大腸菌、腸出血性大腸菌、およびヒトライム病(Borrelia burgdo
rferi)からなる群より選択される細菌または真菌、疾患、もしくは症状に対する
免疫応答を増強する。
【０４２１】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをアジュバン
トとして用いて、抗寄生体免疫応答を増強する。アジュバントとして本発明の組
成物を用いて増強することができる抗寄生体免疫応答としては、本明細書に記載
した、もしくは当分野では公知の寄生体、ならびに、寄生体関連疾患または症状
がある。特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、寄
生体に対する免疫応答を増強する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物を
アジュバントとして用いて、プラスモジウム（マラリア）またはリーシュマニア
に対する免疫応答を増強する。
【０４２２】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例
えば、単核食細胞のリクルートおよび活性化を阻止することにより、珪肺症、サ
ルコドーシス、および特発性肺線維症などの感染性疾患を治療することもできる
。
【０４２３】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを抗体産生の
抗原として用いることにより、本発明のポリペプチドに対する免疫媒介応答を阻
害もしくは増強する。
【０４２４】 ある実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物（例えば、マ
ウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、小型ブタ（micro-pig
）、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類
、ならびにヒト、最も好ましくは、ヒト）に投与することにより、免疫系を増強
して、１以上の抗体（例えば、IgG、IgA、IgM、およびIgE）の生産量を増加させ
、より高いアフィニティー抗体生産およびイムノグロブリンクラススイッチング
（例えば、IgG、IgA、IgM、およびIgE）を誘導し、および／または免疫応答応答
を高める。
【０４２５】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、病原体に
対するＢ細胞応答性の刺激剤として用いる。
【０４２６】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、Ｔ細胞の
アクチベーターとして用いる。
【０４２７】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制
治療薬の投与前に、個体の免疫状態を高める薬剤として用いる。
【０４２８】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、より高い
アフィニティー抗体を誘導する薬剤として用いる。
【０４２９】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清イム
ノグロブリン濃度を高める薬剤として用いる。
【０４３０】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫無防
備状態の個体の回復を促進する薬剤として用いる。
【０４３１】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、高齢の集
団および／または新生児における免疫応答性を高める薬剤として用いる。
【０４３２】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、骨髄移植
および／またはその他の移植（同種異型もしくは異種器官移植）の前、最中、ま
たは、後に、免疫系エンハンサーとして用いる。移植に関しては、本発明の組成
物を移植前、移植と同時に、および／または移植後に投与する。特定の実施形態
では、本発明の組成物は、移植後、Ｔ細胞集団の回復開始の前に投与する。別の
特定の実施形態では、本発明の組成物は、移植後、Ｔ細胞集団の回復開始後であ
るが、Ｂ細胞集団の完全な回復前に投与する。
【０４３３】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、後天性Ｂ
細胞機能欠失を有する個体における免疫応答性を高める薬剤として用いる。後天
性Ｂ細胞機能欠失による病状は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／ま
たは本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与す
ることにより改善もしくは治療することができ、このような病状として、限定す
るものではないが、HIV感染、AIDS、骨髄移植、ならびに、Ｂ細胞慢性リンパ性
白血病（CLL）が挙げられる。
【０４３４】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一時性免
疫欠損を有する個体における免疫応答性を高める薬物として用いる。一時性免疫
欠損による病状は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の
アルブミン融合タンパク質を投与することにより改善もしくは治療することがで
き、このような病状として、限定するものではないが、ウイルス感染（例えば、
インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する症状、感染性単核細胞症から
の回復、もしくはストレスに関連する症状、麻疹からの回復、輸血からの回復、
ならびに、手術からの回復が挙げられる。
【０４３５】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球、樹
状細胞、および／またはＢ細胞による抗原提示の調節剤として用いる。一実施形
態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、in vitroまたはin vivoでの
抗原提示を増強する、あるいは、抗原提示に拮抗する。さらに、関連する実施形
態では、このような抗原提示の増強または拮抗作用は、抗腫瘍治療手段として、
あるいは、免疫系をモジュレートする上で有用となると考えられる。
【０４３６】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、TH1細胞
性応答とは反対に、体液性応答（例えば、TH2）の発生に向けて、個体の免疫系
を指令する薬剤として用いる。
【０４３７】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍増殖
を誘導することにより、抗腫瘍形成剤に対する腫瘍の感受性を高める薬剤として
用いる。例えば、多発性骨髄腫は、低速分裂疾患であるため、抗腫瘍形成療法に
対して耐性である。これらの細胞をより高速に増殖させれば、それらの感受性プ
ロフィールも同様に変化すると考えられる。
【０４３８】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、AIDS、慢
性リンパ球障害および／または分類不能原発性免疫不全などの疾病におけるB細
胞産生の刺激剤として用いる。
【０４３９】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、手術、外
傷または遺伝的欠陥によるリンパ系組織の産生および再生のための治療薬として
用いる。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、移
植前の骨髄サンプルの前処理に用いる。
【０４４０】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、SCID患者
に認められるような免疫不能／免疫不全を引き起こす遺伝的障害に対する遺伝子
治療薬として用いる。
【０４４１】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球／マ
クロファージを活性化する手段として用いることにより、リーシュマニア属のよ
うな単球に影響を与える寄生体性疾患を防御する。
【０４４２】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の
ポリペプチドにより誘発される分泌サイトカインを調節する手段として用いる。
【０４４３】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、これらが
、獣医学に適用可能であることから、本明細書に記載した１以上の用途に用いる
。
【０４４４】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外来病原
体または自己に対する様々な形態の免疫応答を阻止する手段として用いる。特定
形態の免疫応答の阻止が望まれる疾患もしくは病状として、例えば、狼瘡および
関節炎のような自己免疫障害、ならびに、皮膚アレルギー、炎症、腸疾患、損傷
、および病原体に関連する疾患／障害などの免疫応答性が挙げられる。
【０４４５】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特発性血
小板減少性紫斑、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫疾
患に関連するＢ細胞増殖およびIg分泌を防止する治療薬として用いる。
【０４４６】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上皮細胞
におけるＢおよび／またはＴ細胞移動の阻害剤として用いる。この活性は、組織
アーキテクチャーもしくはコグネート応答を破壊し、例えば、免疫応答を破壊し
、敗血症を阻止するのに有用である。
【０４４７】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、重症度が
不確かな単一クローン性高γグロブリン血症（MGUS）、ワンデンシュトレーム病
、関連する特発性単一クローン性高γグロブリン血症、およびプラズマ細胞腫な
どの疾患に明らかな慢性高γグロブリン血症の治療薬として用いる。
【０４４８】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例
えば、特定の自己免疫疾患、慢性炎症性および感染性疾患において、マクロファ
ージおよびその前駆体、ならびに、好中球、好塩基球、Ｂリンパ球および数種の
Ｔ細胞サブセット、例えば、活性化およびCD8細胞傷害性Ｔ細胞、ならびにナチ
ュラルキラー細胞のポリペプチド化学走性および活性化を阻害することができる
。自己免疫疾患の例は、本明細書に記載されており、多発性硬化症やインスリン
依存性糖尿病が挙げられる。
【０４４９】 また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、好酸球生産お
よび移動を阻止することにより、特発性高好酸球症候群を治療することもできる
。
【０４５０】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、補
体媒介細胞溶解を増強もしくは阻害する。
【０４５１】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、抗
体依存性細胞傷害を増強もしくは阻害する。
【０４５２】 別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、タ
ンパク質と動脈壁への単球浸潤を阻止することにより、動脈硬化を治療すること
もできる。
【０４５３】 もう1つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは成人
性呼吸障害症候群(ARDS)の治療に用いることができる。
【０４５４】 もう１つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは創傷
および組織修復の刺激、脈管形成の刺激、および／または血管またはリンパ系疾
患または障害の修復に有用であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および
／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは粘
膜表面の再生を刺激するのに用いられる。
【０４５５】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発
明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、先天的または
後天的免疫不全、欠陥のある血清免疫グロブリン産生、再発感染および／または
免疫系不全を特徴とする障害の診断、予後判定、治療および／または予防に使用
される。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、関節、骨、皮膚および／または
耳下腺の感染、血液-骨感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血性関節炎および／
または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書に開示されるもの）、炎症性
疾患、および悪性腫瘍、および／または限定されるものではないが、CVID、その
他の先天性免疫不全、HIV疾患、CLL、再発性気管支炎、副鼻腔炎、中耳炎、結膜
炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例えば、重症性帯状疱疹）、および／また
はカリニ肺炎をはじめとする、これらの感染症、疾患、障害および／または悪性
腫瘍に関連するいずれかの疾患または障害または症状の治療または予防に用いら
れる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク
質をコードするポリヌクレオチドで予防、診断、予後判定、および／または治療
され得るその他の疾患および障害としては、限定されるものではないが、HIV感
染症、HTLV-BLV感染症、リンパ球減少症、食細胞殺菌不全性貧血、血小板減少症
、および血色素尿症が挙げられる。
【０４５６】 もう1つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分
類不能型免疫不全症（「CVID」「後天性無γグロブリン血症」および「後天性低
γグロブリン血症」とも呼ばれる）またはこの疾患のサブセットを有する者の治
療および／または診断のために使用される。
【０４５７】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発
明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫細胞もし
くは免疫組織関連の癌または腫瘍をはじめとする癌または腫瘍の診断、予後判定
、予防および／または治療に用いられる。本発明の融合タンパク質および／また
は本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって予
防、診断または治療され得る癌または腫瘍の例としては、限定されるものではな
いが、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキン性リンパ
腫、急性リンパ性貧血(ALL)、 慢性リンパ球白血病、 形質細胞腫、多発性骨髄
腫、バーキットリンパ腫、EBV変換疾患、および／または本明細書の別の場所「
過増殖性疾患」と題した節に記載されている疾患および障害が挙げられる。
【０４５８】 もう1つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大
Ｂ細胞リンパ腫の細胞内増殖を低下させる療法として用いられる。
【０４５９】 もう1つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ
細胞および慢性骨髄性白血病関連のIgの介在を低下させる手段として用いられる
。
【０４６０】 特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば部分的または完全脾臓摘出術
を受けた者のようなＢ細胞免疫不全者の免疫応答性を高める薬剤として用いられ
る。
【０４６１】 血液関連疾患 好ましい実施形態では、免疫グロブリン、血清コリンエステラーゼ、α−１ア
ンチトリプシン、アプロチニンおよび前駆体形態および活性形態の凝固因子(例
えば、フォン・ビルブラント因子、フィブリノーゲン、第II因子、第VII因子、
活性第VIIA因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、c1インアクチ
ベーター、アンチトロンビンIII、トロンビンおよびプロトロンビン、アポ-リポ
タンパク質、ｃ−反応性タンパク質およびプロテインＣが含まれるがこれらに限
定されない)ならびにその断片および/もしくは変異体に対応する治療用タンパク
質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して、止血（出血を止め
る）または血栓崩壊（血餅を溶解する）活性を改変し、そして血液に関連する疾
患を治療、予防、診断、予後判定および/または検出することができる。
【０４６２】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、止血(出血の停止)または血栓崩壊(
血餅溶解)活性をモジュレートするのに用いることができる。例えば、止血活性
または血栓溶解活性を高めることによって本発明の融合タンパク質および／また
は本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液凝
固の疾患、障害および／もしくは症状（例えば、無フィブリノーゲン血症、因子
欠損症、血友病）、血小板性の疾患、障害および／もしくは症状（例えば、血小
板減少症）、または外傷、外科術もしくは他の理由による創傷の治療もしくは予
防に使用できる。あるいは、止血活性または血栓溶解活性を低下させ得る本発明
の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドは、凝固を阻害または溶解するのに使用できる。これらの分
子は心臓発作（梗塞）、卒中または瘢痕形成の治療または予防に重要であり得る
。
【０４６３】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発
明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈
血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗
塞、一過性脳虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、予後判定および／または治
療に用いられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質およ
び／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは
、伏在移植片の閉塞の予防のため、血管形成術に付随し得るものとしての手術前
後の血栓症のリスクを軽減するため、非リウマチ性心房細動をはじめとする心房
細胞を有する患者における卒中のリスクを軽減するため、機械的心臓弁および／
または僧帽弁の疾患に関連する塞栓症のリスクを軽減するために用いてもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドのその他の使用としては、限定されるもの
ではないが、体外装置（例えば、血管内カニューレ、血液透析患者の血管挿入シ
ャント、血液透析機、および心肺バイパス装置）における閉塞の予防がある。
【０４６４】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液およ
び／または本発明のポリペプチドが発現する組織と関連した器官をめぐる血液の
疾患および障害の予防、診断、予後判定および／または治療のために用いられる
。
【０４６５】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドは、造血（血球の形成）活性をモジュレートするの
に用いてもよい。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば赤血
球、リンパ球（ＢまたはＴ細胞）、骨髄性細胞（例えば、好塩基球、好酸球、好
中球、マスト細胞、マクロファージ）および血小板などの血球の全てまたはサブ
セットの量を増やすために用いられる。血球または血球サブセットの量を減らす
能力は下記の貧血症および／または白血球減少症の予防、検出、診断および／ま
たは治療に有用であり得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質およ
び／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは
、例えば赤血球、リンパ球（ＢまたはＴ細胞）、骨髄性細胞（例えば、好塩基球
、好酸球、好中球、マスト細胞、マクロファージ）および血小板などの血球の全
てまたはサブセットの量を減らすために用いてもよい。血球または血球サブセッ
トの量を減らす能力は例えば好酸球増加症などの白血球増加症の予防、検出、診
断および／または治療に有用であり得る。
【０４６６】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドは血液疾患の予防、治療または診断に用いてもよい
。
【０４６７】 貧血症は赤血球の数またはヘモグロビン（酸素を輸送するタンパク質）の量が
正常値を下回る症状である。貧血症は過剰な出血、赤血球生産の低下、または赤
血球破壊（溶血）の増加を原因とする。本発明のアルブミン融合タンパク質およ
び／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは
貧血症の治療、予防および／または診断に有用であり得る。本発明のアルブミン
融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドによって治療、予防または診断され得る貧血症としては、鉄欠
乏性貧血、低色素性貧血、小球子性貧血、萎黄病、遺伝性鉄赤芽球性貧血、特発
性後天性鉄赤芽球性貧血、赤血球形成不全、巨赤芽球性貧血（例えば、悪性貧血
、(ビタミンＢ１２欠乏症)および葉酸欠乏性貧血）、再生不良性貧血、溶血性貧
血（例えば、自己免疫性溶血性貧血、細血管性溶血性貧血、および発作性夜間血
色素尿症）が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定される
ものではないが、全身性紅斑性狼瘡、癌、リンパ腫、慢性腎疾患、および脾臓肥
大に関連する貧血症をはじめとする疾患に関連の貧血症の治療、予防および／ま
たは診断に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、メチルド
ーパ、ダプソン、および／またはスルファ剤に関連する貧血症のような薬剤治療
から起こる貧血症の治療、予防および／または診断に有用であり得る。さらに、
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、遺伝性球状赤血球症
、遺伝性楕円赤血球症、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症、および
鎌状赤血球貧血をはじめとする、異常な赤血球構造に関連する貧血症の治療、予
防および／または診断に有用であり得る。
【０４６８】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘモグロビン異常（例えば、鎌状赤
血球貧血、ヘモグロビンＣ症、へのグロビンS-C症、およびヘモグロビンE症）の
治療、予防および／または診断に有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン
融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、多数型および少数型α-地中
海貧血症およびβ-地中海貧血症をはじめとする地中海貧血症の診断、予後判定
、予防および／または治療に有用であり得る。
【０４６９】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定され
るものではないが、血小板減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑、および血
栓性血小板減少性紫斑）、フォン・ビルブラント病、遺伝性血小板障害（例えば
、チェディアック・東症候群およびヘルマンスキー・パドラック症候群などの貯
蔵プール疾患、トロンボキサンＡ２機能不全、血小板無力症、およびベルナール
・スリエ症候群）、溶血性尿毒症候群、Ａ型血友病もしくは因子VII欠乏症およ
びクリスマス病もしくは因子IX欠乏病などの血友病、ランデュー・オスラー・ウ
ェーバー症候群としても知られる遺伝性出血性毛細血管拡張症、アレルギー性紫
斑（ヘノッホ・シェーンライン紫斑）および汎発性血管内凝固をはじめとする出
血性疾患の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０４７０】 血液の凝固時間に対する、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作用は、限
定されるものではないが、全血部分トロンボプラスチン時間(PTT)、活性化部分
トロンボプラスチン時間(aNT)、活性化凝固時間(ACT)、カルシウム再沈着活性化
凝固時間、またはリー・ホワイト凝固時間をはじめとする、当技術分野で公知の
凝固試験のいずれによってモニターしてもよい。
【０４７１】 いくつかの疾患および種々の薬剤が血小板機能不全を引き起こし得る。従って
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは腎不全、白血病、
多発性骨髄腫、肝硬変および全身性紅斑性狼瘡を伴う血小板機能不全、ならびに
アスピリン、チクロピジン、非ステロイド系抗炎症薬（関節炎、痛みおよび捻挫
に用いられる）、および高用量ペニシリンによる治療をはじめとする薬剤治療に
関連する血小板機能不全といった後天性血小板機能不全の診断、予後判定、予防
および／または治療に有用であり得る。
【０４７２】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球数
の増加または減少を特徴とする、またはそれと関連する疾患および障害の診断、
予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。白血球減少症は白血球の
数が正常値以下に減少する場合に起こる。血球減少症としては、限定されるもの
ではないが、好中球減少症およびリンパ球減少症がある。正常値に比べたときの
白血球の数の増加は白血球増加症として知られる。身体では感染中に白血球数の
増加が起こる。このように白血球増加症は容易に、感染を反映する通常の生理学
的パラメーターとなる。あるいは、白血球増加症は傷害または癌などのその他の
疾患の指標にもなる。白血球増加症としては、限定されるものではないが、好酸
球増加症およびマクロファージの集積が挙げられる。特定の実施形態では、本発
明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク
質をコードするポリヌクレオチドは白血球減少症の診断、予後判定、予防および
／または治療に有用であり得る。他の特定の実施形態では、本発明のアルブミン
融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドは白血球増加症の診断、予後判定、予防および／または治療に
有用であり得る。
【０４７３】 白血球減少症はあらゆる種類の白血球の全般的な減少である場合もあるし、あ
るいは特定の種類の白血球の特異的消耗の場合もある。このように特定の実施形
態では、 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは好中球減少症として知られる
好中球数の減少の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／ま
たは治療され得る好中球減少症としては、限定されるものではないが、小児遺伝
性顆粒球減少症、家族性好中球減少症、周期性好中球減少症、栄養不足（例えば
、ビタミンＢ１２欠乏症または葉酸欠乏症）による、または関連する好中球減少
症、薬剤治療（例えば、ペニシリン治療などの抗生物質投与、スルホンアミド治
療、抗凝固剤治療、抗痙攣薬、抗甲状腺薬および抗癌化学療法）による、または
関連する好中球減少症、および数種の細菌またはウイルス感染、アレルギー性障
害、自己免疫疾患、脾臓肥大者の症状（例えば、フェルティ症候群、マラリアお
よび類肉腫症）およびいくつかの薬剤治療法に付随して起こる好中球破壊の増加
を原因とする好中球減少症が挙げられる。
【０４７４】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ストレ
ス、薬剤治療（例えば、コルチコステロイド、癌化学療法および／または放射線
療法）、エイズ感染、および／または、例えば癌、慢性関節リウマチ、全身性紅
斑性狼瘡、慢性感染、いくつかのウイルス感染および／または遺伝性疾患（例え
ば、ディジョージ症候群、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、重症性複合型
免疫欠損、毛細血管拡張性運動失調）などの他の疾患による、または関連するリ
ンパ球減少症をはじめとするリンパ球減少症（Ｂおよび／またはＴリンパ球数の
減少）の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０４７５】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ゴーシ
ェ病、ニーマン・ピック病、レテラー・ジーヴェ病およびハンド・シュラー・ク
リスチャン病をはじめとする、マクロファージ数および／またはマクロファージ
機能に関連する疾患および障害の診断、予後判定、予防および／または治療に有
用であり得る。
【０４７６】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定され
るものではないが、特発性過好酸球増加症候群、好酸球増加性筋肉痛症候群、お
よびハンド・シュラー・クリスチャン病をはじめとする、好酸球数および／また
は好酸球機能に関連する疾患および障害の診断、予後判定、予防および／または
治療に有用であり得る。
【０４７７】 なおもう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／ま
たは本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定
されるものではないが、急性リンパ球性（リンパ芽球性）白血病(ALL)、急性骨
髄性（骨髄性(myeloid)、骨髄性(myelogenous)、骨髄芽球性、または骨髄単球性
）白血病、慢性リンパ球性白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、セザ
ール症候群、およびヘアリー細胞白血病）、慢性骨髄性（骨髄性(myeloid)、骨
髄性(myelogenous)、または顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキン
リンパ腫、バーキットリンパ腫、および菌状息肉腫をはじめとする白血病および
リンパ腫の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０４７８】 その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定される
ものではないが、形質細胞悪液質、単一クローン性高γグロブリン血症、重症度
が不確かな単一クローン性高γグロブリン血症、多発性骨髄腫、マクログロブリ
ン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、寒冷グロブリン血症、お
よびレイノー現象をはじめとする、形質細胞の疾患または障害の診断、予後判定
、予防および／または治療に有用であり得る。
【０４７９】 その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定される
ものではないが、真性赤血球増加症、相対的赤血球増加症、続発性赤血球増加症
、骨髄繊維症、急性骨髄繊維症、原因不明骨髄様化生、血小板減少症（原発生お
よび続発生血小板減少症の両者を含む）、および慢性骨髄性白血病をはじめとす
る骨髄増殖生疾患の治療、予防および／または診断に有用であり得る。
【０４８０】 その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科手術に
先立ち赤血球生産を増強する処置として有用であり得る。
【０４８１】 その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球、好
酸球およびマクロファージの移動、食作用、スーパーオキシド生産、それらの細
胞傷害性に依存する抗体を増強する薬剤として有用であり得る。
【０４８２】 その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは幹細胞のフェ
レーシスに先立ち循環中の幹細胞の数を増やす薬剤として有用であり得る。もう
1つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板の
フェレーシスに先立ち循環中の幹細胞の数を増やす薬剤として有用であり得る。
【０４８３】 その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはサイトカイン
生産を増強する薬剤として有用であり得る。
【０４８４】 その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原発生造血
障害の予防、診断および／または治療に有用であり得る。
【０４８５】過増殖性疾患 ある実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍をはじめとする過増殖
性疾患の治療または検出に使用できる。本発明のアルブミン融合タンパク質およ
び／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは
、相互作用を指示するまたは指示しないことによってのこの障害の増殖を阻害し
得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過増殖性疾患を阻害し得る他の
細胞を増殖させ得る。
【０４８６】 例えば、免疫応答を増強する、特に過増殖性疾患の抗原性を増強することによ
り、またはＴ細胞を増殖、分化もしくは可動化することにより、過増殖性疾患は
治療できる。この免疫応答は既存の免疫応答を増強すること、または新たな免疫
応答を誘導することのいずれかにより増強され得る。あるいは、化学療法薬など
、免疫応答を低下させることも過増殖性疾患の治療方法となり得る。
【０４８７】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドによって治療または検出できる過増殖性疾患の例と
しては、限定されるものではないが、結腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵
臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、
眼、頭部および頚部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織
、脾臓、胸部および泌尿生殖管に存在する腫瘍が挙げられる。
【０４８８】 同様に、その他の過増殖性疾患も本発明の融合タンパク質および／または本発
明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療また
は検出できる。かかる過増殖性疾患の例としては、限定されるものではないが、
急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病
、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人性（原発性）肝細胞癌、成人性（原発性
）肝癌、成人性急性リンパ球性白血病、成人性急性骨髄性白血病、成人性ホジキ
ン病、成人性ホジキン白血病、成人性リンパ球性白血病、成人性非ホジキンリン
パ腫、成人性原発性肝癌、成人性軟組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連
悪性腫瘍、肛門癌、星状膠細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫
瘍、乳癌、腎盂および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リ
ンパ腫、小脳星状膠細胞腫、大脳星状膠細胞腫、子宮頚癌、小児（原発性）肝細
胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ芽急性白血病、小児急性骨髄性白血
病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状膠細胞腫、小児大脳星状膠細胞腫、小児頭
蓋外生殖細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部・視
覚経路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ
腫、小児松果体・テント上原始神経板外胚葉腫瘍、小児原発性肝癌、小児網紋筋
肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚経路・視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血
病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌性膵島細胞腫、子
宮内膜癌、上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、外分
泌性膵臓癌、頭蓋外生殖細胞腫瘍、生殖腺外生殖細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌
、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、胃腸癌、生殖細胞癌、
妊娠栄養膜癌、ヘアリー細胞白血病、頭部・頚部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホ
ジキンリンパ腫、高γグロブリン血症、下咽頭癌、腸管癌、眼内黒色腫、島細胞
癌腫、島細胞膵癌、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌、口唇・口腔癌、肝臓癌、肺癌
、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺
腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜伏原発性扁平上皮頚癌、転移性原発性扁
平上皮頚癌、転移性扁平上皮頚癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍
、脊髄形成不全症候群、骨髄性白血病(Myelogenous Leukemia)、骨髄性白血病（
Myeloid Leukemia）、骨髄増殖性疾患、鼻腔・副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞
腫、妊娠中非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜伏原発性転
移性扁平上皮頚癌、口咽頭癌、骨／悪性繊維肉腫、骨肉腫／悪性繊維組織球腫、
骨肉腫／骨の悪性腫瘍繊維組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞癌、卵巣低悪性
潜在癌、膵臓癌、異常蛋白血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和性細
胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、
原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、横
紋筋肉腫、唾液腺癌、類肉腫症肉腫、セザール症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小
腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頚癌、胃癌、テント上原始神経板外胚葉・松果体腫
瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、胸腺癌、腎盂・尿管の移行細胞癌、移行
腎盂・尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管・腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣
癌、視覚経路・視床下部神経膠腫、陰門癌、ワルデンシュトレーム性マクログロ
ブリン血症、ビルムス腫瘍、および上記の臓器系に存在する腫瘍以外のその他の
過増殖性疾患が挙げられる。
【０４８９】 もう１つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および
／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
限定されるものではないが上記の疾患をはじめ、前悪性症状の診断、予後判定、
予防および／または治療に、また、腫瘍または悪性状態への進行の予防に用いら
れる。かかる使用は、特に過形成、化生、または最も特には形成異常からなる非
腫瘍性細胞増殖が起こっている腫瘍または癌への上記進行に先行することが知ら
れている、または先行すると予測される症状に指示される(かかる異常増殖症状
の総説としては、RobbinsおよびAngell, 1976, Basic Pathology, 第2版, W. B.
Saunders Co., Philadelphia, 68-79頁を参照)。
【０４９０】 過形成は、構造または機能に有意な変化を伴わない組織または器官の細胞数の
増加を含む、制御された細胞増殖の一形態である。本発明の融合タンパク質およ
び／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで
診断、予後判定、予防および／または治療され得る過形成疾患としては、限定さ
れるものではないが、血管濾胞性縦隔リンパ節過形成、好酸球増加症随伴血管類
リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨リンパ
節過形成、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性皮脂過形成、嚢胞性過
形成、乳房嚢胞性過形成、義歯過形成、腺管過形成、子宮内膜過形成、繊維筋過
形成、限局性上皮過形成、歯肉過形成、炎症性繊維過形成、炎症性乳頭過形成、
血管内乳頭内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性増
殖症、老人性脂腺増殖症、およびいぼ状過形成が挙げられる。
【０４９１】 化生は、ある種類の成熟細胞、または完全に分化した細胞が別の種類の成熟細
胞に置き換わる、制御された細胞増殖の一形態である。本発明の融合タンパク質
および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドで診断、予後判定、予防および／または治療され得る化生疾患としては、限定
されるものではないが、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化生、自
己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、変形骨化、化生性
ポリープ、骨髄性化生、原発性骨髄性化生、続発生骨髄性化生、扁平上皮化生、
羊膜扁平上皮化生、および症候性骨髄性化生が挙げられる。
【０４９２】 形成異常は癌の前兆であることが多く、主として上皮に見られ、個々の細胞の
均一性および細胞の構造的な配向の欠如を含む、非腫瘍性細胞増殖の最も病的な
形態である。形成異常細胞はしばしば異常に大きく、濃く染まる核を有し、多形
態性を示す。特徴的には、形成異常は慢性的な刺激または炎症が存在する場所で
起こる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドで診断、予後判定、予防および／または治療
され得る形成異常疾患としては、限定されるものではないが、無発汗性外胚葉性
形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺形成
異常、大脳形成異常、 子宮頚形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形
成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋手根骨足根骨形成異
常、 頭蓋骨幹端形成異常、象牙質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常
、エナメル質形成異常、脳眼球形成異常、骨端形成異常性半肢症、多発性骨端形
成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性繊
維性顎形成異常、家族性白色襞形成異常、繊維筋性形成異常、繊維性骨形成異常
、根尖性骨形成異常、遺伝性腎臓網膜形成異常、発汗性外胚葉性形成異常、低発
汗性外胚葉性形成異常、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、下顎顔面
骨形成不全、骨幹端形成異常、モンディーニ形成異常、単発性維性形成異常、粘
膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼
歯指形成異常、歯原性形成異常、眼下顎四肢形成異常、歯根尖周囲セメント質形
成異常、多発性繊維性形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異
常、眼中隔形成不全、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常が挙げられる
。
【０４９３】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドで診断、予後判定、予防および／または治療され得
るさらなる前腫瘍性疾患としては、限定されるものではないが、良性増殖異常（
例えば、良性腫瘍、繊維嚢胞性症状、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、お
よび食道形成異常）、白斑病、角化症、ボーエン病、農夫肌、日光性角化症が挙
げられる。
【０４９４】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の
ポリペプチドを発現する組織に関連する疾患の診断および／または予後判定に用
いられる。
【０４９５】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
上記のような毒素または放射性同位元素と共役した本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、本明細書
の上記のものをはじめとする癌および腫瘍の治療に用いられる。さらなる好まし
い実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または上記のよう
な毒素または放射性同位元素と共役した本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは、急性骨髄性白血病の治療に用いられる。
【０４９６】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドはアポトーシスに作用することから、細胞
の生存の上昇またはアポトーシスの阻害の上昇に関連するいくつかの疾患を治療
するのに有用であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドお
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって診断、予後判定、予防
および／または治療され得る細胞の生存またはアポトーシスの阻害の上昇に関連
する疾患としては、癌（限定されるものではないが、結腸癌、心腫瘍、膵臓癌、
黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘
液腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺癌、乳癌
、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌などをはじめとする濾胞性リンパ腫、p5
3変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍）、多発性硬化症、シューグレン
症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋
炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウマチ
などの自己免疫疾患、およびウイルス感染症（ヘルペスウイルス、ポックスウイ
ルスおよびアデノウイルスなど）、炎症、移植片対宿主病、急性移植拒絶、およ
び慢性移植拒絶が挙げられる。
【０４９７】 好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌、特に上記のものの
増殖、進行および／または転移の阻害に用いられる。
【０４９８】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または治療
され得る細胞の生存の上昇に関連するさらなる疾病または症状としては、限定さ
れるものではないが、白血病（急性白血病(例えば、急性リンパ球性白血病、急
性骨髄性白血病(骨髄芽性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含
む)および慢性白血病(例えば、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ球
性白血病))、真性赤血球増加症、リンパ腫(例えば、ホジキン病および非ホジキ
ン病)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、
および限定されるものではないが、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、
骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ管内皮肉腫
、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、
乳癌、子宮癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺
癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、脊髄癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆
管癌、繊毛上皮癌、精上皮癌、胎生期癌、ビルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、
肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、頭
蓋咽頭腫、上衣細胞腫、 松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫、乏突起神経膠腫
、血管腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫を
はじめとする固形腫瘍といった悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転
移が挙げられる。
【０４９９】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または治療
できるアポトーシスの上昇に関連する疾患としては、エイズ;神経変性疾患(アル
ツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、大脳変性
および脳腫瘍または先の関連疾患など);自己免疫疾患(多発性硬化症、シェーグ
レン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発
性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウ
マチなど)、骨髄形成不全症候群(再生不良性貧血など)、移植片対宿主病、虚血
性傷害(心筋梗塞、卒中および再潅流傷害によって引き起こされるものなど)、肝
傷害(例えば、肝炎関連肝傷害、虚血性/再潅流傷害、胆汁うっ滞(胆管傷害)およ
び肝臓癌);毒素誘発性肝疾患(アルコールにより引き起こされるものなど)、敗血
症性ショック、悪液質および拒食症が挙げられる。
【０５００】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または治療
できる過増殖性疾患または障害としては、限定されるものではないが、肝臓、腹
部、骨、乳房、消化系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣
、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頚部、神経系（中枢および末梢）、リ
ンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖管に存在する腫瘍が挙
げられる。
【０５０１】 同様に、その他の過増殖性疾患も、本発明の融合タンパク質および/または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、
予後判定、予防および/または治療できる。そのよな過増殖性疾患の例としては
、限定されるものではないが、高γグロブリン血症、リンパ増殖性障害、パラプ
ロテイン血症、紫斑病、類肉腫症、セザール症候群、ワルデンシュトレーム性マ
クログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および上記の臓器系に存在す
る腫瘍以外のその他の過増殖性疾患が挙げられる。
【０５０２】 もう１つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドは、本発明、および／またはタンパク質融合物もしくは
その断片を用いた遺伝子療法により、異常細胞分裂を阻害するのに用いられる。
【０５０３】 よって、本発明では異常増殖細胞にその発現を抑制する本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより細胞増殖性障
害を治療する方法が提供される。
【０５０４】 本発明のもう1つの実施形態では、本発明の1以上の活性遺伝子コピーの異常増
殖細胞への投与を含んでなる個体において細胞増殖性障害を治療する方法が提供
される。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはそのポリヌクレオ
チドをコードするDNA配列を発現するのに有効な組換え発現ベクターを含んでな
るDNA構築物である。本発明のもう1つの好ましい実施形態では、本発明の融合タ
ンパク質をコードするDNA構築物が細胞に挿入され、それがレトロウイルス、さ
らに好ましくはアデノウイルスベクターを用いて治療される(参照により本明細
書に組み入れる、G. J. Nabelら, PNAS 1999 96: 324-326参照)。最も好ましい
実施形態では、ウイルスベクターは欠損しており、非増殖細胞を形質転換しない
で増殖細胞だけを形質転換する。さらに、好ましい実施形態では、単独またはそ
の他のポリヌクレオチドとの組合せもしくはそれとの融合状態で増殖細胞へ挿入
された本発明のポリヌクレオチドは、さらに、そのポリヌクレオチドのプロモー
ター上流で作用してコードされたタンパク質産物の発現を誘導する外部刺激(す
なわち、磁性物質、特定小分子、化学物質または薬剤投与、他)を介してモジュ
レートされ得る。本発明の有益な治療効果自体がその外部刺激に基づいて明白に
モジュレート(すなわち、本発明の発現を増強、低下または阻害すること)され得
る。
【０５０５】 本発明のポリヌクレオチドは発癌遺伝子または抗原の発現の抑制に有用であり
得る。「発癌遺伝子の発現の抑制」とは、遺伝子転写の抑制、遺伝子転写物(プ
レメッセージRNA)の破壊、スプライシングの阻害、メッセンジャーRNAの破壊、
タンパク質の翻訳後修飾の阻害、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常な
機能の阻害を意味するものである。
【０５０６】 異常増殖細胞への局所投与では、本発明のポリヌクレオチドが、限定されるも
のではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のミクロ
注入、またはリポソーム、リポフェクチンなどのビヒクルで、もしくは裸のポリ
ヌクレオチドとしてなどの当業者には公知のいずれかの方法により、あるいは明
細書に記載されるいずれか他の方法により投与され得る。本発明のポリヌクレオ
チドは、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター(Gilboa, J. Viro
logy 44:845 (1982); Hocke, Nature 320:275 (1986); Wilsonら, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 85:3014)、ワクシニアウイルス系(Chakrabartyら, Mol. Cel
l Biol. 5:3403 (1985)または当業者に公知のその他の効率的なDNA送達系(Yates
ら, Nature 313:812 (1985))などの公知の遺伝子送達系により送達され得る。こ
れらの参照文献は単なる例示であり、参照により本明細書に組み入れる。異常増
殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、非分裂細胞のスペア
を作るためには、当業者に公知のレトロウイルス、またはアデノウイルス (当技
術分野で、本明細書の別の場所でも記載される)送達系を用いることが好ましい
。レトロウイルスDNAでは、組み込みに宿主DNA複製が必要であるが、レトロウイ
ルスはその生活環に必要なレトロウイルス遺伝子が欠失しているために自己複製
することができない。本発明のポリヌクレオチドのかかるレトロウイルス送達系
を用いてその遺伝子および構築物を異常増殖細胞に導き、非分裂正常細胞のスペ
アを作る。
【０５０７】 本発明のポリヌクレオチドは、注射針を患部に直接誘導するのに使用する画像
装置を用いて内臓、体腔等の細胞増殖性障害／疾患部位に直接送達され得る。ま
た、本発明のポリヌクレオチドは手術的介入の際にも患部に投与され得る。
【０５０８】 「細胞増殖性疾患」とは、良性または悪性いずれかの、細胞、細胞群、または
組織の単一または多数の局所的異常増殖を特徴とする器官、腔、または体の一部
のいずれか1つまたはいずれかの組合せに作用するヒトまたは動物疾患もしくは
障害のいずれかを意味するものである。
【０５０９】 本発明のポリヌクレオチドは処置される細胞の増殖に生物学的阻害効果を及ぼ
し得るいずれもの量が投与され得る。さらに、1以上の本発明のポリヌクレオチ
ドを同時に同じ部位に投与することが可能である。「生物学的阻害」とは、部分
的または完全成長阻害ならびに細胞の増殖または成長速度の低下を意味するもの
である。生物学的阻害量は本発明のポリヌクレオチドの、組織培養物における標
的悪性または異常増殖細胞成長、動物および細胞培養物における腫瘍成長に及ぼ
す効果の評価により、または当業者に公知のいずれか他の方法により決定され得
る。
【０５１０】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは本明細書の別の場所で記載されるように
単独で、融合タンパク質として、または他のポリペプチドとの組み合わせてのい
ずれかで、増殖細胞または組織の脈管形成の直接または間接的阻害に有用である
。
【０５１１】 最も好ましい実施形態では、その抗脈管形成効果は間接的に、例えば腫瘍関連マ
クロファージなどの造血性、腫瘍特異的細胞の阻害によって達成され得る(参照
により本明細書に組み入れる、Joseph IBら, J Natl Cancer Inst, 90(21):1648
-53 (1998)参照)。
【０５１２】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスの誘導により増殖性細
胞または組織の阻害に有用であり得る。これらの融合タンパク質および／または
ポリヌクレオチドは直接または間接的のいずれかで作用して、例えば腫瘍壊死因
子(TNF)受容体-1、CD95 (Fas/APO-1)、TNF受容体関連アポトーシス媒介タンパク
質(TRAMP)ならびにTNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体-1および-2
などのデスドメイン受容体の活性化において増殖性細胞および組織のアポトーシ
スを誘導し得る(参照により本明細書に組み入れる、Schulze-Osthoff Kら, Eur
J Biochem 254(3):439-59 (1998)参照)。さらに本発明のもう1つの好ましい実施
形態では、これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アポト
ーシスを活性化するその他のタンパク質の活性化において、またはこれらのタン
パク質の発現をアポプトニン、ガレクチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク
質などの小分子薬剤もしくは補助的薬剤単独またはそれらの組合せで刺激するこ
とによるなどのその他の機構によりアポトーシスを誘導し得る(例えば、Mutat R
es 400(1-2):447-55 (1998), Med Hypotheses.50(5):423-33 (1998), Chem Biol
Interact. Apr 24:111-112:23-24 (1998), J Mol Med.76(6):402-12 (1998), I
nt J Tissue React;20(1):3-15 (1998)参照、なおこれらは全て参照により本明
細書に組み入れられる)。
【０５１３】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは増殖性細胞または組織の転移の阻害に
有用である。阻害はこれらのアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌク
レオチドを投与するといった直接的な結果として、または転移を阻害することが
知られているタンパク質、例えばα4 インテグリンの発現の活性化など、間接的
にも起こり得る(例えば、参照により本明細書に組み入れる、Curr Top Microbio
l Immunol 1998;231:125-41参照)。本発明のかかる治療効果は小分子薬剤もしく
は補助的薬剤単独またはそれらの組合せで達成され得る。
【０５１４】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組
成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する、またはそれと会合する
、それによって結合されるポリペプチドを発現する標的化された細胞に送達する
方法が提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質は疎水、親水、イオンお
よび／または共有結合によって異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロ
ドラッグと会合し得る。
【０５１５】 本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質を
「ワクチン注射」して増殖性抗原および免疫原に応じた免疫応答が起こるといっ
たように直接的に、またはその抗原および免疫原に対する免疫応答を増強するこ
とが知られているタンパク質(例えば、ケモカイン)の発現の活性化など間接的に
、増殖細胞または組織の免疫原性および／または抗原性の増強に有用である。
【０５１６】腎障害 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは腎臓系統の障害の治療、予防、診断お
よび／または予後判定に用いられる。本発明の組成物を用いて診断、予後判定、
予防、および／または治療できる腎障害としては、限定されるものではないが、
腎不全、 腎炎、腎臓の血管障害、代謝性および先天性腎障害、腎臓の泌尿器障
害、自己免疫疾患、硬化および壊死、電解質平衡異常、ならびに腎臓癌が挙げら
れる。
【０５１７】 本発明の組成物を用いて診断、予後判定、予防、および／または治療できる腎
疾患としては、限定されるものではないが、急性腎不全、慢性腎不全、アテロー
ム塞栓性腎不全、末期腎疾患、炎症性腎疾患(例えば、急性糸球体腎炎、感染後
糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、膜性糸球体腎炎、家族
性ネフローゼ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎IおよびII、メサンギウム増殖性糸
球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急性尿細管間質性腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、溶
連菌感染後急性糸球体腎炎(PSGN)、腎盂腎炎、ループス腎炎、慢性腎炎、間質性
腎炎、ならびに溶連菌感染後糸球体腎炎)、腎臓の血管障害(例えば、腎臓梗塞、
アテローム塞栓性腎疾患、腎皮質壊死、悪性腎硬化症、腎静脈血栓症、腎潅流不
全、腎性網膜症、腎虚血再灌流、腎動脈塞栓症、および腎動脈狭窄)、ならびに
尿路疾患(例えば、腎盂腎炎、水腎症、尿石症(腎結石症、腎石病)、逆流性腎症
、尿路感染症、尿閉、および急性または慢性片側性閉塞性尿路疾患)が原因とな
る腎障害が挙げられる。
【０５１８】 さらに、本発明の組成物は代謝性および先天性腎障害(例えば、尿毒症、アミ
ロイド腎症、腎性骨異栄養症、尿細管性アシドーシス、腎性糖尿、腎性尿崩症、
シスチン尿症、ファンコーニ症候群、腎性線維嚢胞性骨組織形成(腎性くる病)、
ハルトナップ病、バーター症候群、リドル症候群、多嚢胞性腎疾患、髄質嚢胞性
疾患、海綿腎、アルポート症候群、爪膝蓋骨症候群、先天性ネフローゼ症候群、
CRUSH症候群、馬蹄腎、糖尿病性腎症、腎性尿崩症、鎮痛薬性腎症、腎石、およ
び膜性腎症)、ならびに腎臓の自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス(S
LE)、グッドパスチャー症候群、IgA腎症、およびIgMメサンギウム増殖性糸球体
腎炎)の診断、予後判定、予防、および／または治療に使用できる。
【０５１９】 また、本発明の組成物は硬化性または壊疽性腎障害(例えば、糸球体硬化症、
糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、壊死性糸球体腎炎、および腎乳
頭壊死)、腎臓癌(例えば、腎腫、副腎腫、腎芽腫、腎細胞癌、移行細胞癌、腎腺
癌、扁平上皮細胞癌、およびウィルムス腫瘍)、および電解質平衡異常(例えば、
腎石灰化症、膿尿症、浮腫、水腎炎、蛋白尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム
血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症
、低リン酸血症、および高リン酸血症)の診断、予後判定、予防、および／また
は治療にも使用できる。
【０５２０】 本発明の組成物は、限定されるものではないが、送達部位での注射針による直
接注入、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、バイオリスティックインジェク
ター(biolistic injector)、粒子加速器、ジェルフォームスポンジデポー、その
他の商業的に入手可能なデポー剤、浸透圧ポンプ、経口または坐剤用固形医薬製
剤、手術中のデカンティングまたは局所適応、エアゾール送達などの当技術分野
で公知のいずれかの方法を用いて投与され得る。かかる方法は当技術分野で公知
である。本発明の組成物は以下でさらに詳細に記載する治療用物質の一部として
投与され得る。本発明のポリヌクレオチドを送達する方法については本明細書で
さらに詳細に記載する。
【０５２１】心血管障害 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、四肢虚
血などの末梢動脈疾患をはじめとする心血管障害の治療、予防、診断、および／
または予後判定にも用いられる。
【０５２２】 心血管障害としては、限定されるものではないが、動脈-動脈性フィステル、
動静脈フィステル、脳動静脈奇形、先天性心欠陥、肺動脈弁閉鎖症、およびシミ
ター症候群などの心血管異常が挙げられる。 先天性心欠陥としては、限定され
るものではないが、大動脈縮狭症、心縮狭症、冠状血管奇形、十字心、右胸心、
動脈管開存症、エブシュタイン奇形、アイゼンメンガー複合、左心室発育不良症
候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転移症、両大動脈右室起始症、三尖弁閉
鎖症、動脈管遺残、ならびに大動脈肺動脈中隔欠損症、心内膜床欠損症、リュタ
ンバッシュ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症などの心中隔欠損症が挙
げられる。
【０５２３】 心血管障害としてはまた、限定されるものではないが、不整脈、カルチノイド
心疾患、高心拍出量、低心拍出両、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）
、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心
浮腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心
室中隔断裂、心臓弁疾患、心筋性疾患、心筋虚血、心膜滲出、心膜炎（狭窄性お
よび結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、肺動脈性心疾患、リウマチ
性心疾患、心室不全、充血、妊娠性心血管合併症、シミター症候群、心血管梅毒
、および心血管結核などの心疾患が挙げられる。
【０５２４】 不整脈としては、限定されるものではないが、洞性不整脈、心房細動、心房粗
動、徐脈、期外収縮、アダムズ-ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック
、長期QT症候群、副収縮、ローン-ギャノング-レバイン症候群、マハイム型異常
早期興奮症候群、ウォルフ-パーキンソン-ホワイト症候群、洞機能不全症候群、
頻脈、および心室細動が挙げられる。頻脈としては、発作性頻脈、上室性頻脈、
急速心室固有調律、房室結節性再入頻脈、異所性心房頻脈、異所性接合部頻脈、
洞房結節性頻脈、洞性頻脈、トルサード・ド・ポワント、および心室頻脈が挙げ
られる。
【０５２５】 心臓弁疾患としては、限定されるものではないが、大動脈弁不全、大動脈弁狭
窄、心雑音、大動脈弁脱出症、僧帽弁脱出症、三尖弁脱出症、僧帽弁不全、僧帽
弁狭窄、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖症、三尖弁
不全、および三尖弁狭窄が挙げられる。
【０５２６】 心筋性疾患としては、限定されるものではないが、アルコール性心筋症、うっ
血性心筋症、肥大性心筋症、大動脈性弁下狭窄、肺動脈性弁下狭窄、限局性心筋
症、シャガス心筋症、心内膜繊維弾性症、心内膜心筋繊維症、キーンズ症候群、
心筋再潅流傷害および心筋炎が挙げられる。
【０５２７】 心筋虚血としては、限定されるものではないが、狭心症、冠状動脈瘤、冠状動
脈硬化症、冠状動脈血栓症、冠状動脈血管痙攣、心筋梗塞および心筋性気絶など
の冠状動脈性疾患が挙げられる。
【０５２８】 心血管疾患としてはまた、動脈瘤、脈管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症
、ヒッペル-リンダウ病、クリベル-トルノネー-ウェーバー症候群、スタージ-ウ
ェーバー症候群、血管神経性浮腫、大動脈病、高安動脈炎、大動脈炎、レリッシ
ェ症候群、動脈閉塞性疾患、動脈炎、動脈内膜炎(enarteritis)、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞症、高血圧症、低血圧症、虚血、末梢血管症、静脈炎
、肺静脈閉塞症、レイノー病、CREST症候群、網膜静脈閉塞症、シミター症候群
、上大静脈症候群、毛細管拡張症、毛細血管拡張性運動失調症、遺伝性出血性毛
細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、 脈管炎および静脈不
全などの血管性疾患が挙げられる。
【０５２９】 動脈瘤としては、限定されるものではないが、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、 感
染性動脈瘤、破裂性動脈瘤、大動脈瘤、脳動脈瘤、冠状動脈瘤、心動脈瘤および
回腸動脈瘤が挙げられる。
【０５３０】 動脈閉塞性疾患としては、限定されるものではないが、動脈硬化症、間欠性跛
行、頸動脈狭窄、繊維筋性形成異常、腸間膜血管閉塞症、モヤモヤ病、腎動脈閉
塞症、網膜動脈閉塞症、および閉塞性血栓血管炎が挙げられる。
【０５３１】 脳血管障害としては、限定されるものではないが、頸動脈疾患、脳アミロイド
血管症、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳
塞栓血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンバーグ症候群、脳溢血、硬膜上
血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血、脳梗塞、脳虚血(一過性を含む)、鎖骨下動脈
盗血症候群、周室白血球軟化症、血管性頭痛、群発性頭痛、偏頭痛、および基底
椎骨不全が挙げられる。
【０５３２】 塞栓症としては、限定されるものではないが、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレ
ステロール塞栓症、ブルートウ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓
塞栓症が挙げられる。血栓症としては、限定されるものではないが、冠状動脈血
栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンバー
グ症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０５３３】 虚血性障害としては、限定されるものではないが、脳虚血、虚血性大腸炎、仕
切り症候群、前仕切り症候群、心筋虚血、再潅流傷害、および末梢四肢虚血が挙
げられる。血管炎としては、限定されるものではないが、大動脈炎、動脈炎、ベ
ーチェット症候群、チャーグ-ストラウス症候群、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉
塞性血栓血管炎、過敏感性血管炎、シェンライン-ヘノッホ紫斑、アレルギー性
皮膚血管炎、およびウェジナー肉芽腫が挙げられる。
【０５３４】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、送達部
位での注射針による直接注入、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、バイオリ
スティックインジェクター、粒子加速器、ジェルフォームスポンジデポー、その
他の商業的に入手可能なデポー剤、浸透圧ポンプ、経口または坐剤用固形医薬製
剤、手術中のデカンティングまたは局所適応、エアゾール送達などの当技術分野
で公知のいずれかの方法を用いて投与され得る。かかる方法は当技術分野で公知
である。ポリヌクレオチドを送達する方法については本明細書でさらに詳細に記
載する。
【０５３５】呼吸器障害 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは呼吸器系疾患および／または障害の治
療、予防、診断、および／または予後判定に用いられる。
【０５３６】 呼吸器系の疾患および障害としては、限定されるものではないが、鼻前庭炎、 非アレルギー性鼻炎(例えば、急性鼻炎、慢性鼻炎、萎縮性鼻炎、 血管運動神
経性鼻炎)、鼻ポリープ、および副鼻腔炎、若年性血管線維腫、鼻の癌および若
年性乳頭腫、声帯ポリープ、結節(歌手結節)、接触潰瘍、声帯麻痺、喉頭炎、喉
頭気腫、咽頭炎(例えば、ウイルス性および細菌性)、扁桃炎、扁桃性蜂巣炎、傍
咽頭膿腫、咽頭炎、咽頭気腫、および咽頭癌(例えば、鼻咽頭癌、扁桃癌、喉頭
癌)、肺癌(例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞(燕麦細胞)癌、大細胞癌、および腺
癌)、アレルギー性疾患(好酸球性肺炎、過敏感性肺炎(例えば、外因性アレルギ
ー性肺胞炎、アレルギー性間質性肺炎、有機質塵肺、アレルギー性気管支肺アス
ペルギルス症、喘息、ウェジナー肉芽腫(肉芽腫性脈管炎)、グッドバスチャー症
候群))、肺炎 (例えば、細菌性肺炎(例えば、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneu
moniae) (肺炎球菌性肺炎)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(ブドウ球
菌性肺炎)、グラム陰性菌肺炎(例えば、クレブシェラ種(Klebsiella spp.)およ
びシュードモナス種(Pseudomonas spp.)により引き起こされるもの)、肺炎マイ
コプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)性肺炎、インフルエンザ(Hemophilus influ
enzae)性肺炎、レジェネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)(在郷軍
人病)、およびオウム病クラミジア(Chlamydia psittaci (オウム病))およびウイ
ルス性肺炎(例えば、インフルエンザ、水痘)が挙げられる。
【０５３７】 さらなる呼吸器系の疾患および障害としては、限定されるものではないが、細
気管支炎、ポリオ(灰白髄炎)、クループ、呼吸シンシチアルウイルス感染症、流
行性耳下腺炎、伝染性紅斑(第五病)、小児バラ疹、進行性風疹全脳炎、風疹、お
よび亜急性硬化性全脳炎、真菌性肺炎(例えば、ヒストプラズマ症、コクシジオ
イデス症、ブラストミセス症、免疫系が著しく抑制された人々の真菌感染(例え
ば、 クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)により引
き起こされるクリプトコックス症、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)により
引き起こされるアスペルギルス症、カンジダ(Candida)により引き起こされるカ
ンジダ症、およびムコール菌症))、ニューモシスティス・カリニ(Pnemocystis c
arinii)(ニューモシスティス肺炎)、 非定型肺炎(例えば、マイコプラズマ種(My
coplasma spp.)およびクラミジア種(Chlamydia spp.))、日和見感染肺炎、 院内
肺炎、化学性肺炎および嚥下性肺炎、胸膜性疾患(例えば、胸膜炎、滲出性胸膜
炎、および気胸(例えば、単純性一過性気胸、合併型一過性気胸、緊張性気胸))
、 閉塞性気道疾患(例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、慢性または
急性気管支炎)、職業性肺疾患(例えば、珪肺症、黒色肺(石炭労働者塵肺症)、ア
スベスト肺、ベリリウム症、職業性喘息、綿肺症、および良性塵肺症)、浸潤性
肺疾患(例えば、肺繊維症(例えば、繊維性肺胞炎、一般間質性肺炎)、特発性肺
繊維症、剥離性間質性肺炎、リンパ性間質性肺炎、原因不明性組織球増殖症(例
えば、レタラー-シウェ病、ハンド-シュラークリスチャン病、好酸球性肉芽腫)
、特発性肺血鉄症、類肉腫症および肺胞タンパク質症)、急性呼吸困難症候群(例
えば、成人性呼吸困難症候群とも呼ばれる)、浮腫、肺塞栓症、気管支炎(例えば
、ウイルス性、細菌性)、気管支拡張症、無気肺、肺膿瘍(例えば、黄色ブドウ球
菌またはレジェネラ・ニューモフィラにより引き起こされるもの)、および嚢胞
性繊維症が挙げられる。
【０５３８】抗脈管新生活性 脈管形成の内因性刺激物質と阻害剤との天然に存在する均衡状態では阻害的作
用が優勢である。Rastinejadら, Cell 56: 345-355 (1989)。血管新生が創傷治
癒、器官再生、胚発生、および女性生殖プロセスなどの通常の生理的条件下で起
こるという稀な場合では、脈管形成は厳格に調節されており、空間的および時間
的に範囲が定められる。固形腫瘍成長を特徴とするなどの病的脈管形成条件下で
はこれらの調節制御はできない。脈管形成が調節されないことから病的状態とな
り、数多くの腫瘍性および非腫瘍性疾患の進行が続く。数多くの重大な疾患とし
ては、固形腫瘍成長および転移などの異常血管新生、関節炎、いくつかの種類の
眼障害、ならびに乾癬が主なものである。例えば、 Mosesら, Biotech. 9:630-6
34 (1991); Folkmanら, N. Engl. J. Med., 333:1757-1763 (1995); Auerbachら
, J. Microvasc. Res. 29:401-411(1985); Folkman, Advances in Cancer Resea
rch, KleinおよびWeinhouse編, Academic Press, New York, 175-203頁 (1985);
Patz, Am. J. Opthalmol. 94:715-743 (1982);およびFolkmanら, Science 221:
719-725 (1983)による総説を参照されたい。数多くの病的状況において、脈管形
成プロセスがその病状の一因となっている。例えば、固形腫瘍の成長が脈管形成
によるものであることを示唆する有意なデータが蓄積されている。Folkmanおよ
びKlagsbrun, Science 235:442-447 (1987)を参照されたい。
【０５３９】 本発明は本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドの投与により血管新生に関連する疾患また
は障害の治療を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、また
はアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて治療できる悪性症状および転移症
状としては、限定されるものではないが、本明細書に記載される悪性腫瘍、固形
腫瘍、および癌、ならびに当技術分野で公知のその他のものが挙げられる(かか
る疾患の総説としては、Fishman ら, Medicine, 第2版, J．B. Lippincott Co.,
Philadelphia (1985)参照)。よって、本発明は、治療上有効な量の、本発明の
アルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドをそれを必要とする個体に投与することを含んでな
る、脈管形成に関連する疾患および／または障害を治療する方法を提供する。例
えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク
質をコードするポリヌクレオチドは、癌または腫瘍を治療するための種々の更な
る方法において用いてよい。本発明の融合タンパク質および／または本発明のア
ルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療し得る癌と
しては、限定されるものではないが、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵
臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、
子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌などの固形腫瘍;原
発性腫瘍および転移性腫瘍;黒色腫;神経膠芽腫;カポジ肉腫;平滑筋腫;非小細胞
肺癌;結腸直腸癌; 進行した悪性腫瘍;ならびに白血病などの血中腫瘍が挙げられ
る。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚癌などの癌、頭部腫瘍および頚
部腫瘍、乳房腫瘍、ならびにカポジ肉腫を治療するために局所的に送達し得る。
【０５４０】 なお他の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表在型膀胱癌を
例えば膀胱腔内投与により治療するために利用し得る。本発明のアルブミン融合
タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドは注射またはカテーテルによって腫瘍、または腫瘍部位近くに直接
送達し得る。もちろん当業者には明らかなように、治療しようとする癌により好
適な投与様式は異なる。その他の送達様式については本明細書に記載される。
【０５４１】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌のほかに脈管形成に関連するその
他の障害の治療に有用であり得る。これらの障害としては、限定されるものでは
ないが、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、および
化膿性肉芽腫;アテローム硬化性プラーク;眼脈管形成疾患、例えば糖尿病性網
膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体
後方繊維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎および眼の表皮爪膜
(異常血管成長);慢性関節リウマチ;乾癬;遅延創傷治癒;子宮内膜症;脈管形成;肉
芽; 肥厚性瘢痕(ケロイド);骨癒着不全骨折;硬皮症;トラコーマ;血管癒着;心筋
脈管形成; 側副冠状動脈（coronary collaterals）、側副脳 (cerebral collate
rals);動静脈奇形;虚血性四肢脈管形成;オスラー-ウェバー症候群;プラーク新血
管形成;毛細管拡張症;血友病関節症; 血管線維腫;線維筋性形成異常;外傷性肉芽
;クローン病;ならびにアテローム性動脈硬化が挙げられる。
【０５４２】 例えば、本発明のある態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを肥厚
性瘢痕またはケロイドに投与するステップを含んでなる、肥厚性瘢痕およびケロ
イドを治療する方法が提供される。
【０５４３】 本発明のある実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／また
は本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、肥厚性
瘢痕またはケロイドにこれらの障害の進行を予防する目的で直接に注射し得る。
この治療は肥厚性瘢痕およびケロイド(例えば、火傷)が現われることが知られて
いる症状の予防治療においては特に価値があり、好ましくは増殖相が進行する時
間を経過した後(最初の損傷後約14日)であるが肥厚性瘢痕またはケロイドが現わ
れる前に開始する。上記のように、本発明では、例えば角膜血管新生、血管新生
緑内障、増殖性糖尿病性網膜症、水晶体後方繊維増殖症および黄斑変性などの眼
の血管新生疾患を治療する方法も提供される。
【０５４４】 さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療できる血管新生に
関連する眼障害としては、限定されるものではないが、血管新生緑内障、糖尿病
性網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後方繊維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児黄斑変性
網膜症、角膜移植片血管新生、ならびにその他の炎症性眼疾患、眼腫瘍および脈
絡膜または虹彩血管新生に関連する疾患が挙げられる。例えば、Waltmanら, Am.
J. Ophthal. 85:704-710 (1978)およびGartnerら, Surv. Ophthal. 22:291-312
(1978)による総説を参照されたい。
【０５４５】 従って、本発明のある態様では、血管形成が阻害されるよう患者に治療上有効
な量の化合物(例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブ
ミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド)を角膜投与するステップを
含んでなる、角膜血管新生(角膜移植片血管新生を含む)などの眼の血管新生疾患
を治療する方法が提供される。簡潔には、角膜は通常血管のない組織であるが、
ある病的状態では周辺の角膜周囲血管網から毛細血管が角膜に広がることがある
。角膜に血管新生が起こると角膜が曇り、患者の視力低下が起こる。角膜が完全
に混濁した場合には失明することがある。例えば角膜感染(例えば、トラコーマ
、単純疱疹、角膜炎、リーシュマニア症および糸状虫症)、免疫プロセス(例えば
、移植片拒絶反応およびスティーヴンズ-ジョンソン症候群)、アルカリ火傷、外
傷、(何らかの原因による)炎症、中毒性および栄養欠乏状態を含む種々の障害、
ならびにコンタクトレンズ着装による合併症によって角膜血管新生が起こり得る
。 本発明の特に好ましい実施形態では、局所投与用に生理食塩水中で(眼用製剤
に一般に用いられるいずれかの防腐剤および抗細菌薬を組み合わせて)調製し、
点眼形態で投与し得る。液剤または懸濁剤を純粋形態で調製し、1日に数回投与
し得る。また、上記のように調製した抗脈管形成組成物はまた直接角膜に投与し
得る。好ましい実施形態では、抗脈管形成組成物は角膜と結合する粘膜付着高分
子物質とともに調製し得る。さらなる実施形態では、抗脈管形成因子または抗脈
管形成組成物を、補助的薬剤として通常のステロイド治療に用いる。局所治療は
脈管形成応答が高確率で誘導されることが知られている角膜損傷(化学火傷など)
の予防にも有用であり得る。これらの場合、望ましくはステロイドと組み合わせ
た治療を直ちに始め、その後に起こる合併症の予防を手助けし得る。
【０５４６】 その他の実施形態では、眼科医が上記の化合物を顕微鏡使用下で角膜基質に直
接注入し得る。好ましい注入部位は個々の損傷の形態によって異なるが、投与の
目的は脈管構造の発達の最前線に組成物を注入する(すなわち、血管および正常
な角膜間に散在させる)ことである。このことは、多くの場合、発達しつつある
血管から角膜を保護するべく辺縁周囲角膜へ注入することを含む。この方法は、
角膜血管新生を予防的に阻害するために角膜損傷後直ちに用いる。この状況にお
いては、この物質を角膜損傷部とその望ましくない可能性を有する辺縁血液供給
源との間に散在する辺縁周囲角膜に注入できる。かかる方法はまた、移植角膜の
毛細血管侵入を防ぐために同様に使用してもよい。徐放性形態では、年に2〜3回
の注入しか必要でない。注入自体が原因で起こる炎症を抑えるために注入液にス
テロイドを添加し得る。
【０５４７】 本発明のもう1つの態様では、血管形成が阻害されるよう患者に本発明のアル
ブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドの治療上有効な量を経眼投与するステップを含んでなる
、血管新生緑内障を治療する方法が提供される。ある実施形態では、化合物を早
期血管新生緑内障を治療するために眼に局所投与し得る。その他の実施形態では
、化合物を前房角の領域への注入により埋め込んでもよい。その他の実施形態で
は、化合物を、該化合物が房水に持続的に放出されるように、いずれかの部位に
注入する。本発明のもう1つの態様では、血管形成が阻害されるよう患者に本発
明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク
質をコードするポリヌクレオチドの治療上有効な量を経眼投与するステップを含
んでなる、増殖性糖尿病性網膜症を治療する方法が提供される。
【０５４８】 本発明の特に好ましい実施形態では、増殖性糖尿病性網膜症を、網膜における
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの
局所濃度を高めるために房水またはガラス体への注入により治療し得る。好まし
くは、光凝固が必要な重篤な疾患となる前にこの治療を開始するべきである。
【０５４９】 本発明のもう1つの態様では、血管形成が阻害されるよう患者に本発明のアル
ブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドの治療上有効な量を経眼投与するステップを含んでなる
、水晶体後方繊維増殖症を治療する方法が提供される。化合物をガラス体内への
注入および／または眼内への移植によって局所的に送達し得る。
【０５５０】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療できる障害としては、限定さ
れるものではないが、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム硬化性プ
ラーク、遅延創傷治癒、肉芽、血友病関節症、肥厚性瘢痕、骨癒着不全骨折、オ
スラー-ウェバー症候群、 化膿性肉芽腫、硬皮症、トラコーマ、および血管癒着
が挙げられる。
【０５５１】 さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療、予防、診断およ
び／または予後判定できる障害および／または状態としては、限定されるもので
はないが、固形腫瘍、白血病など血中腫瘍、腫瘍転移、カポジ肉腫、良性腫瘍、
例えば血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫、慢性
関節リウマチ、乾癬、眼脈管形成疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、
黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後方繊維増殖症、ルベ
オーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎、遅延創傷治癒、子宮内膜症、脈管
形成、肉芽、肥厚性瘢痕(ケロイド)、骨癒着不全骨折、硬皮症、トラコーマ、血
管癒着、心筋脈管形成、側副冠状動脈（coronary collaterals）、側副脳 (cere
bral collaterals)、動静脈奇形、虚血性四肢脈管形成、オスラー-ウェバー症候
群、プラーク新血管形成、毛細管拡張、血友病関節症、血管線維腫、線維筋性形
成異常、外傷性肉芽、クローン病、アテローム性動脈硬化、胎芽着床に必要な脈
管新生の阻害により月経を制御する避妊薬、猫ひっかき病(ロシェル・ミナリア
キントーサ（Rochele minalia quintosa）)、潰瘍(ヘリコバクター・ピロリ(Hel
icobacter pylori))、バルトネラ症および細菌性血管腫症などの病気の結果とし
て脈管形成を受ける疾患が挙げられる。
【０５５２】 避妊法のもう1つの態様では、性交および受精の前または後に胎芽着床を妨害
するのに十分な化合物量を投与することによって、効果的な受胎調節法、あるい
は「モーニングアフター(事後避妊)」法が提供される。本発明のアルブミン融合
タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドは、月経の制御に用いてもよく、または、子宮内膜症の治療におい
ては腹膜洗浄液または腹膜植込みのいずれかとして投与してもよい。
【０５５３】 . 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合
タンパク質をコードするポリヌクレオチドは縫合部肉芽腫を予防するために外科
用縫糸に組み込んでもよい。 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは多様な外科的処置に用いてよい。例え
ば、本発明のある態様では、組成物(例えば、スプレーまたはフィルム形態)は、
正常な周囲組織を悪性組織から分離するために、および／または周囲組織への疾
患の転移を防ぐために、腫瘍除去前にある領域を被覆または噴霧するのに用いら
れる。本発明のその他の態様では、組成物(例えば、スプレー形態)は腫瘍を被覆
する、または所望の場所での脈管形成を阻害するために内視鏡による処置を介し
て送達され得る。本発明のさらに他の態様では、本発明の抗脈管形成組成物で被
覆した外科用メッシュを外科用メッシュを使用するあらゆる処置において用いて
よい。例えば、本発明のある実施形態では、抗脈管形成組成物を含めた外科用メ
ッシュを、(例えば、結腸切除後の)腹部癌切除術中にその構造を支持し、かつ大
量の抗脈管形成因子を放出するために用いてよい。
【０５５４】 本発明のさらなる態様では、癌の局所的再発およびその部位での新血管の形成
が阻害されるように本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の
アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを摘出後の腫瘍を切除
した周辺部分に投与することを含んでなる、腫瘍摘出部位を処置する方法が提供
される。本発明のある実施形態では、抗脈管形成化合物を腫瘍摘出部位に直接投
与する(例えば、抗脈管形成化合物をスワビング、はけ塗り、または被覆により
腫瘍を切除した周辺部分に塗布する)。別法として、抗脈管形成化合物を投与前
に公知の外科用ペーストと混合してもよい。本発明の特に好ましい実施形態では
、抗脈管形成化合物を肝臓の悪性腫瘍切除後および神経外科手術後に適用する。
【０５５５】 本発明のある態様では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば乳房、結腸、脳
および肝臓の腫瘍などの多様な腫瘍を切除した周辺部分に投与し得る。例えば、
本発明のある実施形態では、その部位での新血管の形成が阻害されるように抗脈
管形成化合物を摘出後の神経腫瘍部位に投与し得る。
【０５５６】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはその他の抗脈管形成因子とともに投与
し得る。他の抗脈管形成因子の代表例としては、抗侵襲性因子、レチノイン酸お
よびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ-1の組織阻
害剤、メタロプロテイナーゼ-2の組織阻害剤、プラスミノゲンアクチベーター阻
害剤-1、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤-2、ならびに種々の形態の低密度
「d族」遷移金属が挙げられる。
【０５５７】 低密度「d族」遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タング
ステン、チタン、ニオブ、およびタンタル種が挙げられる。かかる遷移金属種は
遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の好適な錯体としては、オキソ遷
移金属錯体が挙げられる。
【０５５８】 バナジウム錯体の代表例としては、バナジン酸錯体およびバナジル錯体などの
オキソバナジウム錯体が挙げられる。好適なバナジン酸錯体としては、例えばメ
タバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン
酸ナトリウムなどのメタバナジン酸錯体およびオルトバナジン酸錯体が挙げられ
る。好適なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネートならび
に硫酸バナジル一および三水和物などの硫酸バナジル水和物を含む硫酸バナジル
が挙げられる。
【０５５９】 タングステンおよびモリブデン錯体の代表例としても、オキソ錯体が挙げられ
る。好適なオキソタングステン錯体としては、タングステン酸錯体および酸化タ
ングステン錯体が挙げられる。好適なタングステン酸錯体としては、タングステ
ン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水
和物およびタングステン酸が挙げられる。好適な酸化タングステンとしては、酸
化タングステン(IV)および酸化タングステン(VI)が挙げられる。好適なオキソモ
リブデン錯体としては、モリブデン酸、酸化モリブデン、およびモリブデニル錯
体が挙げられる。好適なモリブデン酸錯体としては、モリブデン酸アンモニウム
およびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブ
デン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。好適な酸化モリブデンとしては
、酸化モリブデン(VI)、酸化モリブデン(VI)、およびモリブデン酸が挙げられる
。好適なモリブデニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネート
が挙げられる。その他の好適なタングステンおよびモリブデン錯体としては、例
えばグリセロール、酒石酸、および糖類から誘導されたヒドロキソ誘導体が挙げ
られる。
【０５６０】 多様な他の抗脈管形成因子もまた本発明の脈絡の中で用いてよい。代表例とし
ては、血小板因子 4;硫酸プロタミン;硫酸化キチン誘導体(ズワイガニ殻より製
造)、(Murataら, Cancer Res. 51:22-26, 1991);硫酸化多糖ペプチドグリカン複
合体(SP-PG)(エストロゲンおよびクエン酸タモキシフェンなどのステロイド類の
存在によって化合物の機能が高められていてもよい);スタウロスポリン;例えば
プロリン類似体、シスヒドロキシプロリン、d,L-3,4-デヒドロプロリン、チアプ
ロリン、α,α-ジピリジル、フマル酸アミノプロピオニトリルなどの基質代謝の
モジュレーター;4-プロピル-5-(4-ピリジニル)-2(3H)-オキサゾロン;メトトレキ
サート;ミトキサントロン;ヘパリン;インターフェロン;2 マクログロブリン-血
清;ChIMP-3(Pavloffら, J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992)); キモスタチ
ン(Tomkinsonら, Biochem J. 286:475-480, (1992)); シクロデキストリンテト
ラデカスルフェート;エポンマイシン;カンプトテシン;フマギリン(Ingberら, Na
ture 348:555-557, 1990);チオマレイン酸金ナトリウム(「GST」; Matsubaraお
よびZiff, J. Clin. Invest. 79:1440-1446, (1987));抗コラゲナーゼ血清;α2-
抗プラスミン(Holmesら, J. Biol. Chem. 262(4):1659-1664, (1987));ビスアン
トレン(National Cancer Institute);ロベンサリット二ナトリウム(N-(2)-カル
ボキシフェニル-4-クロロアントロニル酸二ナトリウムまたは「CCA」; Takeuchi
ら, Agents Actions 36:312-316, (1992)); サリドマイド; 血管拡張性のステロ
イド;AGM-1470;カルボキシアミノイミダゾール;およびBB94などのメタロプロテ
イナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０５６１】細胞レベルでの疾患 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療、予防、診断および／または予後判定
できる細胞生存の上昇またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、癌（
例えば、限定されるものではないが、結腸癌、心腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽
細胞腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リ
ンパ腫、内皮腫、骨芽腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺癌、乳癌、前立腺
癌、カポジ肉腫、および卵巣癌を含む濾胞性リンパ腫、p53変異を伴う癌腫、お
よびホルモン依存性腫瘍）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレ
ン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性
筋炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウマ
チ）、およびウイルス感染症（例えばヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよ
びアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、および慢性移
植片拒絶が挙げられる。
【０５６２】 好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは癌、特に上記のものの増
殖、進行および／または転移を阻害するのに用いられる。
【０５６３】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドによって治療または検出し得る、細胞の生存の上昇
に関連する他の疾患および症状としては、限定されるものではないが、白血病（
急性白血病(例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病 (骨髄芽性、前
骨髄性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む))および慢性白血病(例えば
、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ球性 白血病)）、真正赤血球増
加症、リンパ腫(例えば、ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、バル
デンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びに限定されるものではない
が、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫
、内皮肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング
腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、扁
平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、
嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、繊毛上皮癌、精上
皮腫、胎生期癌、ウイルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀
胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状膠細胞腫、骨髄細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫
、 松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫、乏突起神経膠腫、血管腫、黒色腫、神
経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫をはじめとする固形腫瘍
といった悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が挙げられる。
【０５６４】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドによって治療、予防、診断および／または予後判定
できるアポトーシスの上昇に関連する疾患としては、エイズ;神経変性疾患(アル
ツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、大脳変性
および脳腫瘍または先の関連疾患など);自己免疫疾患(多発性硬化症、シェーグ
レン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発
性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウ
マチなど)、骨髄形成不全症候群(再生不良性貧血など)、対宿主性移植片病、虚
血性傷害(心筋梗塞、卒中および再潅流傷害によって引き起こされるものなど)、
肝傷害(例えば、肝炎関連肝傷害、虚血性/再潅流傷害、胆汁鬱滞(胆管傷害)およ
び肝臓癌);毒素誘発性肝疾患(アルコールにより引き起こされるものなど)、敗血
症性ショック、 悪液質および拒食症が挙げられる。
【０５６５】創傷治癒および上皮細胞増殖 本発明のなおさらなる態様によれば、本発明の融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的
で、例えば創傷治癒目的で上皮細胞増殖および基底ケラチン生成細胞を刺激する
ために使用する方法、および毛包発生および皮膚創傷の治癒を刺激するために使
用する方法が提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科的創傷
、摘出による創傷、真皮および表皮の損傷を含む深い創傷、眼組織創傷、歯組織
創傷、口腔創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈鬱血潰瘍、
熱への曝露または化学薬品による火傷、ならびに、尿毒症、 栄養不良、ビタミ
ン欠乏、ならびにステロイド類、放射線療法、ならびに抗腫瘍薬および代謝拮抗
物質を用いた全身性治療に関連する合併症などのその他の異常な創傷治癒症状を
含む創傷治癒を刺激するのに臨床的に有用であり得る。本発明のアルブミン融合
タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質は、コードするポ
リヌクレオチドは皮膚喪失後の皮膚再生を早めるのに用いることができる。
【０５６６】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚移植片の創傷床への接着性を高
め、さらに創傷床の再上皮化を刺激するのに用いる。以下のものは、創傷床への
接着性を高めるのに本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが使用できる移植片の種類である
:自家移植片、人工皮膚、同種移植片、自己移植片、無血管性移植片、ブレア-ブ
ラウン移植片、 骨移植片、胚胎組織移植片、皮膚移植片、遅延移植片、真皮移
植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層移植片、異種構造移植片、異種移植片、同
種移植片、増殖性移植片、表層移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリア-ティ
ールシュ移植片、大網移植片、パッチ移植片、茎状移植片、穿通性移植片、スプ
リット(split)皮膚移植片、シックスプリット(thick split)移植片。本発明のア
ルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは皮膚の強度を強め、老化した皮膚の外観を改善する
のに使用できる。
【０５６７】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドはまた、肝細胞増殖、ならびに肺、乳房、膵臓、胃
、小腸、および大腸の上皮細胞増殖に変化をもたらすであろうと考えられている
。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮脂細胞、毛包、肝細胞、II型肺胞
上皮細胞、ムチン生成杯状細胞、およびその他の上皮細胞などの上皮細胞、なら
びに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内にあるそれらの前駆体の増殖を増進するこ
とができる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブ
ミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは上皮細胞、ケラチン生成細
胞、および基底ケラチン生成細胞の増殖を増進し得る。
【０５６８】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは放射線、化学療法による治療、または
ウイルス感染によって起こる腸毒性の副作用の低下にも使用できる。本発明のア
ルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは小腸粘膜に対して細胞保護効果があり得る。本発明
のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドは化学療法およびウイルス感染によって起こる粘
膜炎(口腔潰瘍)の治癒も刺激し得る。
【０５６９】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは火傷をはじめとする全体的および部分
的層皮膚欠損における皮膚の完全再生(すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の
再生)、乾癬などのその他の皮膚欠損の治療にさらに使用できる。本発明のアル
ブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドは、表皮水疱症（幾つもの、開いた、痛みを伴う水疱を
引き起こすことになる、表皮の下層にある真皮への接着不足）をこれらの損傷の
再上皮化を加速することにより治療するのに使用できる。本発明のアルブミン融
合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドはより迅速な粘膜内層の瘢痕形成および腺粘膜および十二指腸粘
膜内層の再生により胃潰瘍および十二指腸潰瘍を治療し、さらに治癒を助けるの
にも使用できる。クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患は小腸また
は大腸各々の粘膜表面の破壊をもたらす疾患である。よって、本発明の融合タン
パク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチドは、粘膜表面の再生を促してより迅速な治癒に向かわせ、さらに炎症性
腸疾患の進行を妨げるのに使用できる。本発明の融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いた治療
は胃腸管内の粘液の生成に重大な効果を与えるものと考えられ、摂取された毒性
物質からの、または手術後の腸粘膜の保護に使用できる。本発明のアルブミン融
合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドは発現不足に関連する疾患の治療に使用できる。
【０５７０】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは種々の病的状態による肺損傷の予防およ
び治癒に使用できる。増殖および分化を刺激できる本発明のアルブミン融合タン
パク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチドは肺胞および気管支上皮の修復を助けて急性または慢性肺損傷を予防ま
たは治療する。例えば、肺胞の進行性損傷を起こす肺気腫、ならびに気管支上皮
および肺胞の壊死を起こす、すなわち煙吸入および火傷による吸入損傷は本発明
のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを
用いて効果的に治療できる。また、本発明の融合タンパク質および／または本発
明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはII型肺胞上皮細
胞の増殖および分化を刺激するのに使用でき、これは幼児呼吸障害症候群および
気管支肺形成異常などのヒアリン膜症などの早産児の疾患の治療または予防を助
け得る。
【０５７１】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは肝細胞の増殖および分化を刺激できる
ため、硬変、ウイルス性肝炎が原因となる肝臓損傷および毒性物質(すなわち、
アセトアミノフェン、四塩化炭素および当技術分野で公知のその他の肝細胞毒素
)によって起こる電撃性肝機能不全などの肝疾患および病状の緩和または治療に
使用できる。 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは真性糖尿病の徴候の治療または予防に使
用できる。新たにIおよびII型糖尿病と診断された膵島細胞の機能がいくぶんか
残っている患者では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは疾患の一定の症状を緩和、遅
延または予防するために膵島機能を維持するのに使用できる。また、本発明の融
合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドは膵島細胞の機能を改善または助けるために膵島細胞移植での補
助的薬剤として使用できる。
【０５７２】神経活性および神経疾患 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳および／または神経系の疾患、障害
、損傷、または創傷の診断および／または治療に用いられる。本発明の組成物 (
例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド)を用いて治療できる神経系障害としては、
限定されるものではないが、軸索の断絶、ニューロンの減少もしくは変性、また
は脱髄のいずれかを生ずる神経系創傷および疾患または障害が挙げられる。本発
明の方法により患者(ヒトおよび非ヒト哺乳動物患者を含む)において治療し得る
神経系損傷としては、限定されるものではないが、中枢神経系(脊髄、脳を含む)
または末梢神経系のいずれかの以下の損傷:(1)神経系の一部における酸素欠乏に
より脳梗塞もしくは脳虚血、または脊髄梗塞もしくは脊髄虚血などのニューロン
の損傷または死を引き起こす虚血性損傷;(2)物理的創傷によって起こるまたは手
術に伴う損傷などの外傷性損傷、例えば神経系の一部を断絶する損傷、または圧
迫損傷;(3)神経系の一部が神経系関連悪性腫瘍または非神経系組織に由来する悪
性腫瘍のいずれかである悪性組織によって破壊されるまたは損傷を受ける悪性損
傷;(4)神経系の一部が感染の結果として、例えば膿瘍により、またはヒト免疫不
全ウイルス、帯状疱疹ウイルス、もしくは単純疱疹ウイルスによる感染症または
ライム病、結核、もしくは梅毒と関連して破壊されるまたは損傷を受ける感染損
傷;(5)神経系の一部が、限定されるものではないが、パーキンソン病、アルツハ
イマー病、ハンティングトン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症 (ALS)に関連す
る変性などの変性プロセスの結果として、破壊されるまたは損傷を受ける変性損
傷;(6)神経系の一部が、限定されるものではないが、ビタミンB12欠乏症、葉酸
欠乏症、ヴェルニッケ疾患、タバコ-アルコール弱視、マルキアファーバ-ビニャ
ーミ病(脳梁の原発性変性)、およびアルコール性小脳変性などの栄養性障害また
は代謝性障害により破壊されるまたは損傷を受ける、栄養性疾患または障害に関
連する損傷;(7)限定されるものではないが、糖尿病(糖尿病性神経障害、ベル麻
痺)、全身性エリテマトーデス、癌腫、または類肉腫症などの全身性疾患に関連
する神経損傷;(8)アルコール、鉛、または特定の神経毒などの毒性物質よって起
こる損傷、ならびに(9)神経系の一部が、限定されるものではないが、多発性硬
化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断性脊髄障害、または種々の病因
などの脱髄疾患、進行性多病巣性白質脳障害、ならびに橋中央ミエリン溶解によ
り破壊されるまたは損傷を受ける脱髄損傷、が挙げられる。
【０５７３】 ある実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは低酸素症による有
害な効果から神経細胞を保護するのに用いられる。さらに好ましい実施形態では
、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳低酸素症による有害な効果から神経
細胞を保護するのに用いられる。この実施形態によれば、本発明の化合物は脳低
酸素症に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。この実施形態の
ある非限定的な態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本
発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳虚血に関連
する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。この実施形態のもう1つの非
限定的な態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の
アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳梗塞に関連する神
経細胞損傷の治療または予防に用いられる。
【０５７４】 もう1つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および
／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは発
作に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。特定の実施形態では
、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは発作に関連する脳神経細胞損傷の治療
または予防に用いられる。
【０５７５】 もう1つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および
／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは心
臓発作に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。特定の実施形態
では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは心臓発作に関連する脳神経細胞損
傷の治療または予防に用いられる。
【０５７６】 神経系障害の治療または予防に有用な本発明の組成物はニューロンの生存また
は分化を促進する生物活性を調べることにより選択し得る。例えば、限定される
ものではないが、本発明によれば、以下のいずれかの効果を示す本発明の組成物
が有用であり得る:(1)低酸素症または低酸素症状の存在または不在のいずれかに
おける培養中のニューロンの生存時間の延長;(2)培養におけるまたはin vivoに
おけるニューロンの成長の増大;(3)培養におけるまたはin vivoにおけるニュー
ロン関連分子、例えば運動ニューロンに関係するコリンアセチルトランスフェラ
ーゼまたはアセチルコリンエステラーゼの産生の増大;または(4)in vivoにおけ
るニューロン機能障害症状の緩和。かかる効果は当技術分野で公知のいずれかの
方法により測定し得る。好ましい非限定的な実施形態では、ニューロンの生存の
延長は本明細書に記載の、または、例えば、Zhangら, Proc Natl Acad Sci USA
97:3637-42 (2000)またはArakawaら, J. Neurosci., 10:3507-15 (1990)などの
当技術分野で公知の方法を用いて定型的に測定し得る。ニューロンの成長の増大
は、例えばPestronkら, Exp. Neurol., 70:65-82 (1980)、またはBrownら, Ann.
Rev. Neurosci., 4:17-42 (1981)に記載の方法などの当技術分野で公知の方法
により検出し得る。ニューロン関連分子の産生の増大は当技術分野で公知の技術
を用いて、測定しようとする分子に応じて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗
体結合ノーザンブロットアッセイなどにより測定し得る。さらに、運動ニューロ
ン機能障害は運動ニューロン障害の身体上の徴候、例えば脱力、運動ニューロン
伝導速度、または機能障害.を評価することによりにより測定し得る。
【０５７７】 特定の実施形態では、本発明により治療し得る運動ニューロン障害としては
、限定されるものではないが、運動ニューロン、ならびに神経系のその他の構成
部分に影響を及ぼし得る梗塞、感染症、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性
疾患または悪性腫瘍などの障害、ならびにニューロンに選択的に影響を及ぼし得
る 筋萎縮性側索硬化症などの障害が挙げられ、さらに、限定されるものではな
いが、進行性脊髄筋萎縮症、進行性延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮症
および若年性筋萎縮症、小児性進行性延髄麻痺(ファチオ-ロンド症候群)、灰白
髄炎およびポリオ後症候群を含む障害、ならびに遺伝性運動感覚神経障害(シャ
ルコー-マリー・トゥース病)が挙げられる。
【０５７８】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドはニューロン生存;シナプス形成;伝導性;
神経分化等において役割を果たし得る。よって、本発明の組成物(本発明の融合
タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドを含む)はこれらの役割に関連した、限定されるものではないが、
学習障害および／または認識障害を含む疾患または障害の診断および／または治
療もしくは予防に用いられる。本発明の組成物は神経変性疾患状態および／また
は行動障害の治療または予防にも有用であり得る。かかる神経変性疾患状態およ
び／または行動障害としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、
パーキンソン病、 ハンティングトン舞踏病、トゥーレット症候群、精神分裂病
、躁病、痴呆、偏執症、強迫神経障害、恐慌性障害、学習不能症、ALS、精神病
、自閉症、ならびに摂食、睡眠パターン、平衡および知覚における障害などの異
常行動が挙げられる。さらに、本発明の組成物は発生胚、または性関連障害と関
係のある発達障害の治療、予防および／または検出における役割もまた果たし得
る。 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、頸動脈疾
患(例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄、またはもやもや病)、脳アミロイド血管
症、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓
血栓症(例えば、頸動脈血栓症、洞血栓症、またはヴァレンバーグ症候群)、脳溢
血(例えば、硬膜上血腫または硬膜下血腫、またはクモ膜下出血)、脳梗塞、脳虚
血(例えば、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、または基底椎骨不全)、血管
性痴呆(例えば、多発梗塞性痴呆症)、脳室周囲白血球軟化症、および血管性頭痛
(例えば、群発性頭痛または片頭痛)などの脳血管障害に関連した疾患、損傷、障
害、または創傷から神経細胞を保護するのに有用であり得る。
【０５７９】 本発明のなおさらなる態様によれば、本発明の融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的
で、例えば神経細胞増殖および／または分化を刺激するために使用する方法が提
供される。よって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは神経疾患の治療および／または
検出に用いられる。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のア
ルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは特定の神経系疾患また
は障害のマーカーまたはデテクターとして使用できる。
【０５８０】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できる神経疾患の例として
は、フェニルケトン尿症(母性フェニルケトン尿症など)、ピルビン酸カルボキシ
ラーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症(ウェルニッケ脳障害
、脳浮腫)を含む代謝性脳疾患、脳腫瘍テント下腫瘍を含む小脳腫瘍、脳室腫瘍(
脈絡膜叢腫瘍など)、視床下部腫瘍、テント上腫瘍など)、カナバン病、小脳疾患
(脊髄小脳変性症(毛細血管拡張性運動失調症など)を含む小脳性運動失調症、小
脳性共同運動失調、フリートライヒ運動失調、マシャド-ジョセフ病、オリーブ
橋小脳萎縮症、小脳腫瘍(テント下腫瘍など)、汎発性脳硬化症(軸索周囲性脳炎
など)など)、球様細胞性白質萎縮症、異染性白質萎縮症ならびに亜急性硬化性汎
脳炎などの脳疾患が挙げられる。
【０５８１】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患と
しては、脳血管障害(頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびもやもや病を含む頸動脈
疾患など)、脳アミロイド血管症、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動
静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓および脳血栓症(頸動脈血栓症、洞血栓症、およ
びヴァレンバーグ症候群など)、脳出血(硬膜上血腫、硬膜下血腫およびクモ膜下
出血など)、脳梗塞、脳虚血(一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および基底椎
骨不全など)、血管性痴呆(多発脳梗塞性痴呆症など)、脳室周囲白血球軟化症、
血管性頭痛(群発性頭痛および片頭痛など)などが挙げられる。
【０５８２】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患と
しては、AIDS性痴呆症症候群、初老期痴呆(アルツハイマー病およびクロイツフ
ェルト-ヤーコプ症候群など)、老人性痴呆(アルツハイマー病および進行性核上
性麻痺など)、血管性痴呆(多発脳梗塞性痴呆症など)などの痴呆、軸索周囲性脳
炎、ウイルス性脳炎(流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、ダニ(媒介)脳
炎、および西ナイル熱など)、急性播種性脳脊髄炎、髄膜脳炎(ブドウ膜脳炎症候
群、脳炎後パーキンソン病および亜急性硬化性汎脳炎など)、脳軟化症(脳室周囲
白血球軟化症など)を含む脳炎、癲癇(小児痙攣を含む全般癲癇、欠損癲癇、MERR
F症候群含む筋間代癲癇、緊張性間代癲癇、部分癲癇(複雑部分癲癇など)、前頭
葉癲癇および側頭葉癲癇、外傷後癲癇、痙攣重積状態(持続性部分癲癇、および
ハラーフォルデン-シュパッツ症候群など)が挙げられる。
【０５８３】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患と
しては、水頭症(ダンディ-ウォーカー症候群および正常圧水頭症など)、視床下
部疾患(視床下部腫瘍、脳性マラリア、脱力発作を含む睡眠発作、延髄灰白髄炎
、偽脳腫瘍、レット症候群、レイ症候群、視床疾患、脳トキソプラズマ症、頭蓋
内結核およびツェルウェガー症候群など)、中枢神経系感染症(AIDS性痴呆症症候
群など)、脳膿瘍、硬膜下蓄膿、脳脊髄炎(馬脳脊髄炎、ベネズエラ馬脳脊髄炎、
壊死性出血脳脊髄炎、ビスナおよび脳性マラリアなど)が挙げられる。
【０５８４】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患と
しては、髄膜炎(クモ膜炎、無菌性髄膜炎(リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス
性髄膜炎など)、ヘモフィルス髄膜炎、リステリア菌髄膜炎、髄膜炎菌髄膜炎(ウ
ォータハウス-フリーデリクセン症候群、肺炎双球菌髄膜炎および髄膜結核など)
を含む細菌性髄膜炎、真菌性髄膜炎(クリプトコックス髄膜炎など)など)、硬膜
下滲出、髄膜脳炎(ブドウ膜脳炎症候群など)、脊髄炎(横断性脊髄炎など)、神経
梅毒(脊髄癆など)、延髄灰白髄炎および灰白髄炎後症候群を含む灰白髄炎、プリ
オン病(クロイツフェルト-ヤーコプ症候群、牛スポンジ様脳症、ゲルストマン-
シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピーなど)、ならびに脳トキソプラ
ズマ症が挙げられる。
【０５８５】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患と
しては、中枢神経系腫瘍(小脳腫瘍(テント下腫瘍など)、脳室腫瘍(脈絡膜叢腫瘍
など)、視床下部腫瘍およびテント上腫瘍を含む脳腫瘍など)、髄膜腫瘍、硬膜外
腫瘍を含む脊髄腫瘍、脱髄疾患(カナバン病など)、副腎白質ジストロフィーを含
む汎発性脳硬化症、軸索周囲性脳炎、球様細胞性白質萎縮症、汎発性脳硬化症(
異染性白質萎縮症など)、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行
性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中心性髄鞘崩壊、横断性脊髄炎、視神
経脊髄炎、スクラピー、脊柱前湾症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経症候群
、髄膜症、脊髄疾患(先天性筋無緊張症など)、筋萎縮性側索硬化症、脊髄筋萎縮
症(ウェルドニッヒ-ホフマン病など)、脊髄圧迫症、脊髄腫瘍(硬膜外腫瘍など)
、脊髄空洞症、脊髄癆、スティッフマン症候群、精神薄弱(アンジェルマン症候
群など)、猫鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシド症(
ガングリオシド症 G(MI)など)、サンドホフ病、テイ-サックス病、ハルトナップ
病、ホモシスチン尿症、ローレンス・ムーン・ビードル症候群、レッシュ-ナイ
ハン症候群、かえで糖尿症、ムコ脂質症(フコシドーシス)など)、ニューロンセ
ロイド脂褐素症、眼脳腎症候群、フェニルケトン尿症(母性フェニルケトン尿症
など)、プラダー-ウィリー症候群、レット症候群、ルビンスタイン・テイビー症
候群、結節硬化症、WAGR症候群、神経系異常(全前脳症など)、神経管欠損症（水
無脳症）含む無脳症など)、アルノルト-キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄
膜脊髄瘤、脊椎閉鎖不全(嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎など)が挙げられ
る。
【０５８６】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患と
しては、シャルコー-マリー病、遺伝性視神経萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性
対麻痺、ウェルドニッヒ-ホフマン病、遺伝性の感覚神経障害および自律神経障
害(先天性痛覚脱失および家族性自律神経障害など)を含む遺伝性の運動神経障害
および感覚神経障害、神経学的症状発現(ゲルストマン症候群含む失認症など)、
健忘症(逆行性健忘症など)、失行症、神経因性膀胱障害、脱力発作、コミュニケ
ーション障害(難聴、部分的聴力喪失、ラウドネス・レクルートメントおよび耳
鳴りを含む聴力障害、言語障害(失書症、名称失語症、ブローカ失語症、および
ヴェルニッケ失語症を含む失語症、失読症(後天性失読症など)、言語発達障害、
言語障害(名称失語症、ブローカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症
など)、構音障害など)、コミュニケーション障害(構語障害、反響言語、無言症
およびどもりを含む言語障害、発音障害 (失声症および嗄声など)など)、除脳状
態、譫妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、運動障害(アンジェルマン症候群など)
、運動失調症、無定位運動症、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、筋
間代、チック、斜頚および震顫、筋肉緊張亢進(筋肉硬直 (スティッフマン症候
群など)など)、筋肉痙攣、麻痺(耳部帯状疱疹含む顔面麻痺など)、胃不全麻痺、
片麻痺、眼筋麻痺(複視など)、デュアン症候群、ホルネル症候群、慢性進行性外
眼筋麻痺(キーンズ症候群など)、延髄麻痺、熱帯性強直性対麻痺、対麻痺(ブラ
ウンセカール症候群など)、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺、不全麻痺、幻
想肢、味覚障害(無味覚症および味覚不全など)、視覚障害(弱視、失明、色盲、
複視、片側視野欠損、暗点および正常以下の視力など)、睡眠障害(クライン-レ
ヴィン症候群、不眠症、および夢遊症を含む睡眠過剰など)、痙攣(開口障害など
)、意識消失(昏睡、永続性植物状態ならびに失神およびめまいなど)、神経筋疾
患(先天性筋無緊張症など)、筋萎縮性側索硬化症、ランバート-イートン筋無力
症候群、運動ニューロン疾患、筋萎縮症(棘筋萎縮症、シャルコー-マリー病およ
びウェルドニッヒ-ホフマン病など)、灰白髄炎後症候群、筋ジストロフィー、重
症性筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリン筋障害、家族性周期
性麻痺、多発性パラミオクロヌス、熱帯性痙攣性不全対麻痺およびスティッフマ
ン症候群、末梢神経系疾患(先端疼痛症など)、アミロイド神経障害、自律神経系
疾患(エーディ症候群、バレー・リーウー（Barre-Lieou）症候群、家族性自律神
経障害、ホルナー症候群、反射交感神経ジストロフィーおよびシャイ-ドレーガ
ー症候群など)、脳神経疾患(聴神経疾患(神経繊維腫症 2を含む聴神経腫など)な
ど)、顔面神経疾患(顔面神経痛など)、メルカーソン-ローゼンタール症候群、弱
視を含む眼球運動障害、眼振盪、眼球運動神経麻痺、眼筋麻痺(デュアン症候群
など)、ホルネル症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺、斜視(内
斜視および外斜視など)、眼球運動神経麻痺、視神経疾患(遺伝性視神経萎縮症を
含む視神経萎縮症など)、視神経円板晶洞、視神経炎(視神経脊髄炎など)、乳頭
水腫、三叉神経痛、声帯麻痺、脱髄疾患(視神経脊髄炎および脊柱前湾症など)、
ならびに糖尿病性神経障害(糖尿病性足病変など)が挙げられる。
【０５８７】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患と
しては、神経圧迫症候群(手根管症候群、足根管症候群など)、胸郭出口症候群(
頚肋症候群など)、尺骨神経圧迫症候群、神経痛(灼熱痛、頚腕神経痛、顔面神経
痛および三叉神経痛など)、神経炎(実験的アレルギー性神経炎、視神経炎、多発
性神経炎、多発性神経根神経炎など)および神経根炎(多発性神経根炎など)、遺
伝性の運動神経障害および感覚神経障害(シャルコー-マリー病、遺伝性視神経萎
縮症、レフスム病、遺伝性強直性対麻痺およびウェルドニッヒ-ホフマン病など)
、先天性痛覚脱失および家族性自律神経障害を含む遺伝性の感覚神経障害および
自律神経障害、POEMS症候群、座骨神経痛、味覚性発汗ならびにテタニーが挙げ
られる。
【０５８８】内分泌障害 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはホルモン平衡失調に関連する障害およ
び／もしくは疾患、ならびに／または内分泌系の障害もしくは疾患の治療、予防
、診断、および／または予後判定に用いられる。
【０５８９】 内分泌腺から分泌されるホルモンが身体の成長、生殖機能、代謝機能およびそ
の他の機能を制御している。障害は、ホルモン産生の混乱およびホルモンに応答
する組織の無能力の二通りに分類し得る。これらのホルモン平衡失調または内分
泌系疾患、障害もしくは症状の原因は遺伝子性、体性(癌およびいくつかの自己
免疫疾患など)、後天性(例えば、化学療法、創傷、または毒素による)、または
感染性であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のア
ルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内分泌系および／ま
たはホルモン平衡失調に関連する特定の疾患または障害のマーカーまたはデテク
ターとして使用できる。
【０５９０】 内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調および／もしくは疾患は、限定さ
れるものではないが、妊娠および出産による合併症(例えば、早期分娩、過期妊
娠、自然流産、および緩慢な分娩または分娩の停止)を含む子宮運動性障害;なら
びに月経周期障害および／または疾患 (例えば、月経困難症および子宮内膜症)
を包含する。
【０５９１】 内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調障害および／もしくは疾患として
は、例えば真性糖尿病、 尿崩症、先天性膵臓非形成、クロム親和性細胞腫-膵島
細胞腫瘍症候群などの膵臓障害および／または疾患;例えばアジソン病、コルチ
コイド欠乏症、男性化疾患、多毛性早熟症、クッシング症候群、高アルドステロ
ン症、クロム親和性細胞腫などの副腎障害および／または疾患;例えば下垂体機
能亢進症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、下垂体腺腫、汎下垂体機能低下
症、 先端巨大症、巨人症などの下垂体の障害および／または疾患;限定されるも
のではないが、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、プラマー病、グレーヴズ
病(中毒性汎発性甲状腺腫)、中毒性結節性甲状腺腫、甲状腺炎 (橋本甲状腺炎、
亜急性肉芽腫性甲状腺炎および無症候性リンパ球性甲状腺炎)、ペンドレッド症
候群、粘液水腫、クレチン病、甲状腺中毒症、甲状腺ホルモン縮合障害、胸腺形
成不全症、甲状腺のヒュルトレ細胞腫瘍、甲状腺癌、甲状腺癌腫、甲状腺髄様癌
などの状腺障害および／または疾患;例えば副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能
低下症などの副甲状腺障害および／または疾患;視床下部障害および／または疾
患が挙げられる。
【０５９２】 さらに、内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調障害および／もしくは疾
患は癌をはじめとする精巣または卵巣の障害および／または疾患も含む。さらに
、その他の精巣または卵巣の障害および／または疾患としては、例えば、卵巣癌
、多嚢胞性卵巣症候群、クラインフェルター症候群、消失精巣症候群(両側無睾
丸症)、先天性ライディヒ細胞欠損症、潜在睾丸、ヌーナン症候群、筋緊張性ジ
ストロフィー、精巣の毛細血管腫(良性)、精巣腫瘍および新生精巣 (neo-testis
)が挙げられる。
【０５９３】 さらに、内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調障害および／もしくは疾
患はまた、例えば多腺性欠陥症候群、クロム親和性細胞腫、神経芽細胞腫、多発
性内分泌性腫瘍形成、ならびに内分泌組織の障害および／または癌などの障害お
よび／または疾患を包含する。
【０５９４】 もう1つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明の
アルブミンタンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質が発
現される組織に関連する内分泌疾患および／または障害の診断、予後判定、予防
および／または治療に用いられる。
【０５９５】生殖系障害 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、生殖系疾患および／または障害の診
断、治療、または予防に用いられる。本発明の化合物により治療できる生殖系障
害としては、限定されるものではないが、生殖系損傷、感染症、腫瘍性障害、先
天性欠損症、ならびに不妊症、妊娠、出産または分娩による合併症、および分娩
後の問題を引き起こす疾患または障害が挙げられる。
【０５９６】 生殖系障害および／または疾患としては、精巣萎縮症、精巣性女性化症、潜在
睾丸(片側性および両側性)、無睾丸症、異所性睾丸、副睾丸炎および睾丸炎(典
型的には感染 (例えば、淋病、耳下腺炎、結核および梅毒など)の結果として起
こる)、精巣捻転、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍 (例えば、精上皮腫、胎生期細
胞癌腫、奇形癌、絨毛上皮癌、卵黄嚢腫瘍、および奇形腫)、ストロマ腫瘍(例え
ば、ライディヒ細胞腫瘍)、水瘤、血瘤、精索静脈瘤、精液瘤、鼠蹊ヘルニア、
および精子産生障害(例えば、線毛不動症候群、無精液症、精子無力症、無精子
症、精子過少症および奇形性無精子症)を含む精巣疾患および／または障害が挙
げられる。
【０５９７】 生殖系障害としてはまた、急性非細菌性前立腺炎、慢性非細菌性前立腺炎、急
性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎、前立腺失調症、前立腺炎、肉芽腫性前
立腺炎、マラコプラキア、良性前立腺肥大または過形成および、腺癌、移行上皮
癌、腺管癌腫、および扁平上皮細胞癌腫を含む前立腺腫瘍性障害などの前立腺障
害も挙げられる。
【０５９８】 さらに、本発明の化合物は亀頭包皮炎、閉塞性乾燥性亀頭炎、包茎、嵌頓包茎
、梅毒、単純疱疹ウイルス、淋病、非淋菌性尿道炎、クラミジア感染症、マイコ
プラズマ症、トリコモナス症、HIV、AIDS、ライター症候群、尖形コンジローム
、扁平コンジローム、および光沢陰茎丘疹などの炎症性障害;尿道下裂、尿道上
裂、および包茎などの尿道異常;ケーラー紅色肥厚症、ボーエン病、ボーエン病
様の症状、ブシュケ・レーベンシュタインの巨大コンジローム、およびいぼ状癌
を含む前悪性病変;扁平上皮細胞癌腫、上皮内癌、いぼ状癌、および散在性陰茎
癌腫を含む陰茎癌;陰茎尿道癌、尿道球膜癌、および前立腺尿道癌を含む尿道腫
瘍性障害;ならびに持続勃起症、ペイロニー病、勃起不全、および性不能症など
の勃起障害をはじめとする陰茎および尿道障害または疾患の診断、治療、および
／または予防に有用であり得る。
【０５９９】 さらに、精管の疾患および／または障害としては、脈管炎およびCBAVD(先天性 両側性精管欠如症)が挙げられ;さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質お
よび／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
は、嚢腫疾患、先天性塩素下痢、および多嚢胞性腎疾患をはじめとする精嚢の疾
患および／または障害の診断、治療、および／または予防に用いられる。
【０６００】 その他の男性生殖系の障害および／または疾患としては、例えばクラインフェ
ルター症候群、ヤング症候群、早漏、真性糖尿病、嚢胞性繊維症、カルタゲナー
症候群、高熱、多発性硬化症、および女性化乳房が挙げられる。
【０６０１】 さらに、本発明のポリヌクレオチド、融合タンパク質および／または本発明の
アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細菌性膣症、カン
ジダ膣炎、単純疱疹ウイルス、軟性下疳、鼡径性肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、
疥癬、ヒト乳頭腫ウイルス、膣外傷、外陰部外傷、腺疾患、クラミジア膣炎、淋
病、トリコモナス膣炎、尖形コンジローム、梅毒、伝染性軟属種、萎縮性膣炎、
パジェット病、硬化性苔癬、扁平苔癬、外陰痛、毒性ショック症候群、膣痙、外
陰膣炎、外陰部前庭炎、ならびに扁平上皮過形成、透明細胞癌、基底細胞癌、黒
色腫、バルトリン腺癌、および外陰部上皮内腫瘍形成などの腫瘍性障害をはじめ
とする膣および外陰部疾患および／または障害の診断、治療、および／または予
防に用いられる。
【０６０２】 子宮障害および／または疾患としては、月経困難症、子宮後傾症、子宮内膜症
、子宮類腺腫、子宮腺筋症、無排卵性出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇
胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、早発思春期、子宮ポリープ、機能不全性
不正子宮出血(例えば、異常なホルモンシグナルによる)、ならびに腫瘍性子宮疾
患（例えば、子宮腺癌、子宮平滑筋肉腫および子宮肉腫など）が挙げられる。さ
らに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、双角子宮、中隔子宮、単純単角
子宮、非空洞形成性不完全発育角を有する単角子宮、非伝達性空洞形成性不完全
発育角を有する単角子宮、伝達性空洞形成性子宮角を有する単角子宮、弓状子宮
、完全重複子宮、およびT型子宮などの先天性子宮異常のマーカーまたはデテク
ターとして、ならびに診断、治療、および／または予防に有用であり得る。
【０６０３】 卵巣疾患および／または障害としては、無排卵、多嚢胞性卵巣症候群(ステイ
ン-レベンサル症候群)、 卵巣嚢腫、卵巣機能低下、性腺刺激ホルモンに対する
卵巣無反応、アンドロゲンの卵巣過剰生産、右卵巣静脈症候群、無月経、女性内
分泌障害性多毛症、および卵巣癌(限定されるものではないが、原発性および続
発性癌増殖、セルトリ-ライジヒ腫瘍、卵巣内膜癌、卵巣乳頭状漿液性腺癌、卵
巣粘液性腺癌、および子宮クルーケンベルク腫を含む)が挙げられる。
【０６０４】 子宮頸部疾患および／または障害としては、子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、粘
液膿性子宮頸管炎、子宮頸部形成異常、子宮頸管ポリープ、ナーボト嚢胞、子宮
頸管糜爛、子宮頸部機能不全、および子宮頸部腫瘍(例えば、子宮頸癌、扁平上
皮化生、扁平上皮細胞癌、腺扁平細胞腫瘍、および円柱細胞腫瘍を含む)が挙げ
られる。
【０６０５】 さらに、生殖系疾患および／または障害としては、流産および死産(早期流産
、後期流産、自然流産、誘導流産、治療的流産、切迫流産、稽留流産、不完全流
産、完全流産、習慣性流産、および敗血性流産など);子宮外妊娠、貧血症、Rh不
適合、妊娠中の膣内出血、妊娠性糖尿病、子宮内成長遅延、羊水過多症、HELLP
症候群、常位胎盤早期剥離、前置胎盤、悪阻、子癇前症、子癇、妊娠性疱疹、お
よび妊娠性蕁麻疹をはじめとする妊娠性障害および／または疾患が挙げられる。
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは心疾患、心不全、リウマチ性心
疾患、先天性心疾患、僧帽弁脱出症、高血圧症、貧血症、腎疾患、感染症(例え
ば、風疹、サイトメガロウイルス、トキソプラズマ症、感染性肝炎、クラミジア
、HIV、AIDS、および 陰部ヘルペス)、真性糖尿病、グレーヴズ病、甲状腺炎、
甲状腺機能低下症、橋本甲状腺炎、慢性活動性肝炎、肝硬変、原発性 胆汁性肝
硬変、喘息、全身深在性紅斑狼瘡、慢性関節リウマチ、重症性筋無力症、特発性
血小板減少性 紫斑病、虫垂炎、卵巣嚢胞、胆嚢障害、および腸閉塞をはじめと
する妊娠を困難なものにする可能性のある疾患の診断、治療、および／または予
防に用いられる。
【０６０６】 陣痛および分娩に関連する合併症としては、子宮膜の早期破裂、早期分娩、過
期妊娠、過熟妊娠、進行遅延分娩、胎児仮死(例えば、異常心拍 (胎児または母
親)、呼吸困難、および異常胎児位、肩難産、臍帯脱出症、羊水塞栓症、および
異常子宮出血が挙げられる。
【０６０７】 さらに、子宮内膜症、子宮筋層炎、子宮傍結合組織炎、腹膜炎、骨盤血栓静脈
炎、肺塞栓症、内毒素血症、腎盂腎炎、伏在血栓静脈炎、 乳腺炎、膀胱炎、産
後出血、および子宮反転症をはじめとする分娩前疾患および／または障害が挙げ
られる。 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、治療、および／または予防
し得るその他の女性生殖系障害および／または疾患としては、例えばターナー症
候群、偽雌雄同体現象、月経前緊張症候群、炎症性骨盤疾患、骨盤内鬱血(血管
充溢)、性交無欲症、無オルガスム症、性交疼痛症、輸卵管破裂、および中間痛
が挙げられる。 感染症 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは感染病原体の治療または検出に使用で
きる。例えば、免疫応答を増強する、特にBおよび／またはT細胞の増殖および分
化を増強することにより、感染症は治療し得る。免疫応答は既存の免疫応答を増
強すること、または新たな免疫応答を誘導することのいずれかにより増強され得
る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合
タンパク質をコードするポリヌクレオチドは免疫応答を必ずしも誘導することな
く、感染病原体を直接阻害し得る。
【０６０８】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出できる疾患また
は症状の原因となる感染病原体の１つの例がウイルスである。ウイルスの例とし
ては、限定されるものではないが、以下のDNAおよびRNAウイルス、ならびにウイ
ルス科:アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイ
ルス、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カルシウイルス科、サーコウイル
ス科、コロナウイルス科、デングウイルス、EBV、HIV、フラビウイルス科、 ヘ
パドナウイルス科(肝炎)、ヘルペスウイルス科(サイトメガロウイルス、単純疱
疹、帯状疱疹など)、モノネガウイルス(例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウ
イルス、ラブドウイルス科)、オルトミクソウイルス科(例えば、Ａ型インフルエ
ンザ、B型インフルエンザ、およびパラインフルエンザ)、パピローマウイルス、
パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス
科(天然痘または種痘症など)、レオウイルス科(例えば、ロタウイルス)、レトロ
ウイルス科(HTLV-I、HTLV-II、レンチウイルス)、ならびにトガウイルス科 (例
えば、ルビウイルス)が挙げられる。これらの科に属するウイルスは、限定され
るものではないが、関節炎、細気管支炎、呼吸器合胞体ウイルス症、脳炎、眼感
染症(例えば、結膜炎、角膜炎)、慢性疲労症候群、肝炎(A型、B型、C型、E型、
慢性活動性、デルタ)、日本脳炎、アルゼンチン出血熱、チクングンヤ、リフト
バレー熱、黄熱、髄膜炎、日和見感染症(例えば、AIDS)、肺炎、バーキットリン
パ腫、水疱瘡、出血熱、麻疹、耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、
ポリオ、白血病、風疹、性交感染症、皮膚疾患(例えば、カポジ肉腫、疣贅)、お
よびウイルス血症をはじめとする種々の疾患または症状を引き起こし得る。本発
明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク
質をコードするポリヌクレオチドはこれらの症状または疾患のいずれかの治療ま
たは検出に使用できる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／
または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは髄膜
炎、デング熱、EBV、および／または肝炎(例えば、B型肝炎)の治療に用いられる
。さらなる特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明
のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、1種以上のその
他の商業的に入手可能な肝炎ワクチンに応答しない患者の治療に用いられる。さ
らなる特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のア
ルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはAIDSの治療に用いられ
る。
【０６０９】 同様に、疾患または症状を引き起こし、かつ本発明のアルブミン融合タンパク
質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドにより治療または検出できる細菌および真菌病原体としては、限定されるも
のではないが、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌、細菌科、ならびに真菌
:アクチノミセス属(例えば、Norcardia)、アシネトバクター属、クリプトコック
ス・ネオフォルマンス、アスペルギルス属、バチルス属(例えば、炭疽菌(Bacill
us anthrasis))、バクテロイデス属(例えば、Bacteroides fragilis)、ブラスト
ミセス、ボルデテラ属、ボレリア属(例えば、ライム病ボレリア)、ブルセラ属、
カンジダ属、カンピロバクター菌、クラミジア、クロストリディウム属(例えば
、Clostridium botulinum、Clostridium dificile、Clostridium perfringens、
Clostridium tetani)、コクシジオイデス菌、コリネバクテリア菌(例えば、Cory
nebacterium diptheriae)、クリプトコックス、Dermatocycoses、大腸菌(例えば
、Enterotoxigenic E. coliおよびEnterohemorrhagic E. coli)、エンテロバク
ター菌(例えば、Enterobacter aerogenes)、腸内細菌科(クレブシェラ菌)、サル
モネラ菌(例えば、Salmonella typhi、Salmonella enteritidis、Salmonella ty
phi)、腸内菌科セラチア属、エルシニア属、シゲラ)、エリジペロスリックス属
、ヘモフィリス属(例えば、インフルエンザB型)、ヘリコバクター菌、レジオネ
ラ属(例えば、レジェネラ・ニューモフィラ)、レプトスピラ菌、リステリア菌(
例えば、Listeria monocytogenes)、マイコプラズマ属、マイコバクテリウム属(
例えば、ライ菌およびMycobacterium tuberculosis)、ビブリオ属(例えば、Vibr
io cholerae)、ナイセリア属(例えば、Neisseria gonorrhea、Neisseria mening
itidis)、パスツレラ属、プロテウス属、シュードモナス(例えば、Pseudmonas a
eruginosa)、リケッチア属、スピロヘータ(例えば、Treponema spp.、Leptospir
a spp.、Borrelia spp.)、シゲラ種、ブドウ球菌(例えば、黄色ブドウ球菌)、Me
ningio球菌、肺炎双球菌および連鎖球菌(例えば、肺炎連鎖球菌ならびにA、B、
およびC群連鎖球菌)、およびウレアプラスマ属が挙げられる。これらの細菌、寄
生体、および真菌科は、限定されるものではないが、抗生物質耐性感染症、菌血
症、心内膜炎、敗血症、眼感染症(例えば、結膜炎)、ブドウ膜炎、結核、歯肉炎
、細菌性下痢、日和見感染症(例えば、AIDS関連感染症)、爪囲炎、補綴関連感染
症、齲食症、ライター病、気道感染症(百日咳または蓄膿症など)、敗血症、ライ
ム病, 猫ひっかき病、赤痢、 パラチフス、食中毒、レジオネラ症、慢性および
急性炎症、紅斑、酵母感染症. チフス、肺炎、淋病、髄膜炎(例えば、AおよびB
型髄膜炎)、クラミジア感染症、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、ブルセラ病、
消化性潰瘍、炭疽、自然流産、先天的欠損症、肺炎、肺感染症、耳感染症、難聴
、失明、無気力、倦怠感、嘔吐、慢性下痢、クローン病、大腸炎、膣症、不妊症
、炎症性骨盤疾患、カンジダ症、副結核症、結核、ループス、ボツリヌス中毒、
壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ性熱、猩紅熱、性交感染症、皮膚疾患(例えば
、蜂巣炎、皮膚嚢腫)、妊娠中毒症、尿路感染症、創傷感染症、院内感染症をは
じめとする疾患または症状を引き起こし得る。本発明のアルブミン融合タンパク
質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドはこれらの症状または疾患のいずれかの治療または検出に使用できる。特定
の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは破傷風、ジフテリア、ボツリヌス
中毒、および／または髄膜炎B群の治療に用いられる。
【０６１０】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防および／または診断でき
る疾患または症状を引き起こす寄生病原体としては、限定されるものではないが
、以下の系統または種:アメーバ症、バベシア病、コクシジウム症、クリプトス
ポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外部寄生虫症、 ランブル鞭毛虫症、蠕
虫病、リーシュマニア症、住血吸虫症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリ
パノソーマ症、およびトリコモナス症、ならびに胞子虫症(例えば、三日熱マラ
リア原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫)
が挙げられる。これらの寄生体は、限定されるものではないが、疥癬、ツツガム
シ病、眼感染症、腸疾患(例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症)、肝疾患、肺疾患
、日和見感染症(例えば、AIDS関連)、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラ
ズマ症をはじめとする種々の疾患または症状を引き起こし得る。本発明のアルブ
ミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコード
するポリヌクレオチドはこれらの症状または疾患のいずれかの治療、予防、およ
び／または診断に使用できる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質お
よび／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
はマラリアの治療、予防、および／または診断に用いられる。
【０６１１】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質
の有効量を患者に投与すること、または患者の細胞を取り出し、その細胞に本発
明のポリヌクレオチドを与え、その培養細胞を患者に戻すこと(ex vivo治療)の
いずれかにより使用できる。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および
／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
感染症に対する免疫応答を高めるワクチンの抗原としても使用できる。
【０６１２】再生 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは細胞を分化、増殖、および誘引して組
織の再生をもたらすために使用できる。(Science 276:59-87 (1997)参照). 組織
再生は先天性欠損症、外傷(創傷、火傷、切開、または潰瘍)、加齢、疾患(例え
ば、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周疾患、肝機能不全)、手術(美容形成外科を含
む)、繊維形成、再潅流傷害、または全身性サイトカイン傷害により損傷を受け
た組織を修復、移植、または保護するために使用できる。
【０６１３】 本発明を用いて再生できる組織としては、器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎
臓、皮膚、内皮)、筋肉(平滑筋、骨格筋、または心筋)、脈管構造(血管およびリ
ンパ管を含む)、神経、造血および骨格(骨、軟骨、腱、および靭帯)組織が挙げ
られる。好ましくは瘢痕がなくまたはわずかな瘢痕で再生がもたらされる。再生
には脈管形成も含まれる。
【０６１４】 さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドは治癒が困難な組織の再生を増進し得る。
例えば、腱／靭帯再生を増進することで損傷後の再生時間が早まる。本発明のア
ルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは損傷を防ぐための予防にも使用できる。治療できる
特定の疾患としては、腱炎、手根管症候群、およびその他の腱または靱帯欠損が
挙げられる。非治癒性創傷の組織再生のさらなる例としては、圧迫性潰瘍、血管
不全に関連した潰瘍、外科的創傷、および外傷的創傷が挙げられる。
【０６１５】 同様に、神経および脳組織は神経細胞を増殖および分化する本発明の融合タン
パク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチドを用いて再生できる。この方法を用いて治療できる疾患としては、中枢
および末梢神経系疾患、神経障害、または物理的および外傷性障害(例えば、脊
髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および脳卒中)が挙げられる。特に、末梢神経
損傷、末梢神経障害、(例えば、化学療法またはその他の医学療法の結果として
起こる)、局在性神経障害、および中枢神経系 疾患(例えば、アルツハイマー病
、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャ
イ-ドレガー症候群)に関連する疾患は総て、本発明のアルブミン融合タンパク質
および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドを用いて治療できる。
【０６１６】胃腸障害 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性疾患および／または症状, 感
染症、癌(例えば、腸腫瘍(小腸の類癌腫瘍 、小腸の非ホジキン性リンパ腫、小
腸リンパ腫))、および潰瘍(消化性潰瘍など)をはじめとする胃腸障害の治療、予
防、診断、および／または予後判定に用いられる。
【０６１７】 胃腸障害としては、嚥下困難、嚥下痛、食道の炎症、消化性食道炎、胃逆流、
粘膜下組織繊維症と狭窄症、マロリー-ワイス病巣、平滑筋腫、脂肪腫、表皮癌
、腺癌、胃停留障害、胃腸炎、胃萎縮症、胃癌、胃のポリープ、自己免疫疾患(
悪性貧血など)、幽門狭窄、胃炎(細菌性、ウイルス性、エオシン好性、ストレス
性、慢性糜爛性、萎縮性、プラズマ細胞性、およびメネトリエ)、および腹膜疾
患(例えば、乳び腹膜、血管腹膜、腸間膜 嚢胞、腸間膜リンパ節炎、腸間膜血管
閉塞、皮下脂肪組織炎、腫瘍、腹膜炎、肺腹膜、下横隔膜膿瘍)が挙げられる。
【０６１８】 胃腸障害としては、吸収不良症候群、腹部膨張、過敏性腸症候群、糖不耐性、
小児脂肪便症、十二指腸潰瘍、十二支腸炎、熱帯性スプルー、ホイップル病、腸
リンパ管拡張症、クローン病、虫垂炎、回腸閉塞、メッケル憩室症、多発性憩室
症、小腸および大腸の完全回転不全、リンパ腫、ならびに細菌性および寄生体性
疾患(旅行者下痢、チフスおよびパラチフス、コレラ、回虫(Ascariasis lumbric
oides)、十二指腸虫(Ancylostoma duodenale)、線虫(Enterobius vermicularis)
、条虫(Taenia saginata, Echinococcus granulosus、Diphyllobothrium spp.、
およびT. solium)による感染症など)などの小腸に関連する障害も挙げられる。
【０６１９】 肝疾患および障害としては、肝内胆汁鬱血(alagille 症候群、胆汁性肝硬変)
、脂肪肝(アルコール性脂肪肝、レイ症候群)、肝静脈血栓症、肝レンズ核変性症
、肝腫、肝肺症候群、肝腎症候群、門脈圧亢進症(食道および胃静脈瘤)、肝臓膿
瘍(アメーバ性肝臓膿瘍)、肝硬変(アルコール性、胆汁性および経験性)、アルコ
ール性肝疾患(脂肪肝、肝炎、硬変)、寄生体性(肝性包虫症、肝蛭症、アメーバ
性肝臓膿瘍)、黄疸(溶血性、肝細胞性、および胆汁鬱帯性)、胆汁鬱血、門脈圧
亢進症、肝肥大、腹水症、肝炎(アルコール性肝炎、動物肝炎、慢性肝炎(自己免
疫、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、薬剤性)、毒性肝炎、 ウイルス性ヒト 肝炎 (
A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎)、ウィルソン病、肉芽腫性肝炎
、続発性胆汁性硬変、肝性脳症、門脈圧亢進症、静脈瘤、原発性胆嚢硬変、原発
性硬化性胆管炎、肝細胞性腺腫、血管腫、 胆石、肝機能不全(肝性脳症、急性肝
機能不全)、および肝臓腫瘍(血管筋脂肪腫、石灰化肝臓転移、嚢胞性肝臓転移、
上皮腫瘍、繊維性層状肝癌、限局性結節性過形成、肝性腺腫、肝胆汁性嚢胞腺腫
、肝芽細胞腫、肝細胞癌、肝腫瘍、肝臓癌、肝臓 血管内皮腫、間充織過誤腫、
間充織肝腫瘍、結節性再生過形成、良性肝臓腫瘍(肝臓嚢胞[単純嚢胞、多嚢胞性
肝疾患、肝胆汁性嚢胞腺腫、総胆管嚢胞]、間充織腫瘍[間充織過誤腫、小児血管
内皮腫、血管腫、肝臓紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍、その他]、上皮腫瘍[胆管
上皮(胆管過誤腫、胆管腺腫)、肝細胞(腺腫、限局性結節性過形成、結節性再生
過形成)]、悪性肝臓腫瘍 (肝細胞、肝芽細胞腫、肝細胞癌、胆管細胞、胆管癌、
嚢胞腺癌、血管腫瘍、血管肉腫, カポジ肉腫、血管内皮腫、その他の腫瘍、胎生
期肉腫、繊維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、奇形腫、類癌腫、扁平上
皮癌腫、原発性リンパ腫)、肝臓紫斑病、エリスロヘパティック・ポルフィリン
症、肝性ポルフィリン症(急性間欠性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン
症)、ツェルウェガー症候群)が挙げられる。
【０６２０】 膵臓疾患および／または障害としては、急性膵炎、慢性膵炎(急性壊死性膵炎
、アルコール性膵炎)、腫瘍 (膵臓腺癌、嚢胞腺癌、インスリノーマ、ガストリ
ノーマ、およびグルカゴノーマ、嚢胞性腫瘍、島細胞腫瘍、膵芽細胞腫)、およ
びその他の膵臓疾患(例えば、嚢胞性繊維症、嚢胞(膵臓偽嚢胞、膵臓フィステル
、機能不全))が挙げられる。
【０６２１】 胆嚢疾患としては、胆石(胆石症および総胆管結石症)、胆嚢切除後症候群、胆
嚢憩室症、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、胆管腫瘍、および粘液嚢胞腫が挙げられる
。
【０６２２】 大腸疾患および／または障害としては、抗生物質関連大腸炎、憩室炎、潰瘍性
大腸炎、後天性巨大結腸症、膿瘍、真菌および細菌感染症、肛門直腸障害(例え
ば、裂溝、痔核)、結腸疾患(大腸炎、結腸腫瘍[結腸癌、腺腫様結腸ポリープ(例
えば、絨毛腺腫)、結腸癌腫、結腸直腸癌]、結腸憩室炎、結腸憩室症、巨大結腸
症[ヒルシュスプラング病、中毒性巨大結腸症];S状結腸疾患[直腸結腸炎、S状腫
瘍]);便秘症、クローン病、下痢(小児下痢、赤痢)、十二指腸疾患(十二指腸腫瘍
、十二指腸閉塞、十二指腸潰瘍、十二指腸炎)、腸炎(全腸炎)、HIV腸疾患、回腸
疾患(回腸腫瘍、回腸炎)、免疫増殖性小腸疾患、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、
クローン病)、腸閉鎖症、寄生体性疾患(アニサキス症、バランチジウム症、胚盤
胞感染症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、アメーバ性腸炎、ランブ
ル鞭毛虫症)、腸フィステル (直腸フィステル)、腸腫瘍(盲腸腫瘍、結腸腫瘍、
十二指腸腫瘍、回腸腫瘍、腸ポリープ、空腸腫瘍、直腸腫瘍)、腸閉塞(輸入脚症
候群、十二指腸閉塞、嵌入糞便、腸偽閉塞 [盲腸捻転]、腸重積症)、腸穿孔、腸
ポリープ(結腸ポリープ、ガードナー症候群、ポイツ-ジェガーズ症候群)、空腸
疾患(空腸腫瘍)、吸収不良症候群(盲嚢症候群、セリアック病、乳糖不耐性、短
腸症候群、熱帯性スプルー、ホイップル病)、腸間膜血管閉塞、腸壁嚢胞状気腫
、タンパク質喪失性腸症(腸リンパ管拡張症)、直腸疾患(肛門疾患、大便失禁、
痔核、直腸炎、直腸フィステル、直腸脱出症、直腸瘤)、消化性潰瘍(十二指腸潰
瘍、消化性食道炎、出血、穿孔、胃潰瘍、ゾリンジャー-エリソン症候群)、胃切
除後症候群(ダンピング症候群)、胃疾患(例えば、無塩酸症、十二指腸胃逆流(胆
汁逆流)、胃洞血管拡張症、胃フィステル、胃出口閉塞、胃炎(萎縮性または肥大
性)、胃不全麻痺、胃拡張症、胃憩室疾患、胃腫瘍 (胃癌、胃ポリープ、胃腺癌
、過形成性胃ポリープ)、胃破裂、胃潰瘍、胃捻転)、結核、内臓下垂症、嘔吐(
例えば、吐血、妊娠悪阻、術後悪心および嘔吐)および出血性大腸炎が挙げられ
る。
【０６２３】 さらに、胃腸系疾患および／または障害としては、胆管疾患(胃壁破裂症、フ
ィステル(例えば、胆嚢フィステル、食道フィステル、胃フィステル、腸フィス
テル、膵臓フィステル)、腫瘍(例えば、胆管腫瘍、食道腫瘍(食道腺癌など)、食
道扁平上皮細胞癌、胃腸腫瘍、膵臓腫瘍(膵臓腺癌 など)、粘液性嚢胞性膵臓腫
瘍、膵臓嚢胞性腫瘍、膵芽細胞腫、および腹膜腫瘍など)、食道疾患(例えば、水
疱性疾患、カンジダ症、糖原性表皮肥厚症、潰瘍、バレット食道静脈瘤、閉鎖症
、嚢胞、憩室 (例えば、ツェンカー憩室)、フィステル(例えば、気管食道フィス
テル)、運動性障害(例えば、CREST症候群、嚥下障害、噴門無弛緩症、痙攣、胃
食道逆流)、腫瘍、穿孔(例えば、ブールハーフェ症候群、マロリー-ワイス症候
群、狭窄、食道炎、横隔膜ヘルニア(例えば、裂孔ヘルニア))；胃腸疾患(胃腸炎
(例えば、コレラ病、ノーウォークウイルス感染症)、出血(例えば、吐血、黒色
便、消化性潰瘍性出血)、胃腫瘍 (胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、胃癌))、ヘルニ
ア(例えば、先天性 横隔膜ヘルニア、大腿ヘルニア、鼠蹊ヘルニア、閉塞膜ヘル
ニア、臍ヘルニア、腹壁ヘルニア))、ならびに腸疾患(例えば、盲腸疾患(虫垂炎
、盲腸腫瘍))など)が挙げられる。
【０６２４】走化性 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは走化性を有している。走化性分子は細
胞(例えば、単球、繊維芽細胞、好中球、T細胞、マスト細胞、好酸球、上皮およ
び／または内皮細胞)を炎症、感染、あるいは過剰増殖部位のような体の特定部
位、へと誘引するまたは移動させる。移動した細胞はその後、特定の外傷または
異常と闘いおよび／またはそれを治癒することができる。
【０６２５】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の細胞の走化性を高め得る。そ
れゆえ、これらの走化性分子は、体の特定部位に標的化される細胞の数を高める
ことによる炎症、感染症、過剰増殖性障害、またはいずれかの免疫系障害の治療
に使用できる。例えば、走化性分子は、免疫細胞を損傷部位に誘導することによ
り組織の創傷およびその他の外傷の治療に使用できる。本発明の走化性分子は創
傷の治療に使用できる繊維芽細胞も誘引することができる。
【０６２６】 本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするポリヌクレオチドは、走化性を阻害し得ることもまた考えられる。こ
のような分子も障害の治療に使用できる。それゆえ、本発明の融合タンパク質お
よび／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
は、走化性の阻害剤として使用できる。
【０６２７】結合活性 本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合タンパク質の治療用タンパク質部
分と結合する分子、または融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する分
子をスクリーニングするのに使用できる。融合タンパク質とこの分子の結合はこ
の融合タンパク質または結合したこの分子を活性化(アゴニスト)し、その活性を
増強、阻害(アンタゴニスト)または低下させ得る。かかる分子の例としては、抗
体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば、受容体)、または小分子が挙げら
れる。
【０６２８】 好ましくはこの分子は、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分の天
然リガンド、例えば、リガンド断片、または天然基質、リガンド、構造または機
能ミメティックに密接に関連している(Coliganら, Current Protocols in Immun
ology 1(2):Chapter 5 (1991)参照)。同様に、この分子は、本発明のアルブミン
融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する天然受容体、または少なくと
も本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分によって結合され
得る受容体の断片(例えば、活性部位)に密接に関連し得る。いずれの場合も、こ
の分子は公知の技術を用いて合理的に設計することができる。
【０６２９】 好ましくは、これらの分子のスクリーニングには、本発明のアルブミン融合タ
ンパク質を発現する適当な細胞を作出することが含まれる。好ましい細胞として
は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞が挙げられる。
【０６３０】 このアッセイは、単に候補化合物の本発明のアルブミン融合タンパク質への結
合を試験するものであり、ここで結合は標識によるか、あるいは標識された競合
物との競合を含むアッセイで検出する。さらにこのアッセイでは、候補化合物が
、融合タンパク質に結合することで生じるシグナルをもたらすかどうかを試験し
てもよい。
【０６３１】 あるいは、このアッセイは、細胞フリー調製物、固相支持体に固定した融合タ
ンパク質／分子、化学ライブラリー、または天然産物混合物を用いて行うことも
できる。このアッセイはまた単に、候補化合物をアルブミン融合タンパク質を含
有する溶液と混合するステップ、融合タンパク質／分子の活性または結合を測定
するステップ、融合タンパク質／分子の活性または結合を標品と比較するステッ
プを含んでなってもよい。 好ましくは、ELISAアッセイは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いてサンプル(例えば、生物サンプル)中の融合タンパク質のレベルまたは活性
を測定することができる。この抗体は、融合タンパク質のレベルまたは活性を、
直接または間接的にアルブミン融合タンパク質と結合させるか、あるいは基質に
関してアルブミン融合タンパク質と競合させるかのいずれかによって測定するこ
とができる。
【０６３２】 さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合す
る受容体は、当業者に公知の多くの技術、例えばリガンドパンニングFACSソーテ
ィング(Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991))
によって同定することができる。例えば、融合タンパク質の治療用タンパク質部
分がFGFに相当する場合には発現クローニングを用いてもよく、ここではアルブ
ミン融合タンパク質に応答する細胞、例えばFGFファミリーのタンパク質に対す
る複数の受容体を含むことが知られているNIH3T3細胞、およびSC-3細胞からポリ
アデニル化RNAを調製し、さらに、このRNAから作製したcDNAライブラリーをプー
ルに分割してCOS細胞または、アルブミン融合タンパク質に応答しないその他の
細胞をトランスフェクトするのに用いる。スライドグラス上で増殖させたトラン
スフェクト細胞を、標識した後の本発明のアルブミン融合タンパク質に曝す。ア
ルブミン融合タンパク質は、ヨウ素化または部位特異的タンパク質キナーゼの認
識部位を含めることなどの種々の手段で標識することができる。
【０６３３】 固定化またはインキュベーションの後、これらのスライドに対してオートラジ
オグラフィー分析を行う。陽性プールを確認し、サブプールを調製し、そしてサ
ブプールの調製と再スクリーニングのプロセスを繰り返して再トランスフェクト
すると、最終的に推定受容体をコードする単一のクローンが得られる。
【０６３４】 受容体を同定する別のアプローチとしては、標識したアルブミン融合タンパク
質を、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質成分の受容体分子
を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合させてもよく、この結合した
材料はPAGE解析によって分解し、X線フィルムに露光してもよい。融合タンパク
質の受容体を含む標識複合体は切り出してペプチド断片に分解し、タンパク質マ
イクロシーケンシグを行うことができる。 マイクロシーケンシングから得られ
たアミノ酸配列を用いて、推定受容体をコードする遺伝子を同定するためのcDNA
ライブラリーをスクリーニングすることを目的とした縮重したオリゴヌクレオチ
ドのプローブセットを設計する。
【０６３５】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフ
リングおよび／またはコドンシャッフリング(ひとまとめにして「DNAシャッフリ
ング」と呼ばれる)の技術を用いて、融合タンパク質の活性および／または本発
明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分もしくはアルブミン成分
をモジュレートし、それにより本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニスト
およびアンタゴニストを効果的に作出してもよい。一般に、米国特許第5,605,79
3号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,252号および同第5,837,45
8、およびPatten, P.A.ら, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Hara
yama, S. Trends Biotechnol.16(2):76-82 (1998); Hansson, L. 0.ら, J. Mol.
Biol. 287:265-76 (1999);ならびにLorenzo, M. M.およびBlasco, R. Biotechn
iques 24(2):308-13 (1998)参照、なお、これらの特許および刊行物の各々は参
照により本明細書に組み入れられる。ある実施形態では、本発明のアルブミン融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、従ってそれによってコードされて
いるアルブミン融合タンパク質の変更はDNAシャッフリングによって達成できる
。DNAシャッフリングは相同組換えまたは部位特異的組換えによって所望の分子
へ2以上のDNAセグメントを組み込むことを含む。他の実施形態では、本発明のア
ルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、従ってそれによってコ
ードされているアルブミン融合タンパク質を、組換えに先立ち、誤りがちなPCR
によるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入またはその他の技術を
行うことで変更することができる。もう1つの実施形態では、本発明のアルブミ
ン融合タンパク質の1以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断
片などを、1以上の異種分子の1以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメ
イン、断片などと組み合わせてもよい。好ましい実施形態では、これらの異種分
子はファミリーのメンバーである。さらに好ましい実施形態では、これらの異種
分子は、例えば血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン様増殖因子(IGF-I)、ト
ランスフォーミング増殖因子(TGF)-α、上皮増殖因子(EGF)、繊維芽細胞増殖因
子(FGF)、TGF-β、骨形態形成タンパク質(BMP)-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7
、アクチビンAおよびB、デカペンタプレジック(dpp)、60A、OP-2、ドーサリン、
増殖分化因子(GDF)、ノーダル、MIS、インヒビン-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β
3、TGF-β5および神経膠細胞由来神経栄養因子(GDNF)などの増殖因子である。
【０６３６】 他の好ましい断片としては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タン
パク質部分および／またはアルブミン成分の生物学的に活性な断片がある。生物
学的活性断片は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分お
よび／またはアルブミン成分の活性と同一である必要はないが、同等の活性を示
すものである。これら断片の生物活性には、望ましい活性の増強または望ましく
ない活性の低下が含まれる。
【０６３７】 さらに本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の作用をモジュレートす
るものを同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。かかるアッセイ
の例としては、哺乳類繊維芽細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質およびス
クリーニングする化合物を、繊維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で、3[H]
チミジンと組み合わせることを含む。スクリーニングする化合物の不在下で対照
アッセイを行い、化合物の存在下での繊維芽細胞の増殖量と比較して、各場合の3 [H]チミジンの取り込みを測定することでその化合物が増殖を刺激するかどうか
を調べる。繊維芽細胞の増殖量は3[H]チミジンの組み込みを測定する液体シンチ
レーションクロマトグラフィーによって測定する。アゴニストおよびアンタゴニ
スト化合物はいずれもこの手順によって同定することができる。
【０６３８】 別法では、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質成分の受容
体を発現する哺乳類細胞または膜調製物を該化合物の存在下、標識した本発明の
融合タンパク質とともにインキュベートする。そうすることでこの相互作用を増
強または遮断する化合物の能力を測定することができる。あるいは、スクリーニ
ングする化合物と受容体の相互作用の後、公知の第二のメッセンジャー系の応答
を測定し、受容体と結合して第二のメッセンジャー応答を誘起する化合物の能力
を測定して、その化合物が可能性のある融合タンパク質であるかどうかを調べる
。かかる第二のメッセンジャー系としては、限定されるものではないが、cCAMP
グアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げ
られる。
【０６３９】 これら上記のアッセイは全て、診断または予後判定マーカーとして使用できる
。これらのアッセイを用いて発見された分子を用い、融合タンパク質／分子を活
性化または阻害することで患者において疾患を治療したり、特定の結果(例えば
、血管増殖)をもたらしたりすることができる。さらに、これらのアッセイは、
適宜操作した細胞または組織からの本発明のアルブミン融合タンパク質の産生を
阻害または増強し得る薬物を発見することもできる。
【０６４０】 従って本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する化合物を同定
する方法であって、(a)候補化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質ととも
にインキュベートするステップ、さらに(b)結合が起こったかどうかを調べるス
テップを含んでなる方法を含む。さらに本発明は、(a) 候補化合物を本発明のア
ルブミン融合タンパク質とともにインキュベートするステップ、(b)生物活性を
アッセイするステップ、さらに(c)その融合タンパク質の生物活性が変更された
かどうかを調べるステップを含んでなる、アゴニスト／アンタゴニストの同定方
法を含む。
【０６４１】標的送達 もう1つの実施形態では、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の成
分に対する受容体を発現する標的細胞に組成物を送達する方法を提供する。
【０６４２】 本明細書で論じるように、本発明の融合タンパク質は、疎水性相互作用、親水
性相互作用、イオン相互作用および／または共有結合相互作用を介して異種ポリ
ペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと結合し得る。１つの実施形態
では、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と結合している本発明の融合タン
パク質(抗体を含む)を投与することで、細胞に本発明の組成物を特異的に送達す
る方法を提供する。１つの実施例では、本発明は、治療用タンパク質を標的細胞
に送達する方法を提供する。別の実施例では、本発明は、一本鎖核酸(例えば、
アンチセンスまたはリボザイム)または二本鎖核酸(例えば、細胞のゲノムに組み
込まれるか、あるいはエピソームとして複製でき、かつ、転写可能なDNA)を標的
細胞へ送達する方法を提供する。
【０６４３】 もう1つの実施形態では、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質(例え
ば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体)を毒素または細胞傷害性プロド
ラッグと結合させて投与することで特異的に細胞を破壊する(例えば、腫瘍細胞
の破壊)方法を提供する。
【０６４４】 「毒素」とは、内在性の細胞傷害性エフェクター系と結合して活性化する化合
物、放射性同位元素、ホロトキシン、変性毒、毒素の触媒サブユニット、または
細胞内または細胞表面に通常には存在せず定義された条件下で細胞死を引き起こ
す、分子もしくは酵素を意味する。本発明の方法に従って使用できる毒素として
は、限定されるものではないが、当技術分野で公知の放射性同位元素、例えば固
有の、または誘導型の内在性細胞傷害性エフェクター系と結合する抗体(または
その部分を含む相補的固定)、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、RNAアー
ゼ、αトキシン、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素A、ジフテリア毒、
サポリン、モモルジン、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、α-サル
シンおよびコレラ毒などの化合物が挙げられる。「細胞傷害性プロドラッグ」と
は、細胞に通常存在する酵素によって細胞傷害性化合物へ変換される無毒の化合
物を意味する。本発明の方法に従って使用できる細胞傷害性プロドラッグとして
は、限定されるものではないが、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル
誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンCのリン酸誘導体、シトシンアラビノ
シド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体
が挙げられる。
【０６４５】薬物スクリーニング さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質
の治療用タンパク質部分に相当するタンパク質の活性を改変する分子をスクリー
ニングするための、本発明のアルブミン融合タンパク質またはこれらの融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドの使用も考えられる。かかる方法は、本融
合タンパク質と、アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有すると思われる選択
された化合物とを接触させること、および結合させた後にその融合タンパク質の
活性をアッセイすることを含む。
【０６４６】 本発明は、種々の薬物スクリーニング技術において、本発明のアルブミン融合
タンパク質またはその結合断片を用いて治療用化合物をスクリーニングするのに
特に有用である。かかる試験で用いるアルブミン融合タンパク質は固相支持体に
固定してもよいし、細胞表面で発現させてもよいし、液相に遊離していてもよい
し、あるいは細胞内に存在していてもよい。ある薬物スクリーニング法では、ア
ルブミン融合タンパク質を発現する組換え核酸で安定的に形質転換した真核また
は原核宿主細胞を用いる。薬物は、かかる形質転換細胞または、かかる細胞を培
養することで得られる上清に対して、競合結合アッセイでスクリーニングする。
例えば、試験する薬物と本発明のアルブミン融合タンパク質との間の複合体の形
成を測定すればよい。
【０６４７】 このように本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質が媒介する活性に作
用する薬物または他のいずれかの物質のスクリーニング法を提供する。これらの
方法は、かかる物質を本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片と接触
させること、そしてその物質とアルブミン融合タンパク質またはその断片との間
の複合体の存在を、当技術分野で周知の方法によってアッセイすることを含んで
なる。かかる競合結合アッセイでは、スクリーニングのために物質は通常標識さ
れる。インキュベーション後、遊離の物質を、結合形態で存在しているものから
分離し、遊離の、または複合体を形成していない標識の量が、本発明のアルブミ
ン融合タンパク質へ結合する特定の物質の能力の尺度となる。
【０６４８】 薬物スクリーニングのもう1つの技術は、本発明のアルブミン融合タンパク質
に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを
提供するが、これは、1984年9月13日公開の欧州特許出願84/03564に詳細に記載
されている（これは、参照により本明細書に組み入れる）。簡単に述べると、多
数の異なる小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたは他の何らかの表面
などの固相支持体上で合成する。これらのペプチド試験化合物を本発明のアルブ
ミン融合タンパク質と反応させて洗浄する。次ぎに結合したペプチドを当技術分
野で周知の方法によって検出する。精製したアルブミン融合タンパク質は、上記
の薬物スクリーニング技術 で用いるプレートに直接コーティングする。さらに
、非中和性抗体を用いてペプチドを捕捉して固相支持体上にそれを固定化しても
よい。
【０６４９】 本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合し得る中和性抗体が
、本アルブミン融合タンパク質またはその断片との結合に関して、試験化合物と
特異的に競合するという競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図してい
る。このようにして、抗体は、本発明のアルブミン融合タンパク質と、1以上の
抗原エピトープを共有するペプチドの存在を検出するのに用いられる。
【０６５０】結合ペプチドおよびその他の分子 本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合するポリペプチドお
よび非ポリペプチドを同定するスクリーニング法、およびそれによって同定され
た結合分子を包括する。これらの結合分子は例えば本発明のアルブミン融合タン
パク質のアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。かかるアゴニスト
およびアンタゴニストは本発明に従い、以下、詳細に記載される治療の実施形態
で使用できる。
【０６５１】 本方法は、 本発明のアルブミン融合タンパク質を複数の分子と接触させ、さらに そのアルブミン融合タンパク質と結合する分子を同定する、 ステップを含んでなる。
【０６５２】 本発明のアルブミン融合タンパク質を複数の分子と接触させるステップはいく
つかの方法で達成できる。例えば、アルブミン融合タンパク質を固相支持体に固
定化し、複数の分子の溶液をその固定化したポリペプチドと接触させることが考
えられる。かかる方法は、アフィニティーマトリックスが、固定化した本発明の
アルブミン融合タンパク質から構成され、アフィニティークロマトグラフィー法
に類似している。従って本アルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有
する分子はアフィニティー選択によって精製することができる。固相支持体の性
質、アルブミン融合タンパク質の固相支持体への結合プロセス、溶媒、アフィニ
ティー単離または選択の条件は概ね常套的なものであり、当業者には周知である
。
【０６５３】 あるいはまた、複数のポリペプチドを、ポリペプチドのサブセットまたは単独
のポリペプチドを含んでなる実質的に個別の画分に分離してもよい。例えば、複
数のポリペプチドはゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、またはポリペプ
チドの分離に関して当業者に公知の同様の方法で分離することができる。個々の
ポリペプチドはまた形質転換宿主細胞によって、その外表上またはその周辺で発
現させるような方法で作製することもできる(例えば、組換えファージ)。個々の
単離物は次ぎに、発現が必要とされる場合はインデューサーの存在下で、本発明
のアルブミン融合タンパク質によって「プロービング」し、アルブミン融合タン
パク質と個々のクローン間で選択的親和性相互作用が生じるかどうかを調べるこ
とができる。アルブミン融合タンパク質を個々のポリペプチドを含む各画分と接
触させる前に、これらのポリペプチドをさらに便宜となるようにまず固体支持体
へ移すことができる。かかる固体支持体は、単にニトロセルロースまたはナイロ
ン製のもののようなフィルターメンブレンであってもよい。このようにして、陽
性クローンは発現ライブラリーの形質転換宿主細胞コレクションから同定するこ
とができ、それらは本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を
有するポリペプチドをコードするDNA構築物を含んでいる。また、本発明のアル
ブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配
列は従来の手段によって直接決定してもよいし、あるいはそのポリペプチドをコ
ードするDNAのコード配列はより便宜に決定できることもしばしばある。次ぎに
この一次配列を対応するDNA配列から推定することができる。アミノ酸配列をそ
のポリペプチド自体から決定しようとする際には、マイクロシーケンシング技術
を用いればよい。このシーケンシング技術は質量分析法を含み得る。
【０６５４】 状況によっては、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出する試みの前
に本発明のアルブミン融合タンパク質と複数のポリペプチドの混合物から結合し
ていないポリペプチドを洗い流すことが望ましい場合がある。かかる洗浄ステッ
プは、本発明のアルブミン融合タンパク質または複数のポリペプチドが固体支持
体に結合している場合に特に望ましいものであり得る。
【０６５５】 本方法で提供される複数の分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質と特異
的に結合する分子をスクリーニングできるランダムまたはコンビナトリアルペプ
チドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様なライブラリーによって提供する
ことができる。使用できる多くのライブラリーが当技術分野で公知であり、例え
ば化学合成ライブラリー、組換え(例えば、ファージディスプレーライブラリー)
およびin vitro翻訳に基づくライブラリーがある。化学合成ライブラリーの例は
、Fodorら, Science 251:767-773 (1991); Houghtenら, Nature 354:84-86 (199
1); Lamら, Nature 354:82-84 (1991); Medynski, Bio/Technology 12:709-710
(1994); Gallopら, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251 (1994); Ohlmeye
rら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Erbら, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 91:11422-11426 (1994); Houghtenら, Biotechniques 13:412
(1992); Jayawickremeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618 (1994);
Salmonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712 (1993); PCT公開WO93
/20242;ならびにBrennerおよびLerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5
383 (1992) に記載されている。
【０６５６】 ファージディスプレーライブラリーの例は、Scottら, Science 249:386-390 (
1990); Devlinら, Science, 249:404-406 (1990); Christianら, 1992, J. Mol.
Biol. 227:711-718 (1992); Lenstra, J. Immunol. Meth. 152:149-157 (1992)
; Kayら, Gene 128:59-65 (1993);および1994年8月18日付けのPCT公開WO94/1831
8に記載されている。
【０６５７】 in vitro翻訳に基づくライブラリーとしては、限定されるものではないが、 1
991年4月18日付けのPCT公開WO91/05058;およびMatteakisら, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:9022-9026 (1994)に記載されている。
【０６５８】 非ペプチドライブラリーの一例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー(例
えば、Buninら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712 (1994) 参照) が使
用に適している。ペプトイドライブラリー(Simonら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 89:9367-9371(1992)) も使用できる。化学的に変換されたコンビナトリアル
ライブラリーを作製するためにペプチドのアミド官能基が過メチル化された、使
用可能なライブラリーの他の一例が、Ostreshら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
1: 11138-11142 (1994)) により記載されている。
【０６５９】 本発明で有用な非ペプチドライブラリーにはいろいろなものがある。例えば、
EckerおよびCrooke(Bio/Technology 13:351-360 (1995)) は、種々のライブラリ
ーの基礎となる化学種の中で、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジ
オン、ビフェニル、糖類似体、β-メルカプトケトン、酢酸アリール、アシルピ
ペリジン、ベンゾピラン、クバン、キサンチン、アミンイミド、およびオキサゾ
ロンを挙げている。
【０６６０】 非ペプチドライブラリーは大きく分けて修飾モノマーとオリゴマーの2つのタ
イプに分類できる。修飾モノマーライブラリーでは、種々の官能基が付加される
比較的単純な足場構造を用いる。この足場は既知の有用な薬理活性を有する分子
であることが多い。例えばこの足場はベンゾジアゼピン構造であってもよい。
【０６６１】 非ペプチドオリゴマーライブラリーでは多数のモノマーを用いるが、モノマー
を組み合わせて新しい形状が作り出され、この形状は組み合わされるモノマーの
順序に基づいて決まる。今までに使用されたモノマーユニットとしては、カルバ
メート、ピロリノンおよびモルホリノがある。側鎖がα炭素ではなくαアミノ基
に結合しているペプチド様オリゴマーであるペプトイドは、非ペプチドオリゴマ
ーライブラリーのもう1つの形式の基礎となる。初期の非ペプチドオリゴマーラ
イブラリーでは単一タイプのモノマーを用いていたことから繰り返しの主鎖を含
んでいた。最近のライブラリーでは1種以上のモノマーが用いられているので、
ライブラリーには柔軟性がある。
【０６６２】 ライブラリーをスクリーニングするは一般に公知の多様な方法のいずれによっ
て達成してもよい。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示して
いる以下の参照文献:Parmleyら, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218 (1989); S
cottら, Science 249:386-390 (1990); Fowlkesら, BioTechniques 13:422-427
(1992); Oldenburgら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397 (1992); Yu
ら, Cell 76:933-945 (1994); Staudtら, Science 241:577-580 (1988); Bockら
, Nature 355:564-566 (1992); Tuerkら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988
-6992 (1992); Ellingtonら, Nature 355:850-852 (1992); 米国特許第5,096,81
5号、同第5,223,409号および同第5,198,346(全てLadnerら); Rebarら, Science
263:671-673 (1993);およびPCT公開WO94/18318を参照。
【０６６３】 特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する分子を同
定するためのスクリーニングは、そのライブラリーのメンバーを、固相に固定化
した本発明のアルブミン融合タンパク質と接触させ、アルブミン融合タンパク質
と結合するライブラリーのメンバーを回収することで行うことができる。「パン
ニング」技術と呼ばれるかかるスクリーニング法の例は、Pamleyら, Gene 73:30
5-318 (1988); Fowlkesら, BioTechniques 13:422-427 (1992); PCT公開WO94/18
318;および本明細書に挙げられた参照文献に例として記載されている。
【０６６４】 もう1つの実施形態では、酵母において相互作用タンパク質を選択するための
ツーハイブリッド系(Fieldsら, Nature 340:245-246 (1989); Chienら, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991) を用いて、本発明のポリペプチドに
特異的に結合する分子を同定することができる。
【０６６５】 結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、ランダムペプチド
ライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチ
ドライブラリーをはじめとするいずれのペプチドライブラリーからも便宜に選択
することができる。「バイアス」とは本明細書においては、得られる分子（この
場合はペプチド）のコレクションの多様性を司る1以上のパラメーターを制限す
るよう、ライブラリーを作製する方法を操作することをさして用いる。
【０６６６】 従って真のランダムペプチドライブラリーでは、ペプチドのある位置で特定の
アミノ酸が見られる確率が、20種のアミノ酸の全てについて同じであるペプチド
のコレクションが作製される。しかし、例えばリジンが5番目ごとのアミノ酸に
くるよう、あるいはデカペプチドライブラリーの4番目、8番目および9番目の位
置を固定してアルギニンのみを含むように指定することで、ライブラリーにバイ
アスを組み込むことができる。明らかに多くの種類のバイアスが考えられるが、
本発明はいずれかの特定のバイアスに制限されるものではない。さらに本発明で
は、ファージディスプレーペプチドライブラリーおよびDNAインサートを有する
λファージベクターを含むDNA構築物を用いるものなど、特定の種類のペプチド
ライブラリーが考えられる。
【０６６７】 上記のように、結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、約
6個ないし約60個未満のアミノ酸残基、好ましくは約6個ないし約10個のアミノ酸
残基、最も好ましくは約6個ないし約22個のアミノ酸を含み得る。別の実施形態
では、結合ポリペプチドは15ないし100個の範囲のアミノ酸、または20ないし50
個の範囲のアミノ酸を有する。
【０６６８】 選択された結合ポリペプチドは化学合成または組換え発現によって得ることが
できる。
【０６６９】その他の活性 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈硬化症、およびその他
の心血管症状などの種々の病態による虚血組織の血管再開を刺激する処置に用い
てもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミ
ン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、上記のような脈管形成
および四肢再生の刺激に用いてもよい。
【０６７０】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、繊維芽細胞および骨格筋細胞な
どの種々の源の種々の細胞に対して細胞分裂誘発性があることから、また従って
損傷組織または罹患組織の修復または置換を促進するので、傷害、火傷、術後の
組織修復、および潰瘍による創傷の治療に用いてもよい。
【０６７１】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ニューロンの増殖を刺激するた
めに、またある種のニューロン性障害、またはアルツハイマー病、パーキンソン
病、およびエイズ関連合併症などの神経変性症状において起こるニューロンの損
傷を治療または予防するために用いてもよい。本発明のアルブミン融合タンパク
質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得ることから、それらは骨および歯根の再生
の増強のため、および組織移植または骨移植を助けるために用いてもよい。
【０６７２】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ケラチノサイトの増殖を刺激す
ることで日焼けによる皮膚の老化を予防するために用いてもよい。
【０６７３】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、FGFファミリーのメンバーが毛
髪形成細胞を活性化し、メラノサイトの増殖を促進することから、脱毛の予防に
用いてもよい。同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、他のサイトカイン
と併用する場合には、造血系細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激するの
に用いてもよい。
【０６７４】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、移植前の器官を維持するため、
または一次組織の細胞培養を助けるために用いてもよい。本発明のアルブミン融
合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドはまた、初期の胚における分化のために中胚葉起点の組織を誘導するのに
用いてもよい。
【０６７５】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、上記で述べた造血系の他、胚幹
細胞の分化および増殖を増強または低下させ得る。
【０６７６】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、身長、体重、毛の色、眼の色、
皮膚、脂肪組織のパーセンテージ、色素沈着、大きさ、および形状(例えば、美
容整形)などの哺乳類の特徴をモジュレートするのに用いてもよい。同様に、本
発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは、エネルギーの異化作用、同化作用、処理、利用お
よび貯蔵に作用する哺乳類の代謝をモジュレートするのに用いてもよい。
【０６７７】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、バイオリズム、caricadic rhythms
、意気消沈(鬱病を含む)、暴力傾向、痛みの許容、生殖能(好ましくはアクチビ
ンまたはインヒビン様活性)、ホルモンまたは内分泌物レベル、食欲、性衝動、
記憶、ストレス、またはその他の認識できる特性に影響を及ぼすことにより哺乳
類の精神状態または身体状態を変化させるために用いてもよい。
【０６７８】 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、貯蔵能、脂肪含量、脂質、タン
パク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子またはその他の栄養成分の低下
または増強など、食品添加物または保存剤として用いてもよい。
【０６７９】 上記に挙げた用途は広範な種類の宿主に使用しうる。かかる宿主としては、限
定されるものではないが、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、
ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、マイクロピッグ、ニワトリ、ヤギ、
ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒトが挙げられる。特定
の実施形態では、宿主はマウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット
、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコである。好ましい実施形態では
、宿主は哺乳類である。最も好ましい実施形態では、宿主はヒトである。
【０６８０】 以上、本発明を概括的に説明したが、以下の実施例を参照すればさらに容易に
理解できるであろう。なお以下の実施例は説明のためのものであって、限定を意
図するものではない。
【０６８１】 さらなる記載がなくとも、当業者ならば上記の説明および下記の例示的な実施
例を用いて、本発明に記載された変更を行ったり利用したりすること、また特許
請求の範囲の方法を実施したりすることができると思われる。以下、実施例を挙
げて本発明の好ましい実施形態を具体的に示すが、本開示以外の他の部分を何ら
限定するものではない。
【０６８２】実施例 実施例1: HA-hGH融合タンパク質の調製 HA-hGH融合タンパク質は、次のように調製した。
【０６８３】hGH cDNAのクローニング PCR増幅によりヒト脳下垂体cDNAライブラリー(カタログ番号HL1097v, Clontec
h Laboratories, Inc)からhGH cDNAを得た。Applied Biosystems 380B Oligonuc
leotide Synthesizerを用いて、hGH cDNAのPCR増幅に好適な2種のオリゴヌクレ
オチドHGH1およびHGH2を合成した。
【０６８４】 HGH1: 5' - CCCAAGAATTCCCTTATCCAGGC - 3' (配列番号１) HGH2: 5' - GGGAAGCTTAGAAGCCACAGGATCCCTCCACAG - 3' (配列番号２)
【０６８５】 HGH1およびHGH2は、それぞれ2つおよび3つのヌクレオチドがhGH cDNA配列(Mar
tial et. al., 1979)の等価な部分と異なっていた。すなわち、PCR増幅後、EcoR
I部位をcDNAの5'末端に導入し、BamH1部位をcDNAの3'末端に導入するようにした
。さらに、HGH2は、hGH配列のすぐ下流にHindIII部位を含有していた。
【０６８６】 Perkin-Elmer-Cetus Thermal Cycler 9600およびPerkin-Elmer-Cetus PCRキッ
トを用いて、cDNAライブラリーのファージ粒子から以下のように単離された一本
鎖DNA鋳型を用いてPCR増幅を行った。すなわち、10μLのファージ溶解緩衝液(28
0μg/mLのTE緩衝液中プロテイナーゼK)の添加、55℃で15分間、続いて85℃で15
分間のインキュベーションを行うことにより、10μLのファージ粒子を溶解させ
た。氷上で1分間インキュベートした後、14,000rpmで3分間遠心することにより
ファージの破砕物をペレット化した。PCR混合物は、このDNA鋳型6μL、各プライ
マー0.1μMおよび各デオキシリボヌクレオチド200μMを含有していた。PCRは、9
4℃で30秒間の変性、65℃で30秒のアニーリング、および72℃で30秒間の伸長を3
0サイクルで行ったが、伸長時間は1サイクルごとに1秒ずつ増加させた。
【０６８７】 ゲル電気泳動により反応液を分析したところ、予想されたサイズ(589塩基対)
の単一の産物が得られたことがわかった。
【０６８８】 Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega Corp)を用いてPCR産物
を精製し、次に、EcoRIおよびHindIIIで消化させた。ゲル電気泳動によりEcoRI-
HindIII断片のさらなる精製を行った後、EcoRIおよびHindIIIで消化したpUC19(G
IBCO BRL)中に産物をクローン化してpHGH1を得た。EcoRI HindIII領域のDNA配列
決定を行ったところ、それぞれEcoRIおよびBamHI部位の導入された5'および3'末
端を除くと、PCR産物はhGH配列(Martial et al., 1979)と配列が同一であること
がわかった。
【０６８９】 hGH cDNAの発現 2つの75merオリゴヌクレオチドのアニーリングにより形成されたオリゴヌクレ
オチドリンカーをEcoRI部位とHindIII部位との間に挿入することによって、ファ
ージミドpBluescribe(+)(Stratagene)のポリリンカー配列を置換し、pBST(+)を
形成させた。新しいポリリンカーは、特有のNotI部位を含んでいた。
【０６９０】 PRBIプロモーター、HA/MFα-1ハイブリッドリーダー配列をコードするDNA、HA
をコードするDNAおよびADH1ターミネーターを含むpAYE309のNotI HA発現カセッ
ト(EP 431 880)をpBST(+)に移入してpHA1を形成させた。HindIIIによる消化それ
に続く再連結により、このプラスミドからHAコード配列を除去してpHA2を形成し
た。
【０６９１】 実施例1に記載されているようにhGH cDNAのクローニングを行い、プロhGH配列
および成熟hGH配列の最初の8塩基対(bp)が欠如しているhGHコード領域を得た。
酵母からhGHを分泌させるための発現プラスミドを構築するために、酵母プロモ
ーター、シグナルペプチドおよびhGH配列の最初の8bpを、クローン化されたhGH
配列の5'末端に次のように連結させた。すなわち、2種の合成オリゴヌクレオチ
ドHGH3およびHGH4(これらは、SfaNIおよびEcoRI付着末端とアニーリングするこ
とができる付着末端を有するDNAの二本鎖断片を生成するように互いにアニーリ
ングすることができる)を介してpHA1由来のHindIII-SfaNI断片をpHGHI由来のEco
RI/HindIII断片の5'末端に連結させた。
【０６９２】 HGH3: 5' - GATAAAGATTCCCAAC - 3' (配列番号３) HGH4: 5' - AATTGTTGGGAATCTTT - 3' (配列番号４)
【０６９３】 以上のように形成されたHindIII断片をHindIIIで消化したpHA2中にクローン化
してpHGH2を作製し、hGH cDNAがPRBIプロモーターおよびHA/MFα-1融合リーダー
配列(たとえば、国際公開WO 90/01063号を参照されたい)の下流に位置するよう
にした。hGH cDNAの下流にADH1ターミネーターを含む、pHGH2に含まれるNotI発
現カセットを、NotIで消化したpSAC35(Sleep et al., BioTechnology 8:42 (199
0))中にクローン化してpHGH12を作製した。このプラスミドには、複製機能を提
供するための2μmの全プラスミドと形質転換体を選択するためのLEU2遺伝子とが
含まれていた。
【０６９４】 形質転換によりpHGH12をS.セレビシエ（S. cerevisiae）D88に導入し、10mLの
YEPD(1% w/v酵母抽出物、2% w/vペプトン、2% w/vデキストロース)中、30℃で個
々の形質転換体を3日間増殖させた。
【０６９５】 細胞を遠心分離した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によ
り上清を検査し、予想されたサイズのかつウェスタンブロットで抗-hGH抗血清(S
igma, Poole, UK)により確認されるタンパク質を含有することを確認した。
【０６９６】 HA-hGH融合タンパク質のクローニングおよび発現 hGH cDNAの5'末端にHA cDNAを融合するために、2種のオリゴヌクレオチドHGH7
およびHGH8を介してpHGH1 EcoRI-HindIII断片(hGH cDNAの大部分を含む)にpHA1
HindIII-Bsu361断片(HA cDNAの大部分を含む)を連結させた。
【０６９７】 HGH7: 5' - TTAGGCTTATTCCCAAC 3' (配列番号５) HGH8: 5' - AATTGTTGGGAATAAGCC 3' (配列番号６)
【０６９８】 以上のように形成されたHindIII断片をHindIIIで消化したpHA2中にクローン化
してpHGH10を作製し、このプラスミドのNotI発現カセットをNotIで消化したpSAC
35中にクローン化してpHGH16を作製した。
【０６９９】 pHGH16を用いてS.セレビシエD88を形質転換し、培養物の上清を上述したよう
に分析した。HAとhGHとの合計質量に対応する約88kDの分子量を有する主要なバ
ンドが観測された。抗-HAおよび抗-hGH抗血清(Sigma)を用いたウェスタンブロッ
ティングにより、アルブミン融合タンパク質の2つの構成部分の存在を確認した
。
【０７００】 陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続く陰イオン交換およびゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。
アミノ酸の配列決定を行ってタンパク質のN末端を分析することにより、予想さ
れたアルブミン配列の存在を確認した。
【０７０１】 in vitro成長ホルモン活性アッセイ(Ealey et al., Growth Regulation 5:36
(1995))を行ったところ、アルブミン融合タンパク質が十分なhGH活性を有するこ
とがわかった。本質的にヨーロッパ薬局方(European Pharmacopoeia；1987年,
モノグラフ556)に記載されているように行った下垂体の切除されたラットの体重
増加モデルにおいて、同一の活性単位数(上記のin vitroアッセイを基準とする)
で毎日投与した場合、融合分子はhGHよりも効力が高かった。アルブミン融合タ
ンパク質を4日に1回投与した別の実験では、hGHを毎日投与したときと類似した
全体的成長応答を示した。125Iで標識されたタンパク質をラットに投与した薬物
動態学的実験では、アルブミン融合タンパク質の循環半減期がhGHと比較して約1
0倍増加することが示された。
【０７０２】 S.セレビシエのインベルターゼ(SUC2)リーダー配列をコードするDNAでハイブ
リッドリーダーの配列を置き換えた類似のプラスミドを構築し、コードされるリ
ーダー、およびHA配列との結合(↓)が以下のとおりになるようにした。
【０７０３】 ..MLLQAFLFLLAGFAAKISA↓DAHKS..(配列番号７)インベルターゼリーダー HA配列... このプラスミドをS.セレビシエDBI中に導入したところ、このプラスミドは、p
HGH16で得られたのと同様のレベルでアルブミン融合タンパク質の発現および分
泌を指令した。アルブミン融合タンパク質のN末端を分析したところ、成熟タン
パク質からリーダー配列が正確かつ効率的に開裂されることがわかった。
【０７０４】 hGH-HA融合タンパク質のクローニングおよび発現 HA cDNAの5'末端にhGH cDNAを融合するために、最初に部位特異的突然変異誘
発法により、コード領域の5'末端の近傍にEcoNI部位を導入するようHA cDNAを改
変した。これは、pHAIから調製された一本鎖DNA鋳型および合成オリゴヌクレオ
チドLEU4を用いてKunkelらの方法(Methods in Euzymol. 154:367 (1987))により
行った。
【０７０５】 LEU4: 5'-GAGATGCACACCTGAGTGAGG-3' (配列番号8)
【０７０６】 このオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発により、HA cDNAの
コード配列がLys4からLeu4に変化した(K4L)。しかしながら、この変化は、2種の
オリゴヌクレオチドHGH5およびHGH6を介してpHGH2のNotI-BamHI断片を突然変異
型pHAIのEcoNI-NotI断片に連結することによりhGH cDNAをその後の5'末端への連
結時に修復された。
【０７０７】 HGH5: 5' - GATCCTGTGGCTTCGATGCACACAAGA - 3' (配列番号９) HGH6: 5' - CTCTTGTGTGCATCGAAGCCACAG - 3' (配列番号10)
【０７０８】 以上のように形成されたNotI断片をNotIで消化したpSAC35中にクローン化して
pHGH14を作製した。pHGH14を用いてS.セレビシエD88を形質転換し、培養液の上
清を上述したように分析した。hGHとHAとの合計質量に対応する約88kDの分子量
を有する主要なバンドが観測された。抗-HAおよび抗-hGH抗血清を用いたウェス
タンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質の2つの構成部分の存在
を確認した。
【０７０９】 陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続く陰イオン交換およびゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。
アミノ酸の配列決定を行ってタンパク質のN末端を分析することにより、予想さ
れたhGH配列の存在を確認した。
【０７１０】 in vitroで調べたところ、このアルブミン融合タンパク質はhGH活性を保持し
ているが、N末端部分として全長HA(1〜585)およびC末端部分としてhGHを含む上
述したアルブミン融合タンパク質よりもかなり効力が低いことがわかった。
【０７１１】 HAのドメインへのhGH融合物を発現させるためのプラスミドの構築 HAの最初の2つのドメイン(残基1〜387)にhGH分子を融合させた融合ポリペプチ
ドを作製した。オリゴヌクレオチドHGH11およびHGH12を介して、HAのドメイン1
および2に対するコード配列の大部分を含有するpHA1のHindIII-Sapl断片をpHGHI
のEcoRI-HindIII断片に連結させることにより、hGHのN末端への融合を行った。
【０７１２】 HGH11: 5’ - TGTGGAAGAGCCTCAGAATTTATTCCCAAC - 3' (配列番号11) HGH12: 5' - AATTGTTGGGAATAAATTCTGAGGCTCTTCC - 3' (配列番号12)
【０７１３】 以上のように形成されたHindIII断片をHindIIIで消化したpHA2中にクローン化
してpHGH37を作製し、このプラスミドのNotI発現カセットをNotIで消化したpSAC
35中にクローン化した。
【０７１４】 得られたプラスミドpHGH38には、S.セレビシエDB 1中に形質転換したときに上
清中への融合ポリペプチドの分泌を指令することが見いだされた発現カセットが
含まれていた。抗-HAおよび抗-hGH抗血清を用いたウェスタンブロッティングに
より、アルブミン融合タンパク質の2つの構成部分の存在を確認した。
【０７１５】 陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続くゲル浸透クロマトグラフィーに
より培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。
【０７１６】 精製済みのタンパク質を用いてin vivo試験を行ったところ、その循環半減期
はhGHの循環半減期よりも長く、N末端部分として全長HA(1〜585)およびC末端部
分としてhGHを含む上述したアルブミン融合タンパク質の循環半減期と同程度で
あることがわかった。in vitro試験の結果、アルブミン融合タンパク質がhGH活
性を保持していることが判明した。
【０７１７】 先に詳述したのと類似の手法を用いて、N末端部分としてHAの第1のドメイン(
残基1〜194)およびC末端部分としてhGHを含むアルブミン融合タンパク質をクロ
ーン化してS.セレビシエDBL中で発現させた。抗-HAおよび抗-hGH抗血清を用いた
培養液上清のウェスタンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質の2
つの構成部分の存在を確認した。
【０７１８】 フレキシブルリンカー配列を用いるhGHへのHAの融合 オリゴヌクレオチドHGH16、HGH17、HGH18およびHGH19のクローニングにより、
[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n〔式中、nは2または3のいずれかである〕の反復単位を
含むフレキシブルリンカーをHAとhGHアルブミンとの融合タンパク質の間に導入
した。
【０７１９】 HGH16:5'-TTAGGCTTAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGTGGATCTTTCCCA AC-3' (配列番号
13) HGH17:5'-AATTGTTGGGAAAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACCTAAGCC-3' (配列番号
14) HGH18:5'-TTAGGCTTAGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTGGTGGCGGTGGATCCTTCCCAA
C-3' (配列番号15) HGH19:5'-AATTGTTGGGAAGGATCCACCGCCACCAGATCCGCCGCCACCA GATCCACCACCGCCTAA
GCC-3' (配列番号16)
【０７２０】 HGH16とHGH17とのアニーリングによりn=2のものが得られ、一方、HGH18をHGH1
9にアニーリングさせることによりn=3のものが得られた。アニーリングの後、pH
GH1から単離されたEcoRI-Bsu361断片と共に二本鎖オリゴヌクレオチドをBsu361
で消化したpHGH10中にクローン化してそれぞれpHGH56(n=2)およびpHGH57(n=3)を
作製した。これらのプラスミド由来のNotI発現カセットをNotIで消化したpSAC35
中にクローン化してそれぞれpHGH58およびpHGH59を作製した。
【０７２１】 pHGH56およびpHGH57を作製するためのオリゴヌクレオチドのクローニングでは
、リンカー配列中にBamHI部位を導入した。したがって、pHGH56由来のHindIII-B
amHI断片とをpHGH57由来のBamHI-HindIII断片とを連結させるか(n=1になる)また
はpHGH57由来のHindIII-BamHI断片とpHGH56由来のBamHI-HindIII断片とを連結さ
せる(n=2になる)ことにより、n=1およびn=4であるリンカー配列を構築すること
が可能であった。これらの断片をpHA2のHindIII部位にクローン化することによ
り、pHGH60(n=1)およびpHGH61(n=4)を得た。pHGH60およびpHGH61由来のNotI発現
カセットをNotIで消化したpSAC35中にクローン化してそれぞれpHGH62およびpHGH
63を作製した。
【０７２２】 pHGH58、pHGH59、pHGH62およびpHGH63でS.セレビシエを形質転換することによ
り、上清中に融合ポリペプチドを分泌する形質転換体を得た。抗-HAおよび抗-hG
H抗血清を用いたウェスタンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質
の2つの構成部分の存在を確認した。
【０７２３】 陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続く陰イオン交換およびゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。
アミノ酸の配列決定を行ってタンパク質のN末端を分析することにより、予想さ
れたアルブミン配列の存在を確認した。エレクトロスプレー（electrospray）質
量分析法により精製済みタンパク質を分析したところ、上記のHA-hGH融合タンパ
ク質と比較して315D(n=1)、630D(n=2)、945D(n=3)および1260D(n=4)の質量増加
が確認された。精製済みタンパク質はin vitroで活性であることがわかった。
【０７２４】HA-hGH融合タンパク質の貯蔵寿命の増大: 方法 5%のウマ血清を含有する細胞培養培地中でHA-hGHおよびhGHを別々に100〜200
μg/mlの最終濃度になるように希釈し、4℃、37℃または50℃でインキュベート
した。時間ゼロで、およびその後1週間ごとに、サンプルのアリコートをそれら
の生物活性に関してNb2細胞増殖アッセイで試験し、対照(時間ゼロのhGH溶液)の
生物活性でデータを基準化した。他のアッセイでは、4℃、37℃および50℃のリ
ン酸緩衝化生理食塩水中でhGHおよびHA-hGHをインキュベートした。
【０７２５】 Nb2細胞増殖アッセイ: これらの細胞の増殖は、hGHまたは他の乳腺刺激ホルモ
ンに依存する。典型的な実験では、5〜10%のウマ血清を含有するDMEMのような培
地中、異なる濃度のhGHまたはHA-hGHの存在下で、104細胞/ウェルを96ウェルプ
レートにプレーティングして、インキュベーター中に24〜48時間入れる。インキ
ュベーション期間の後、1:10容量のMTT(5mg/ml、H20中)をそれぞれのウェルに添
加し、プレートをさらに6〜16時間インキュベートする。増殖する細胞は、MTTを
不溶性ホルマザンに変換する。このホルマザンを酸性イソプロパノールにより可
溶化させ、生成した色をマイクロタイタープレートリーダーにより570nmで測定
する。ホルマザンの生成の程度は、細胞増殖のレベルを表す。
【０７２６】HA-hGH融合タンパク質の貯蔵寿命の増大: 結果 アルブミンに治療用タンパク質を融合させると、水溶液中または他の溶液中で
の安定性が付与される。図1は、細胞培養培地中に37℃で5週間まで保存した後に
残存するHA-hGHの生物活性の点からhA融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示して
いる。5%のウマ血清を含有する組織培養培地中に200μg/mlのHA-hGH溶液を調製
し、この溶液を時間ゼロから開始して37℃でインキュベートした。所定の時間で
サンプルを採取し、2ng/mlの最終濃度でNb2細胞アッセイによりその生物活性を
調べた。図1に示されているように、HA-hGHの生物活性は、37℃で5週間インキュ
ベートした後でも、本質的に完全な状態(実験変動の範囲内)のままである。この
実験の対照として使用した組換えhGHは、実験の第1週目でその生物活性を失った
。
【０７２７】 図2は、4℃、37℃または50℃で細胞培養培地中に3週間まで保存した後のHA-hG
Hの安定性を示している。時間ゼロで、5%のウマ血清を含有する組織培養培地中
にHA-hGH溶液を調製し、4℃、37℃および50℃でインキュベートした。指定の期
間でサンプルを採取して60ng/mlの最終濃度でNb2細胞増殖アッセイにおいてその
生物活性を測定した。HA-hGHは、インキュベーション後、試験したすべての温度
で少なくとも3週間にわたりその初期活性の90%超を保持しているのに対して、hG
Hは、1週間以内にその生物活性を失う。この活性レベルはさらに、37℃で少なく
とも7週間および50℃で5週間保持される。これらの結果は、HA-hGHが温度ストレ
ス下でさえも水溶液中でかなり安定であることを示している。
【０７２８】 図3Aおよび3Bは、Nb2細胞増殖アッセイにおいてhGHと比較したときのHA-hGHの
安定な生物活性を示している。時間ゼロで添加される段階的に増加させた濃度の
組換えhGHまたはHA-hGHの存在下でNb2細胞を増殖させた。MTT方法により増殖の
程度を測定する前に細胞を24または48時間インキュベートした。アッセイにおけ
るHA-hGHの安定性が増大した結果として、24時間での増殖活性(図3A)が48時間で
の増殖活性(図3B)と本質的に同じになるが、hGHでは、48時間のインキュベーシ
ョンの後、その増殖活性のかなりの減少がみられる(図3Aおよび3B)。hGHと比較
して、HA-hGHは、1日後、より低い生物学的効力を有しており、アルブミン融合
タンパク質は、効力がhGHの約1/5である。しかしながら、2日後、HA-hGHは、ア
ッセイにおけるhGHの短寿命が原因でhGHと本質的に同一の効力を示す。アルブミ
ン融合タンパク質としてのhGHの安定性のこの増加は、タンパク質の生物活性に
大きな予想外の影響を有する。アルブミン融合タンパク質の効力は短期間バイオ
アッセイでは融合されていない対応物よりもわずかに低いが、より長期のin vit
roアッセイまたはin vivoアッセイでは、その生物学的安定性のおかげではるか
に高い生物活性が得られる。
【０７２９】実施例2: HA融合タンパク質の調製 図4は、HA融合物を形成すべく治療用パートナーのcDNAをクローン化するため
のベースベクターとして使用することができるプラスミド(pPPC0005)のマップを
示している。たとえば、このベクターを制限酵素Bsu361/部分的HindIIIで消化さ
せれば、Bsu361部位を含むHAの最後の5アミノ酸をコードするように5'末端が改
変されかつ2重停止コドンおよびHindIII部位を含むように3'末端が改変されたcD
NAを挿入することが可能になるであろう。他の例として、このベクターを制限酵
素Bsu361/, SphIで消化させれば、Bsu361部位を含むHAの最後の5アミノ酸をコー
ドするように5'末端が改変されかつ2重停止コドン、HindIII部位、およびSphI部
位を含めてSphI部位までのADHIターミネーター配列を含むように3'末端が改変さ
れたcDNAを挿入することが可能になる。
【０７３０】 このプラスミドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する目的で治療
用タンパク質またはその断片もしくは変異体をより容易にベクター中にクローン
化しうるように、たとえば、制限部位を改変、付加または除去すべく当業者であ
れば容易に改変することが可能である。
【０７３１】 たとえば、治療用部分が(成熟)アルブミンタンパク質のN末端に配置されたア
ルブミン融合タンパク質を作製する目的で、図4に示されたpPPC0005中のHAをコ
ードするDNAの5'末端に制限部位を付加した。
【０７３２】 pPPC0005中のHAタンパク質をコードするDNAの5'末端に、特有のXhoIおよびCla
I部位を付加することが望ましかったので、最初に、それらの同一部位をプラス
ミドから切り出すことが必要であった(ADH1ターミネーター配列の3'側に位置す
る)。これは、XhoIおよびClaIでpPPC0005を切断し、T4 DNAポリメラーゼで付着
末端を充填し、そして平滑末端を再連結してpPPC0006を作製することにより達成
された。
【０７３３】 pPPC0006中のHAタンパク質をコードするDNAのちょうど5'側にある融合リーダ
ー配列中へのXhoおよびCla I制限部位の遺伝子操作は、2ラウンドのPCRを用いて
行った。第1のペアのオリゴヌクレオチドは、配列番号19および配列番号20のオ
リゴヌクレオチドである。配列番号19は、融合リーダー配列およびHAタンパク質
の開始部分をコードするDNA配列に関して4つの点突然変異を含有する。これらの
突然変異は、融合リーダー配列中にXhoI部位を形成しHAタンパク質をコードする
DNAのちょうど開始部分にCla I部位を形成するのに必要である。これらの4つの
突然変異は以下に示されている配列中に下線を付している。pPPC0006中で、これ
らの4つの位置のヌクレオチドは、5'から3'方向にT、G、T、およびGである。
【０７３４】 5'-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGG-3' (配列
番号19) 5'-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAATAAGC-3' (配
列番号20) 次に、上流フランキングプライマー5'-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3'(配列番号2
1)および下流フランキングプライマー5'-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3'(配
列番号22)を用いて第2ラウンドのPCRを行う。その後、得られたPCR産物を精製し
、次いでAflIおよびXbaIで消化し、そしてpPPC0006中の同一部位に連結すること
によりpScCHSAを作製する。得られたプラスミドは、融合リーダー配列に遺伝子
操作により導入されたXhoI部位を有するであろう。XhoI部位が存在すると、融合
リーダー配列の末端でLDKRからLEKRへの単一アミノ酸変化を生じる。5'SalI付着
末端(XhoI末端との適合性がある)および3'ClaI末端を有する治療用部分を含む断
片をXhoIおよびCla I部位に連結させた場合、DからEへの変化は、最終的なアル
ブミン融合タンパク質発現プラスミド中には存在しないであろう。SalIにXhoIを
連結させると、融合リーダー配列の元のアミノ酸配列が回復する。治療用タンパ
ク質部分は、Kex2部位(Kex2は、融合リーダー配列の末端にある二塩基性アミノ
酸配列KRの後を開裂させる)の後かつClaI部位の前に挿入されうる。
【０７３５】 さらに、治療用部分が(成熟)アルブミンタンパク質のC末端に配置されたアル
ブミン融合タンパク質を作製する目的で、pScCHSA中のHAをコードするDNAの3'末
端に4つの8塩基対制限部位を付加した。例として、pScCHSA中のHAタンパク質を
コードするDNAの末端にあるBsu36IおよびHindIII部位の間にAscI、FseI、および
PmeI制限部位を組み込むことが望ましいと思われた。これは、所望の制限部位を
含有する2種の相補的合成オリゴヌクレオチド(配列番号19および配列番号20)を
使用することにより達成された。
【０７３６】 5'-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCTTAATTCT-3' (配
列番号23) および 5-AGAATTAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3' (配
列番号24) 当技術分野で公知の方法を用いて、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリング
してBsu36IおよびHindIIIで消化し、pScCHSA中のHAタンパク質をコードするDNA
の末端に位置する同一部位に連結させることにより、pScNHSAを作製することが
可能である。
【０７３７】アルブミン部分が治療用部分のN末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベ
クターの作製 HAの最後の5アミノ酸をコードする(およびBsu36I部位を含有する)DNAを、治療
用タンパク質をコードするDNAの5'末端に付加し、かつ停止コドンおよび適切な
クローニング部位をコード配列の3'末端に付加するプライマーを用いて、治療用
部分をコードするDNAをPCR増幅することが可能である。たとえば、治療用タンパ
ク質をコードするDNAを増幅するために使用されるフォワードプライマーは、配
列5'-aagctGCCTTAGGCTTA(N)15-3'(配列番号25)を有しうる。ここで、下線の付さ
れた配列はBsu36I部位であり、大文字のヌクレオチドは成熟HAタンパク質の最後
の4アミノ酸(ALGL)をコードし、(N)15は、対象の治療用タンパク質をコードする
最初の15ヌクレオチドと同じである。同様に、治療用タンパク質をコードするDN
Aを増幅するために使用されるリバースプライマーは、次の配列を有しうる。
【０７３８】 ここで、イタリック体のヌクレオチドはPmeI部位であり、2重下線の付されたヌ
クレオチドはFseI部位であり、1重下線の付された部分はPmeI部位であり、枠で
囲まれたヌクレオチドは2つの直列停止コドンの逆方向相補配列であり、(N)15は
、対象の治療用タンパク質をコードする最後の15ヌクレオチドの逆方向相補配列
と同じである。PCR産物が増幅されれば、それをBsu36Iおよび(AscI、FseI、また
はPmeI)のうちの1つで切断してpScNHSA中に連結させることが可能である。
【０７３９】アルブミン部分が治療用部分のN末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベ
クターの作製 融合リーダー配列の最後の3アミノ酸をコードする(およびSalI部位を含有する
)DNAを、治療用タンパク質およびHAの最初の数個のアミノ酸をコードする(およ
びClaI部位を含有する)DNAの5'末端に付加するプライマーを用いて、治療用部分
をコードするDNAをPCR増幅することが可能である。たとえば、治療用タンパク質
をコードするDNAを増幅するために使用されるフォワードプライマーは、配列5'-
aggagcgtcGACAAAAGA(N)15-3'(配列番号27)を有しうる。ここで、下線の付された
配列はSalI部位であり、大文字のヌクレオチドは融合リーダー配列の最後の3ア
ミノ酸(DKR)をコードし、(N)15は、対象の治療用タンパク質をコードする最初の
15ヌクレオチドと同じである。同様に、治療用タンパク質をコードするDNAを増
幅するために使用されるリバースプライマーは、以下の配列を有しうる。
【０７４０】 ここで、イタリック体のヌクレオチドはClaI部位であり、下線の付されたヌクレ
オチドは、HAの最初の9アミノ酸(DAHKSEVAH)をコードするDNAの逆方向相補配列
であり、(N)15は、対象の治療用タンパク質をコードする最後の15ヌクレオチド
の逆方向相補配列と同じである。PCR産物が増幅されれば、それをSalIおよびCla
Iで切断して、XhoIおよびCla Iで消化されたpScCHSAに連結させることが可能で
ある。
【０７４１】酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現 次に、pScCHSAまたはpScNHSAから作製された、N末端またはC末端アルブミン融
合タンパク質のいずれかをコードするDNAを含有するNot I断片を、pSAC35のNotI
部位にクローン化することが可能である。
【０７４２】哺乳動物細胞系からのアルブミン融合タンパク質の発現 このほかに、哺乳動物培養系により好適なpC4ベクター中にHSA遺伝子をクロー
ン化してプラスミドpC4:HSAを形成した。より具体的には、HSAタンパク質の成熟
形態をコードするDNA(たとえば、プラスミドpScCHSA中のDNA)の5'末端にアニー
リングし、BamHI(イタリック体で以下に示されている)およびHindIII(1重下線を
付して以下に示されている)クローニング部位が組み込まれ、コザック配列(2重
下線を付して以下に示されている)および天然HSAシグナルペプチド(MKWVSFISLLF
LFSSAYSRSLDKR、配列番号29)をコードするDNA(以下に太字で示されている)が連
結された5'プライマー(配列番号30)と、HSAタンパク質の成熟形態をコードするD
NAの3'末端にアニーリングし、Asp718制限部位(以下に太字で示されている)が組
み込まれた3'プライマー(配列番号31)とを用いて、成熟HSA遺伝子をPCR増幅する
ことにより、pC4HSAを作製した。配列番号30中の天然ヒト血清アルブミンリーダ
ー配列をコードするDNAにはまた、以下で枠に囲まれたXhoI部位を導入する改変
が含まれている。
【０７４３】 次に、このPCR産物(1.85kb)を精製してBamHIおよびAsp718で消化し、そしてpC4(
ATCC受託番号209646)中の同一部位にクローン化してpC4:HSAを生成させる。
【０７４４】アルブミン部分が治療用部分のC末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベ
クターの、pC4:HSAベクターを用いた作製 治療用タンパク質部分がアルブミン配列のN末端にあるアルブミン融合タンパ
ク質に関して、pC4:HSAを用いて、それ自体のシグナル配列を有する治療用タン
パク質をコードするDNAをBam HI(またはHindIII)とClaI部位との間にクローン化
することができる。BamHIまたはHind III部位のいずれかにクローン化する場合
、サブクローン化される治療用タンパク質をコードするDNAの翻訳開始コドンの
前にコザック配列(CCGCCACCATG)を組み込むことを忘れないようにする。治療用
タンパク質がシグナル配列を有していない場合には、その治療用タンパク質をコ
ードするDNAをXhoIとClaI部位との間にクローン化してもよい。XhoI部位を用い
る場合、次の5'(配列番号32)および3'(配列番号33)PCRプライマーを使用するこ
とが可能である。
【０７４５】 5'-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)18-3' (配列番号32) 5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)18-3' (配列番号33)
【０７４６】 配列番号32において、下線の付された配列はXhoI部位であり、XhoI部位および
XhoI部位に続くDNAは、天然ヒト血清アルブミンのリーダー配列の最後の7アミノ
酸をコードする。配列番号33において、下線の付された配列はClaI部位であり、
ClaI部位およびそれに続くDNAは、成熟HSAタンパク質(配列番号18)の最初の10ア
ミノ酸をコードするDNAの逆方向相補配列である。配列番号32において、「(N)18 」は、対象の治療用タンパク質をコードする最初の18ヌクレオチドと同じDNAで
ある。配列番号33において、「(N)18」は、対象の治療用タンパク質をコードす
る最後の18ヌクレオチドをコードするDNAの逆方向相補配列である。これらの2種
のプライマーを用いて、対象の治療用タンパク質をPCR増幅し、PCR産物を精製し
、それをXhoIおよびClaI制限酵素で消化し、次に、それをpC4:HSAベクター中のX
hoIおよびClaI部位にクローン化する。
【０７４７】アルブミン部分が治療用部分のN末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベ
クターの、pC4:HSAベクターを用いた作製 治療用タンパク質部分がアルブミン配列のN末端にあるアルブミン融合タンパ
ク質に関して、pC4:HSAを用いて、治療用タンパク質をコードするDNAをBsu36Iと
AscI制限部位との間にクローン化することができる。Bsu36IおよびAscI中にクロ
ーン化する場合、酵母ベクター系にクローン化するために使用されるのと同一の
プライマー設計(配列番号25および26)を利用することが可能である。
【０７４８】 pC4ベクターは、CHO細胞からアルブミン融合タンパク質を発現させるのに特に
好適である。発現に関して、NSO細胞などの他の種類の哺乳動物細胞では、アル
ブミン融合タンパク質をコードするDNAを含有するHindIII-EcoRI断片(治療用タ
ンパク質をコードするDNAがすでにヒト血清アルブミン(の成熟形態)をコードす
るDNAとフレームをあわせてクローン化されているpC4ベクターに由来する)を他
の発現ベクター(たとえば、本明細書に記載されている任意の哺乳動物発現ベク
ター)中にサブクローン化することが有用なこともある。
【０７４９】実施例3: HA-サイトカインまたはHA-増殖因子融合タンパク質の調製(EPO、GMCSF 、GCSFなど) 対象のサイトカインまたは増殖因子、たとえばEPO、のcDNAは、さまざまな手
段により単離することができる。たとえば、cDNAライブラリーから、一連の重複
する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRによりおよびPCRにより
、いずれも標準的方法で単離することができる。これらのタンパク質のいずれに
ついてもそのヌクレオチド配列は公知であり、たとえば、米国特許第4,703,008
号、同第4,810,643号および同第5,908,763号に記載のものが利用できる。HAのcD
NAを含有するベクター中に上記cDNAをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリ
ンカーを使用できるように、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制限部位を
形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにNまた
はC末端で行うことができる。EPO(または他のサイトカイン)cDNAは、pPPC0005(
図4)、pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:HSAのようなベクター中にクローン化され
、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿
入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、
酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その
生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、
使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびター
ミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む(実施例2参照)。その場合
、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好
適なプラスミドに挿入する。
【０７５０】実施例4: HA-IFN融合タンパク質(IFNαなど)の調製 対象のインターフェロン（IFNαなど）のcDNAは、さまざまな手段により単離
することができる。たとえば、cDNAライブラリーから、一連の重複する合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRによりおよびPCRにより、いずれも標
準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。
IFNαのようなインターフェロンのヌクレオチド配列は公知であり、たとえば、
米国特許第5,326,859号および同第4,588,585号、EP 32 134号、ならびにGenBank
のような公共のデータベース中のものが利用できる。HAのcDNAを含有するベクタ
ー中に上記cDNAをクローン化すべくオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるよ
うに、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる
。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずに、HA配列のNまたはC末端で行
うことができる。IFNα(または他のインターフェロン)cDNAは、pPPC0005(図4)、
pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:HSAのようなベクター中にクローン化され、次い
で、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入され
て、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる(図8参照)。次
に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、
その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現で
も、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列および
ターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む(実施例2参照)。その
場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクション
に好適なプラスミドに挿入する。
【０７５１】 バイアルからの最大のタンパク質回収率 本発明のアルブミン融合タンパク質は、低濃度でパッケージングした場合でさ
えも、高度の安定性を有する。さらに、低いタンパク質濃度にもかかわらず、バ
イアル壁への結合を最小限に抑えるべく添加される他のタンパク質を水溶液が含
んでいない場合でさえも、良好な融合タンパク質回収率が観測される。図5は、
バイアルに保存されたHA-IFN溶液の回収率をストック溶液の場合と比較している
。6または30μg/mlのHA-IFN溶液をバイアルに入れて4℃で保存した。48または72
時間後、最初の10ngに相当する容量のサンプルを取り出し、IFNサンドイッチELI
SAで測定した。その推定値を、高濃度ストック溶液の場合と比較した。示されて
いるように、これらのバイアル中では本質的にサンプルの損失はない。このこと
から、バイアル壁へのサンプル損失を防止するためにアルブミンのような外因性
物質を添加することは必要ではないことがわかる。
【０７５２】 HA-α-IFN融合物のin vivo安定性および生物学的利用能 HA-α-IFN融合分子のin vivo安定性および生物学的利用能を調べるために、図
6および7に記載されている用量および時間点で精製済みの融合分子(酵母由来)を
サルに投与した。HA-α-IFN融合物から製剤化された医薬組成物は、図6および7
に例示される血清半減期の延長および生物学的利用能を呈する可能性がある。し
たがって、医薬組成物は、天然のα-インターフェロン分子と比較して、より低
いα-インターフェロン活性のより低い用量を含有するように製剤化しうる。
【０７５３】 HA-α-IFN融合物を含有する医薬組成物は、α-IFNの投与によりモジュレート
することのできる任意の疾患または症状を示す患者において疾患を治療または予
防するために使用しうる。そのような疾患としては、ヘアリー細胞白血病、カポ
ジ肉腫、生殖器および肛門疣贅、慢性B型肝炎、慢性非A型非B型肝炎（特に、C型
肝炎、D型肝炎）、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、膀胱癌、卵巣および子宮頚癌
、皮膚癌、再発性呼吸器乳頭腫症、非ホジキンおよび皮膚T細胞リンパ腫、黒色
腫、多発性骨髄腫、AIDS、多発性硬化症、膠芽細胞腫など(Interferon Alpha, A
HFS Drug Information, 1997を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。
【０７５４】 したがって、本発明は、ヒトに投与するのに適切な用量で製剤化されたHA-α-
IFN融合型のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含有する医薬組成物を
包含する。本発明はまた、少なくとも1種のHA-α-IFN融合型のタンパク質、ポリ
ペプチドまたはペプチドを含有する医薬組成物を投与するステップを少なくとも
含む、そのような治療の必要な患者の治療方法をも包含する。
【０７５５】 二機能性HA-α-IFN融合物 二機能性HA-α-IFN融合タンパク質を発現させるための挿入を行うために、図8
のHA-α-IFN発現ベクターを改変する。たとえば、二重停止コドンを除去するか
またはコード配列の下流に移動させた後、対象の第2のタンパク質のcDNAを「rHA
-IFN」配列の下流にフレームをあわせて挿入しうる。
【０７５６】 二機能性HA-α-IFN融合タンパク質の1形態では、Bリンパ球刺激性タンパク質(
GenBank登録番号4455139)またはポリペプチドに対する抗体またはフラグメント
を融合分子のHA部分の一方の末端に融合させうる。この二機能性タンパク質は、
融合物のα-IFN部分により引き起こされるいかなる免疫応答をもモジュレートす
るのに役立つ。
【０７５７】実施例5: HA-ホルモン融合タンパク質(インスリン、LH、FSHなど)の調製 対象のホルモン（インスリンなど）のcDNAは、さまざまな手段により単離する
ことができる。たとえば、cDNAライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを用いてRT-PCRによりおよびPCRにより、いずれも標準的
方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。これ
らのタンパク質はいずれもそのヌクレオチド配列が公知であり、たとえば、GenB
ankのような公共のデータベース中のものが利用できる。HAのcDNAを含有するベ
クター中に上記cDNAをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用で
きるように、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制限部位を形成することが
できる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにNまたはC末端で行うこ
とができる。ホルモンcDNAは、pPPC0005(図4)、pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:H
SAのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセッ
トが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合
タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タン
パク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができ
る。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物の
プロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似
の手順を踏む(実施例2参照)。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳
動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０７５８】実施例6: HA-TNF受容体のようなHA-可溶性受容体またはHA-結合性タンパク質型
の融合タンパク質の調製 対象の可溶性受容体または結合性タンパク質（TNF受容体など）のcDNAは、さ
まざまな手段により単離することができる。たとえば、cDNAライブラリーから、
一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRによりおよび
PCRにより、いずれも標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限
定されるものではない。これらのタンパク質はいずれもそのヌクレオチド配列が
公知であり、たとえば、GenBank中のものが利用できる。HAのcDNAを含有するベ
クター中に上記cDNAをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用で
きるように、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制限部位を形成することが
できる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにNまたはC末端で行うこ
とができる。受容体cDNAは、pPPC0005(図4)、pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:HSA
のようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセット
が切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タ
ンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパ
ク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる
。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプ
ロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の
手順を踏む(実施例2参照)。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動
物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０７５９】実施例7: HA-IGF-1融合タンパク質のようなHA-増殖因子の調製 対象の増殖因子（IGF-1など）のcDNAは、さまざまな手段により単離すること
ができる。たとえば、cDNAライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いてRT-PCRによりおよびPCRにより、いずれも標準的方法
で単離することができる(GenBank津呂苦番号NP_000609参照)。ただし、これらに
限定されるものではない。HAのcDNAを含有するベクター中に上記cDNAをクローン
化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、cDNAの5'および3'
末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配
列を用いてまたは用いずにNまたはC末端で行うことができる。増殖因子cDNAは、
pPPC0005(図4)、pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:HSAのようなベクター中にクロー
ン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpS
AC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる
。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製
し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発
現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列お
よびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む(実施例2参照)。
その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクシ
ョンに好適なプラスミドに挿入する。
【０７６０】実施例8: HA-一本鎖抗体融合タンパク質の調製 一本鎖抗体は、いくつかの方法で作製される。たとえば、ファージライブラリ
ーからの選択、抗体のcDNAをクローン化し、可変領域をクローン化するためのプ
ライマーとしてフランキング定常領域を用いるかまたは任意の特異的抗体の可変
領域に対応するオリゴヌクレオチドを合成することによる特異的抗体の可変領域
のクローニングによって作製される。ただし、これに限定されるものではない。
HAのcDNAを含有するベクター中に上記cDNAをクローン化すべく、オリゴヌクレオ
チドリンカーを使用できるように、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制限
部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずに
NまたはC末端で行うことができる。細胞cDNAは、pPPC0005(図4)、pScCHSA、pScN
HSA、またはpC4:HSAのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから
完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけ
るアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。
【０７６１】 本発明の融合分子において、VHおよびVLは、以下の手段のうちの1つまたはそ
れらの組み合わせにより連結させることができる：すなわちVHのC末端とVLのN末
端との間のペプチドリンカー；分泌時に2つが開裂分離され次いで自己会合する
ように設けられたVHとVLとの間のKex2pプロテアーゼ開裂部位；ならびにVHおよ
びVLがそれらの間にジスルフィド結合を形成して両者が互いに連結できるように
配置されたシスチン残基(図14を参照)。他の手段としては、HAまたはHAドメイン
断片のN末端にVHを、HAまたはHAドメイン断片のC末端にVLを配置することがある
。
【０７６２】 次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製
し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発
現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列お
よびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む(実施例2参照)。
その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクシ
ョンに好適なプラスミドに挿入する。このように産生された抗体を培地から精製
し、そして標準的な免疫化学的方法を用いて、その抗原への抗体の結合に関して
試験を行うことができる。
【０７６３】実施例9: HA-細胞接着分子融合タンパク質の調製 対象の細胞接着分子のcDNAは、さまざまな手段により単離することができる。
たとえば、cDNAライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いてRT-PCRによりおよびPCRにより、いずれも標準的方法で単離する
ことができる。ただし、これらに限定されるものではない。既知の細胞接着分子
のヌクレオチド配列は公知であり、たとえば、GenBank中のものが利用できる。H
AのcDNAを含有するベクター中に上記cDNAをクローン化すべく、オリゴヌクレオ
チドリンカーを使用できるように、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制限
部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずに
NまたはC末端で行うことができる。細胞接着分子cDNAは、pPPC0005(図4)、pScCH
SA、pScNHSA、またはpC4:HSAのようなベクター中にクローン化され、次いで、そ
れらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵
母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌
されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関
して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現
カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを
利用する点を除けば、類似の手順を踏む(実施例2参照)。その場合、この発現カ
セットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミ
ドに挿入する。
【０７６４】実施例10: HA融合タンパク質としての抑制性因子およびペプチド(HA-抗ウイルス 薬、HA-抗生物質、HA-酵素阻害剤およびHA-抗アレルギー性タンパク質など)の調 製 対象のペプチド（抗生物質ペプチドなど）のcDNAは、さまざまな手段により単
離することができる。たとえば、cDNAライブラリーから、一連の重複する合成オ
リゴヌクレオチドプライマーを用いてRT-PCRによりおよびPCRにより、いずれも
標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない
。HAのcDNAを含有するベクター中に上記cDNAをクローン化すべく、オリゴヌクレ
オチドリンカーを使用できるように、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制
限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いず
にNまたはC末端で行うことができる。ペプチドcDNAは、pPPC0005(図4)、pScCHSA
、pScNHSA、またはpC4:HSAのようなベクター中にクローン化され、次いで、それ
らから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母
におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌さ
れたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関し
て試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カ
セットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利
用する点を除けば、類似の手順を踏む(実施例2参照)。その場合、この発現カセ
ットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミド
に挿入する。
【０７６５】実施例11: ターゲティングHA融合タンパク質の調製 対象のタンパク質に対するcDNAは、cDNAライブラリーから単離するかまたはい
くつかの重複オリゴヌクレオチドを用いて標準的な分子生物学的方法で合成的に
作製することができる。都合のよい制限部位を形成すべく、さらにまたhGHにつ
いて記載した方法と同じようにしてアルブミンcDNAへのタンパク質cDNAの結合を
可能にすべく、適切なヌクレオチドを遺伝子工学的にcDNAに導入することができ
る。また、細胞内部のタンパク質に向かうことのできる一本鎖抗体またはペプチ
ド(たとえば、核局在化シグナル)のようなターゲッティングタンパク質またはペ
プチドcDNAをアルブミンの他方の末端に融合させることができる。対象のタンパ
ク質およびターゲッティングペプチドは、アルブミンcDNAとの融合を可能にする
pPPC0005(図4)、pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:HSAのようなベクター中にクロー
ン化される。このようにして、アルブミンのN-およびC-末端の両方を他のタンパ
ク質に融合させる。次いで、融合されたcDNAをpPPC0005から切り出して、pSAC35
のようなプラスミドに挿入し、酵母においてアルブミン融合タンパク質を発現さ
せる。上記の手順はすべて、分子生物学における標準的方法を用いて行うことが
できる。酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製
し、その生物活性およびそのターゲッティング活性に関して適切な生化学的およ
び生物学的試験により調べることができる。
【０７６６】実施例12: HA-酵素融合物の調製 対象の酵素のcDNAは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば
、cDNAライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを
用いてRT-PCRによりおよびPCRにより、いずれも標準的方法で単離することがで
きる。ただし、これらに限定されるものではない。HAのcDNAを含有するベクター
中に上記cDNAをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるよ
うに、cDNAの5'および3'末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる
。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにNまたはC末端で行うことがで
きる。酵素cDNAは、pPPC0005(図4)、pScCHSA、pScNHSA、またはpC4:HSAのような
ベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出
され、プラスミドpSAC35に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質
の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培
地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動
物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモータ
ー、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏
む(実施例2参照)。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系
のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０７６７】実施例13: アルブミン融合タンパク質の細菌における発現 DNA配列の5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、細菌シグナル配列を含む本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドを増幅し、挿入断片（インサート）を合成する。インサートをコ
ードするポリヌクレオチドを増幅するために使用されるプライマーは、好ましく
は、増幅された産物を発現ベクター中にクローン化するためにプライマーの5'末
端にBamHIおよびXbaIのような制限部位を含有しているとよい。たとえば、BamHI
およびXbaIは、細菌発現ベクターpQE-9(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)上の制
限酵素部位に相当する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性(Ampr)、細菌
複製起点(ori)、IPTG調節性プロモーター/オペレーター(P/O)、リボソーム結合
部位(RBS)、6-ヒスチジンタグ(6-His)、および制限酵素クローニング部位をコー
ドしている。
【０７６８】 pQE-9ベクターをBamHIおよびXbaIで消化し、そして細菌RBSで開始されるリー
ディングフレームを保持するpQE-9ベクター中に増幅断片を連結させる。次に、
連結混合物を用いて、プラスミドpREP4の複数のコピーを含有する大腸菌M15/rep
4株(Qiagen, Inc.)を形質転換する。pREP4は、lacIリプレッサーを発現するとと
もにカナマイシン耐性(Kanr)を付与する。LBプレートにおけるそれらの増殖能力
により形質転換体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択す
る。プラスミドDNAを単離して制限分析により確認する。
【０７６９】 所望の構築物を含有するクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の
両方を添加したLB培地中で液体培養により一晩(O/N)増殖させる。一晩（O/N）培
養物を用いて1:100から1:250の比で大量培養液に接種する。0.4〜0.6の間の光学
濃度600(O.D.600)になるまで細胞を増殖させる。次に、1mMの最終濃度になるよ
うにIPTG(イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド)を添加する。IPTGは、lac
Iリプレッサーを不活性化することによりP/O除去を誘発して遺伝子発現の増大を
もたらす。
【０７７０】 細胞をさらに3〜4時間増殖させる。次に、遠心分離(6000×gで20分間)により
細胞を回収する。4℃で3〜4時間攪拌することにより、カオトロピック剤6モル当
量のグアニジンHCl中にまたは好ましくは8M尿素および濃度0.14M超の2-メルカプ
トエタノール中に細胞ペレットを可溶化させる(たとえば、Burton et al., Eur.
J. Biochem. 179:379-387(1989)を参照されたい)。遠心分離により細胞破砕物
を除去し、ポリペプチドを含有する上清をニッケル-ニトリロ-トリ-酢酸(「Ni-N
TA」)アフィニティー樹脂カラム(QIAGEN, Inc.,前掲から入手可能)上に充填する
。6×Hisタグを有するタンパク質は、高い親和力でNi-NTA樹脂に結合するので、
単純なワンステップ手順で精製することができる(詳細についてはThe QIAexpres
sionist (1995) QIAGEN, Inc.,前掲を参照されたい)。
【０７７１】 簡潔に述べると、6Mグアニジン-HCl, pH8中のカラム上に上清を充填する。最
初に10倍量の6Mグアニジン-HCl(pH8)でカラムを洗浄し、次に10倍量の6Mグアニ
ジン-HCl pH6で洗浄し、最後に6Mグアニジン-HCl, pH5でポリペプチドを溶出さ
せる。
【０７７２】 次に、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)または50mM 酢酸ナトリウム, pH6緩衝液
＋200mM NaClに対して透析することにより、精製済みのタンパク質を再生する。
あるいは、Ni-NTAカラムに固定した状態で、タンパク質をうまくリフォールディ
ングさせることもできる。条件は、たとえば、次のとおりである。すなわち、プ
ロテアーゼ阻害剤を含有する500mM NaCl、20%グリセロール、20mM Tris/HCl pH7
.4中の直線的6M-1M尿素勾配を用いて再生する。再生は1.5時間以上かけて行わな
ければならない。再生の後、250mMイミダゾールの添加によりタンパク質を溶出
させる。PBSまたは50mM酢酸ナトリウムpH6緩衝液＋200mM NaClに対する最終透析
ステップによりイミダゾールを除去する。精製済みのタンパク質は、4℃で保存
するかまたは-80℃で凍結させる。
【０７７３】 上記の発現ベクターに加えて、本発明にはさらに、本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたファージオペレー
ターおよびプロモーターエレメントを含有するpHE4a(ATCC受託番号209645、1998
年2月25日寄託)と呼ばれる発現ベクターが包含される。このベクターは、1)選択
マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、2) 大腸菌複
製起点、3) T5ファージプロモーター配列、4) 2つのlacオペレーター配列、5)
シャイン・ダルガーノ配列、および6)ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子(l
acIq)を含有する。複製起点(oriC)は、pUC19(LTI, Gaithersburg, MD)に由来す
る。プロモーターおよびオペレーター配列は、合成により作製される。
【０７７４】 NdeIと、XbaI、BamHI、XhoI、またはAsp718を用いてベクター（pHE4a）を制限
切断し、制限切断された産物をゲル上で泳動させ、そしてより大きな断片を単離
することにより、DNAをpHE4a中に挿入することができる(スタッファー断片は約3
10塩基対でなければならない)。本明細書に記載のまたは当技術分野で公知のPCR
プロトコルに従って、NdeI(5'プライマー)およびXbaI、BamHI、XhoI、またはAsp
718(3'プライマー)に対する制限部位を有するPCRプライマーを用いて、DNAイン
サートを作製する。PCRインサートをゲル精製し、適合する酵素で制限切断する
。標準的なプロトコルに従って、インサートとベクターとを連結させる。
【０７７５】 遺伝子工学的に操作されたベクターを上記のプロトコルで代用して、細菌系で
タンパク質を発現させてもよい。
【０７７６】実施例14: 哺乳動物細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現 本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現させることがで
きる。典型的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、ならびに転写の終了および転写産物の
ポリアデニル酸付加に必要なシグナルを含有している。さらなるエレメントとし
ては、エンハンサー、コザック配列、ならびにRNAスプライシングのための供与
部位と受容部位とに挟まれた介在配列が挙げられる。高効率の転写は、SV40由来
の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（RSV、HTLVI、HIVIなど）由来
の長末端反復配列(LTR)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモータ
ーにより達成される。しかしながら、細胞エレメントを使用することもできる(
たとえば、ヒトアクチンプロモーター)。
【０７７７】 本発明を実施する際に使用される好適な発現ベクターとしては、たとえば、pS
VLおよびpMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(
ATCC 37146)、pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport 2.0およびpCMVSport 3.0のよう
なベクターが挙げられる。使用しうる哺乳動物宿主細胞としては、ヒトHela、29
3、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCVI、
ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０７７８】 このほか、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを染色体
中に組み込まれた状態で含有する安定な細胞系において、アルブミン融合タンパ
ク質を発現させることもできる。DHFR、gpt、ネオマイシン、またはハイグロマ
イシンのような選択可能なマーカーと共に共トランスフェクションを行うと、ト
ランスフェクトされた細胞の同定および単離が可能になる。
【０７７９】 融合タンパク質をコードするトランスフェクトされたポリヌクレオチドを増幅
することにより、コードされる融合タンパク質を大量に発現させることもできる
。DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)マーカーは、対象の遺伝子の数百またはさら
には数千のコピーを有する細胞系を確立するのに有用である。(たとえば、Alt e
t al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370(1978); Hamlin et al., Biochem. et Bi
ophys. Acta, 1097:107-143(1990); Page et al., Biotechnology 9:64-68(1991
)を参照されたい)。他の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ(GS)
である(Murphy et al., Biochem J. 227:277-279(1991); Bebbington et al., B
io/Technology 10:169-175(1992))。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞
を選択培地中で増殖させ、最大の耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞系
は、染色体中に組み込まれた増幅遺伝子を含有する。チャイニーズハムスター卵
巣(CHO)およびNSO細胞は、タンパク質の産生のためによく使用される。
【０７８０】 プラスミドpSV2-dhfr(ATCC受託番号37146)、発現ベクターpC4(ATCC受託番号20
9646)およびpC6(ATCC受託番号209647)の誘導体は、ラウス肉腫ウイルスの強力な
プロモーター(LTR) (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-44
7 (March, 1985))とCMV-エンハンサーの断片(Boshart et al., Cell 41:521-530
(1985))とを含有する。多重クローニング部位、たとえば、制限酵素開裂部位Ba
mHI、XbaIおよびAsp718を有する多重クローニング部位は、対象の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。このベクターはまた、ラットプレプロインスリン遺伝子
の3'イントロン、ポリアデニル酸付加および終止シグナル、ならびにSV40初期プ
ロモーターの制御下のマウスDHER遺伝子を含有する。
【０７８１】 具体的には、たとえば、プラスミドpC6を適切な制限酵素で消化させ、次いで
、当技術分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフェートを用いて脱リン酸化する
。次に、1%アガロースゲルからベクターを単離する。
【０７８２】 本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術
分野で公知の方法を用いて生成され、そしてこのポリヌクレオチドは、当技術分
野で公知のPCR法を用いて増幅される。天然に存在するシグナル配列を用いて本
発明の融合タンパク質を産生する場合、ベクターは第2のシグナルペプチドを必
要としない。このほか、天然に存在するシグナル配列を用いない場合、異種シグ
ナル配列が含まれるようにベクターを改変することができる。(たとえば、国際
公開WO 96/34891号を参照されたい。) 本発明の融合タンパク質をコードする増幅断片は、市販のキット("Geneclean,
" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)を用いて1%アガロースゲルから単離される。そ
の後、断片は適切な制限酵素で消化され、1%アガロースゲルを用いて再び精製さ
れる。
【０７８３】 この場合、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする増幅断片は、同一
の制限酵素で消化され、1%アガロースゲルを用いて精製される。次に、単離され
た断片と脱リン酸化されたベクターとをT4 DNAリガーゼで連結させる。その後、
大腸菌HB 101またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、プラスミドpC6中に挿入された
断片を含有する細菌を、たとえば制限酵素分析を用いて同定する。
【０７８４】 活性DHFR遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェク
ションに使用する。リポフェクチンを用いて0.5μgのプラスミドpSVneoと共に5
μgの発現プラスミドpC6またはpC4を共トランスフェクトする(Felgner et al.,
前掲)。プラスミドpSV2-neoは、G418を含む1群の抗生物質に対する耐性を付与す
る酵素をコードしているTn5由来のnec遺伝子である優性選択性マーカーを含有す
る。1mg/mlのG418を添加したアルファマイナスMEMに細胞を接種する。2日後、細
胞をトリプシン処理し、10、25、または50ng/mlメトトレキセート＋1mg/ml G418
を添加したアルファマイナスMEMを入れたハイブリドーマクローニングプレート(
Greiner、Germany)に接種する。約10〜14日後、単一クローンをトリプシン処理
し、次いで、さまざまな濃度のメトトレキセート(50nM、100nM、200nM、400nM、
800nM)を用いて6ウェルペトリディッシュまたは10mlフラスコに接種する。次に
、最高濃度のメトトレキセートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレ
キセート(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)を含有する新しい6ウェルプレートに
移す。100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで、同一の手順を繰
り返す。所望の融合タンパク質の発現は、たとえばSDS-PAGEおよびウェスタンブ
ロットによりまたは逆相HPLC分析により解析される。
【０７８５】実施例15: 多重融合型融合物 アルブミン融合タンパク質(たとえば、アルブミン(またはそれらの断片もしく
は変異体)と融合した治療用タンパク質(またはそれらの断片もしくは変異体)を
含有するもの)をさらに他のタンパク質に融合させて「多重融合タンパク質」を
生成することが可能である。これらの多重融合タンパク質は、さまざまな用途に
使用することができる。たとえば、本発明のアルブミン融合タンパク質をHisタ
グ、HAタグ、プロテインA、IgGドメイン、およびマルトース結合性タンパク質に
融合させると、精製が容易になる。(たとえば、EP A 394,827; Traunecker et a
l., Nature 331:84-86(1988)を参照されたい)。本発明のポリペプチドに融合さ
れた核局在化シグナルは、特定の細胞小器官の局在位置にタンパク質をターゲッ
ティングすることができ、一方、共有結合性ヘテロダイマーまたはホモダイマー
は、アルブミン融合タンパク質の活性を増大または低減させることができる。こ
のほか、本発明のアルブミン融合タンパク質に追加のタンパク質配列を融合させ
ると、融合タンパク質の溶解性および/または安定性がさらに増大する可能性が
ある。上記の融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法を用いるかもしくは慣
例に従ってそれを改変することにより、および／またはIgG分子へのポリペプチ
ドの融合について概説している以下のプロトコルを修正することにより、作製す
ることができる。
【０７８６】 簡潔に述べると、IgG分子のヒトFc部分は、以下に記載されている配列の5'お
よび3'末端を含むプライマーを用いてPCR増幅することができる。これらのプラ
イマーはまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物または酵母発現ベクター中へ
のクローニングを容易にする都合のよい制限酵素部位を有していなければならな
い。
【０７８７】 たとえば、pC4(ATCC受託番号209646)を使用する場合、ヒトFc部分はBamHIクロ
ーニング部位に連結することができる。3'BamHI部位が破壊される必要があるこ
とに留意されたい。次に、ヒトFc部分を含有するベクターをBamHIで再び制限切
断してベクターを線状化し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質をコード
するポリヌクレオチド(当技術分野で公知の方法を用いて生成および単離された
もの)を、このBamHI部位に連結させる。本発明の融合タンパク質をコードするポ
リヌクレオチドは停止コドンなしでクローン化されることに留意されたい。それ
以外の場合には、融合タンパク質を含有するFcは産生されないであろう。
【０７８８】 天然に存在するシグナル配列を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を産
生する場合、pC4は第2のシグナルペプチドを必要としない。このほか、天然に存
在するシグナル配列を使用しない場合には、ベクターは異種シグナル配列が含ま
れるように改変することができる。(たとえば、国際公開WO 96/34891号を参照さ
れたい) ヒトIgG Fc領域: GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTG
CACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACAT
GCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC
ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC
TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCG
AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATG
AGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGT
GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT
TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC
ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGC
GACTCTAGAGGAT (配列番号36)
【０７８９】実施例16: アルブミン融合タンパク質からの抗体の産生 a) ハイブリドーマ法 本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質
の一部分(たとえば、融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン
部分)に結合する抗体をさまざまな方法で調製することができる(Current Protoc
ols, Chapter 2を参照されたい)。そのような方法の一例として、本発明のアル
ブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分の調製
物は、天然の夾雑物が実質的に含まれないように調製および精製される。次に、
特異的活性ができるだけ高いポリクロナール抗血清を産生すべく、そのような調
製物を動物に導入する。
【０７９０】 本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質
の一部分に特異的なモノクロナール抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製され
る(Kohler et al., Nature 256:495(1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol.
6:511(1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292(1976); Hammerling et
al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp.563
-681(1981))。一般的には、動物(好ましくはマウス)を本発明のアルブミン融合
タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分で免疫する。その
ようなマウスの脾細胞を抽出して好適な骨髄腫細胞系と融合させる。本発明にお
いては任意の好適な骨髄腫細胞系を利用しうる。しかしながら、ATCCから入手可
能な親骨髄腫細胞系(SP2O)を利用することが好ましい。融合後、得られたハイブ
リドーマ細胞をHAT培地中で選択的に保持し、次いでWandsら(Gastroenterology
80:225-232 (1981))により記載されたような限界希釈によりクローン化する。次
に、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、本発明
のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分
に結合することのできる抗体を分泌するクローンを同定する。
【０７９１】 このほか、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合
タンパク質の一部分に結合することのできる他の抗体は、抗イディオタイプ抗体
を用いて2段階法で作製することもできる。そのような方法では、抗体がそれら
自体で抗原であるという事実が利用される。したがって、第2抗体に結合する抗
体を得ることが可能である。この方法によれば、タンパク質特異的抗体を用いて
、動物、好ましくはマウスを免疫する。次に、そのような動物の脾細胞を用いて
ハイブリドーマ細胞を作製し、そしてハイブリドーマ細胞をスクリーニングして
、本発明の融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に
より阻害されうる、本発明のアルブミン融合タンパク質(または本発明のアルブ
ミン融合タンパク質の一部分)に特異的な抗体に結合する能力、を有する抗体を
産生するクローンを同定する。そのような抗体は、本発明の融合タンパク質(ま
たは本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分)に特異的な抗体に対する抗イ
ディオタイプ抗体を含み、これを用いて動物を免疫すると本発明の融合タンパク
質(または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分)に特異的な別の抗体の形
成が誘発される。
【０７９２】 ヒトにおいて抗体をin vivoで使用するために、抗体は「ヒト化」される。そ
のような抗体は、上記のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由
来する遺伝子構築物を用いて作製することができる。キメラおよびヒト化抗体の
作製方法は、当技術分野で公知であり、本明細書でも論じられている。(概説に
関しては次の文献を参照されたい。Morrison, Science 229:1202(1985); Oi et
al., BioTechniques 4:214(1986); Cabilly et al.,米国特許第4,816,567号; Ta
niguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al.,
WO 8601533; Robinson et al., 国際公開WO 8702671号; Boulianne et al., Na
ture 3 12:643(1984); Neuberger et al., Nature 314:268(1985))。
【０７９３】b) scFvのライブラリーからの、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発
明のアルブミン融合タンパク質の一部分に対する抗体フラグメントの単離 ヒトPBLから単離された天然に存在するV遺伝子から、ドナーが暴露されたもの
であってもなくてもよい本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアル
ブミン融合タンパク質の一部分に対する反応性を含有する抗体フラグメントのラ
イブラリーを構築する(たとえば、米国特許第5,885,793号を参照されたい。参照
により該特許全体が本明細書に組み入れられるものとする)。
【０７９４】 ライブラリーのレスキュー： 国際公開WO 92/01047号に記載されているよう
に、ヒトPBLのRNAからscFvのライブラリーを構築する。ファージを提示する抗体
フラグメントをレスキューするために、ファージミドを保有する約109個の大腸
菌を用いて、1%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含有する50mlの2×
TY(2×TY-AMP-GLU)に接種し、振盪しながらO.D.が0.8になるまで増殖させる。こ
の培養物5mlを用いて50mlの2×TY-AMP-GLUに接種し、2×108TUのデルタ遺伝子3
ヘルパー(M13デルタ遺伝子III、国際公開WO 92/01047号参照)を添加し、そして
振盪せずに37℃で45分間、次に振盪しながら37℃で45分間、培養物をインキュベ
ートする。培養物を4000r.p.m.で10分間遠心分離し、100μg/mlアンピシリンお
よび50μg/mlカナマイシンを含有する2リットルの2×TY中にペレットを再懸濁さ
せ、そして一晩増殖させる。国際公開WO 92/01047号に記載されているようにフ
ァージを調製する。
【０７９５】 M13デルタ遺伝子IIIを次のように調製する。M13デルタ遺伝子IIIヘルパーファ
ージは遺伝子IIIタンパク質をコードしていないので、ファージ(ミド)を提示す
る抗体フラグメントは、抗原に対するより大きな結合アビディティーを有する。
感染性M13デルタ遺伝子III粒子は、ファージ形態形成過程で野生型遺伝子IIIタ
ンパク質を供給するpUC19誘導体を保有する細胞中でヘルパーファージを増殖さ
せることにより作製される。振盪せずに37℃で1時間、次に振盪しながら37℃で
さらに1時間、培養物をインキュベートする。細胞を遠心沈降させ(IEC-Centra 8
,400r.p.m.で10分間)、100μgアンピシリン/mlおよび25μgカナマイシン/mlを含
有する300mlの2×TYブロス(2×TY-AMP-KAN)中に再懸濁させ、37℃で振盪しなが
ら一晩増殖させる。2回のPEG沈殿(Sambrook et al., 1990)により培養培地から
ファージ粒子を精製および濃縮し、2ml PBS中に再懸濁させ、そして0.45μmフィ
ルター(Minisart NML; Sartorius)に通して、約1013形質導入単位/mlの最終濃度
とする(アンピシリン耐性クローン)。
【０７９６】 ライブラリーのパニング： PBS中で一晩かけて、100μg/mlまたは10μg/mlの
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の
一部分4mlでイムノチューブ（Immunotube、Nunc）をコーティングする。このチ
ューブを2% Marvel-PBSを用いて37℃で2時間ブロッキングし、次いでPBS中で3回
洗浄する。約1013TUのファージをチューブに適用し、上下ターンテーブルを用い
てタンブリングさせながら室温で30分間インキュベートし、次いでさらに1.5時
間放置する。PBS 0.1% Tween-20で10回、PBSで10回、チューブを洗浄する。1ml
の100mMトリエチルアミンを添加し、上下ターンテーブルを用いて15分間回転す
ることにより、ファージを溶出させ、その後、直ちに0.5mlの1.0M Tris-HCl, pH
7.4で溶液を中和する。次に、ファージを使用して、溶出されたファージを細菌
と共に37℃で30分間インキュベートすることにより、10mlの中間対数増殖期大腸
菌TG1に感染させる。次に、1%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含有す
るTYEプレート上に大腸菌をプレーティングする。次に、得られた細菌ライブラ
リーを上記のデルタ遺伝子3ヘルパーファージでレスキューして、後続の選択ラ
ウンド用のファージを調製する。次に、このプロセスを繰り返して合計4ラウン
ドのアフィニティー精製を行う。その際、ラウンド3および4に対するチューブの
洗浄を、PBS、0.1% Tween-20で20回、PBSで20回に増大させる。
【０７９７】 結合物の特性決定： 第3および第4ラウンドの選択から溶出されたファージを
用いて大腸菌HB 2151に感染させ、単一コロニーから可溶性scFvを産生さてアッ
セイにかける(Marks, et al., 1991)。50mM重炭酸塩pH 9.6中の10pg/mlの本発明
のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分
のいずれかでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いてELISAを行
う。ELISAで陽性のクローンをPCRフィンガープリント法(たとえば、国際公開WO
92/01047号参照)により、次に配列決定により、さらに特性決定する。これらのE
LISA陽性クローンはまた、たとえば、エピトープマッピング、結合アフィニティ
ー、受容体シグナル伝達、抗体/抗原結合を阻止または競合的に阻害する能力、
および競合的アゴニストまたはアンタゴニスト活性のような当技術分野で公知の
方法により、さらに特性決定することが可能である。
【０７９８】実施例17: ex vivoでの遺伝子治療を用いる治療方法 遺伝子治療の1方法では、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現すること
のできる繊維芽細胞が患者に移植される。一般的には、皮膚生検により被験者か
ら繊維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に配置し、小片に分割する。
組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に配置する。約10片をそれぞれのフ
ラスコ中に配置する。フラスコを上下逆さまにし、密閉して室温で一晩放置する
。室温で24時間後、フラスコは反転させ、組織塊をフラスコの底部に固定された
状態に保持し、新たな培地(たとえば、10% PBS、ペニシリンおよびストレプトマ
イシンを有するHam's F12培地)を添加する。次に、フラスコを37℃で約1週間イ
ンキュベートする。
【０７９９】 この時点で、新たな培地を添加し、さらに数日ごとに交換する。さらに2週間
培養した後、繊維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理して、より大き
なフラスコにスケールアップする。
【０８００】 Moloneyマウス肉腫ウィルスの長末端反復配列によりフランキングされたpMV-7
(Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25(1988))をEcoRIおよびHindIIIで消
化させ、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。アガロースゲル上で線状ベ
クターを分画し、ガラスビーズを用いて精製する。
【０８０１】 本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当技術
分野で公知の方法により作製し、5'および3'末端の配列に対応しておりさらに所
要であれば適切な制限部位および開始/停止コドンを任意に有するPCRプライマー
を用いて増幅することができる。好ましくは、5'プライマーはEcoRI部位を含有
し、3'プライマーはHindIII部位を含む。等量のMoloneyマウス肉腫ウィルスの線
状バックボーンと、増幅されたEcoRIおよびHindIII断片とを、T4 DNAリガーゼの
存在下で一緒に添加する。得られた混合物を2種の断片のライゲーションにふさ
わしい条件下に保持する。次に、ライゲーション混合物を用いて細菌HB101を形
質転換し、次いでそれを、適切に挿入された対象遺伝子をベクターが有している
ことを確認する目的で、カナマイシンを含有する寒天上にプレーティングする。
【０８０２】 10%仔ウシ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するDulbecco
改変Eagle培地(DMEM)中で、アンホトロピックなpA317またはGP+am12パッケージ
ング細胞を集密濃度まで組織培養により増殖させる。次に、上記遺伝子を含有す
るMSVベクターを培地に添加して、ベクターをパッケージング細胞に形質導入す
る。こうすると、パッケージング細胞は、上記遺伝子を含有する感染性ウイルス
粒子を産生するようになる(この時点のパッケージング細胞は、プロデューサー
細胞と呼ばれる)。
【０８０３】 形質導入されたプロデューサー細胞に新たな培地を添加し、続いて、集密的な
プロデューサー細胞が含まれる10cmプレートから培地を取り出す。感染性ウイル
ス粒子を含有する使用済み培地をミリポアフィルターに通して濾過し、分離され
たプロデューサー細胞を除去する。そして次にこの培地を用いて繊維芽細胞に感
染させる。繊維芽細胞を有する半集密的プレートから培地を除去し、プロデュー
サー細胞からの培地とすばやく交換する。この培地を除去し、新たな培地と交換
する。ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての繊維芽細胞が感染している
であろうから、選択の必要はない。力価が非常に低い場合、neoまたはhisのよう
な選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。繊維芽
細胞に効率的に感染させた後、繊維芽細胞を分析してアルブミン融合タンパク質
が産生されるかどうかを調べる。
【０８０４】 次に、遺伝子工学的に操作された繊維芽細胞を、そのままでまたはcytodex 3
マイクロキャリアービーズ上で集密的になるまで増殖させた後で、宿主に移植す
る。
【０８０５】実施例18: in vivoでの遺伝子治療を用いる治療方法 本発明の他の態様は、障害、疾患および病的状態を治療するためにin vivoで
の遺伝子治療法を用いることである。遺伝子治療法は、本発明のアルブミン融合
タンパク質をコードする裸の核酸(DNA、RNAおよびアンチセンスDNAまたはRNA)配
列を動物に導入することに関連する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドは、標的組織によるポリペプチドの発現に必要なプロモ
ーターまたは任意の他の遺伝的エレメントに機能しうるように連結させる(すな
わち、結合する)ことが可能である。そのような遺伝子治療および送達の技術お
よび方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、次の文献を参照されたい。WO
90/11092, WO 98/11779; 米国特許第5693622号, 同第5705151号, 同第5580859
号; Tabata et al., Cardiovasc. Res. 35(3):470-479(1997); Chao et al., Ph
armacol. Res. 35(6):517-522(1997); Wolff, Neuromuscul. Disord. 7(5):314-
318(1997); Schwartz et al., Gene Ther. 3(5):405-411(1996); Tsurumi et at
., Circulation 94(12):3281-3290(1996) (参照により本明細書に組み入れられ
るものとする)。
【０８０６】 ポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方
法により、たとえば、組織(心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など)の間質空間へ
の注射により、送達することが可能である。ポリヌクレオチド構築物は、製薬上
許容される液体または水性キャリアー中に入れて送達することができる。
【０８０７】 「裸」のポリヌクレオチドDNAまたはRNAという用語は、ウイルス配列、ウイル
ス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈澱剤などの、細胞への進入
を支援、促進、または容易化するように作用するいかなる送達ビヒクルをも有し
てない配列を意味する。しかしながら、本発明のアルブミン融合タンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法により調製することのできる
リポソーム製剤(たとえば、Felgner P.L. et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 7
72:126-139およびAbdallah B. et al. (1995) Biol. Cell 85(1):1-7中で教示さ
れているもの)中に入れて送達することも可能である。
【０８０８】 遺伝子治療法で使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、
宿主ゲノム中に組み込まれずかつ複製を可能にする配列を含有しない構築物であ
る。DNAの発現を駆動するために、当業者に公知の任意の強力なプロモーターを
使用することができる。他の遺伝子治療技術と異なり、裸の核酸配列を標的細胞
に導入することの1つの主要な利点は、細胞中におけるポリヌクレオチド合成の
一過的な性質である。非複製性DNA配列を細胞に導入することにより所望のポリ
ペプチドの産生が最大6ヶ月間提供されることが研究から明らかになった。
【０８０９】 ポリヌクレオチド構築物を、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、
心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮
、直腸、神経系、眼、腺および結合組織を含む動物内の組織の間質空間に送達す
ることができる。組織の間質空間は、細胞間液；器官組織の細網繊維間、脈管も
しくは房室の壁中の弾性繊維間または繊維組織の膠原繊維間にムコ多糖マトリッ
クス；あるいは結合組織鞘膜保持筋肉細胞内または骨小腔中に同マトリックス、
を含有する。それは、同様に、循環系の血漿およびリンパ管のリンパ液により占
有された空間である。以下に述べた理由により、筋肉組織の間質空間への送達が
好ましい。これらの細胞を含む組織に注射することによりポリヌクレオチド構築
物を都合よく送達することが可能である。分化した永続的に非分裂性の細胞に送
達してそこで発現させることが好ましいが、たとえば血液の幹細胞や皮膚の繊維
芽細胞のような未分化または不完全分化細胞で送達および発現を行ってもよい。
in vivoの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込んで発現させる能力が特に大
きい。
【０８１０】 裸のポリヌクレオチドを注射する場合、DNAまたはRNAの有効投与量は、約0.05
g/kg体重から約50mg/kg体重までの範囲であろう。好ましくは、用量は、約0.005
mg/kgから約20mg/kgまで、より好ましくは約0.05mg/kgから約5mg/kgまでであろ
う。もちろん、当業者であればわかるであろうが、この用量は、注射対象の組織
部位によって変化するであろう。核酸配列の適切な有効用量は、当業者により容
易に決定することができ、治療対象の病的状態および投与経路に依存する可能性
がある。好ましい投与経路は、組織の間質空間に注射する非経口経路によるもの
である。しかしながら、他の非経口経路を使用してもよく、たとえば、特に、肺
もしくは気管支組織、咽頭または鼻の粘膜に送達するために、エーロゾル製剤の
吸入を行ってもよい。さらに、血管形成術を施す際、その処置に用いられるカテ
ーテルにより、裸のポリヌクレオチド構築物を動脈に送達することができる。
【０８１１】 in vivoで筋肉に注射されたポリヌクレオチドの用量応答効果は、次のように
決定される。本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAの産生に好
適な鋳型DNAを、標準的な組換えDNA法に従って調製する。環状であっても直鎖状
であってもよい鋳型DNAを、裸のDNAとして使用するかまたはリポソームと複合化
させる。次に、マウスの四頭筋に種々の量の鋳型DNAを注射する。
【０８１２】 0.3mlの2.5% Avertinを腹腔内注射することにより、5〜6週齢の雌および雄Bal
b/Cマウスに麻酔をかける。大腿前部に1.5cmの切開を行い、四頭筋を直接肉眼視
できるようにする。筋肉の遠位挿入部位から膝中に約0.5cm入った深さ約0.2cmの
位置に、1ccシリンジ内の0.1mlのキャリアー中に含まれる鋳型DNAを27ゲージ針
で1分間かけて注射する。あとで位置が特定されるように注射部位上で縫合を行
い、ステンレス鋼クリップで皮膚を閉鎖する。
【０８１３】 適切なインキュベーション時間(たとえば、7日間)の後、四頭筋全体を切除す
ることにより筋肉摘出物を調製する。それぞれの四頭筋の15μm横断切片を5片ご
とに組織化学的に染色してタンパク質発現を調べる。様々な時間に切除された別
々のマウスからの四頭筋を用いること以外は同様にして、融合タンパク質発現の
時間的経過を調べることも可能である。注射後の筋肉内でのDNAの持続性につい
ては、注射されたマウスおよび対照のマウスから全細胞DNAおよびHIRT上清を調
製した後、サザンブロット分析により調べることが可能である。マウスにおける
上記の実験の結果を用いて、ヒトおよび他の動物において裸のDNAを使用したと
きの適切な用量および他の治療パラメーターを推定することができる。
【０８１４】実施例19: トランスジェニック動物 本発明のアルブミン融合タンパク質は、トランスジェニック動物中で発現させ
ることもできる。トランスジェニック動物を作製するために、マウス、ラット、
ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ(micro-pig)、ヤギ、ヒツジ
、ウシ、ならびに非ヒト霊長類、たとえば、ヒヒ、サルおよびチンパンジーを含
めて任意の種の動物を使用することが可能であるが、これらに限定されるもので
はない。特定の実施形態では、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の方法
を用いて、遺伝子治療プロトコルの一部としてヒトにおいて本発明の融合タンパ
ク質を発現させる。
【０８１５】 本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物に導
入してトランスジェニック動物の創始者系統(founder line)を作製するために、
当技術分野で公知の任意の技術を使用することが可能である。そのような技術と
しては、前核マイクロインジェクション(Paterson et aL, Appl. Microbiol. Bi
otechnol. 40:691-698(1994); Carver et al., Biotechnology (NY) 11:1263-12
70(1993); Wright et al., Biotechnology (NY) 9:830-834(1991);およびHoppe
et al., 米国特許第4,873,191号(1989)); 生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺
伝子導入(Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152
(1985))、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子導入; 胚幹細胞におけ
る遺伝子ターゲッティング(Thompson et al., Cell 56:313-321(1989)); 細胞ま
たは胚のエレクトロポレーション(Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814(198
3)); 遺伝子銃を用いる本発明のポリヌクレオチドの導入(たとえば、Ulmer et a
l., Science 259:1745(1993)を参照されたい); 多能性胚幹細胞への核酸構築物
の導入および胚盤胞へのその幹細胞の戻し移入; ならびに精子媒介遺伝子導入(L
avitrano et al., Cell 57:717-723(1989);などが挙げられるが、これらに限定
されるものではない。このような方法の概説に関しては、Gordon,「トランスジ
ェニック動物(Transgenic Animals)」 Intl. Rev. Cytol. 115:171-229(1989)（
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする）を参照されたい。
【０８１６】 当技術分野で公知の任意の方法を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質
をコードするポリヌクレオチドを含有するトランスジェニッククローンを作製す
ることが可能であり、そのような方法としてはたとえば、静止期に誘導されてい
る培養された胚性細胞、胎児細胞、または成体細胞から核を除核した卵母細胞に
、核を移入すればよい(Campell et al., Nature 380:64-66 (1996); Wilmut et
al., Nature 385:810-813 (1997))。
【０８１７】 本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
をすべての細胞中に有するトランスジェニック動物、ならびにすべての細胞中で
はなく一部の細胞中にこれらのポリヌクレオチドを有する動物、すなわち、モザ
イク動物またはキメラ動物を提供する。トランスジーンは、単独のトランスジー
ンとして、または頭部-頭部タンデム、頭部-尾部タンデムなどのコンカテマーの
ような複数コピーとして、組み込むことが可能である。トランスジーンはまた、
たとえば、Laskoら(Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236(
1992))の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入して、そこで活性化させる
ことも可能である。そのような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、対象の
特定の細胞型に依存するであろう。またそうした調節配列は、当業者には自明で
あろう。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本発明の融
合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン部分に対応する内因性遺
伝子の染色体部位に組み込むことが望まれる場合は、遺伝子ターゲッティングが
好ましい。簡潔に述べると、そのような技術を利用する場合、染色体配列との相
同的組換えにより内因性遺伝子のヌクレオチド配列中に組み込んでその機能を破
壊する目的で、その内因性遺伝子に相同な何らかのヌクレオチド配列を含有する
ベクターをデザインする。トランスジーンはまた、たとえば、Guら(Gu et al.,
Science 265:103-106(1994))の教示に従うことにより、特定の細胞型に選択的に
導入して、その結果その細胞型においてだけ内因性遺伝子を不活性化することが
できる。そのような細胞型特異的不活性化に必要な調節配列は、対象の特定の細
胞型に依存するであろう。またそうした調節配列は、当業者には自明であろう。
【０８１８】 トランスジェニック動物が作製されたならば、標準的な技術を利用して組換え
遺伝子の発現をアッセイすることが可能である。サザンブロット分析またはPCR
法により最初のスクリーニングを行って動物組織を分析して、本発明の融合タン
パク質をコードするポリヌクレオチドの組込みが起こったことを確認することが
可能である。限定されるものではないが、動物から得られた組織サンプルのノー
ザンブロット分析、in situハイブリダイゼーション分析、逆転写酵素-PCR(rt-P
CR)などの技術を用いて、トランスジェニック動物の組織中における本発明の融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのmRNA発現のレベルを評価すること
も可能である。融合タンパク質発現組織のサンプルは、融合タンパク質に特異的
な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価することも可能であ
る。
【０８１９】 創始者動物が作製されれば、それらを交配、同系交配、異系交配、異種交配し
て、特定の動物のコロニーを作り出すことが可能である。そのような交配ストラ
テジーの例としては、たとえば、別個の系統を樹立するために、2ヶ所以上の組
込み部位を有する創始者動物を異系交配すること；それぞれのトランスジーンの
相加的発現の効果によってより高レベルでトランスジーンを発現する複合トラン
スジェニック動物を作製するために、別個の系統を同系交配すること；発現を増
大させてかつDNA分析による動物のスクリーニングの必要性をなくすべく、所与
の組込み部位に関してホモ接合である動物を作製するために、ヘテロ接合性トラ
ンスジェニック動物を交配すること；複合ヘテロ接合系統またはホモ接合系統を
作製するために、別個のホモ接合系統を交配すること；および、対象の実験モデ
ルに適した明確なバックグラウンドにトランスジーン(すなわち、本発明のアル
ブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド)が配置されるように、交
配することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０８２０】 本発明のトランスジェニック動物は、本発明の融合タンパク質ならびに本発明
の融合タンパク質の治療用タンパク質成分および／またはアルブミン成分の生物
学的機能を詳細に検討したり、正常でない発現に関連づけられる病的状態および
／または障害を調べたり、そのような病的状態および／または障害を改善するの
に有効な化合物をスクリーニングしたりするのに有用な動物モデル系を含む用途
を有するが、これらの用途に限定されるものではない。
【０８２１】実施例20: B細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ 機能的体液性免疫応答の生起は、B系列細胞とその微小環境との間の可溶性か
つコグネイトの両方のシグナリングを必要とする。シグナルは、B系列細胞のプ
ログラムされた発生を継続させる正の刺激を付与することもあれば、その現在の
発生経路を阻止するように細胞に指示する負の刺激を付与することもある。これ
までに、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL10、IL-13、IL-14およびIL-15を含
めて、多数の刺激性および抑制性シグナルがB細胞の応答性に影響を及ぼすこと
がわかっている。興味深いことに、これらのシグナルは、それ自体、弱いエフェ
クターであるが、種々の共刺激性タンパク質と一緒になって、B細胞集団の活性
化、増殖、分化、ホーミング、免疫寛容および死滅を引き起こすことができる。
【０８２２】 B細胞共刺激性タンパク質のうち最もよく研究されたクラスの1つは、TNFスー
パーファミリーである。このファミリーのうち、CD40、CD27、およびCD30は、そ
れらのそれぞれのリガンドCD154、CD70、およびCD153と一緒になって、さまざま
な免疫応答を調節することが判明している。これらのB細胞集団およびそれらの
前駆体の増殖および分化の検出および/または観測を可能にするアッセイは、種
々のタンパク質が増殖および分化に関してこれらのB細胞集団に及ぼしうる効果
を調べるうえで価値あるツールである。B細胞集団およびそれらの前駆体の分化
、増殖、または阻害の検出を可能にするようにデザインされた2つのアッセイを
以下に示す。
【０８２３】 in vitroアッセイ−B細胞集団およびそれらの前駆体の活性化、増殖、分化あ
るいは阻害および/または死滅を誘発する能力に関して、本発明のアルブミン融
合タンパク質(治療用タンパク質および/もしくはアルブミンの断片または変異体
あるいはアルブミンの断片または変異体を含有する融合タンパク質を含む)を評
価することができる。0.1から10,000ng/mLまでの用量範囲にわたり定性的に測定
される、精製済みヒト扁桃B細胞に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の
活性を、標準的なBリンパ球共刺激アッセイで評価する。このアッセイでは、精
製済み扁桃B細胞を、プライミング剤としてのホルマリン固定スタフィロコッカ
ス＝アウレウス＝コーワンI(Staphylococcus aureus Cowan I)（SAC）または固
定化された抗ヒトIgM抗体のいずれかの存在下で培養する。IL-2およびIL-15のよ
うな第2シグナルは、SACおよびIgM架橋と相乗作用して、トリチウム化チミジン
取り込みにより測定されるB細胞増殖を誘発する。新規な相乗剤は、このアッセ
イを用いて容易に同定することができる。アッセイには、CD3陽性細胞の磁性ビ
ーズ(MACS)枯渇によるヒト扁桃B細胞の単離が含まれる。得られる細胞集団は、C
D45R(B220)の発現により評価した場合、95%超のB細胞である。
【０８２４】 それぞれのサンプルの種々の稀釈液を96ウェルプレートの個々のウェルに入れ
、全容量150μlとなるように培養培地(10% FBS、5×10-5M 2ME、100U/mlペニシ
リン、10μg/mlストレプトマイシンおよび10-5稀釈のSACを含有するRPMI 1640)
中に懸濁された105個のB細胞をウェルに添加する。因子添加の72時間後に開始さ
れる3H-チミジン(6.7 Ci/mM)を用いた20時間パルス(1μCi/ウェル)により、増殖
または阻害を定量する。正および陰性対照は、それぞれIL2および培地である。
【０８２５】 in vivoアッセイ−緩衝剤のみまたは2mg/kgの本発明のアルブミン融合タンパ
ク質(治療用タンパク質および／もしくはアルブミンの断片または変異体あるい
はアルブミンの断片または変異体を含有する融合タンパク質を含む)を、BALB/c
マウスに1日2回注射する(腹腔内)。マウスがこの処置を4日連続して受けた時点
で、分析のためにマウスを屠殺して種々の組織および血清を採取する。正常な脾
臓と本発明のアルブミン融合タンパク質で処理された脾臓から得られたH&E切片
とを比較することにより、B細胞集団の分化および増殖の活性化を示していると
考えられる動脈周囲リンパ鞘の拡散および／または赤色髄領域の有核細胞性の著
しい増加のような脾臓細胞に対する前記融合タンパク質の活性の結果を同定する
。B細胞マーカーである抗CD45R(B220)を用いた免疫組織化学的研究を使用して、
脾臓組織崩壊のような脾臓細胞に対するなんらかの生理学的な変化が、樹立T細
胞領域に浸潤する境界の不明瞭なB細胞ゾーン内での増大されたB細胞提示が原因
であるかどうかを調べる。
【０８２６】 アルブミン融合タンパク質で処理されたマウスの脾臓のフローサイトメトリー
分析を用いることにより、アルブミン融合タンパク質がThB+, CD45R(B220)dull
B細胞の割合を対照マウス中で観測されるものを上回って特異的に増大させるか
どうかを調べる。
【０８２７】 同様に、in vivoにおいて増大された成熟B細胞提示から推定される結果は、血
清Ig力価の相対的増加である。したがって、血清IgMおよびIgAレベルを、緩衝剤
で処理されたマウスと融合タンパク質で処理されたマウスとの間で比較する。
【０８２８】 この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するもの
であった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレ
オチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるで
あろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０８２９】実施例21: T細胞増殖アッセイ PBMCについてCD3誘導増殖アッセイを行い、3H-チミジンの取り込みによる測定
を行う。アッセイは次のように行う。CD3に対するmAb(HIT3a、Pharmingen)また
はアイソタイプが一致した対照mAb(B33.1)を100μl/ ml用いて4℃で一晩かけて9
6ウェルプレートをコーティングし(.05M重炭酸塩緩衝液, pH9.5中、1μg/ml)、
次いでPBSで3回洗浄する。F/Hグラジエント遠心分離によりヒト末梢血からPBMC
を単離し、10% FCSおよびP/Sを含有するRPMI中に加えて、さまざまな濃度の本発
明のアルブミン融合タンパク質(治療用タンパク質および／もしくはアルブミン
の断片または変異体あるいはアルブミンの断片または変異体を含有する融合タン
パク質を含む)の存在下で(全容量200μl)、mAbでコーティングされたプレートの
四重反復試験ウェルに添加する(5×104/ウェル)。該当するタンパク質緩衝液お
よび培地単独が対照である。37℃で48時間培養した後、プレートを1000rpmで2分
間スピンして、100μlの上清を取り出し、増殖に対する影響が観測される場合に
は、それをIL-2(または他のサイトカイン)の測定のために-20℃で保存する。ウ
ェルに0.5μCiの3H-チミジンを含有する100μlの培地を添加し、37℃で18〜24時
間培養する。ウェルの内容物を回収し、3H-チミジンの取り込みを増殖の尺度と
して使用する。抗CD3単独が増殖に関する陽性対照である。増殖を促進する対照
として、IL-2(100U/ml)をも使用する。本発明の融合タンパク質の効果に対する
陰性対照として、T細胞の増殖を誘導しない対照抗体を使用する。
【０８３０】 この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するもの
であった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレ
オチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるで
あろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０８３１】実施例22: MHCクラスII、共刺激性および接着分子の発現ならびに単球および単
球由来ヒト樹状細胞の細胞分化に及ぼす本発明の融合タンパク質の効果 末梢血で見いだされる増殖性前駆体を増殖させることにより、樹状細胞を生成
する。すなわち、接着性PBMCまたは水簸単球画分を、GM-CSF(50ng/ml)およびIL-
4(20ng/ml)と共に7〜10日間培養する。これらの樹状細胞は、非成熟細胞の特徴
的表現型を有する(CD1、CD80、CD86、CD40およびMHCクラスII抗原の発現）。TNF
-αのような活性化因子で処理すると、表面表現型の急速な変化(MHCクラスIおよ
びII、共刺激性および接着分子の発現、FCγRIIのダウンレギュレーション、CD8
3のアップレギュレーション、の増加）が起こる。これらの変化は、抗原提示能
力の増加および樹状細胞の機能的成熟と関連する。
【０８３２】 表面抗原のFACS分析を次のように実施する。漸増濃度の本発明のアルブミン融
合タンパク質またはLPS(陽性対照)を用いて細胞を1〜3日間処理し、1% BSAおよ
び0.02mMアジ化ナトリウムを含有するPBSで洗浄し、次いで1:20希釈した適切なF
ITCまたはPE標識モノクローナル抗体と共に4℃で30分間インキュベートする。さ
らなる洗浄を行った後、標識された細胞をフローサイトメトリーによりFACScan(
Becton Dickinson)で分析する。
【０８３３】 サイトカインの産生に対する効果： 樹状細胞により生成されるサイトカイン
、特にIL-12は、T細胞依存性免疫応答の開始に重要である。IL-12は、Th1ヘルパ
ーT細胞免疫応答の生起に強く影響し、そして細胞傷害性TおよびNK細胞機能を誘
導する。ELISAを用いて、次のようにIL-12放出を測定する。漸増濃度の本発明の
アルブミン融合タンパク質を用いて樹状細胞(106/ml)を24時間処理する。陽性対
照として細胞培養物にLPS(100ng/ml)を添加する。次に、細胞培養物からの上清
を採取し、そして市販のELISAキット(例えば、R&D Systems(Minneapolis,MN))を
用いてIL-12含量について分析する。キットに提供されている標準的なプロトコ
ルを用いる。
【０８３４】 MHCクラスII、共刺激性分子および接着分子の発現に対する効果： 細胞表面
抗原の3つの主要なファミリー、すなわち、接着分子、抗原提示に関与する分子
、およびFc受容体を、単球上で同定することができる。MHCクラスII抗原および
他の共刺激性分子、たとえば、B7およびICAM-1の発現がモジュレートされると、
単球の抗原提示能力およびT細胞活性化を誘導する能力が結果として変化する可
能性がある。Fc受容体の発現の増大は、単球の細胞傷害活性、サイトカイン放出
および食作用の改善と相関しうる。
【０８３５】 次のようにFACS分析を用いて表面抗原を調べる。漸増濃度の本発明のアルブミ
ン融合タンパク質またはLPS(陽性対照)を用いて単球を1〜5日間処理し、1% BSA
および0.02mMアジ化ナトリウムを含有するPBSで洗浄し、次いで1:20希釈の適切
なFITCまたはPE標識モノクローナル抗体と共に4℃で30分間インキュベートする
。さらなる洗浄を行った後、標識された細胞をフローサイトメトリーによりFACS
can(Becton Dickinson)で分析する。
【０８３６】 単球の活性化および/または増大された生存： 単球を活性化する(もしくは不
活化する)および/または単球の生存を増大させる(もしくは単球生存を低下させ
る)分子のアッセイは、当該技術分野で公知であり、本発明の分子が単球のイン
ヒビターまたはアクチベーターとして機能するかを調べるために慣用的に適用し
うる。本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下に記載の3つのアッセイを用
いてスクリーニングすることができる。これらのアッセイのそれぞれで、Histop
aque勾配(Sigma)を通した遠心分離により単一のdonor leukopack(American Red
Cross, Baltimore, MD)から末梢血単核細胞(PBMC)を精製する。向流遠心水簸に
よりPBMCから単球を単離する。
【０８３７】 単球生存アッセイ： ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激物の不在下で培
養した場合、次第に生存能力を失う。それらの死は、内的に調節された過程(ア
ポトーシス)から生じる。活性化因子、たとえばTNF-αを培養物に添加すると、
細胞の生存は劇的に改善され、DNAの断片化が防止される。ヨウ化プロピジウム(
PI)染色を用いて、次のようにアポトーシスを調べる。ポリプロピレンチューブ
内の無血清培地(陽性対照)中、100ng/ml TNF-α(陰性対照)の存在下かつ試験さ
れる種々の濃度の融合タンパク質の存在下で、単球を48時間培養する。5μg/ml
の最終濃度でPIを含有するPBS中に2×106/mlの濃度で細胞を懸濁させ、次いで室
温で5分間インキュベートしてからFACScan分析にかける。PI取り込みは、この試
験状況でDNAの断片化と相関することがわかっている。
【０８３８】 サイトカイン放出に対する効果： 単球/マクロファージの重要な機能は、刺
激後のサイトカイン放出を介した免疫系の他の細胞集団に対する調節活性である
。サイトカイン放出を測定するためにELISAを次のように実施する。漸増濃度の
本発明のアルブミン融合タンパク質と共に、および同一条件下であるが該融合タ
ンパク質の不在下で、ヒト単球を5×105細胞/mlの濃度でインキュベートする。I
L-12産生を調べるために、前記融合タンパク質の存在下でIFN(100U/ml)を用いて
細胞を一晩プライミングする。次いで、LPS(10ng/ml)を添加する。24時間後、馴
化培地を採取して使用するまで凍結保存する。その後、市販のELISAキット(たと
えば、R&D Systems(Minneapolis, MN))を用いてかつキットに提供されている標
準的プロトコルを適用して、TNF-アルファ、IL-10、MCP-1およびIL-8の測定を行
う。
【０８３９】 酸化的バースト： 精製済みの単球を96ウェルプレートに2〜1×105細胞/ウェ
ルでプレーティングする。漸増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を、ウ
ェルの全容量0.2mlの培養培地(RPMI 1640 + 10% FCS、グルタミンおよび抗生物
質)中に添加する。3日間インキュベートした後、プレートを遠心分離にかけて、
ウェルから培地を取り出す。マクロファージの単層に、1ウェルあたり0.2mlのフ
ェノールレッド溶液(140mM NaCl、10mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0、5.5mMデキ
ストロース、0.56mMフェノールレッドおよび19U/mlのHRPO)を刺激物質(200nM PM
A)と共に添加する。プレートを37℃で2時間インキュベートし、そして1ウェルあ
たり20μlの1N NaOHを添加することにより反応を停止させる。610nmで吸光度を
読み取る。マクロファージにより生成されたH2O2の量を計算するために、既知の
モル濃度のH2O2溶液の標準曲線をそれぞれの実験に適用する。
【０８４０】 この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するもの
であった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質またはポリヌクレ
オチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるで
あろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０８４１】実施例23: 本発明の融合タンパク質の生物学的効果 星状細胞およびニューロンアッセイ 皮質ニューロン細胞の生存、神経突起伸長、または表現型分化を促進する活性
に関して、およびグリア繊維酸性タンパク質免疫陽性細胞である星状細胞の増殖
の誘導に関して、本発明のアルブミン融合タンパク質を試験することができる。
バイオアッセイに用いる皮質細胞の選択は、皮質構造中でのFGF-1およびFGF-2の
優勢な発現ならびに既に報告されているFGF-2処理から生じる皮質ニューロン生
存の増強に基づく。たとえば、チミジン取り込みアッセイを用いて、これらの細
胞に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を解明することができる。
【０８４２】 さらに、in vitroにおける皮質または海馬ニューロンに対するFGF-2(塩基性FG
F)の生物学的効果を記載した既報により、ニューロン生存および神経突起伸長の
両方の増大が実証されている(Walicke et al.,「繊維芽細胞増殖因子は分離され
た海馬ニューロンの生存を促進し、神経突起伸長を増強する」Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 83:3012-3016(1986)、参照によりその全体が本明細書に組み入れら
れるアッセイ)。しかしながら、PC-12細胞で行われた実験の報告からは、これら
の2つの応答が、必ずしも同義的なものでないこと、およびどのFGFが試験されて
いるかだけでなくどの受容体が標的細胞で発現されるかにも依存しうることが示
唆される。皮質ニューロン初代培養パラダイムを用いれば、本発明のアルブミン
融合タンパク質が神経突起伸長を誘導する能力を、たとえばチミジン取り込みア
ッセイを用いて、FGF-2で得られた応答と比較することができる。
【０８４３】 繊維芽細胞および内皮細胞アッセイ ヒト肺繊維芽細胞をClonetics(San Diego, CA)から入手し、そしてClonetics
製の増殖培地中で保持する。真皮微小血管内皮細胞をCell Applications(San Di
ego, CA)から入手する。増殖アッセイのために、ヒト肺繊維芽細胞および真皮微
小血管内皮細胞を、96ウェルプレートの増殖培地中、5,000細胞/ウェルで1日培
養すればよい。次いで、0.1% BSA基本培地中で細胞を1日インキュベートする。
培地を新たな0.1% BSA培地と交換した後、本発明のタンパク質の試験融合タンパ
ク質と共に細胞を3日間インキュベートする。Alamar Blue(Alamar Biosciences,
Sacramento, CA)を10%の最終濃度になるように各ウェルに添加する。細胞を4時
間インキュベートする。CytoFluor蛍光リーダーで読み取ることにより細胞生存
能力を測定する。PGE2アッセイのために、96ウェルプレート中、5,000細胞/ウェ
ルでヒト肺繊維芽細胞を1日培養する。培地を0.1% BSA基本培地と変換した後、I
L-1αを用いてまたは用いずにFGF-2または本発明の融合タンパク質と共に細胞を
24時間インキュベートする。上清を採取し、そしてEIAキット(Cayman, Ann Arbo
r, MI)によりPGE2に関してアッセイする。IL-6アッセイのために、96ウェルプレ
ート中、5,000細胞/ウェルでヒト肺繊維芽細胞を1日培養する。培地を0.1% BSA
基本培地と変換した後、FGF-2と共にまたは本発明のアルブミン融合タンパク質
および／またはIL-1αと共にまたはそれを用いずに、細胞を24時間インキュベー
トする。上清を採取し、そしてELISAキット(Endogen, Cambridge, MA)によりIL-
6に関してアッセイする。
【０８４４】 ヒト肺繊維芽細胞をFGF-2または本発明のアルブミン融合タンパク質と共に基
本培地中で3日間培養した後、Alamar Blueを添加して繊維芽細胞の増殖に対する
効果を評価する。FGF-2は、10〜2500ng/mlで刺激を示すはずであり、この値を本
発明の融合タンパク質による刺激と比較することができる。
【０８４５】 [3H]チミジン取り込みに基づく細胞増殖 次の[3H]チミジン取り込みアッセイを用いて、繊維芽細胞、上皮細胞または未
熟筋肉細胞のような細胞の増殖に対する増殖因子タンパク質などの治療用タンパ
ク質の効果を測定することができる。
【０８４６】 無血清培地中で18時間インキュベートすることにより、半集密的培養物をG1期
で停止させる。次に、治療用タンパク質を24時間にわたり添加し、その最後の4
時間で、培養物を0.33μMの最終濃度の[3H]チミジン(25Ci/mmol, Amersham, Arl
ington Heights, IL)で標識する。組み込まれた[3H]チミジンを氷冷された10%ト
リクロロ酢酸で24時間かけて沈澱させる。続いて、氷冷された10%トリクロロ酢
酸で、次いで氷冷水で、連続的に細胞をすすぐ。0.5M NaOH中で溶解させてから
、溶解物およびPBSリンス(500ml)をプールして、放射活性の量を測定する。
【０８４７】 パーキンソンモデル パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特性
づけされたパーキンソン病の動物モデルは、1-メチル-4フェニル1,2,3,6-テトラ
ヒドロピリジン(MPTP)の全身的投与を伴う。CNSの場合、MPTPは、星状細胞に取
り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼBにより1-メチル-4-フェニルピリジン
(MPP+)に異化され、そして放出される。続いて、MPP+は、ドーパミンの高親和性
再取り込みトランスポーターによりドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積
される。次いで、MPP+は、電気化学的勾配によりミトコンドリア中に濃縮され、
そしてニコチン酸アミドアデニン二リン酸:ユビキノン酸化還元酵素(複合体I)を
選択的に阻害することにより、電子伝達を妨害して最終的に酸素ラジカルを生成
する。
【０８４８】 FGF-2(塩基性FGF)は黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活性を有する
ことが組織培養状況で実証されている(Ferrari et al., Dev. Biol. 1989)。最
近、Unsicker博士のグループは、ゲル形態インプラントとしてFGF-2を線条体に
投与すると、MPTP曝露に関連づけられる毒性から黒質のドーパミン作動性ニュー
ロンがほぼ完全に保護されることを実証した(Otto and Unsicker, J. Neuroscie
nce, 1990)。
【０８４９】 FGF-2で得られたデータに基づいて、本発明のアルブミン融合タンパク質を評
価し、in vitroにおけるドーパミン作動性ニューロンの生存を増強するFGF-2の
作用と類似の作用を有するかどうかを調べることができ、さらにまた、線条体に
おいてMPTP処理に関連づけられる損傷からドーパミン作動性ニューロンを保護す
ることに関してin vivoで試験することができる。ドーパミン作動性ニューロン
細胞培養状況において本発明のアルブミン融合タンパク質の潜在的効果を最初に
in vitroで試験する。妊娠14日目のWisterラット胚由来の中脳底板を切り取るこ
とにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そしてポリオルニチ
ン-ラミニンでコーティングされたカバーガラス上に200,000細胞/cm2の密度で接
種する。ホルモン添加物(NI)を含有するDulbecco改変Eagle培地およびF12培地中
で細胞を保持する。8日後、パラホルムアルデヒドにより培養物をin vitroで固
定し、そしてドーパミン作動性ニューロンに対する特異的マーカーであるチロシ
ンヒドロキシラーゼの免疫組織化学的染色のための処理を施す。胎児期ラットか
ら解離細胞培養物を調製する。培養培地を3日ごとに交換し、因子もその時点で
添加する。
【０８５０】 ドーパミン作動性前駆細胞が増殖する段階を過ぎている発生時期である妊娠14
日目にドーパミン作動性ニューロンを動物から単離するので、チロシンヒドロキ
シラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、in vitroで生存するドーパミン作動
性ニューロンの数の増加を表すであろう。したがって、治療用タンパク質がドー
パミン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、前記融合タン
パク質がパーキンソン病に関与しうることが示唆されよう。
【０８５１】 この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試
験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質および
ポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変すること
ができるであろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０８５２】実施例24: 血管内皮細胞の増殖に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の効 果 1日目、4%ウシ胎仔血清(FBS)、16ユニット/mlヘパリン、および50ユニット/ml
内皮細胞増殖添加物(ECGS, Biotechnique, Inc.)を含有するM199培地中に、2〜5
×104細胞/35mmディッシュの濃度でヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を接種する。2日
目、培地を、10% FBS、8ユニット/mlヘパリンを含有するM199と置換する。本発
明のアルブミン融合タンパク質および陽性対照、たとえば、VEGFおよび塩基性FG
F(bFGF)を種々の濃度で添加する。4日目および6日目、培地を置換する。8日目、
Coulter Counterを用いて細胞数を測定する。
【０８５３】 HUVEC細胞数の増加は、前記融合タンパク質が血管内皮細胞を増殖させうるこ
とを示し、一方、HUVEC細胞数の減少は、前記融合タンパク質が血管内皮細胞を
阻害することを示す。
【０８５４】 この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試
験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質および
ポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変すること
ができるであろう。
【０８５５】実施例25: ラット角膜創傷治癒モデル この動物モデルは、新血管形成に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の
効果を示す。実験プロトコルは、以下を含む。
【０８５６】 角膜の中心から間質層へ1〜1.5mmの長さの切開を行う。
【０８５７】 眼の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する。
【０８５８】 ポケットを作る(その底面は眼の縁から1〜1.5mmである)。
【０８５９】 50ng〜5μgの本発明のアルブミン融合タンパク質を含むペレット剤を、ポケッ
ト内に配置する。
【０８６０】 本発明のアルブミン融合タンパク質を用いる治療は、20mg〜500mgの用量範囲
で角膜創傷に局所的に適用することもできる(5日間毎日治療)。
【０８６１】 この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試
験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質および
ポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変すること
ができるであろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０８６２】実施例26: 糖尿病マウスおよびグルココルチコイド障害性創傷治癒モデル 糖尿病のdb+/db+マウスモデル 本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒過程を促進することを実証するため
に、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを使用する。db+/db+マウスにおける
全層創傷治癒モデルは、障害性創傷治癒の十分に特性づけられた臨床的に関連す
る再現性のあるモデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮に依存するのではな
く肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する(Gartner, M.H. et al., J. Surg
. Res. 52:389(1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235(19
90))。
【０８６３】 糖尿病動物は、II型真性糖尿病で観察される特徴的特性の多くを有する。ホモ
接合性(db+/db+)マウスは、それらの正常なヘテロ接合性(db+/+m)同腹仔と比較
して肥満である。突然変異体糖尿病(db+/db+)マウスは、第4染色体上に単一の常
染色体劣性突然変異(db+)を有する(Colemanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:283
-293(1982))。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。突然変異体糖尿
病マウス(db+/db+)は、上昇した血中グルコース、増加したかまたは正常なイン
スリンレベル、および抑制された細胞媒介免疫を示す(Mandel et al., J.Immuno
l. 120:1375(1978); Debray-Sachs,M. et at.,Clin.Exp.Immunol.51(1):1-7(198
3); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114:46-55(1985))。末梢神経障害、心
筋合併症、および微小血管病変、基底膜肥厚、および糸球体濾過異常が、これら
の動物で報告されている(Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83(2):221-232(198
4); Robertson et al., Diabetes 29(1):60-67(1980); Giacomelli et al., Lab
Invest. 40(4):460-473(1979); Coleman, D.L., Diabetes 31(Suppl):1-6(1982
))。これらのホモ接合性糖尿病マウスは、ヒトII型糖尿病に類似したインスリン
耐性のある高血糖症を発症する(Mandel et al., J. Immunol. 120:1375-1377(19
78))。
【０８６４】 これらの動物で観察される特徴から、このモデルにおける治癒は、ヒト糖尿病
で観察される治癒に類似している可能性があることがわかる(Greenhalgh, et al
., Am. J. of Pathol. 136: 1235-1246(1990))。
【０８６５】 遺伝的糖尿病の雌C57BL/KsJ(db+/db+)マウスおよびそれらの非糖尿病(db+/+m)
へテロ接合性同腹仔を、この研究で用いる(Jackson Laboratories)。これらの動
物は6週齢で購入し、研究の開始時は8週齢である。動物を個別に収容し、そして
自由に食物と水を与える。すべての操作を、無菌技法を用いて行う。実験は、Hu
man Genome Sciences, Inc.の「Institutional Animal Care and Use Committee
and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals」の規則お
よび指針に従って行う。
【０８６６】 既報の方法に従って創傷プロトコルを実施する(Tsuboi, R. and Rifkin, D .
B., J. Exp. Med. 172:245-251(1990))。簡潔に述べると、創傷を行う日に、脱
イオン水に溶解したAvertin(0.01mg/mL)、2,2,2-トリブロモエタノールおよび2-
メチル-2-ブタノールを腹腔内注射することにより、動物を麻酔する。動物の背
面領域を剃毛し、そして70%エタノール溶液およびヨードで皮膚を洗浄する。手
術領域を滅菌ガーゼで拭ってから創傷させる。次いで、Keyes組織パンチを用い
て8mmの全層創傷を形成する。創傷させた直後、創傷の拡大を止めるように周囲
の皮膚を穏やかに伸ばす。実験の間、創傷は開放したままにしておく。治療剤の
適用は、創傷日から開始して5日間連続で局所的に行う。処置の前に、滅菌生理
食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに創傷を洗浄する。
【０８６７】 手術日およびその後2日間隔で、創傷を目視検査し、固定距離で写真撮影する
。1〜5日目の毎日および8日目に測定を行って、創傷閉鎖を判定する。目盛り付
きJamesonカリパスを用いて水平方向および垂直方向に創傷を測定する。肉芽組
織がもはや肉眼で見えずかつ創傷が連続した上皮で覆われている場合、創傷は治
癒したとみなされる。
【０８６８】 1日あたり創傷ごとに4mgから500mgまでの範囲のさまざまな用量で本発明のア
ルブミン融合タンパク質をビヒクルに加えて8日間にわたり投与する。ビヒクル
対照グループには、50mLのビヒクル溶液を与えた。
【０８６９】 8日目にペントバルビタールナトリウム(300mg/kg)を腹腔内注射して動物を安
楽死させる。次いで、組織学的および免疫組織化学的に調べるために、創傷およ
び周囲の皮膚を採取する。さらなる処理に付すべく、生検スポンジ間の組織カセ
ット内の10%中性緩衝化ホルマリン中に組織標本を入れる。
【０８７０】 それぞれ10匹の動物(5匹は糖尿病であり、5匹は糖尿病でない対照である)を含
む3つのグループ、すなわち、1)ビヒクルプラセボ対照、2)非処置グループ、お
よび3)処置グループを評価する。
【０８７１】 垂直軸および水平軸で面積を測定して創傷の合計面積を求めることにより、創
傷閉鎖を解析する。次いで、最初の創傷面積(0日目)と処置後の創傷面積(8日目)
との差を求めることにより、縮小を評価する。1日目の創傷面積は64mm2であり、
これは皮膚パンチのサイズに対応する。計算は次式を用いて行う。 [8日目の開放面積]-[1日目の開放面積]/[1日目の開放面積]
【０８７２】 10%緩衝化ホルマリン中で標本を固定し、そしてパラフィン包埋塊を創傷表面
に対して垂直方向に切片を切り出し(5mm)、そしてReichert-Jungミクロトームを
用いて切断する。二等分された創傷の横断切片に対して、慣用的なヘマトキシリ
ン-エオシン(H&E)染色を行う。創傷の組織学的検査を用いて、治癒過程および修
復された皮膚の形態学的外観が、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いた処
置によって変化したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛
細血管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含むものであ
った(Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990))。目盛り付
きレンズマイクロメーターが盲検観察者により使用される。
【０８７３】 組織切片にはまた、ABC Elite検出システムを使用してポリクローナルウサギ
抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色を施す。ヒト皮膚を陽性組織対照と
して使用し、一方、非免疫IgGを陰性対照として使用する。目盛り付きレンズマ
イクロメーターを用いて創傷の再上皮形成の程度を評価することにより、ケラチ
ノサイト増殖を判定する。
【０８７４】 ABC Elite検出システムで抗PCNA抗体(1:50)を使用することにより、皮膚標本
中の増殖細胞核抗原/サイクリン(PCNA)を実証する。ヒト大腸癌は、陽性組織対
照としての役割を果たし、そしてヒト脳組織は、陰性組織対照として使用される
。各標本は、一次抗体の欠落および非免疫マウスIgGとの置換を有する切片を含
んでいた。これらの切片のランクづけは、増殖の程度に基づいて、わずかな増殖
を反映するスケールのより低い側から、激しい増殖を反映するより高い側まで0
〜8のスケールで行われる。
【０８７５】 片側t検定を用いて実験データを解析する。<0.05のp値は、有意であるとみな
される。
【０８７６】 ステロイド障害性ラットモデル ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のin vitroおよびin vivo系で詳細
に報告されている(Wahl, Glucocorticoids and Wound healing. In: Anti-Infla
mmatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahl
et al., J. Immunol. 115: 476-481(1975); Werb et al., J. Exp. Med. 147:1
684-1694(1978))。グルココルチコイドは、血管形成を阻害すること、血管透過
性(Ebert et al., An. Intern. Med. 37:701-705(1952))、繊維芽細胞増殖、お
よびコラーゲン合成(Beck et al., Growth Factors. 5: 295-304(1991); Haynes
et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797(1978))を低下させること、ならびに循
環性単球の一過的減少を生じること(Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703
-797(1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", In: Antiinflammat
ory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York
, pp.280-302(1989))によって創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対する
ステロイドの全身的投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である(Beck
et al., Growth Factors. 5: 295-304(1991); Haynes et al., J. Clin. Invest
. 61: 703-797(1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", In: Anti
inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press,
New York, pp. 280-302(1989); Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 2229-2233(1989))。
【０８７７】 本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒過程を促進しうることを実証するた
めに、治癒がメチルプレドニゾロンの全身的投与により損なわれたラットにおい
て全層切除皮膚創傷に対する融合タンパク質の複数回の局所適用の効果を評価す
る。
【０８７８】 体重250〜300gの若年成体の雄Sprague Dawleyラット(Charles River Laborato
ries)を、この実験に用いる。動物は、8週齢で購入し、研究の開始時は9週齢で
ある。ラットの治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身的投与
(17mg/kg/ラット、筋肉内)により損なわれる。動物を個別に収容し、そして自由
に食物と水を与える。すべての操作を、無菌技法を用いて行う。この研究は、Hu
man Genome Sciences,Inc.の「Institutional Animal Care and Use Committee
and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals」の規則お
よび指針に従って行う。
【０８７９】 創傷プロトコルは、上記のプロトコルに準じる。創傷を行う日に、ケタミン(5
0mg/kg)およびキシラジン(5mg/kg)を筋肉内注射することにより、動物を麻酔す
る。動物の背面領域を剃毛し、そして70%エタノールおよびヨード溶液で皮膚を
洗浄する。手術領域を滅菌ガーゼで拭ってから創傷させる。Keyes組織パンチを
用いて8mmの全層創傷を形成する。実験の間、創傷を開放したままにしておく。
試験物質の適用は、創傷させ、続いてメチルプレドニゾロンを投与した日から開
始して、1日1回、7日間連続で、局所的に行う。処置の前に、滅菌生理食塩水お
よびガーゼスポンジを用いて穏やかに創傷を洗浄する。
【０８８０】 創傷を行う日および処置終了時に、創傷を目視検査し、固定距離で写真撮影す
る。1〜5日目の毎日および8日目に測定を行って、創傷閉鎖を判定する。目盛り
付きJamesonカリパスを用いて水平方向および垂直方向に創傷を測定する。肉芽
組織がもはや肉眼で見えずかつ創傷が連続した上皮で覆われている場合、創傷は
治癒したとみなされる。
【０８８１】 1日あたり創傷ごとに4mgから500mgまでの範囲のさまざまな用量で本発明の融
合タンパク質をビヒクルに加えて8日間にわたり投与する。ビヒクル対照グルー
プには、50mLのビヒクル溶液を与えた。
【０８８２】 8日目にペントバルビタールナトリウム(300mg/kg)を腹腔内注射して動物を安
楽死させる。次いで、組織学的に調べるために、創傷および周囲の皮膚を採取す
る。さらなる処理に付すべく、生検スポンジ間の組織カセット内の10%中性緩衝
化ホルマリン中に組織標本を入れる。
【０８８３】 それぞれ10匹の動物(5匹はメチルプレドニゾロンで処置し、5匹はグルココル
チコイドで処置しない)を含む3つのグループ、すなわち、1)非処置グループ、2)
ビヒクルプラセボ対照、および3)処置グループを評価する。
【０８８４】 垂直軸および水平軸で面積を測定して創傷の合計面積を求めることにより、創
傷閉鎖を解析する。次いで、最初の創傷面積(0日目)と処置後の創傷面積(8日目)
との差を求めることにより、閉鎖を評価する。1日目の創傷面積は64mm2であり、
これは皮膚パンチのサイズに対応する。計算は次式を用いて行う。 [8日目の開放面積]-[1日目の開放面積]/[1日目の開放面積]
【０８８５】 10%緩衝化ホルマリン中で標本を固定し、そしてパラフィン包埋塊を創傷表面
に対して垂直方向に切片を切り出し(5mm)、そしてOlympusミクロトームを用いて
切断する。二等分された創傷の横断切片に対して、慣用的なヘマトキシリン-エ
オシン(H&E)染色を行う。創傷の組織学的検査により、治癒過程および修復され
た皮膚の形態学的外観が、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いた処置によ
って改善されたかどうかを評価することができる。目盛り付きレンズマイクロメ
ーターが、創傷の切れ目の距離を測定するために盲検観察者により使用される。
【０８８６】 片側t検定を用いて実験データを解析する。<0.05のp値は、有意であるとみな
される。
【０８８７】 この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試
験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質および
ポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変すること
ができるであろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０８８８】実施例27: リンパ浮腫動物モデル この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成およびリンパ
循環系の再確立における本発明のアルブミン融合タンパク質の治療効果を試験す
るための適切かつ一貫したリンパ浮腫モデルを作製することである。有効性は、
罹患した肢の腫脹体積、リンパ管構造の量の定量、総血漿タンパク質、および組
織病理学により測定される。急性リンパ浮腫は、7〜10日間観察される。おそら
く、より重要なことには、浮腫の慢性進行は、3〜4週間まで続く。
【０８８９】 手術を始める前に、タンパク質濃度分析のために血液サンプルを採取する。体
重約350gの雄ラットにペントバルビタールを投与する。続いて、右肢を膝から股
関節部まで剃毛する。剃毛した範囲を、70% EtOHに浸したガーゼで払拭する。血
清全タンパク質試験のために血液を採取する。周径および体積を測定してから2
つの測定レベル(踵の0.5cm上、足背の中間点)に印をつけ、その後、足に色素を
注射する。右足背および左足背の両方の皮内に、0.05mlの1% Evan's Blueを注射
する。次に、足への色素注射に続いて、周径および体積の測定を行う。
【０８９０】 目印として膝関節を用いて、大腿血管の位置が確認できるように中肢鼡径部に
周囲状に切開を行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開して分離する。
大腿血管の位置を確認した後、血管の側面に沿って血管の下を走るリンパ管の位
置を確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を電気的に凝固または縫合糸
結紮する。
【０８９１】 顕微鏡を用いて、肢の背部の筋肉(半腱様筋および内転筋の付近)を平滑に切開
する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認する。次に、2つの近位リンパ管およ
び2つの遠位リンパ管ならびに膝窩節の遠位血液供給部を縫合糸により結紮する
。次いで、結合組織を切断することによって、膝窩リンパ節および任意の付随す
る脂肪組織を切り取る。
【０８９２】 この手順により生じるいかなる軽度の出血をも抑制するように留意すること。
リンパ管を閉塞させた後、液状皮膚(Vetbond)(AJ Buck)を用いることによって、
皮膚弁をシールする。解離した皮膚縁は、脚の周囲に約0.5cmの間隙を残した状
態で、その下の筋肉組織へシールする。皮膚はまた、必要なときにその下の筋肉
に縫合することによって係留しうる。
【０８９３】 感染を防ぐために、金網を用いて動物を個別に収容する(床敷きなし)。最適な
浮腫ピークを通過して、回復中の動物を毎日チェックする。このピークは、通常
は5〜7日以内に生じる。次いで、プラトー浮腫ピークを観察する。リンパ浮腫の
強度を評価するために、各肢の2つの指定部位の周径および体積を手術前および7
日間毎日測定する。リンパ浮腫に対する血漿タンパク質の効果を調べ、そしてタ
ンパク質分析が有用な試験周界であるかどうかもまた検査する。対照肢および浮
腫肢の両方の重量を2部位について評価する。分析は盲検方式で行う。
【０８９４】 周径測定：肢の動きを阻止するための短時間のガス麻酔のもとで、布巻尺を使
用して、肢の周径を測定する。2人の異なる人物により距骨および足背で測定を
行い、次いで、これらの2つの読み取り値を平均する。対照肢および浮腫肢の両
方から読み取る。
【０８９５】 体積測定：手術日にペントバルビタールで動物を麻酔し、そして手術の前に試
験する。毎日の体積測定のために、動物を短時間ハロタン麻酔(迅速な不動化お
よびすばやい回復)の下におき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカーを用
いて脚に同等に印をつける。最初に脚を水に漬け、次いでそれぞれの印をつけた
レベルまで装置内に浸漬し、次いでBuxco浮腫ソフトウェア(Chen/Victor)によっ
て測定する。一人の人物がデータを記録し、もう一人の人物が、印をつけた領域
まで脚を浸漬させる。
【０８９６】 血液-血漿タンパク質測定：手術前に採血し、遠心分離し、そして血清を分離
し、その後手術を行い、最終的には、全タンパク質およびCa2+の比較を行う。
【０８９７】 肢重量比較：採血した後、この動物に対して組織収集のための準備を行う。キ
リチン(quillitine)を用いて肢を切断し、次いで、実験脚と対照脚の両方を結紮
線で切断し、重量を測定する。2回目の秤量は、脛踵の関節を外した状態で行い
、足の重量を測定する。
【０８９８】 組織学的調製物：膝(膝窩)領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金型
中に配置し、freezeGelで満たし、冷却メチルブタンに浸漬し、切片化するまで-
80ECにてラベルつきサンプルバッグに入れておく。切片化の際、蛍光顕微鏡下で
リンパ管に関して筋肉を観察する。
【０８９９】 この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するもの
であった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレ
オチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるで
あろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０９００】実施例28: 本発明のアルブミン融合タンパク質によるTNFα誘導性接着分子発現
の抑制 炎症および血管形成の領域へのリンパ球の動員には、リンパ球上の細胞表面接
着分子(CAM)と血管内皮との間の特異的な受容体-リガンド相互作用が関与する。
接着過程は、通常の環境および病理学的環境のいずれにおいても、内皮細胞(EC)
上での細胞間接着分子-1(ICAM-1)、血管細胞接着分子-1(VCAM-1)、および内皮白
血球接着分子-1(E-セレクチン)の発現を含む多段階カスケードに従う。血管内皮
上でのこれらの分子および他の分子の発現は、白血球が局所血管構造に接着して
炎症応答の生起の際に局所組織中に血管外溢出しうる効率を決定する。サイトカ
インおよび増殖因子の局所濃度は、これらのCAMの発現のモジュレートに関与す
る。
【０９０１】 強力な前炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α(TNF-a)は、内皮細胞にお
ける3種すべてのCAMの刺激因子であり、多種多様な炎症応答に関与する可能性が
あり、しばしば、病的状態を引き起こす。
【０９０２】 TNF-a誘導性CAM発現の抑制を媒介する本発明のアルブミン融合タンパク質の能
力を調べることができる。固相吸着剤としてECを使用する改変型ELISAアッセイ
を利用して、FGFファミリーのタンパク質のメンバーを用いて共刺激したときのT
NF-a処理ECにおけるCAM発現の量を測定することができる。
【０９０３】 この実験を行うために、プールした臍帯採取物からヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC
)培養物を取得し、5% CO2を含む37℃の加湿インキュベーター内の、10% FCSおよ
び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した増殖培地(EGM-2; Clonetics, Sa
n Diego, CA)中に、保持する。96ウェルプレートのEGM培地中に1×104細胞/ウェ
ルの濃度でHUVECを接種し、37℃で18〜24時間または集密状態になるまで置く。
続いて、100U/mlペニシリンおよび100mg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI-
1640の無血清溶液で単層を3回洗浄し、そして所定のサイトカインおよび/または
増殖因子を用いて37℃で24時間処理する。インキュベーション後、続いて、CAM
発現に関して細胞を評価する。
【０９０４】 標準的な96ウェルプレートでヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を集密状態になるま
で増殖させる。細胞から増殖培地を取り除き、そして90μlの199培地(10%FBS)に
置き換える。試験用サンプルおよび正または陰性対照を3重反復試験方式でプレ
ートに添加する(10μl容量)。プレートを37℃で5時間(セレクチンおよびインテ
グリン発現)または24時間(インテグリン発現のみ)のいずれかでインキュベート
する。プレートを吸引して培地を除去し、そして100μlの0.1%パラホルムアルデ
ヒド-PBS(Ca++およびMg++を含有する)を各ウェルに添加する。プレートを4℃で3
0分間保持する。
【０９０５】 次いで、固定液をウェルから除去し、そしてPBS(+Ca,Mg)+0.5% BSAを用いてウ
ェルを1回洗浄し、そして排水する。ウェルを乾燥させないこと。10μlの希釈し
た一次抗体を試験ウェルおよび対照ウェルに添加する。抗ICAM-1-ビオチン、抗V
ACM-1-ビオチンおよび抗E-セレクチン-ビオチンを10μg/mlの濃度(0.1mg/mlスト
ック抗体の1:10希釈)で使用する。加湿した環境において細胞を37℃で30分間イ
ンキュベートする。PBS(+Ca,Mg)+0.5% BSAを用いてウェルを3回洗浄する。
【０９０６】 次に、20μlの希釈したExtrAvidin-Alkaline Phosphotase(希釈度1:5,000)を
各ウェルに添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。PBS(+Ca,Mg)+0.5%
BSAを用いてウェルを3回洗浄する。1錠のp-ニトロフェノールホスフェートpNPP
を5mlのグリシン緩衝液(pH10.4)に溶解させる。pNPP基質を含むグリシン緩衝液1
00μlを各試験ウェルに添加する。ExtrAvidin-Alkaline Phosphotaseの使用希釈
物を含むグリシン緩衝液から3重反復試験方式で標準ウェルを調製する(1:5,000(
100)>10-0.5>10-1>10-1.5)。5μlの各希釈物を3重反復試験ウェルに添加し、各
ウェル中のAP含量が、5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ngになるようにする。次い
で、100μlのpNNP試薬を標準ウェルのそれぞれに添加しなければならない。プレ
ートを37℃にて4時間インキュベートしなければならない。容量50μlの3M NaOH
をすべてのウェルに添加する。得られた液をプレートリーダーにより405nmで定
量する。グリシン緩衝液のみで満たしたブランクウェルに対してバックグラウン
ド差引きオプションを用いる。それぞれの標準ウェル中のAP-コンジュゲート濃
度が[5.50ng; 1.74ng; 0.55ng; 0.18ng]になるようにテンプレートを構成する。
結果は、各サンプル中の結合したAP-コンジュゲートの量として示す。
【０９０７】 この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するもの
であった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレ
オチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるで
あろう(たとえば、遺伝子治療)。
【０９０８】実施例29: GASリポーター構築物の構築 細胞の分化および増殖に関与する1つのシグナル伝達経路は、Jak-STAT経路と
呼ばれる。Jak-STAT経路で活性化されたタンパク質は、多くの遺伝子のプロモー
ターに存在するガンマ活性化部位「GAS」エレメントまたはインターフェロン感
受性応答エレメント(「ISRE」)に結合する。これらのエレメントへのタンパク質
の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。
【０９０９】 GASおよびISREエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよびアク
チベーター、すなわち「STAT」と呼ばれるクラスの転写因子によって認識される
。STATファミリーには6つのメンバーが存在する。Stat1およびStat3は、Stat2と
同様に多くの細胞型に存在する(IFNαに対する応答が広範であるので)。Stat4は
、より限定されており、多くの細胞型には存在しないが、IL-12で処理した後のT
ヘルパークラスIの細胞に見いだされている。Stat5は、当初、乳房増殖因子と呼
ばれたが、骨髄性細胞を含む他の細胞において、より高い濃度で見いだされてい
る。これは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化されうる
。
【０９１０】 STATは、Janus Kinase(「Jak」)ファミリーとして公知のキナーゼのセットに
よりチロシンリン酸化を受けると、活性化されて細胞質から核へ移行する。Jak
は、可溶性チロシンキナーゼの別個のファミリーであり、Tyk2、Jak1、Jak2、お
よびJak3を含む。これらのキナーゼは、顕著な配列類似性を示し、そして一般的
には休止細胞中では触媒的に不活性である。
【０９１１】 Jakは、以下の表によりまとめられる多種多様な受容体によって活性化される
。(Schidler and Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:621-51(1995)によるレビュ
ーから抜粋編集)。Jakを活性化しうるサイトカイン受容体ファミリーは、2つの
グループに分けられる：(a)クラス1は、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、
IL-11、IL-12、IL-15、Epo、PRL、GH、G-CSF、GM-CSF、LIF、CNTF、およびトロ
ンボポエチンに対する受容体を含み;そして(b)クラス2は、IFN-a、IFN-g、およ
びIL-10を含む。クラス1受容体は、保存されたシステインモチーフ(4つの保存さ
れたシステインおよび1つのトリプトファンのセット)およびWSXWSモチーフ(Trp-
Ser-Xaa-Trp-Ser(配列番号37)をコードする膜近接領域)を共有する。
【０９１２】 したがって、受容体へのリガンドの結合が起こると、Jakが活性化され、これ
により次にSTATが活性化され、その後、移行してGASエレメントに結合する。こ
の全過程は、Jak-STATシグナル伝達経路に包含される。したがって、GASまたはI
SREエレメントの結合によりもたらされるJak-STAT経路の活性化は、細胞の増殖
および分化に関与するタンパク質を指定するために使用されうる。たとえば、増
殖因子およびサイトカインは、Jak-STAT経路を活性化することが知られている(
以下の表を参照されたい)。したがって、リポーター分子に連結したGASエレメン
トを使用することにより、Jak-STAT経路のアクチベーターを同定することができ
る。
【０９１３】
【０９１４】 実施例32〜33に記載の生物学的アッセイに使用されるプロモーターエレメント
含有合成GASを構築するために、PCRに基づくストラテジーを利用してGAS-SV40プ
ロモーター配列を作製する。5'プライマーには、IRF1プロモーター中に見いださ
れ、一定範囲のサイトカインによる誘導を受けるとSTATに結合することが既に実
証されている、GAS結合部位の4つのタンデムコピーが含まれるが(Rothman et al
., Immunity 1:457-468(1994))、他のGASまたはISREエレメントを代わりに使用
することもできる。5'プライマーはまた、SV40初期プロモーター配列に相補的な
18bpの配列を含み、そしてXhoI部位でフランキングされている。5'プライマーの
配列は次のとおりである。 5’:GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCG
AAATATCTGCCATCTCAATTAG:3’ (配列番号38)
【０９１５】 下流プライマーは、SV40プロモーターに相補的であり、そしてHindIII部位で
フランキングされている： 5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (配列番号39)
。
【０９１６】 Clontechから入手したB-gal:プロモータープラスミド中に存在するSV40プロモ
ーター鋳型を用いてPCR増幅を行う。得られたPCR断片をXhoI/Hind IIIで消化さ
せ、そしてBLSK2-.(Stratagene)中にサブクローン化する。フォワードおよびリ
バースプライマーを用いる配列決定により、インサートが以下の配列を含有する
ことを確認する。 5’:CTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAAT
ATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCC
AGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCC
TCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3’ (配
列番号40)
【０９１７】 このGASプロモーターエレメントをSV40プロモーターに連結させたら、次に、G
AS:SEAP2リポーター構築物を遺伝子工学的に作製する。ここで、リポーター分子
は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「SEAP」である。しかしながら、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のリポーター分
子がSEAPの代わりになりうる。SEAPの代わりに使用しうる周知のリポーター分子
としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェ
ラーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(
GFP)、または抗体により検出可能な任意のタンパク質が挙げられる。
【０９１８】 上記の配列の確認された合成GAS-SV40プロモーターエレメントをClontechから
入手したpSEAP-プロモーターベクター中に、HindIIIおよびXhoIを用いてサブク
ローン化し、増幅させたGAS: SV40プロモーターエレメントでSV40プロモーター
を効率的に置換して、GAS-SEAPベクターを作製する。しかしながら、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含んでおらず、したがって、哺乳動物の発現系に
は好ましくない。
【０９１９】 したがって、GAS-SEAPリポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作製す
るために、SalIおよびNotIを用いてGAS-SEAPカセットをGAS-SEAPベクターから切
り出し、そしてマルチクローニングサイトのこれらの制限部位を用いて、ネオマ
イシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター、たとえば、pGFP-1(Clontech)に
挿入することにより、GAS-SEAP/Neoベクターを作製する。このベクターを哺乳動
物細胞にトランスフェクトすれば、このベクターは、次に実施例32〜33に記載さ
れているようにGAS結合に対するリポーター分子として使用することができる。
【０９２０】 上記の説明を使用してGASを異なるプロモーター配列で置換することにより、
他の構築物を作製することができる。たとえば、EGRおよびNF-KBプロモーター配
列を含むリポーター分子の構築について、実施例34および35に記載する。しかし
ながら、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して、多くの他のプロモータ
ーを置換することができる。具体的には、SRE、IL-2、NFAT、またはオステオカ
ルシンプロモーターを単独でまたは組み合わせて(たとえば、GAS/NF-KB/EGR、GA
S/NF-KB、Il-2/NFAT、またはNF-KB/GAS)置換することができる。同様に、HELA(
上皮細胞)、HUVEC(内皮細胞)、Reh(B細胞)、Saos-2(骨芽細胞)、HUVAC(大動脈細
胞)、または心筋細胞のような他の細胞株を用いてリポーター構築物の活性を試
験することができる。
【０９２１】実施例30: SEAP活性のアッセイ 本明細書に開示されている実施例に記載のアッセイのためのリポーター分子と
して、SEAP活性を、以下の一般的な手順に従ってTropix Phospho-light Kit(カ
タログ番号BP-400)を用いてアッセイする。Tropix Phospho-light Kitは、以下
で使用される希釈、アッセイ、および反応緩衝液を供給する。
【０９２２】 ディスペンサーに2.5×希釈緩衝液を満たし、そして本発明のアルブミン融合
タンパク質を含有する35μl溶液の入ったオプティプレート(Optiplate)中に15μ
lの2.5×希釈緩衝液を分配する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、
そして65℃で30分間インキュベートする。不均一な加温を避けるためにオプティ
プレートを離間させて置く。
【０９２３】 サンプルを室温まで15分間冷却する。ディスペンサーを空にしてアッセイ緩衝
液で満たす。50mlのアッセイ緩衝液を添加し、室温で5分間インキュベートする
。ディスペンサーを空にして反応緩衝液で満たす(以下の表を参照されたい)。50
μlの反応緩衝液を添加して室温で20分間インキュベートする。化学発光シグナ
ルの強度は時間依存的であり、ルミノメーターで5つのプレートを読み取るのに
約10分かかるので、各回に5つのプレートを処理し、10分後に2つ目のセットを開
始しなければならない。
【０９２４】 ルミノメーターで相対光量単位の値を読み取る。ブランクとしてH12をセット
し、そして結果を印刷する。化学発光の増加は、リポーター活性を示す。
【０９２５】
【０９２６】実施例31: ニューロン活性を同定するアッセイ 細胞が分化および増殖を起こす場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝
達経路を介して活性化される。これらの遺伝子の1つであるEGR1(初期増殖応答遺
伝子1)は、活性化の際に種々の組織および細胞型で誘導される。EGR1のプロモー
ターはそのような誘導の役割を担う。リポーター分子に連結されたEGR1プロモー
ターを使用して、細胞を活性化する本発明の融合タンパク質の能力を評価するこ
とができる。
【０９２７】 特に、以下のプロトコルを用いてPC12細胞系におけるニューロン活性を評価す
る。PC12細胞(ラット褐色細胞腫(phenochromocytoma)細胞)は、TPA(テトラデカ
ノイルホルボールアセテート)、NGF(神経増殖因子)、およびEGF(表皮増殖因子)
のような多くのマイトジェンにより活性化されて増殖および/または分化するこ
とが知られている。この処置の間にEGR1遺伝子発現が活性化される。したがって
、SEAPリポーターに連結されたEGRプロモーターを含む構築物でPC12細胞を安定
にトランスフェクトすることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質による
PC12細胞の活性化を評価することができる。
【０９２８】 以下のプロトコルによりEGR/SEAPリポーター構築物をアセンブルする。以下の
プライマーを用いてEGR-1プロモーター配列(-633〜+1)(Sakamoto K et al., Onc
ogene 6:867-871(1991))をヒトゲノムDNAからPCR増幅することができる。
【０９２９】 5’ GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3' (配列番号41) 5’ GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3' (配列番号42)
【０９３０】 次いで、実施例29で産生させたGAS:SEAP/Neoベクターを用いて、このベクター
にEGR1増幅産物を挿入することができる。制限酵素XhoI/HindIIIを用いてGAS:SE
AP/Neoベクターを線状化し、GAS/SV40スタッファーを取り出す。これらと同一の
酵素を用いて、EGR1増幅産物を制限切断する。ベクターとEGR1プロモーターとを
連結させる。
【０９３１】 細胞培養のための96ウェルプレートを作製するために、コーティング溶液(30%
エタノール(滅菌濾過)中のI型コラーゲン(Upstate Biotech Inc.カタログ番号08
-115)の1:30希釈液)を1つの10cmプレートあたり2mlまたは96ウェルプレートの1
つのウェルあたり50ml添加し、そして2時間空気乾燥させる。
【０９３２】 あらかじめコーティングされている10cm組織培養ディッシュ上において、100
ユニット/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補足した、10%ウ
マ血清(JRH BIOSCIENCES、カタログ番号12449-78P)、5%熱不活性化ウシ胎仔血清
(FBS)を含むRPMI-1640培地(Bio Whittaker)中でPC12細胞を慣例に従って増殖さ
せる。1/4分割を3〜4日ごとに行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取
り出し、そしてピペットによる吸上および滴下を16回以上行って再懸濁させる。
【０９３３】 当技術分野で公知の方法を用いて、EGR/SEAP/Neo構築物をPC12にトランスフェ
クトする。300μg/ml G418中で細胞を増殖させることにより、EGR-SEAP/PC12安
定細胞を得る。通常の増殖では、G418を含まない培地を使用するが、1〜2ヶ月ご
とに2、3回の継代で300μg/mlのG418中で細胞を再増殖させなければならない。
【０９３４】 ニューロン活性をアッセイするために、古い培地を除去して約70〜80%の集密
度で細胞を有する10cmプレートをスクリーニングする。PBS(リン酸緩衝食塩水)
で細胞を1回洗浄する。次いで、一晩かけて低血清培地(抗生物質と共に1%ウマ血
清および0.5% FBSを含有するRPMI-1640)中で細胞を飢餓状態にする。
【０９３５】 翌朝、培地を除去し、そして細胞をPBSで洗浄する。プレートから細胞を掻き
取り、2ml低血清培地中で細胞を十分に懸濁させる。細胞数をカウントし、そし
て5×105細胞/mlの最終細胞濃度になるように、より低血清の培地を添加する。
【０９３６】 200μlの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに添加する(1×105細胞/ウ
ェルに相当)。一連のさまざまな濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を37
℃で48〜72時間添加する。EGRを介してPC12細胞を活性化することが知られてい
る増殖因子、たとえば、50ng/μlの神経増殖因子(NGF)を、陽性対照として使用
することができる。典型的には、50倍を超えるSEAP誘導が陽性対照で観察される
。当技術分野で公知の方法を用いておよび／または実施例30の記載に従って、上
清をSEAPアッセイする。
【０９３７】実施例32: T細胞活性のアッセイ 以下のプロトコルを使用して、因子を同定し、そして本発明のアルブミン融合
タンパク質がT細胞を増殖および/または分化させるかを調べることによって、T
細胞活性を評価する。実施例29で産生させたGAS/SEAP/Neo構築物を用いてT細胞
活性を評価する。したがって、SEAP活性を増加させる因子は、Jaks-STATSシグナ
ル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したT細胞は、Jurkat
T細胞(ATCC受託番号TIB-152)であるが、Molt-3細胞(ATCC受託番号CRL-1552)およ
びMolt-4細胞(ATCC受託番号CRL-1582)細胞を使用することもできる。
【０９３８】 Jurkat T細胞は、リンパ芽球CD4+Th1ヘルパー細胞である。安定な細胞系を産
生するために、DMRIE-C(Life Technologies)を用いて約200万個のJurkat細胞をG
AS-SEAP/neoベクターでトランスフェクトする(以下に記載のトランスフェクショ
ン手順)。トランスフェクトした細胞を1ウェルあたり約20,000個の密度で接種し
、そして1mg/mlのジェネティシン(genticin)に対して耐性であるトランスフェク
タントを選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、漸増濃度のインターフェ
ロンγに対するそれらの応答について試験する。選択されたクローンの用量応答
が示される。
【０９３９】 詳細には、以下のプロトコルにより、200μlの細胞を含む75個のウェルで十分
な細胞が得られるであろう。したがって、スケールアップするか、または複数の
96ウェルプレートで十分な細胞を産生するように複数で実施する。Jurkat細胞は
、1% Pen-Strepを含むRPMI+10%血清中で維持する。T25フラスコ中で2.5mlのOPTI
-MEM(Life Technologies)を10μgのプラスミドDNAと混合する。50μlのDMRIE-C
を含む2.5ml OPTI-MEMを添加し、そして、室温で15〜45分間インキュベートする
。
【０９４０】 インキュベート時間中、細胞濃度をカウントし、所要の細胞数(1トランスフェ
クションあたり107個)を遠心沈降させ、そして107細胞/mlの最終濃度になるよう
にOPTI-MEM中に再懸濁させる。次いで、1×107細胞を有する1mlのOPTI-MEMをT25
フラスコに添加し、そして37℃で6時間インキュベートする。インキュベーショ
ン後、10mlのRPMI+15%血清を添加する。
【０９４１】 RPMI+10%血清、1mg/mlジェネティシン(Genticin)、および1% Pen-Strep中で、
Jurkat:GAS-SEAP安定リポーター系を維持する。これらの細胞をさまざまな濃度
の本発明の１種以上の融合タンパク質で処理する。
【０９４２】 融合タンパク質で処理する日に、細胞を洗浄し、そして1mlあたり500,000個の
細胞濃度となるように新鮮なRPMI+10%血清中に再懸濁させなければならない。必
要となる正確な細胞数は、融合タンパク質の数、およびスクリーニングされる融
合タンパク質の異なる濃度の数に依存する。1枚の96ウェルプレートについて、
およそ1000万個の細胞(10枚のプレートについて1億個の細胞)を必要とする。
【０９４３】 融合タンパク質で処理したJurkat細胞を含むウェルディッシュをインキュベー
ターに48時間入れる(注:この時間は48〜72時間の間で変更可能である)。次いで
、12チャンネルのピペットを用いて、各ウェルから35μlのサンプルを不透明な9
6ウェルプレートに移す。不透明なプレートをカバーで覆い(セロファンカバーを
用いて)、そして実施例30に従ってSEAPアッセイを行うまで、-20℃で保存しなけ
ればならない。残存する処理済み細胞を含むプレートを4℃に置き、そして、所
望により、特定のウェルでアッセイを繰り返すための物質の供給源として役立て
る。
【０９４４】 陽性対照として、100ユニット/mlインターフェロンγを使用することができる
。これは、Jurkat T細胞を活性化することが知られている。典型的には、30倍を
超える誘導が、陽性対照のウェルで観察される。
【０９４５】 当業者には自明なことであろうが、上記のプロトコルは、一過性のトランスフ
ェクト細胞および安定なトランスフェクト細胞の両方の生成に使用することが可
能である。
【０９４６】実施例33: T細胞活性のアッセイ NF-KB(核因子KB)は、転写因子であって、炎症性サイトカインであるIL-1およ
びTNF、CD30およびCD40、リンホトキシン-αおよびリンホトキシン-βを含めて
、多種多様な物質により、LPSまたはトロンビンへの曝露により、ならびに特定
のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される。転写因子として、NF-KBは、
免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポトーシスの制御(NF-KBは、アポ
トーシスから細胞を防御するようである)、B細胞およびT細胞の発生、抗ウイル
ス応答および抗微生物応答、ならびに複数のストレス応答を調節する。
【０９４７】 無刺激条件では、NF-KBは、I-KB(インヒビターKB)と共に細胞質に保持される
。しかしながら、刺激されると、I-KBは、リン酸化および分解されて、核へのNF
-KBの往復を引き起こすことにより、標的遺伝子の転写を活性化する。NF-KBによ
り活性化される標的遺伝子としては、IL-2、IL-6、GM-CSF、ICAM-1およびクラス
1 MHCが挙げられる。
【０９４８】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力のために、NF-KBプ
ロモーターエレメントを利用するリポーター構築物は、融合タンパク質のスクリ
ーニングに使用される。NF-KBのアクチベーターまたはインヒビターは、疾患の
治療、予防、および／または診断に有用である。たとえば、NF-KBのインヒビタ
ーは、NF-KBの急性または慢性活性化に関連する疾患、たとえば、慢性関節リウ
マチ、を処置するために使用しうる。
【０９４９】 NF-KBプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、PCRに基づい
たストラテジーを利用する。上流プライマーは、NF-KB結合部位(GGGGACTTTCCC)(
配列番号43)の4つのタンデムコピー、SV40初期プロモーター配列の5'末端に相補
的な18bpの配列を含み、そしてXhoI部位でフランキングされている。 5’:GCGGCCTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCCTGCCATCTCA
ATTAG:3’ (配列番号44) 下流プライマーは、SV40プロモーターの3'末端に相補的であり、そしてHindII
I部位でフランキングされている。 5’:GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3’ (配列番号39)
【０９５０】 Clontechから入手したpB-gal:プロモータープラスミドに存在するSV40プロモ
ーター鋳型を使用して、PCR増幅を行う。得られたPCR断片をXhoIおよびHindIII
で消化し、BLSK2-(Stratagene)にサブクローン化する。T7およびT3プライマーを
用いる配列決定により、インサートが以下の配列を含むことを確認する。 5’:CTCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTCCATCTGCCATCTCAATTAGT
CAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGC
CCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT
AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3’ (配列番号45)
【０９５１】 次に、XhoIおよびHindIIIを使用して、pSEAP2-プロモータープラスミド(Clont
ech)に存在するSV40最小プロモーターエレメントをこのNF-KB/SV40断片で置換す
る。しかしながら、このベクターはネオマイシン耐性遺伝子を含んでおらず、し
たがって、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０９５２】 安定な哺乳動物細胞系を作製するために、制限酵素SalIおよびNotIを使用して
、上記のNF-KB/SEAPベクターからNF-KB/SV40/SEAPカセットを取り出し、そして
ネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。特定的には、SalIおよびNotIでpG
FP-1を制限切断した後、NF-KB/SV40/SEAPカセットをpGFP-1(Clontech)に挿入し
てGFP遺伝子を置換した。
【０９５３】 NF-KB/SV40/SEAP/Neoベクターを作製した後、実施例32に記載のプロトコルに
従って、安定なJurkat T細胞を作製し、維持する。これらの安定なJurkat T細胞
を用いて融合タンパク質をアッセイする方法についても、同様に、実施例32に記
載される。陽性対照として、外因性TNFα(0.1、1、10ng)をウェルH9、H10、およ
びH11に添加すると、典型的には、5〜10倍の活性化が観察される。
【０９５４】実施例33: 骨髄活性を同定するアッセイ 以下のプロトコルを用いて、融合タンパク質が骨髄細胞を増殖および/または
分化させるかを調べることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質の骨髄活
性を評価する。実施例29で産生されたGAS/SEAP/Neo構築物を用いて骨髄細胞活性
を評価する。したがって、SEAP活性を増大させる因子は、Jaks-STATSシグナル伝
達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した骨髄細胞は、前単球
細胞系U937であるが、TF-1、HL60、またはKG1を使用することもできる。
【０９５５】 実施例29で産生されたGAS/SEAP/Neo構築物でU937細胞を一過性にトランスフェ
クトするために、DEAE-Dextran法(Kharbanda et al, 1994, Cell Growth & Diff
erentiation, 5:259-265)を使用する。最初に、2×107個のU937細胞を採取し、
そしてPBSで洗浄する。通常、100ユニット/mlペニシリンおよび100mg/mlストレ
プトマイシンを補足した10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS)を含むRPMI 1640培地
中でU937細胞を増殖させる。
【０９５６】 次に、0.5mg/ml DEAE-Dextran、8μg GAS-SEAP2プラスミドDNA、140mM NaCl、
5mM KCl、375μM Na2HPO4.7H2O、1mM MgCl2、および675μM CaCl2を含有する1ml
の20mM Tris-HCl(pH 7.4)緩衝液中に細胞を懸濁させる。37℃で45分間インキュ
ベートする。
【０９５７】 10% FBSを含有するRPMI 1640培地で細胞を洗浄し、次いで、10ml 完全培地中
に再懸濁させ、そして37℃で36時間インキュベートする。
【０９５８】 400μg/ml G418中で細胞を増殖させることにより、GAS-SEAP/U937安定細胞を
得る。通常の増殖では、G418を含まない培地を使用するが、1〜2ヶ月ごとに2、3
回の継代で400μg/ml G418中で細胞を再増殖させなければならない。
【０９５９】 これらの細胞を試験するため、1×108個の細胞(これは10枚の96ウェルプレー
トでアッセイするのに十分である)を採取してPBSで洗浄する。上記の増殖培地20
0ml中に5×105細胞/mlの最終濃度で細胞を懸濁させる。96ウェルプレートで1ウ
ェルあたり200μlの細胞(すなわち、1×105細胞/ウェル)をプレーティングする
。
【０９６０】 さまざまな濃度の融合タンパク質を添加する。37℃で48〜72時間インキュベー
トする。陽性対照として、100ユニット/mlインターフェロンγを使用することが
できる。これはU937細胞を活性化させることが知られている。典型的には、30倍
を超える誘導が、陽性対照のウェルで観察される。当技術分野で公知の方法およ
び／または実施例30に記載のプロトコルに従って上清をSEAPアッセイする。
【０９６１】実施例34: 小分子の濃度および膜透過性の変化を同定するアッセイ 受容体へのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのような小
分子およびpHの細胞内レベルを変化させるだけでなく膜電位をも変化させること
が知られている。特定の細胞の受容体に結合する融合タンパク質を同定するアッ
セイで、これらの変化を測定することができる。以下のプロトコルは、カルシウ
ムのアッセイについて記載したものであるが、このプロトコルは、カリウム、ナ
トリウム、pH、膜電位、または蛍光プローブにより検出可能な他の小分子に関す
る変化を検出するように容易に改変されうる。
【０９６２】 以下のアッセイでは、蛍光イメージングプレートリーダー(「FLIPR」)を用い
て、小分子と結合する蛍光分子(分子プローブ)の変化を測定する。明らかなよう
に、ここで使用されているカルシウム蛍光分子fluo-4 (Molecular Probes, Inc.
; カタログ番号F-14202)の代わりに、小分子を検出する任意の蛍光分子を使用す
ることができる。
【０９６３】 付着細胞の場合、透明な底を有するCo-star黒色96ウェルプレートに10,000〜2
0,000細胞/ウェルで細胞を接種する。CO2インキュベーター内でプレートを20時
間インキュベートする。200μlのHBSS(Hank平衡塩類溶液)を用いてBiotek洗浄器
中で付着細胞を2回洗浄し、最終洗浄の後、100μlの緩衝液を残すようにする。
【０９６４】 1mg/ml fluo-4のストック溶液を10%プルロニック酸(pluronic acid)DMSOで調
製する。細胞にfluo-4を供給するため、50μlの12μg/ml fluo-4を各ウェルに添
加する。CO2インキュベーター中、37℃で、プレートを60分間インキュベートす
る。HBSSを用いてBiotek洗浄器中でプレートを4回洗浄し、100μlの緩衝液を残
すようにする。
【０９６５】 非付着細胞の場合、培養培地から細胞を遠心沈降させる。細胞を、HBSSを用い
て50mlコニカルチューブ中で2〜5×106細胞/mlになるように再懸濁させる。細胞
懸濁液1mlあたり4μlの量で10%プルロニック酸DMSO中の1mg/ml fluo-4溶液を添
加する。次に、チューブを37℃の水浴中30〜60分間入れる。細胞をHBSSで2回洗
浄し、1×106細胞/mlになるように再懸濁させ、そしてマイクロプレートに100μ
l/ウェルで分配する。プレートを1000rpmで5分間遠心分離にかける。次に、200
μlを用いてDenley Cell Washでプレートを1回洗浄した後、吸引処理により最終
容量を100μlにする。
【０９６６】 非細胞ベースのアッセイでは、各ウェルにfluo-4のような蛍光分子を入れる。
本発明の融合タンパク質をウェルに添加し、そして蛍光の変化を検出する。
【０９６７】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するために、FLIPRを以下のパラメーターに設
定する: (1)システムのゲインは300〜800mWである; (2)露出時間は0.4秒間であ
る; (3)カメラのF/絞りはF/2である; (4)励起は488nmである; (5) 発光は530nm
である; および(6)サンプル添加は50μlである。530nmにおける発光の増加は、
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に
より誘導された分子によって引き起こされた細胞外シグナル伝達事象を表し、こ
の伝達事象が細胞内Ca++濃度の増加をもたらした。
【０９６８】実施例35: チロシンキナーゼ活性を同定するアッセイ プロテインチロシンキナーゼ(PTK)は、さまざまなグループの膜貫通および細
胞質キナーゼを代表するものである。受容体プロテインチロシンキナーゼ(RPTK)
グループの中には、PDGF、FGF、EGF、NGF、HGFおよびインスリン受容体サブファ
ミリーを含めて、一定の範囲の分裂促進性および代謝性増殖因子に対する受容体
がある。さらに、対応するリガンドが知られていない大きなRPTKファミリーが存
在する。RPTKのリガンドとしては、主に、分泌される小タンパク質が含まれるが
、膜結合および細胞外マトリックスタンパク質も含まれる。
【０９６９】 リガンドによるRPTKの活性化は、結果として受容体サブユニットのトランスリ
ン酸化および細胞質チロシンキナーゼの活性化を生じさせるリガンド媒介受容体
二量体化を含む。細胞質チロシンキナーゼとしては、srcファミリー(たとえば、
src、yes、lck、lyn、fyn)の受容体関連チロシンキナーゼ、ならびにJakファミ
リーのような非受容体結合および細胞質ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げ
られる。これらのメンバーは、受容体のサイトカインスーパーファミリー(たと
えば、インターロイキン、インターフェロン、GM-CSFおよびレプチン)によりト
リガーされるシグナル伝達を媒介する。
【０９７０】 チロシンキナーゼ活性を刺激しうる既知の因子は広範にわたるので、本発明の
アルブミン融合タンパク質または本発明の融合タンパク質により誘導される分子
が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化しうるかの同定は、興味深いも
のである。したがって、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化しうるその
ような分子を同定するために、以下のプロトコルが考えられる。
【０９７１】 Nalge Nunc(Naperville, IL)から購入した96ウェルLoprodyne Silent Screen
Plateに標的細胞(たとえば、初代ケラチノサイト)を約25,000細胞/ウェルの濃度
で接種する。プレートを100%エタノールで30分間ずつ2回すすいで滅菌し、水で
すすぎ、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、100mlの細胞培養用のI
型コラーゲン(50mg/ml)、ゼラチン(2%)またはポリリシン(50mg/ml)(これらはす
べて、Sigma Chemicals(St. Louis, MO)から購入することができる)、またはBec
ton Dickinson(Bedford, MA)から購入した10% Matrigel、あるいは仔ウシ血清で
、2時間コーティングし、PBSですすぎ、そして4℃で保存する。増殖培地に5,000
細胞/ウェルで接種し、48時間後に、製造業者Alamar Biosciences, Inc.(Sacram
ento, CA)により記載されているようにalamarBlueを使用して細胞数を間接計量
することによって、これらのプレート上での細胞増殖をアッセイする。Becton D
ickinson(Bedford, MA)製のFalconプレートカバー#3071を使用して、Loprodyne
Silent Screen Plateを覆う。いくつかの増殖実験では、Falcon Microtest III
細胞培養プレートを使用することもできる。
【０９７２】 抽出物を調製するために、A431細胞をLoprodyneプレートのナイロン膜上に接
種し(20,000/200ml/ウェル)、そして完全培地中で一晩培養する。無血清基本培
地中で24時間インキュベートすることにより、細胞を静止状態にする。EGF(60ng
/ml)またはさまざまな濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質で5〜20分間処
理した後、培地を除去し、そして100mlの抽出緩衝液(20mM HEPES pH7.5、0.15M
NaCl、1% TritonX-100、0.1% SDS、2mM Na3VO4、2mM Na4P2O7およびBoeheringer
Mannheim(Indianapolis, IN)から入手したプロテアーゼ阻害剤のカクテル(#183
6170))を各ウェルに添加し、そしてプレートを回転振盪器にかけて4℃で5分間振
盪する。次に、プレートを真空トランスファーマニホールドに入れ、そしてハウ
スバキュームを使用して抽出物を各ウェルの0.45mm膜底に通して濾過する。抽出
物をバキュームマニホールドの底の96ウェルキャッチ/アッセイプレートに集め
、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により清澄化させた抽出物を得るために、
界面活性剤で5分間可溶化させた後、各ウェルの内容物を取り出して、4℃におい
て16,000×gで15分間遠心分離する。
【０９７３】 チロシンキナーゼ活性のレベルに関して濾過抽出物を試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する方法は多数知られているが、本明細書においては１つの方法
を記載する。
【０９７４】 一般的には、特定の基質(ビオチン化ペプチド)のチロシン残基をリン酸化する
能力を調べることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のチロシンキナー
ゼ活性を評価する。この目的に使用されうるビオチン化ペプチドとしては、PSK1
(細胞分裂キナーゼcdc2-p34のアミノ酸6〜20に相当)およびPSK2(ガストリンのア
ミノ酸1〜17に相当)が挙げられる。両方のペプチドは、ある範囲のチロシンキナ
ーゼの基質であり、Boehringer Mannheimから入手可能である。
【０９７５】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を開始させる。
まず、10μlの5μMビオチン化ペプチドを添加し、次いで、10μlのATP/Mg2+(5mM
ATP/50mM MgCl2)、次いで10μlの5×アッセイ緩衝液(40mM塩酸イミダゾール、p
H7.3、40mM β-グリセロリン酸塩、1mM EGTA、100mM MgCl2、5mM MnCl2、0.5mg/
ml BSA)、次いで5μlのバナジン酸ナトリウム(1mM)、次いで5μlの水を添加する
。成分を穏やかに混合し、反応混合物を30℃で2分間プレインキュベートする。1
0μlの対照酵素または濾過上清を加えることにより反応を開始させる。
【０９７６】 次に、10μlの120mm EDTAを添加することによりチロシンキナーゼアッセイ反
応を停止させ、反応液を氷上に置く。
【０９７７】 チロシンキナーゼ活性を測定するには、反応混合物の50μlアリコートをマイ
クロタイタープレート(MTP)モジュールに移し、37℃で20分間インキュベートす
る。これにより、ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレートを
ビオチン化ペプチドと会合させることができる。MTPモジュールを300μl/ウェル
のPBSで4回洗浄する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ホスホ
チロシン(phospotyrosine)抗体(抗P-Tyr-POD(0.5u/ml))75μlを各ウェルに添加
し、そして37℃で1時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗浄する。
【０９７８】 次に、100μlのペルオキシダーゼ基質溶液(Boehringer Mannheim)を加え、室
温で少なくとも5分間(最長30分間)インキュベートする。ELISAリーダーを使用し
て、405nmにおけるサンプルの吸光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活
性のレベルをELISAリーダーを使用して定量する。これは、チロシンキナーゼ活
性のレベルを反映する。
【０９７９】実施例36:リン酸化活性を同定するアッセイ 実施例35に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性のアッセイに対する可能性
のある代替手段および/または補助手段として、主要な細胞内シグナル伝達中間
体の活性化(リン酸化)を検出するアッセイを使用することもできる。たとえば、
下記のように、1つの特定のアッセイでは、Erk-1およびErk-2キナーゼのチロシ
ンリン酸化を検出することができる。しかしながら、Raf、JNK、p38 MAP、Mapキ
ナーゼキナーゼ(MEK)、MEKキナーゼ、Src、筋肉特異的キナーゼ(MuSK)、IRAK、T
ecおよびJanusのような他の分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチ
ロシン、またはホスホスレオニン分子のリン酸化は、以下のアッセイにおいてこ
れらの分子をErk-1またはErk-2の代わりに用いることにより検出することができ
る。
【０９８０】 詳細には、96ウェルELISAプレートのウェルを、0.1mlのプロテインG(1μg/ml)
により室温(RT)で2時間コーティングすることにより、アッセイプレートを作製
する。次に、プレートをPBSですすぎ、そして3% BSA/PBSによりRTで1時間ブロッ
キングする。次に、プロテインGプレートをErk-1およびErk-2に対する2つの市販
のモノクローナル抗体(100ng/ウェル)(Santa Cruz Biotechnology)で処理する(R
Tで1時間)。(他の分子を検出するために、上記の分子のいずれかを検出するモノ
クローナル抗体を用いることにより、このステップを容易に改変することができ
る)。PBSで3〜5回すすいだ後、使用時まで、プレートを4℃で保存する。
【０９８１】 A431細胞を20,000個/ウェルで96ウェルLoprodyneフィルタープレートに接種し
、そして増殖培地中で一晩培養する。次に、基本培地(DMEM)中で48時間かけて細
胞を飢餓状態にし、次いでEGF(6ng/ウェル)またはさまざまな濃度の本発明の融
合タンパク質で5〜20分間処理する。次に、細胞を可溶化し、そして抽出物を濾
過して直接アッセイプレート中に入れる。
【０９８２】 抽出物をRTで1時間インキュベートした後、ウェルを再びすすぐ。陽性対照と
して、市販のMAPキナーゼ調製物(10ng/ウェル)をA431抽出物の代わりに使用する
。次に、Erk-1およびErk-2キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市
販のポリクローナル(ウサギ)抗体(1μg/ml)でプレートを処理する(RTで1時間)。
この抗体を標準的な手順によりビオチン化する。次に、Wallac DELFIA装置で、
結合されたポリクローナル抗体を、ユーロピウム-ストレプトアビジンおよびユ
ーロピウム蛍光増強剤と共に連続的にインキュベートすることによって定量する
(時間分解蛍光)。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、本発明の融
合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質により誘導された分子に
よるリン酸化を示す。
【０９８３】実施例37: 骨髄CD34+細胞増殖の刺激のアッセイ このアッセイは、ヒトCD34+が造血増殖因子の存在下で増殖する能力に基づく
ものであり、本発明の融合タンパク質がCD34+細胞の増殖を刺激する能力を評価
するものである。
【０９８４】 ほとんどの成熟前駆体は単一のシグナルだけに応答することが既に明らかにさ
れている。より未熟な前駆体は、少なくとも2つの応答シグナルを必要とする。
したがって、広範にわたる前駆細胞の造血活性に対する本発明の融合タンパク質
の効果を試験するために、アッセイは、造血増殖因子の存在下もしくは不在下の
本発明の所与の融合タンパク質を含む。単離した細胞を試験されるサンプルと組
み合わせて、幹細胞因子(SCF)の存在下で5日間培養する。SCFは、単独では、骨
髄(BM)細胞の増殖に対して非常に限られた効果を有し、そのような条件では「生
存」因子としてのみ作用する。しかしながら、これらの細胞に対して刺激作用を
呈する任意の因子(たとえば、IL-3)と組み合わせると、SCFは、相乗効果を引き
起こすであろう。したがって、試験される融合タンパク質が造血前駆細胞に対し
て刺激作用をもつならば、そのような活性は容易に検出することができる。正常
なBM細胞は、低レベルの細胞周期進行中の細胞を有するので、所与の融合タンパ
ク質の阻害効果はなんら検出されない可能性が大きい。したがって、前駆細胞に
対する阻害効果のアッセイは、好ましくは、最初にSCF+IL-3によるin vitro刺激
にさらされ、次にそのような誘導増殖の阻害について評価しようとする化合物と
接触させた細胞で、試験される。
【０９８５】 簡潔に述べると、当技術分野で公知の方法を用いてCD34+細胞を単離する。細
胞を解凍して、培地(1% L-グルタミン(500m1)を有するQBSF 60無血清培地、Qual
ity Biological, Inc., Gaithersburg, MD カタログ番号160-204-101)中に再懸
濁させる。200×gで穏やかな遠心分離工程を数回行った後、細胞を1時間静置す
る。細胞数を2.5×105細胞/mlになるように調節する。この間、100μlの滅菌水
を96ウェルプレートの周壁に添加する。このアッセイにおいて本発明のアルブミ
ン融合タンパク質を用いて試験することのできるサイトカインは、50ng/mlのrhS
CF(R&D Systems, Minneapolis, MN, カタログ番号255-SC)単独、またはrhSCFと3
0ng/mlのrhIL-3(R&D Systems, Minneapolis, MN, カタログ番号203-ML)との組合
せ物である。1時間後、10μlの調製済みサイトカイン、さまざまな濃度の本発明
のアルブミン融合タンパク質、および20μlの希釈した細胞を、100μlの最終全
容量になるようにウェル中に既に存在する培地に添加する。次に、37℃/5%CO2の
インキュベーター中にプレートを5日間入れる。
【０９８６】 アッセイ物を取り出す18時間前、増殖速度を決定するために0.5μCi/ウェルの
[3H]チミジンを10μlの容量で各ウェルに添加する。Tomtec Harvester 96を用い
て、それぞれの96ウェルプレートからフィルターマットに細胞を取り出すことに
より、実験を終了する。採取後、フィルターマットを乾燥させ、トリミングし、
そして1つのOmniFilterプレートと1つのOmniFilterトレーとからなるOmniFilter
アセンブリー中に入れる。60μlのMicroscintを各ウェルに添加し、TopSeal-A p
ress-onシーリングフィルムでプレートを密封する。カウント数を測定するため
に、バーコード15ステッカーを第1のプレートに取り付ける。次に、密封された
プレートを装填して、Packard Top Countにより放射能のレベルを測定し、プリ
ントされたデータを収集して解析する。放射能のレベルは、細胞増殖の量を反映
する。
【０９８７】 この実施例に記載した研究は、骨髄CD34+細胞増殖を刺激する所与の融合タン
パク質の活性を試験するものである。当業者は、本発明の融合タンパク質および
ポリヌクレオチドの活性(たとえば、遺伝子治療)ならびにそれらのアゴニストお
よびアンタゴニストを試験するための、例示された研究を容易に改変することが
できよう。骨髄CD34+細胞の増殖を刺激する本発明のアルブミン融合タンパク質
の能力は、アルブミン融合タンパク質および/または該融合タンパク質に対応す
るポリヌクレオチドが、免疫系および造血に影響を及ぼす障害の診断および治療
に有用であることを示す。代表的な使用は、先の「免疫活性」および「感染症」
の項ならびに本明細書の他の箇所に記載されている。
【０９８８】実施例38: 細胞外マトリックス増強細胞応答(EMECR)のアッセイ 細胞外マトリックス増強細胞応答(EMECR)アッセイの目的は、細胞外マトリッ
クス(ECM)誘導シグナルに関連して造血幹細胞に作用する本発明の融合タンパク
質の能力を評価することである。
【０９８９】 細胞は、周囲の微小環境から受け取ったシグナルに関連して調節因子に応答す
る。たとえば、繊維芽細胞ならびに内皮および上皮幹細胞は、ECMからのシグナ
ルの不在下では複製されない。造血幹細胞は、骨髄中では自己再生を行うことが
できるが、in vitro懸濁培養では行うことができない。幹細胞がin vitroで自己
再生を行う能力は、間質細胞およびECMタンパク質フィブロネクチン(fn)との相
互作用に依存する。fnへの細胞の接着は、ヒトおよびマウス造血幹細胞により発
現されるα5.β1およびα4.β1インテグリン受容体により媒介される。ECM環境
と一体となって幹細胞自己再生の刺激に関与する因子は、まだ同定されていない
。そのような因子の発見は、遺伝子治療および骨髄移植の用途において大きな関
心がもたれるはずである。
【０９９０】 簡潔に述べると、組織培養処理されていないポリスチレン製96ウェルプレート
を、0.2μg/cm2のコーティング濃度でfn断片を用いてコーティングする。マウス
骨髄細胞を0.2mlの無血清培地中にプレーティングする(1,000細胞/ウェル)。IL-
3(5ng/ml)+SCF(50ng/ml)の存在下で培養した細胞は、陽性対照として役立つであ
ろう。この条件下では、幹細胞は自己再生をほとんど行わないが、顕著な分化を
起こすことが予想される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、SCF(5.0ng/ml
)の存在下および不在下で適切な陰性対照と一緒に試験する。ここで、本発明の
アルブミン融合タンパク質を含有する投与組成物の容量は、全アッセイ容量の10
%を占める。次に、低酸素環境(5% CO2、7% O2および88% N2)組織培養インキュベ
ーター中で7日間インキュベートすることにより、プレーティングされた細胞を
増殖させる。次に、細胞DNA中へのチミジン取り込みを測定することにより、ウ
ェル内の増殖細胞数を計量する。アッセイにおける陽性ヒットを検証するには、
細胞の表現型の特性づけが必要であろう。この特性づけは、培養系をスケールア
ップして、細胞表面抗原に対する適切な抗体試薬とFACScanとを用いて、行うこ
とができる。
【０９９１】 当業者は、本発明のアルブミン融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性
(たとえば、遺伝子治療)を試験するための、例示された研究を容易に改変するこ
とができるであろう。
【０９９２】 本発明の特定の融合タンパク質が造血前駆細胞の刺激物質であることが判明す
れば、その融合タンパク質および融合タンパク質に対応するポリヌクレオチドは
、たとえば、免疫系および造血に影響を及ぼす障害の診断および治療に有用であ
る可能性がある。代表的な使用は、先の「免疫活性」および「感染症」の項およ
び本明細書の他の箇所に記載されている。融合タンパク質はまた、種々の血液系
列の幹細胞および決定付けられている前駆細胞の増殖ならびに種々の細胞型の分
化および／または増殖に有用である可能性がある。
【０９９３】 このほか、本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合
タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、造血細胞の増殖および分化を
阻害するために利用することも可能であり、したがって、化学療法において化学
療法剤から骨髄幹細胞を保護するために利用できる可能性がある。この抗増殖効
果は、化学療法剤のより高用量の投与を可能にしうるので、より有効な化学療法
処置を行える可能性がある。
【０９９４】 さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質を
コードするとポリヌクレオチドはまた、間質細胞が造血系列の細胞の産生に重要
であるので、貧血症、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症または白血病
のような造血関連障害の治療および診断に役立つ可能性がある。その使用例とし
ては、骨髄細胞のex vivo培養、骨髄移植、骨髄再形成、新形成物の放射線療法
あるいは化学療法が挙げられる。
【０９９５】実施例39: ヒト皮膚繊維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の増殖 正常なヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)およびヒト大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の培養
物に本発明のアルブミン融合タンパク質を添加し、それぞれのサンプルで2つの
共アッセイを行う。第1のアッセイでは、正常なヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)また
は大動脈平滑筋細胞(AoSMC)の増殖に対する融合タンパク質の効果を調べる。繊
維芽細胞または平滑筋細胞の正常でない増殖は、繊維症を含むいくつかの病的過
程および再狭窄の一部である。第2のアッセイでは、NHDFおよびSMCの両方による
IL6産生を調べる。IL6産生は、機能的活性化の指標である。活性化された細胞は
、いくつかのサイトカインおよび他の因子の産生を増大させているだろう。そし
てその結果として、前炎症または免疫調節の成果を生じる可能性がある。共刺激
性または抑制性活性を調べるために、共TNFα刺激を用いてまたは用いずにアッ
セイを行う。
【０９９６】 簡潔に述べると、1日目、100μlの培養培地中に1000細胞/ウェル(NHDF)または
2000細胞/ウェル(AoSMC)を有する96ウェル黒色プレートを用意する。NHDF培養培
地は、Clonetics FB基本培地、1mg/ml hFGF、5mg/mlインスリン、50mg/mlゲンタ
マイシン、2% FBSを含有し、一方、AoSMC培養培地は、Clonetics SM基本培地、0
.5μg/ml hEGF、5mg/mlインスリン、1μg/ml hFGF、50mg/mlゲンタマイシン、50
μg/mlアンホテリシンB、5% FBSを含有する。37℃で少なくとも4〜5時間インキ
ュベートした後、培養培地を吸引して、増殖停止培地と交換する。NHDFに対する
増殖停止培地は、繊維芽細胞基本培地、50mg/mlゲンタマイシン、2% FBSを含有
し、一方、AoSMCに対する増殖停止培地は、SM基本培地、50mg/mlゲンタマイシン
、50μg/mlアンホテリシンB、0.4% FBSを含有する。2日目まで37℃でインキュベ
ートする。
【０９９７】 2日目、培地対照および公知のタンパク質対照が常に含まれるように、本発明
のアルブミン融合タンパク質の段階希釈液およびテンプレートをデザインする。
刺激および阻害の両方の実験において、増殖停止培地でタンパク質を希釈する。
阻害実験では、2ng/ml(NHDF)または5ng/ml(AoSMC)の最終濃度になるように、TNF
aを添加する。対照または本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する1/3倍容
量の培地を添加し、5日目まで37℃/5% CO2でインキュベートする。
【０９９８】 それぞれのウェルから60μlを、ラベルのつけられた別の96ウェルプレートに
移し、プレートシーラーで覆い、6日目まで4℃で保存する(IL6 ELISA用)。細胞
培養プレート中の残りの100μlに、培養容量の10%に等しい量(10μl)でAlamar B
lueを無菌状態で添加する。プレートを3〜4時間インキュベーターに戻す。次に
、CytoFluorを用いて、530nm励起および590nm発光の条件で蛍光を測定する。こ
れにより増殖促進/阻害データを得る。
【０９９９】 5日目、IL6 ELISAを行うため、PBS(pH7.4)で希釈した50〜100μl/ウェルの抗
ヒトIL6モノクロナール抗体で96ウェルプレートをコーティングし、室温でイン
キュベートを開始する。
【１０００】 6日目、シンクに注いでプレートを空にし、ペーパータオルで吸い取る。4% BS
Aを有するPBSを含むアッセイ緩衝液を調製する。PBS中のPierce Super Blockブ
ロッキング緩衝液200μl/ウェルでプレートを1〜2時間ブロッキングし、次に、
洗浄緩衝液(PBS、0.05% Tween-20)でプレートを洗浄する。プレートをペーパー
タオルで吸い取る。次に、0.50mg/mlに希釈された抗ヒトIL-6モノクロナールビ
オチン標識抗体50μ1/ウェルを添加する。培地でIL-6ストックの稀釈液を作製す
る(30、10、3、1、0.3、0ng/ml)。プレートの最上列に2回反復サンプルを添加す
る。プレートを覆い、振盪器にかけてRTで2時間インキュベートする。
【１００１】 プレートは洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオルで吸い取る。EUで標識された
ストレプトアビジンをアッセイ緩衝液で1:1000に希釈し、100μl/ウェルを添加
する。プレートを覆い、RTで1時間インキュベートする。洗浄緩衝液でプレート
を再び洗浄し、ペーパータオルで吸い取る。
【１００２】 100μl/ウェルの増強溶液を添加する。5分間振盪する。Wallac DELFIA フルオ
ロメーターを用いてプレートを読み取る。それぞれのアッセイの3回反復サンプ
ルから得られた読み取り値を表にして平均値を求める。
【１００３】 このアッセイにおいて陽性の結果は、AoSMC細胞増殖を示唆するとともに、ア
ルブミン融合タンパク質が皮膚繊維芽細胞増殖および/または平滑筋細胞増殖に
関与している可能性があることを示唆する。陽性の結果はまた、アルブミン融合
タンパク質と該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが多くの有望な
用途をもつことを示唆する。たとえば、本明細書全体にわたり詳述されている炎
症および免疫応答、創傷治癒、ならびに血管形成に利用できる。特に、融合タン
パク質は、創傷治癒および皮膚再生ならびに脈管形成の促進(血管およびリンパ
管の両方)に使用することが可能である。脈管の成長は、たとえば、心血管疾患
などの治療に使用することができる。さらに、このアッセイでアンタゴニスト活
性を示す融合タンパク質は、抗血管剤(たとえば、抗血管形成剤)として機能する
ことによって、血管形成が関与する疾患、障害、および/または症状の治療に有
用である可能性がある。これらの疾患、障害、および/または症状は、当技術分
野で公知であるか、かつ/または本明細書に記載されており、たとえば、悪性疾
患、固形腫瘍、良性腫瘍、具体的には、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコ
ーマ、および化膿性肉芽腫；動脈硬化斑；眼の血管形成疾患、具体的には、糖尿
病網膜症、末熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後
繊維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎および眼の翼状斑(Ptery
gia)(異常血管増殖)；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延創傷治癒；子宮内膜症；脈
管形成；肉芽形成；過形成性瘢痕(ケロイド)；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ
；血管癒着；心筋血管形成；冠状動脈側副枝(collaterals)；大脳側副枝(collat
erals)；動静脈奇形；虚血性肢血管形成；Osler-Webber症候群；プラーク新生血
管形成；毛細管拡張症；血友病関節；血管繊維腫；繊維筋性形成異常；創傷肉芽
化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。さらに、このア
ッセイでアンタゴニストとして機能するアルブミン融合タンパク質は、当技術分
野で公知のおよび/または本明細書に記載の抗過増殖性疾患および/または抗炎症
性疾患の治療にも有用である可能性がある。
【１００４】実施例40: 内皮細胞での細胞接着分子(CAM)の発現 炎症および血管形成の領域へのリンパ球の動員には、リンパ球上の細胞表面接
着分子(CAM)と血管内皮との間の特異的な受容体-リガンド相互作用が関与する。
接着過程は、通常の環境および病理学的環境のいずれにおいても、内皮細胞(EC)
での細胞間接着分子-1(ICAM-1)、血管細胞接着分子-1(VCAM-1)、および内皮白血
球接着分子-1(E-セレクチン)の発現を含む多段階カスケードに従う。血管内皮に
おけるこれらの分子および他の分子の発現は、白血球が局所血管系に接着して炎
症応答の発生中に局所組織中に溢出しうる効率を決定する。サイトカインおよび
増殖因子の局所濃度は、これらのCAMの発現の調節に関与する。
【１００５】 簡潔に述べると、標準的な96ウェルプレートで集密状態になるまで内皮細胞(
たとえば、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC))を増殖させ、細胞から増殖培地を取り除
き、そして100μlの199培地(10%ウシ胎児血清FBS)に置き換える。試験用サンプ
ル(本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する)および陽性または陰性対照を
3回反復試験方式でプレートに添加する(10μl容量)。次に、プレートを37℃で5
時間(セレクチンおよびインテグリン発現)または24時間(インテグリン発現のみ)
インキュベートする。プレートを吸引して培地を除去し、そして100μlの0.1%パ
ラホルムアルデヒド-PBS(Ca++およびMg++を含有)を各ウェルに添加する。プレー
トを4℃で30分間保持する。固定液をウェルから除去し、PBS(+Ca,Mg)+0.5% BSA
を用いてウェルを1回洗浄し、そして排水する。10μlの希釈した1次抗体を試験
ウェルおよび対照ウェルに添加する。抗ICAM-1-ビオチン、抗VCAM-1-ビオチンお
よび抗E-セレクチン-ビオチンを10μg/mlの濃度(0.1mg/mlストック抗体の1:10希
釈)で使用する。加湿した環境において細胞を37℃で30分間インキュベートする
。PBS(+Ca,Mg)+0.5% BSAを用いてウェルを3回洗浄する。20μlの希釈したExtrAv
idin-アルカリホスファターゼ(希釈度1:5,000、本明細書中では使用希釈度と呼
ぶ)を各ウェルに添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。PBS(+Ca,Mg)
+0.5% BSAを用いてウェルを3回洗浄する。グリシン緩衝液(pH10.4) 5mlあたり1
錠のp-ニトロフェノールホスフェートpNPPを溶解させる。pNPP基質を有するグリ
シン緩衝液100μlを各試験ウェルに添加する。使用希釈度でExtrAvidin-アルカ
リホスファターゼを含むグリシン緩衝液から3回反復試験方式で標準ウェルを調
製する(1:5,000(100)>10-0.5>10-1>10-1.5)。5μlの各希釈物を3回反復試験ウェ
ルに添加し、各ウェル中のAP含量が、5.50ng、1.74ng、0.55ng、0.18ngになるよ
うにする。次いで、100μlのpNNP試薬を標準ウェルのそれぞれに添加する。プレ
ートを37℃にて4時間インキューベートする。容量50μlの3M NaOHをすべてのウ
ェルに添加する。グリシン緩衝液のみで満たしたブランクウェルに対してバック
グラウンド減算オプションを使用して、プレートリーダーにより405nmでプレー
トを読み取る。さらに、それぞれの標準ウェル中のAP-コンジュゲート濃度[5.50
ng; 1.74ng; 0.55ng; 0.18ng]を示すテンプレートを構成する。各サンプル中の
結合したAP-コンジュゲートの量として結果を示す。
【１００６】実施例41: Alamar Blue内皮細胞増殖アッセイ このアッセイは、ウシリンパ内皮細胞(LEC)、ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)また
はヒト微小血管子宮筋層細胞(UTMEC)のbFGF-誘導増殖のタンパク質媒介阻害を定
量的に調べるために使用される。このアッセイには、代謝活性の検出に基づくフ
ルオロメトリック増殖指示薬が組み込まれる。標準的なAlamar Blue増殖アッセ
イは、内皮細胞刺激源として添加される10ng/mlのbFGFを有するEGM-2MV中で行わ
れる。このアッセイは、増殖培地および細胞濃度をわずかに変化させてさまざま
な内皮細胞で使用することが可能である。試験されるタンパク質バッチの稀釈液
は、適宜、希釈される。bFGFを含まない無血清培地(GIBCO SFM)を無刺激対照と
して使用し、アンギオスタチンまたはTSP-1を公知の阻害対照として使用する。
【１００７】 簡潔に述べると、LEC、BAECまたはUTMECを、5000〜2000細胞/ウェルの濃度で9
6ウェルプレート中の増殖培地に接種し、37℃で一晩置く。細胞を一晩インキュ
ベートした後、増殖培地を除去し、GIBCO EC-SFMに置き換える。10ng/mlの濃度
になるように追加されたbFGFを有する3回反復試験ウェルで、本発明のアルブミ
ン融合タンパク質または対照タンパク質サンプルの適切な稀釈液(SFM中に調製)
で細胞を処理する。サンプルで細胞を処理した後、プレートを37℃のインキュベ
ーターに戻して3日間置く。3日後、10mlのストックalamar blue(Biosourceカタ
ログ番号DAL1100)をそれぞれのウェルに添加し、そしてプレートを37℃のインキ
ュベーターに戻して4時間置く。次に、CytoFluor蛍光リーダーを用いて530nm励
起および590nm発光の条件でプレートを読み取る。直接出力を相対的な蛍光単位
で記録する。
【１００８】 alamar blueは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応じて蛍光放出
および色変化の両方を生じる酸化還元指示薬である。細胞が培養下で増殖するに
つれて、生来の代謝活性により、ごく近傍の周囲環境の化学還元が生じる。増殖
に関連して還元が起こると、指示薬は、酸化(非蛍光青色)型から還元(蛍光赤色)
型に変化する(すなわち、増殖が刺激されると、より強力なシグナルが生じ、増
殖が阻害されると、より弱いシグナルが生じ、全シグナルは、全細胞数および細
胞の代謝活性に比例する)。バックグラウンドの活性レベルは、飢餓培地単独で
観測する。これを、陽性対照サンプル(増殖培地中のbFGF)およびタンパク質稀釈
液から観測された出力と比較する。
【１００９】実施例42: 混合リンパ球反応の阻害の検出 このアッセイを用いることにより、本発明の融合タンパク質による混合リンパ
球反応(MLR)の阻害を検出し評価することができる。MLRの阻害は、細胞の増殖お
よび生存能力に対する直接的影響、相互作用細胞に対する共刺激分子の調節、リ
ンパ球とアクセサリー細胞との間の接着の調節、またはアクセサリー細胞による
サイトカイン産生の調節に起因するものと考えられる。このアッセイで使用され
る末梢血単核性画分はT、Bおよびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球およ
び樹状細胞を含んでいるので、MLRを阻害するアルブミン融合タンパク質により
、複数の細胞が標的化される可能性がある。
【１０１０】 MLRを阻害することが見いだされた本発明のアルブミン融合タンパク質は、リ
ンパ球および単球の活性化または増殖に関連づけられる疾患に適用できる可能性
がある。これらの例としては、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性皮膚症状、乾癬、
湿疹、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン
病、潰瘍性大腸炎、動脈硬化症、肝硬変、移植片対宿主疾患、宿主対移植片疾患
、肝炎、白血病およびリンパ腫のような疾患が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。
【１０１１】 簡潔に述べると、リンパ球分離培地(LSM(登録商標)、濃度1.0770g/ml、Organo
n Teknika Corporation, West Chester, PA)を用いて密度勾配遠心分離法により
、ヒトドナー由来のPBMCを精製する。2名のドナー由来のPBMCを、10% FCSおよび
2mMグルタミンを補足したRPMI-1640(Life Technologies, Grand Island, NY)中
に2×106細胞/mlとなるように調整する。3人目のドナー由来のPBMCを2×105細胞
/mlとなるように調整する。50マイクロリットルのそれぞれのドナー由来のPBMC
を96ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。融合タンパク質
試験物質の稀釈液(50μl)を3回反復試験方式でマイクロタイターウェルに添加す
る。(対象のタンパク質の) 試験サンプルは、1:4の最終稀釈となるように添加し
; rhuIL-2(R&D Systems, Minneapolis, MN, カタログ番号202-IL)は、1μg/mlの
最終濃度となるように添加し; 抗CD4 mAb(R&D Systems, clone 34930.11, カタ
ログ番号MAB379)は、10μg/mlの最終濃度となるように添加する。5% CO2中、37
℃で、細胞を7〜8日間培養し、そして1μCの[3H]チミジンを最後の16時間の培養
のためにウェルに添加する。細胞を採取し、そしてPackard TopCountを用いてチ
ミジン取り込みを測定する。データは、3回反復試験の測定値の平均および標準
偏差として表す。
【１０１２】 対象の融合タンパク質のサンプルを個別の実験でスクリーニングし、そしてリ
ンパ球の増殖を阻害する陰性対照の処理剤である抗CD4 mAb、およびリンパ球の
増殖を増強する陽性対照の処理剤であるIL-2(組換え物質または上清のいずれか)
と比較する。
【１０１３】実施例43: プロテアーゼ活性のアッセイ 次のアッセイを用いることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のプロ
テアーゼ活性を評価することが可能である。
【１０１４】 実質的に記載されるとおりに(Heusen et al., Anal. Biochem., 102:196-202(
1980); Wilson et al., Journal of Urology, 149:653-658(1993))、ゼラチンお
よびカゼインザイモグラフィーを行う。1%ゼラチンまたはカゼインを含有する10
%ポリアクリルアミド/0.1% SDSゲルを用いてサンプルを泳動させ、室温で2.5%ト
リトン中に1時間、さらに37℃で0.1Mグリシン, pH8.3中に5〜16時間浸漬する。
アミドブラックで染色した後、タンパク質分解領域は、青黒色のバックグラウン
ドに対して透明な領域として現われる。トリプシン(Sigma T8642)を陽性対照と
して使用する。
【１０１５】 プロテアーゼ活性はまた、n-a-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル(BAEE
)(Sigma B-4500)の切断をモニターすることによっても調べられる。反応は(25mM
NaPO4、lmM EDTAおよび1mM BAEE), pH 7.5中で行う。サンプルを添加し、タイ
ム-ドライブモードでBeckman DU-6分光光度計を用いて260nmの吸光度の変化をモ
ニターする。トリプシンを陽性対照として使用する。
【１０１６】 280nmの吸光度としてまたはFolin法を用いて比色定量により測定されるカゼイ
ンまたはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくさらなるアッセイ
は、Bergmeyer, et al., Methods of Enzymatic Analysis, 5 (1984)の記載に従
って行う。他のアッセイとしては、クロモゲン基質の可溶化が挙げられる(Ward,
Applied Science, 251-317 (1983))。
【１０１７】実施例44: セリンプロテアーゼ基質特異性の同定 当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の方法を用いることにより、セリン
プロテアーゼ活性を有する本発明のアルブミン融合タンパク質の基質特異性を調
べることが可能である。基質特異性を調べる好ましい方法は、GB 2 324 529(そ
の全体を本明細書に組み入れる)に記載されているようなホジショナルスキャニ
ング合成コンビナトリアルライブラリーを用いるものである。
【１０１８】実施例45: リガンド結合アッセイ 次のアッセイを用いることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のリガ
ンド結合活性を評価することが可能である。
【１０１９】 リガンド結合アッセイは、受容体の薬理学的挙動を確認するための直接的方法
を提供し、ハイスループット方式に適用可能である。結合を調べるために、本発
明のアルブミン融合タンパク質に対する精製リガンドを高い比放射能(50〜2000
Ci/mmol)になるように放射能標識する。次に、放射能標識化プロセスが融合タン
パク質に対するリガンドの活性を低減させないことを確かめる。膜および全細胞
ポリペプチド源の両方に対して使用可能なシグナル対ノイズ比が得られるように
、緩衝液、イオン、pH、およびヌクレオチドのような他のモジュレーターに関す
るアッセイ条件を最適化する。これらのアッセイでは、特異的ポリペプチド結合
は、全結合放射能から過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定した放射能を差
し引いた値として定義される。可能な場合には、2種以上の競合リガンドを用い
て、残存する非特異的結合を規定する。
【１０２０】実施例46: ツメガエル卵母細胞における機能アッセイ 標準的な手順に従ってRNAポリメラーゼを用いて、本発明のアルブミン融合タ
ンパク質をコードする線状化プラスミド鋳型からのキャップ付きRNA転写産物をi
n vitroで合成する。in vitro転写産物を0.2mg/mlの最終濃度で水中に懸濁させ
る。成体の雌カエルから卵巣葉を取り出し、第V期脱濾胞(defolliculated)卵母
細胞を取得し、そしてマイクロインジェクション装置を用いてRNA転写産物(10ng
/卵母細胞)を50nlボーラスで注入する。2つの電極電圧クランプを用いて、融合
タンパク質およびポリペプチドアゴニストの暴露に応答して流れる個々のツメガ
エル卵母細胞からの電流を測定する。読み取りは、Ca2+不含のBarth’s培地中で
室温にて行う。ツメガエル系は、既知のリガンドおよび組織/細胞抽出物を活性
化リガンドについてスクリーニングするために使用することができる。
【１０２１】実施例47: ミクロフィジオメトリックアッセイ 多種多様な2次メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が排出さ
れる。生成される酸は、主に、細胞内シグナル伝達過程を刺激するのに必要な代
謝活性が増大された結果として生じるものである。細胞を取り囲む培地のpH変化
は非常に小さいが、CYTOSENSORミクロフィジオメーター(Molecular Devices Ltd
., Menlo Park, Calif.)により検出可能である。したがって、CYTOSENSORは、エ
ネルギーを利用する細胞内シグナル伝達経路に連動した2次メッセンジャーを活
性化させる本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を検出することができる。
【１０２２】実施例48: 抽出物/細胞上清スクリーニング いまだに対応するコグネイトな活性化リガンド(アゴニスト)が見いだされてい
ない多数の哺乳動物受容体が存在する。このため、これらの受容体に対して活性
なリガンドは、これまでに同定されたリガンドバンク内には含まれていない可能
性がある。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質
部分および/またはアルブミンタンパク質部分に対する天然のリガンドを同定す
るために、(カルシウム、cAMP、ミクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学
など、機能的スクリーニングを用いて)本発明のアルブミン融合タンパク質を組
織抽出物に対して機能的にスクリーニングすることもできる。活性化リガンドが
単離・同定されるまで、陽性の機能応答を生じる抽出物を逐次的にサブ分画する
ことができる。
【１０２３】実施例49: ATP結合アッセイ 次のアッセイを用いることにより、本発明の融合タンパク質のATP結合活性を
評価することが可能である。
【１０２４】 本発明のアルブミン融合タンパク質のATP結合活性は、参照により全体が本明
細書に組み入れられる米国特許第5,858,719号に記述されているATP結合アッセイ
を用いて検出することが可能である。簡潔に述べると、競合アッセイで8-アジド
-ATPを用いるフォトアフィニティー標識付けにより、本発明のアルブミン融合タ
ンパク質へのATP結合を測定する。1mg/mlのABC輸送タンパク質を含有する反応混
合物を、さまざまな濃度のATPまたは非加水分解性ATP類似体アデニル-5'-イミド
二リン酸と共に、4℃で10分インキュベートする。8-アジド-ATP(Sigma Chem. Co
rp., St. Louis, MO.)と、8-アジド-ATP(32P-ATP)(5 mCi/μmol, ICN, Irvine C
A.)との混合物を、100μMの最終濃度になるように添加し、そして0.5mlアリコー
トを氷上の磁器スポットプレートのウェルに入れる。プレートから2.5cmの距離
で短波長254nm UVランプを用いて1分間の冷却時間をはさんでプレートへの1分間
の照射を2回行った。2mMの最終濃度になるようにジチオトレイトールを添加する
ことにより、反応を停止させる。インキュベートした混合物をSDS-PAGE電気泳動
にかけ、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーを行う。本発明のアルブミン
融合タンパク質に対応するタンパク質バンドを切り出して、放射能を定量した。
ATPまたはアデニル-5'-イミド二リン酸の増加に伴う放射能の減少は、融合タン
パク質に対するATPの親和性の尺度となる。
【１０２５】実施例50: リン酸化アッセイ 本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性をアッセイするために、米
国特許第5,958,405号(参照により本明細書に組み入れる)に記載されているよう
なリン酸化アッセイを利用する。簡潔に述べると、γ標識32P-ATPを用いてタン
パク質基質をリン酸化し、γ放射性同位体カウンターを用いて取り込まれた放射
能を計数することにより、リン酸化活性を測定することが可能である。タンパク
質基質、32P-ATP、およびキナーゼ緩衝液と共に本発明の融合タンパク質をイン
キュベートする。次に、基質に取り込まれた32Pを、電気泳動により遊離の32P-A
TPから分離し、取り込まれた32Pを計数し、そして陰性対照と比較する。陰性対
照を超える放射能カウント数は、融合タンパク質のリン酸化活性を表す。
【１０２６】実施例51: ポリペプチドリガンドの存在下における本発明のアルブミン融合タン パク質のリン酸化活性(活性化)の検出 当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の方法を用いることにより、本発明
のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性を調べることができる。リン酸化活
性を調べる好ましい方法は、米国特許第5,817,471号(参照により本明細書に組み
入れる)に記載されているようなチロシンリン酸化アッセイを用いるものである
。
【１０２７】実施例52: 本発明のアルブミン融合タンパク質と相互作用するシグナル伝達タン パク質の同定 本発明のアルブミン融合タンパク質は、シグナル伝達経路タンパク質または受
容体タンパク質の同定、特性づけおよび精製を行うための研究ツールとして役立
つ可能性がある。簡潔に述べると、本発明の標識された融合タンパク質は、それ
と相互作用する分子を精製するための試薬として有用である。アフィニティー精
製の1実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をクロマトグラフィー
カラムに共有結合させる。癌腫組織のような推定上の標的細胞に由来する無細胞
抽出物をカラムに通し、適切な親和性を有する分子をアルブミン融合タンパク質
に結合させる。タンパク質複合体をカラムから回収し、解離させ、そして回収さ
れた分子をN末端タンパク質配列決定処理に付す。次に、このアミノ酸配列を用
いて、捕捉された分子を同定するか、または適切なcDNAライブラリーから該当す
る遺伝子をクローン化するための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【１０２８】実施例53: IL-6 バイオアッセイ 本発明のアルブミン融合タンパク質の増殖効果を試験するためのさまざまなア
ッセイが、当技術分野で公知である。たとえば、そのようなアッセイの1つはMar
zら(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 95:3251-56 (1998)、参照により本明細
書に組み入れる)により記載されたようなIL-6バイオアッセイである。37℃で68
時間後、テトラゾリウム塩チアゾリルブルー(MTT)を添加して37℃でさらに4時間
インキュベートすることにより、生細胞の数を測定する。B9細胞をSDSにより溶
解させ、570nmで光学濃度を測定する。対照は、IL-6を含有するもの(陽性対照)
およびサイトカインを含有しないもの(陰性対照)である。簡潔に述べると、IL-6
依存性B9マウス細胞をlL-6不含の培地で3回洗浄し、50μl中5,000細胞／ウェル
の濃度でプレーティングし、そして50μlの本発明の融合タンパク質を添加して
利用する。陰性対照と比べた、試験サンプル(本発明のアルブミン融合タンパク
質を含有する)での増強された増殖は、融合タンパク質により媒介される増殖効
果を表す。
【１０２９】実施例54: ニワトリ胚ニューロン生存の支援 交感ニューロン細胞の生存能力が本発明のアルブミン融合タンパク質により支
援されるかを試験するために、Senaldiらのニワトリ胚ニューロン生存アッセイ
を利用することが可能である(Proc. Nati. Acad. Sci., U.S.A., 96:11458-63(1
998)、参照により本明細書に組み入れる)。簡潔に述べると、運動および交感ニ
ューロンをニワトリ胚から単離し、それぞれL15培地(10% FCS、グルコース、亜
セレン酸ナトリウム、プロゲステロン、コナルブミン、プトレシンおよびインス
リンを含む; Life Technologies, Rockville, MD.)およびDulbecco’s改変イー
グル培地[10% FCS、グルタミン、ペニシリン、および25mMのHepes緩衝液(pH 7.2
)を含む; Life Technologies, Rockville, MD.]に再懸濁させ、そしてさまざま
な濃度の本発明の精製融合タンパク質の存在下で、ならびに、いかなるサイトカ
インをも含んでいない陰性対照として、5% CO2中、37℃でインキュベートする。
3日後、細胞の形態を評価することにより、およびMosmann (Mosmann, T., J. Im
munol. Methods, 65:55-63(1983))の比色アッセイを使用することにより、ニュ
ーロン生存を調べる。サイトカインを含まない対照と比較して増強されたニュー
ロン細胞の生存能力は、ニューロン細胞の生存を増強するアルブミン融合タンパ
ク質の能力を表す。
【１０３０】実施例55: ホスファターゼ活性のアッセイ 次のアッセイを用いることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリ
ン/トレオニンホスファターゼ(PTPase)活性を評価することが可能である。
【１０３１】 セリン/トレオニンホスファターゼ(PTPase)活性をアッセイするために、当業
者に広く知られているアッセイを利用することができる。たとえば、New Englan
d Biolabs, Inc製のPSPaseアッセイキットを用いて、本発明のアルブミン融合タ
ンパク質のセリン/トレオニンホスファターゼ(PSPase)活性を測定することが可
能である。PSPaseの基質であるミエリン塩基性タンパク質(MyBP)を、[32P]ATPの
存在下でcAMP依存性プロテインキナーゼを用いてセリンおよびトレオニン残基上
でリン酸化する。次に、32P標識MyBPからの無機リン酸の放出を測定することに
より、タンパク質セリン/トレオニンホスファターゼ活性を求める。
【１０３２】実施例56: セリン/トレオニンホスファターゼと他のタンパク質との相互作用 セリン/トレオニンホスファターゼ活性(たとえば、実施例55で測定される活性
)を有する本発明の融合タンパク質は、たとえば、さらなる相互作用タンパク質
または受容体タンパク質あるいは他のシグナル伝達経路タンパク質の同定、特性
づけおよび精製を行うための研究ツールとして有用である。簡潔に述べると、本
発明の標識された融合タンパク質は、それと相互作用する分子を精製するための
試薬として有用である。アフィニティー精製の1実施形態では、本発明のアルブ
ミン融合タンパク質をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。神経細胞ま
たは肝細胞のような推定上の標的細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通し、
適切な親和性を有する分子を融合タンパク質に結合させる。融合タンパク質複合
体をカラムから回収し、解離させ、そして回収された分子をN末端タンパク質配
列決定処理に付す。次に、このアミノ酸配列を用いて、捕捉された分子を同定す
るか、または適切なcDNAライブラリーから該当する遺伝子をクローン化するため
の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【１０３３】実施例57: ヘパラナーゼ活性のアッセイ 本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性をアッセイするのに利
用しうる当技術分野で公知の多数のアッセイが存在する。1例を挙げると、本発
明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性は、Vlodavskyら(Vlodavsky
et al., Nat. Med., 5:793-802(1999))により記載されたようにアッセイされる
。簡潔に述べると、細胞溶解物、馴化培地、インタクト細胞(35mm培養皿あたり1
×106個)、細胞培養上清、または精製された融合タンパク質を、35S標識ECMまた
は可溶性ECM誘導ピークIプロテオグリカンと共に、pH 6.2〜6.6、37℃で18時間
インキュベートする。インキュベーション培地を遠心分離し、上清をSepharose
CL-6Bカラム(0.9×30cm)でゲル濾過することにより分析する。画分をPBSで溶出
させ、それらの放射能を測定する。ヘパラン硫酸側鎖の分解断片を、0.5<Kav<0.
8でSepharose 6Bから溶出させる(ピークII)。それぞれの実験を少なくとも3回行
う。Vlodavskyらにより記載された「ピークII」に対応する分解断片は、ヘパラ
ン硫酸の切断における本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を表す。
【１０３４】実施例58: 生体分子の固定化 この実施例は、非宿主細胞脂質二重層構築物中で本発明のアルブミン融合タン
パク質を安定化させる方法を提供する(たとえば、Bieri et al., Nature Biotec
h 17:1105-1108(1999)を参照されたい。参照によりその全体を本明細書に組み入
れる)。この方法は、上記の種々の機能アッセイにおける本発明の融合タンパク
質に関する研究に適合させることが可能である。簡潔に述べると、ビオチン化の
ための炭水化物特異的化学を用いて、ビオチンタグを本発明のアルブミン融合タ
ンパク質に拘束し、固定化後に均一な配向が得られるようにする。洗浄された膜
中の本発明のアルブミン融合タンパク質の50μM溶液を、20mM NaIO4および1.5mg
/ml(4mM)BACHまたは2mg/ml(7.5mM)ビオチン-ヒドラジドと共に、室温で1時間イ
ンキュベートする (反応容量150μl)。その後、500mlの緩衝液R(0.15M NaCl、1m
M MgCl2、10mMリン酸ナトリウム、pH7)に対して、1時間ごとに緩衝液を交換しな
がらサンプルを4℃で最初に5時間透析し、最後に12時間透析する(Pierce Slidea
lizer Cassett, 10kDaカットオフ; Pierce Chemical Co., Rockford IL)。キュ
ベットに添加する直前、緩衝液ROG50(50mMオクチルグルコシドを補充した緩衝液
R)でサンプルを1:5希釈する。
【１０３５】実施例59: メタロプロテイナーゼ活性のアッセイ メタロプロテイナーゼは、触媒機構としてZn2+のような金属イオンを使用する
ペプチドヒドロラーゼである。本発明のアルブミン融合タンパク質のメタロプロ
テイナーゼ活性は、当技術分野で公知の方法に従ってアッセイすることができる
。次の例示的な方法を提供する。
【１０３６】 α-2-マクログロブリンのタンパク質分解： プロテアーゼ活性を確認するために、本発明の精製融合タンパク質を、1×ア
ッセイ緩衝液(50mM HEPES、pH 7.5、0.2M NaCl、10mM CaCl2、25μM ZnCl2およ
び0.05% Brij-35)中で基質α-2-マクログロブリン(0.2ユニット/ml; Boehringer
Mannheim, Germany)と混合し、37℃で1〜5日間インキュベートする。 トリプシンを陽性対照として使用する。陰性対照はアッセイ緩衝液中にα-2-マ
クログロブリンのみを含有する。サンプルを採取し、5% 2-メルカプトエタノー
ルを含有するSDS-PAGEサンプル緩衝液中で5分間煮沸し、次に、8% SDS-ポリアク
リルアミドゲルにローディングする。電気泳動後、銀染色法によりタンパク質を
視覚化する。陰性対照と比較して、より低分子量のバンドが現れたことから、タ
ンパク質分解が実証される。
【１０３７】 メタロプロテイナーゼの阻害剤によるα-2-マクログロブリンタンパク質分解
の阻害： 既知のメタロプロテイナーゼ阻害剤(金属キレート化剤(EDTA、EGTA、およびHg
Cl2)、ペプチドメタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP-1およびTIMP-2)ならびに市販
の小分子MMP阻害剤)を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質
分解活性を特性づけることも可能である。使用しうる3種の合成MMP阻害剤は、次
のとおりである: MMP阻害剤I、[MMP-1およびMMP-8に対するIC50=1.0μM; MMP-9
に対するIC50=30μM; MMP-3に対するIC50=150μM]; MMP-3(ストロメリシン-1)阻
害剤I[MMP-3に対するIC50=5μM]、ならびにMMP-3阻害剤II[MMP-3に対するKi=130
nM]; Calbiochemから入手可能な阻害剤、それぞれカタログ番号444250、444218
および444225)。簡潔に述べると、さまざまな濃度の小分子MMP阻害剤を、22.9μ
lの1×HEPES緩衝液(50 mM HEPES、pH 7.5、0.2 M NaCl、10mM CaCl2、25μM ZnC
l2および0.05% Brij-35)中で本発明の精製融合タンパク質(50μgIml)と混合し、
室温で(24℃)で2時間インキュベートし、次に7.1μlの基質α-2-マクログロブリ
ン(0.2ユニット/ml)を添加し、37℃で20時間インキュベートする。4×サンプル
緩衝液を添加するにより、反応を停止させ、直ちに5分間煮沸する。SDS-PAGEの
後、タンパク質バンドを銀染色により視覚化する。
【１０３８】 合成蛍光性ペプチド基質の切断アッセイ： メタロプロテイナーゼ活性が実証されている本発明の融合タンパク質の基質特
異性は、合成蛍光性ペプチド基質(BACHEM Bioscience Incから購入した)を使用
するなどの、当技術分野で公知の方法を用いて調べることが可能である。試験基
質としては、M-1985、M-2225、M-2105、M-2110、およびM-2255が挙げられる。最
初の4つはMMP基質であり、最後の1つは、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)転換酵素(TAC
E)の基質である。これらの基質は、好ましくは、1:1ジメチルスルホキシド(DMSO
)および水で調製される。ストック溶液は、50〜500μMである。蛍光アッセイは
、恒温水浴を備えたPerkin Elmer LS 50Bルミネセンス分光計を用いて行う。励
起λは328nmであり、発光λは393nmである。簡潔に述べると、176μlの1×HEPES
緩衝液(0.2M NaCl、10mM CaCl2、0.05% Brij-35および50mM HEPES、pH 7.5)を4
μlの基質溶液(50μM)と共に25℃で15分間インキュベートし、次に20μlの本発
明の精製融合タンパク質をアッセイキュベットに添加するにより、アッセイを行
う。基質の最終濃度は1μMである。初期の加水分解速度を30分間モニターする。
【１０３９】 以上の説明および実施例に特に記載されている以外の方法を用いて本発明を実
施しうることは明らかであろう。本発明の多くの修正および変更が上記の教示に
照らして可能であり、したがって、それらは特許請求の範囲内に含まれる。
【１０４０】 引用された各文献(特許、特許出願、特許刊行物、雑誌論文、要約、実験マニ
ュアル、書籍、または他の開示物を含む)ならびに本出願で言及されているGenBa
nk、GeneSeq、またはCAS Registryのようなデータベースに特有の識別番号を介
して利用可能な情報の全開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れ
られるものとする。以下の米国特許出願のそれぞれの明細書および配列表は、参
照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする： 2000年4月12日付け
の同第60/229,358号; 2000年4月25日付けの同第60/199,384号および2000年12月2
1日付けの同第60/256,931号。
【１０４１】 ATCC寄託番号：未設定 カナダ 本出願人は、出願に基づきカナダ特許が発行されるまで、あるいは出願が拒絶
されるか、放棄されてもはや回復することがないか、または取り下げられるまで
は、特許庁長官が、特許庁長官に指名された第三者的立場の専門家に対してだけ
、本出願において言及する寄託生物材料のサンプルを提供する権限を有するよう
に、請求する。従って本出願人は、国際出願の公開のための手続的準備の完了前
に、国際事務局に上申書により通知する必要がある。
【１０４２】 ノルウェー 本出願人は、本出願が（ノルウェー特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくノルウェー特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるよ
うに、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がノルウェー特許法の
22条および33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がノ
ルウェー特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合
、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを用いることを示さなく
てはならない。専門家とは、ノルウェー特許庁が作成した公認専門家のリストに
記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０４３】 オーストラリア 本出願人は、特許の付与前、あるいは本出願の失効、拒絶または取り下げの前
には、微生物サンプルは本発明に利害関係を有しない技術者の受け取り手に対し
てのみ提供されるように、ここに強調する（オーストラリア特許法規則の、規則
3.25(3)）。
【１０４４】 フィンランド 本出願人は、本出願が（フィンランド特許庁(National Board of Patents and
Regulations)により）公衆の閲覧のために公開されるまで、または閲覧用に公
開されることなくフィンランド特許庁により最終決定が下されるまでは、サンプ
ルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるように、ここに請求する。
【１０４５】 英国 本出願人は、微生物サンプルは専門家のみが入手できるように提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願の国際公開の手続的準備
の完了前に、出願人が国際事務局に提出する必要がある。
【１０４６】 デンマーク 本出願人は、本出願が（デンマーク特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくデンマーク特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるように、
ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がデンマーク特許法の22条お
よび33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がデンマー
ク特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合、第三
者によるサンプル提供のいかなる要求でも、専門家がそれを用いることを示さな
くてはならない。専門家とは、デンマーク特許庁が作成した公認専門家のリスト
に記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０４７】 スウェーデン 本出願人は、本出願が（スウェーデン特許庁により）公衆の閲覧のために公開
されるまで、または閲覧用に公開されることなくスウェーデン特許庁により最終
決定が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、優先日から16ヶ月の期限満了前
に、出願人が、（好ましくは、PCT出願人ガイドの第１巻の付録Zに掲載された様
式PCT/RO/134に基づいて）国際事務局に提出するものとする。前記請求が出願人
により提出された場合、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを
用いることを示さなくてはならない。専門家とは、スウェーデン特許庁が作成し
た公認専門家のリストに記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認
めた任意の者である。
【１０４８】 オランダ 本出願人は、オランダ特許が付与される日まで、あるいは本出願が拒絶される
か、取り下げられるか、または失効する日までは、特許法規則31F(1)に規定され
るように、微生物サンプルは専門家のみが入手可能となるよう供給されるように
、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がオランダ王国特許法の22
C条または25条に基づき公衆に利用可能となる日のいずれか早い日よりも前に、
出願人がオランダ知的財産局に提出する必要がある。
【１０４９】 ATCC寄託番号：未設定 カナダ 本出願人は、出願に基づきカナダ特許が発行されるまで、あるいは出願が拒絶
されるか、放棄されてもはや回復することがないか、または取り下げられるまで
は、特許庁長官が、特許庁長官に指名された第三者的立場の専門家に対してだけ
、本出願において言及する寄託生物材料のサンプルを提供する権限を有するよう
に、請求する。従って本出願人は、国際出願の公開のための手続的準備の完了前
に、国際事務局に上申書により通知する必要がある。
【１０５０】 ノルウェー 本出願人は、本出願が（ノルウェー特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくノルウェー特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるよ
うに、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がノルウェー特許法の
22条および33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がノ
ルウェー特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合
、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを用いることを示さなく
てはならない。専門家とは、ノルウェー特許庁が作成した公認専門家のリストに
記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０５１】 オーストラリア 本出願人は、特許の付与前、あるいは本出願の失効、拒絶または取り下げの前
には、微生物サンプルは本発明に利害関係を有しない技術者の受け取り手に対し
てのみ提供されるように、ここに強調する（オーストラリア特許法規則の、規則
3.25(3)）。
【１０５２】 フィンランド 本出願人は、本出願が（フィンランド特許庁(National Board of Patents and
Regulations)により）公衆の閲覧のために公開されるまで、または閲覧用に公
開されることなくフィンランド特許庁により最終決定が下されるまでは、サンプ
ルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるように、ここに請求する。
【１０５３】 英国 本出願人は、微生物サンプルは専門家のみが入手できるように提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願の国際公開の手続的準備
の完了前に、出願人が国際事務局に提出する必要がある。
【１０５４】 デンマーク 本出願人は、本出願が（デンマーク特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくデンマーク特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるように、
ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がデンマーク特許法の22条お
よび33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がデンマー
ク特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合、第三
者によるサンプル提供のいかなる要求でも、専門家がそれを用いることを示さな
くてはならない。専門家とは、デンマーク特許庁が作成した公認専門家のリスト
に記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０５５】 スウェーデン 本出願人は、本出願が（スウェーデン特許庁により）公衆の閲覧のために公開
されるまで、または閲覧用に公開されることなくスウェーデン特許庁により最終
決定が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、優先日から16ヶ月の期限満了前
に、出願人が、（好ましくは、PCT出願人ガイドの第１巻の付録Zに掲載された様
式PCT/RO/134に基づいて）国際事務局に提出するものとする。前記請求が出願人
により提出された場合、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを
用いることを示さなくてはならない。専門家とは、スウェーデン特許庁が作成し
た公認専門家のリストに記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認
めた任意の者である。
【１０５６】 オランダ 本出願人は、オランダ特許が付与される日まで、あるいは本出願が拒絶される
か、取り下げられるか、または失効する日までは、特許法規則31F(1)に規定され
るように、微生物サンプルは専門家のみが入手可能となるよう供給されるように
、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がオランダ王国特許法の22
C条または25条に基づき公衆に利用可能となる日のいずれか早い日よりも前に、
出願人がオランダ知的財産局に提出する必要がある。
【１０５７】 ATCC寄託番号：未設定 カナダ 本出願人は、出願に基づきカナダ特許が発行されるまで、あるいは出願が拒絶
されるか、放棄されてもはや回復することがないか、または取り下げられるまで
は、特許庁長官が、特許庁長官に指名された第三者的立場の専門家に対してだけ
、本出願において言及する寄託生物材料のサンプルを提供する権限を有するよう
に、請求する。従って本出願人は、国際出願の公開のための手続的準備の完了前
に、国際事務局に上申書により通知する必要がある。
【１０５８】 ノルウェー 本出願人は、本出願が（ノルウェー特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくノルウェー特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるよ
うに、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がノルウェー特許法の
22条および33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がノ
ルウェー特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合
、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを用いることを示さなく
てはならない。専門家とは、ノルウェー特許庁が作成した公認専門家のリストに
記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０５９】 オーストラリア 本出願人は、特許の付与前、あるいは本出願の失効、拒絶または取り下げの前
には、微生物サンプルは本発明に利害関係を有しない技術者の受け取り手に対し
てのみ提供されるように、ここに強調する（オーストラリア特許法規則の、規則
3.25(3)）。
【１０６０】 フィンランド 本出願人は、本出願が（フィンランド特許庁(National Board of Patents and
Regulations)により）公衆の閲覧のために公開されるまで、または閲覧用に公
開されることなくフィンランド特許庁により最終決定が下されるまでは、サンプ
ルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるように、ここに請求する。
【１０６１】 英国 本出願人は、微生物サンプルは専門家のみが入手できるように提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願の国際公開の手続的準備
の完了前に、出願人が国際事務局に提出する必要がある。
【１０６２】 デンマーク 本出願人は、本出願が（デンマーク特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくデンマーク特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるように、
ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がデンマーク特許法の22条お
よび33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がデンマー
ク特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合、第三
者によるサンプル提供のいかなる要求でも、専門家がそれを用いることを示さな
くてはならない。専門家とは、デンマーク特許庁が作成した公認専門家のリスト
に記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０６３】 スウェーデン 本出願人は、本出願が（スウェーデン特許庁により）公衆の閲覧のために公開
されるまで、または閲覧用に公開されることなくスウェーデン特許庁により最終
決定が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、優先日から16ヶ月の期限満了前
に、出願人が、（好ましくは、PCT出願人ガイドの第１巻の付録Zに掲載された様
式PCT/RO/134に基づいて）国際事務局に提出するものとする。前記請求が出願人
により提出された場合、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを
用いることを示さなくてはならない。専門家とは、スウェーデン特許庁が作成し
た公認専門家のリストに記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認
めた任意の者である。
【１０６４】 オランダ 本出願人は、オランダ特許が付与される日まで、あるいは本出願が拒絶される
か、取り下げられるか、または失効する日までは、特許法規則31F(1)に規定され
るように、微生物サンプルは専門家のみが入手可能となるよう供給されるように
、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がオランダ王国特許法の22
C条または25条に基づき公衆に利用可能となる日のいずれか早い日よりも前に、
出願人がオランダ知的財産局に提出する必要がある。
【１０６５】 ATCC寄託番号：未設定 カナダ 本出願人は、出願に基づきカナダ特許が発行されるまで、あるいは出願が拒絶
されるか、放棄されてもはや回復することがないか、または取り下げられるまで
は、特許庁長官が、特許庁長官に指名された第三者的立場の専門家に対してだけ
、本出願において言及する寄託生物材料のサンプルを提供する権限を有するよう
に、請求する。従って本出願人は、国際出願の公開のための手続的準備の完了前
に、国際事務局に上申書により通知する必要がある。
【１０６６】 ノルウェー 本出願人は、本出願が（ノルウェー特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくノルウェー特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるよ
うに、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がノルウェー特許法の
22条および33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がノ
ルウェー特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合
、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを用いることを示さなく
てはならない。専門家とは、ノルウェー特許庁が作成した公認専門家のリストに
記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０６７】 オーストラリア 本出願人は、特許の付与前、あるいは本出願の失効、拒絶または取り下げの前
には、微生物サンプルは本発明に利害関係を有しない技術者の受け取り手に対し
てのみ提供されるように、ここに強調する（オーストラリア特許法規則の、規則
3.25(3)）。
【１０６８】 フィンランド 本出願人は、本出願が（フィンランド特許庁(National Board of Patents and
Regulations)により）公衆の閲覧のために公開されるまで、または閲覧用に公
開されることなくフィンランド特許庁により最終決定が下されるまでは、サンプ
ルは当該技術分野の専門家に対してのみ提供されるように、ここに請求する。
【１０６９】 英国 本出願人は、微生物サンプルは専門家のみが入手できるように提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願の国際公開の手続的準備
の完了前に、出願人が国際事務局に提出する必要がある。
【１０７０】 デンマーク 本出願人は、本出願が（デンマーク特許庁により）公衆の閲覧のために公開さ
れるまで、または閲覧用に公開されることなくデンマーク特許庁により最終決定
が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるように、
ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がデンマーク特許法の22条お
よび33(3)条に基づき公衆に利用可能となる時点よりも前に、出願人がデンマー
ク特許庁に提出するものとする。前記請求が出願人により提出された場合、第三
者によるサンプル提供のいかなる要求でも、専門家がそれを用いることを示さな
くてはならない。専門家とは、デンマーク特許庁が作成した公認専門家のリスト
に記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認めた任意の者である。
【１０７１】 スウェーデン 本出願人は、本出願が（スウェーデン特許庁により）公衆の閲覧のために公開
されるまで、または閲覧用に公開されることなくスウェーデン特許庁により最終
決定が下されるまでは、サンプルは当該技術分野の専門家にのみ提供されるよう
に、ここに請求する。このような効果の請求は、優先日から16ヶ月の期限満了前
に、出願人が、（好ましくは、PCT出願人ガイドの第１巻の付録Zに掲載された様
式PCT/RO/134に基づいて）国際事務局に提出するものとする。前記請求が出願人
により提出された場合、第三者によるサンプル提供の要求では、専門家がそれを
用いることを示さなくてはならない。専門家とは、スウェーデン特許庁が作成し
た公認専門家のリストに記載された任意の者、または個々の場合に本出願人が認
めた任意の者である。
【１０７２】 オランダ 本出願人は、オランダ特許が付与される日まで、あるいは本出願が拒絶される
か、取り下げられるか、または失効する日までは、特許法規則31F(1)に規定され
るように、微生物サンプルは専門家のみが入手可能となるよう供給されるように
、ここに請求する。このような効果の請求は、本出願がオランダ王国特許法の22
C条または25条に基づき公衆に利用可能となる日のいずれか早い日よりも前に、
出願人がオランダ知的財産局に提出する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 細胞培地中で最大５週間にわたり37℃でインキュベートした後に残存している
HA-hGHの生物学的活性（Nb2細胞増殖）に基づいて、HA融合タンパク質の貯蔵寿
命の延長を示した図である。
【図２】 細胞培地中で最大３週間にわたり４℃、37℃または50℃でインキュベートした
後に残存しているHA-hGHの安定な生物学的活性（Nb2細胞増殖）に基づいて、HA
融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示した図である。
【図３】 各種濃度のhGHまたはアルブミン融合タンパク質と共に24時間（Ａ）または48
時間（Ｂ）インキュベートするNb2細胞増殖アッセイで、HA-hGHの生物学的活性
をhGHと比較した図である。
【図４】 HA融合体を形成するために治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを
クローニングすることができる基本ベクターとして使用可能なプラスミド（pPPC
0005）の地図を示した図である。
【図５】 バイアル中で48または72時間貯蔵した後の、各種濃度のHA-IFN溶液の回復をス
トック溶液と比較した図である。
【図６】 IVまたはSCでサルに投与した後のHA-IFNα融合タンパク質の活性を比較した図
である。
【図７】 HA-IFNα融合タンパク質の生物学的利用能および安定性を示した図である。
【図８】 HA-IFNα生産用の発現ベクターの地図を示した図である。
【図９】 HA中のループの位置を示した図である。
【図１０】 HAループの改変の例を示した図である。
【図１１】 HAループを示した図である。
【図１２】 HAループIVを示した図である。
【図１３】 HAの三次構造を示した図である。
【図１４】 scFv-HA融合体の例を示した図である。
【図１５】 成熟型のヒトアルブミンのアミノ酸配列（配列番号18）およびそれをコードす
るポリヌクレオチド（配列番号17）を示した図である。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/48 Ａ６１Ｐ 25/28 ４Ｃ０８５ 38/55 31/12 ４Ｈ０４５ 39/395 31/14 47/48 31/18 Ａ６１Ｐ 1/16 31/20 15/00 35/00 17/12 35/02 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/56 31/12 14/745 31/14 14/75 31/18 14/765 31/20 14/81 35/00 16/00 35/02 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/56 Ｃ１２Ｎ 1/19 14/745 1/21 14/75 9/14 14/765 9/74 14/81 9/99 16/00 15/00 ＺＮＡＡ 19/00 5/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ａ６１Ｋ 37/02 1/21 37/66 Ｇ 5/10 37/54 9/14 37/64 9/74 37/48 9/99 37/547 37/475 (31)優先権主張番号 ６０／２５６，９３１ (32)優先日 平成12年12月21日(2000．12．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バランス，デヴィッド，ジェームズ アメリカ合衆国 19312 ペンシルバニア 州 バーウィン，シムリー ドライブ 1113 (72)発明者 スリープ，ダレル イギリス国 エヌジー２ ５ディーエス ノッティンガム，ウエスト ブリッジフォ ード，レディーベイ ロード 66 (72)発明者 ターナー，アンドリュウ，ジョン アメリカ合衆国 19408 ペンシルバニア 州 イーグルビル，コンエストガ ウェイ 305，アパートメント シイー−28 (72)発明者 サデジー，ホマユーン アメリカ合衆国 18901 ペンシルバニア 州 ドイルズタウン，イースト コート ストリート 320 (72)発明者 プライアー，クリストファー，ピイ． アメリカ合衆国 19010 ペンシルバニア 州 ローズモント，ワールドヘブン ロー ド 460 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA07 BA11 BA14 BA19 BA23 BA41 CA01 CA04 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 4B050 CC03 CC04 CC05 DD07 LL01 LL03 4B065 AA01X AA57X AA90X AA90Y AB01 BA01 CA24 CA25 CA31 CA44 CA46 4C076 CC07 CC14 CC17 CC18 CC27 CC29 CC30 CC35 CC41 EE41 EE59 FF31 FF36 FF63 4C084 AA02 AA07 BA17 BA18 BA22 BA44 CA18 CA53 DA27 DA36 DA37 DA39 DA50 DB22 DB34 DB52 DC02 DC03 DC10 DC14 DC15 DC16 DC17 DC32 DC35 MA05 NA03 NA05 NA12 NA13 ZA15 ZA53 ZA54 ZA75 ZA81 ZA89 ZA91 ZB05 ZB09 ZB26 ZB27 ZB33 ZC03 ZC19 ZC20 ZC55 4C085 AA13 BA83 BA88 BA89 BB11 BB31 CC07 CC08 CC21 CC22 CC31 DD62 EE01 GG01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA16 DA56 DA65 DA70 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 治療用タンパク質Ｘと、配列番号18のアミノ酸配列を含むア
    ルブミンと、を含んでなるアルブミン融合タンパク質。
  2. 【請求項２】 治療用タンパク質Ｘと、アルブミン活性を有する配列番号18
    のアミノ酸配列の断片または変異体と、を含むアルブミン融合タンパク質。
  3. 【請求項３】 前記アルブミン活性が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘの
    貯蔵寿命と比較して、治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命を長引かせる能力である、
    請求項２に記載のアルブミン融合タンパク質。
  4. 【請求項４】 前記断片または変異体が、配列番号18のアミノ酸1〜387のア
    ミノ酸配列を含む、請求項２に記載のアルブミン融合タンパク質。
  5. 【請求項５】 治療用タンパク質Ｘがインターフェロンαを含む請求項１〜
    ４のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  6. 【請求項６】 治療用タンパク質Ｘの断片または変異体と、配列番号18のア
    ミノ酸配列を含むアルブミンと、を含んでなるアルブミン融合タンパク質であっ
    て、該断片または変異体が治療用タンパク質Ｘの生物活性を有するものである、
    上記アルブミン融合タンパク質。
  7. 【請求項７】 治療用タンパク質Ｘがインターフェロンαを含み、前記断片
    または変異体が抗ウイルス活性を有するかまたは細胞増殖を抑制する、請求項６
    に記載のアルブミン融合タンパク質
  8. 【請求項８】 治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が以下： (a)血清コリンエステラーゼ； (b)α−１アンチトリプシン； (c)アプロチニン； (d)凝血剤複合体； (e)フォン・ビルブラント因子； (f)フィブリノーゲン； (g)第VII因子； (h)活性第VIIA因子； (i)第VIII因子； (j)第IX因子； (k)第X因子； (l)第XIII因子； (m)ｃ１インアクチベーター； (n)アンチトロンビンIII； (o)トロンビン； (p)プロトロンビン； (q)アポ−リポタンパク質； (r)ｃ−反応性タンパク質； (s)プロテインＣ；および (t)免疫グロブリン からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１〜４または６のいずれか
    １項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  9. 【請求項９】 治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、アル
    ブミンのＮ末端、またはアルブミンの断片もしくは変異体のＮ末端に融合されて
    いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  10. 【請求項１０】 治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、ア
    ルブミンのＣ末端、またはアルブミンの断片もしくは変異体のＣ末端に融合され
    ている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  11. 【請求項１１】 治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、ア
    ルブミンのＮ末端とＣ末端、またはアルブミンの断片もしくは変異体のＮ末端と
    Ｃ末端に融合されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルブミン融合
    タンパク質。
  12. 【請求項１２】 第１の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体
    、および第２の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体を含み、その
    際、第１の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体は、第２の治療用
    タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体と異なるものである、請求項１〜８
    のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  13. 【請求項１３】 治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、リ
    ンカーによってアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体から分離され
    ている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  14. 【請求項１４】 アルブミン融合タンパク質が次式： R1-L-R2、R2-L-R1、またはR1-L-R2-L-R1 [式中、R1は治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体であり、Lはペプ
    チドリンカーであり、R2は配列番号18のアミノ酸配列を含むアルブミンまたはア
    ルブミンの断片もしくは変異体である] で表される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質
    。
  15. 【請求項１５】 アルブミン融合タンパク質の貯蔵寿命が、非融合状態の治
    療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命より長い、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の
    アルブミン融合タンパク質。
  16. 【請求項１６】 アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合された、
    治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のin vitro生物活性が、非融
    合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のin vitro生物活性
    よりも高い、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質
    。
  17. 【請求項１７】 アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合された、
    治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のin vivo生物活性が、非融
    合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のin vivo生物活性
    よりも高い、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質
    。
  18. 【請求項１８】 配列番号18のアミノ酸配列を含むアルブミンまたはその断
    片もしくは変異体に挿入された、ペプチドを含むアルブミン融合タンパク質。
  19. 【請求項１９】 下記のアミノ酸配列： (a) 配列番号18のアミノ酸54〜61、 (b) 配列番号18のアミノ酸76〜89、 (c) 配列番号18のアミノ酸92〜100、 (d) 配列番号18のアミノ酸170〜176、 (e) 配列番号18のアミノ酸247〜252、 (f) 配列番号18のアミノ酸266〜277、 (g) 配列番号18のアミノ酸280〜288、 (h) 配列番号18のアミノ酸362〜368、 (i) 配列番号18のアミノ酸439〜447、 (j) 配列番号18のアミノ酸462〜475、 (k) 配列番号18のアミノ酸478〜486、 (l) 配列番号18のアミノ酸560〜566、 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアルブミンに挿入された、ペプチ
    ドを含むアルブミン融合タンパク質。
  20. 【請求項２０】 アルブミン融合タンパク質が、非融合状態のペプチドの貯
    蔵寿命と比較して、該ペプチドの貯蔵寿命を長引かせるのに十分なアルブミンの
    部分を含む、請求項１８または１９に記載のアルブミン融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】 アルブミン融合タンパク質が、非融合状態のペプチドのin vitro生物活性と比較して、アルブミンに融合したペプチドのin vitro生物活性
    を長引かせるのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項１８または１９に記載
    のアルブミン融合タンパク質。
  22. 【請求項２２】 アルブミン融合タンパク質が、非融合状態のペプチドのin vivo生物活性と比較して、アルブミンに融合したペプチドのin vivo生物活性を
    長引かせるのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項１８または１９に記載の
    アルブミン融合タンパク質。
  23. 【請求項２３】 一本鎖抗体またはその一部および配列番号１８のアミノ酸
    配列を含むアルブミンまたはその断片もしくは変異体を含むアルブミン融合タン
    パク質。
  24. 【請求項２４】 グリコシル化されていない、請求項１〜２３のいずれか１
    項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  25. 【請求項２５】 酵母において発現させたものである、請求項１〜２３のい
    ずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  26. 【請求項２６】 前記酵母がグリコシル化に欠陥がある、請求項２５に記載
    のアルブミン融合タンパク質。
  27. 【請求項２７】 前記酵母がグリコシル化およびプロテアーゼに欠陥がある
    、請求項２５に記載のアルブミン融合タンパク質。
  28. 【請求項２８】 哺乳動物細胞において発現させたものである、請求項１〜
    ２３のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  29. 【請求項２９】 アルブミン融合タンパク質が培養下の哺乳動物細胞におい
    て発現させたものである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のアルブミン融
    合タンパク質。
  30. 【請求項３０】 アルブミン融合タンパク質が分泌リーダー配列をさらに含
    む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
  31. 【請求項３１】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載のアルブミン融合タ
    ンパク質および製薬上許容される担体を含有する組成物。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載の組成物を含むキット。
  33. 【請求項３３】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載のアルブミン融合タ
    ンパク質を投与することを含んでなる、患者における疾患または障害の治療方法
    。
  34. 【請求項３４】 前記疾患または障害が適応症Ｙを含む、請求項３３に記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】 治療用タンパク質Ｘが、インターフェロンαまたはその断
    片もしくは変異体を含み、前記疾患または障害が、ヘアリーセル白血病;カポジ
    肉腫;性器いぼ;肛門いぼ;慢性Ｂ型肝炎;慢性非Ａ型、非Ｂ型肝炎;Ｃ型肝炎;Ｄ型
    肝炎;慢性骨髄性白血病;腎細胞癌;膀胱癌;卵巣癌;子宮頸癌;皮膚癌;再発性呼吸
    器系乳頭腫症;非ホジキンリンパ腫;悪性皮膚T細胞リンパ腫;黒色腫;多発性骨髄
    腫;ＡＩＤＳ;多発性硬化症;およびグリア芽細胞腫からなる群から選択される、
    請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 有効量の請求項１〜３０のいずれか１項に記載のアルブミ
    ン融合タンパク質を投与することを含んでなる、治療用タンパク質Ｘによりモジ
    ュレートされる疾患または障害をもつ患者の治療方法。
  37. 【請求項３７】 前記疾患または障害が適応症Ｙである、請求項３６に記載
    の方法。
  38. 【請求項３８】 治療用タンパク質Ｘがインターフェロンαまたはその断片
    もしくは変異体であり、前記疾患または障害が、ヘアリーセル白血病;カポジ肉
    腫;性器いぼ;肛門いぼ;慢性Ｂ型肝炎;慢性非Ａ型、非Ｂ型肝炎;Ｃ型肝炎;Ｄ型肝
    炎;慢性骨髄性白血病; 腎細胞癌;膀胱癌;卵巣癌;子宮頸癌;皮膚癌;再発性呼吸器
    系乳頭腫症;非ホジキンリンパ腫;悪性皮膚T細胞リンパ腫;黒色腫;多発性骨髄腫;
    ＡＩＤＳ;多発性硬化症;およびグリア芽細胞腫からなる群から選択される、請求
    項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 非融合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは
    変異体の貯蔵寿命と比較して、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異
    体の貯蔵寿命を引き延ばすのに十分なアルブミンまたはその断片もしくは変異体
    に、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体を融合させることを含ん
    でなる、治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命を引き延ばす方法。
  40. 【請求項４０】 請求項１〜３０のいずれか１項に記載のアルブミン融合タ
    ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  41. 【請求項４１】 請求項４０に記載の核酸分子を含有するベクター。
  42. 【請求項４２】 請求項４０に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
JP2001576866A 2000-04-12 2001-04-12 アルブミン融合タンパク質 Pending JP2003530839A (ja)

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