ES2204899T3 - Modelos de animales transgenicos para la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
Modelos de animales transgenicos para la enfermedad de alzheimer.Info
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Abstract
SE DESCRIBE LA CONSTRUCCION DE MODELOS ANIMALES PARA EVALUAR LOS POSIBLES TRATAMIENTOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. LOS MODELOS SE CARACTERIZAN POR SU GRAN SIMILITUD CON LAS CONDICIONES NATURALES DE APARICION DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, BASADAS EN LA EXPRESION DE LAS TRES FORMAS DE PROTEINA PRECURSORA BETA-AMILOIDE (PPA), PPA695, PPA751 Y PPA770, Y EN VARIAS MUTACIONES PUNTUALES BASADAS EN MUTACIONES NATURALES, COMO LAS MUTACIONES DEL AMINOACIDO 717 EN LA ENFERMEDAD FAMILIAR DE ALZHEIMER (EFA) EN LONDRES E INDIANA, Y MUTACIONES PREDICHAS EN EL GEN PPA. LOS CONSTRUCTOS DE GEN PPA SE PREPARAN UTILIZANDO EL PROMOTOR NATURAL, O PROMOTORES INDUCIBLES COMO EL PROMOTOR DE METALOTIONINA DEL RATON QUE PUEDEN REGULARSE CON LA ADICION DE METALES PESADOS COMO EL ZINC AL AGUA O A LA DIETA DEL ANIMAL, Y PROMOTORES COMO EL PROMOTOR DE ENOLASA ESPECIFICA DE LA NEURONA DE RATA, PROMOTOR DEL GEN ACTINA BETA HUMANO, PROMOTOR DEL GEN HUMANO DE PLAQUETA DERIVADA DEL CRECIMIENTO DE FACTOR B (PDCF-B), PROMOTOR DEL GEN DE CANAL SODIO DE RATA, PROMOTOR DEL GEN DE PROTEINA BASICA DE MIELINA DEL RATON, PROMOTOR DEL GEN DE DISMUTASA DE SUPEROXIDO DE COBRE-ZINC HUMANO Y PROMOTOR DEL GEN REGULADOR DE TIPO POU MAMALIANO. LOS CONSTRUCTOS SE INTRODUCEN EN EMBRIONES ANIMALES USANDO TECNICAS ESTANDAR COMO LA MICROINYECCION. LAS CELULAS ANIMALES SE PUEDEN AISLAR DE LOS ANIMALES TRANSGENICOS O PREPARAR EMPLEANDO LOS MISMOS CONSTRUCTOS CON TECNICAS ESTANDAR COMO LIPOFECCION O ELECTROPORACION. LOS ANIMALES TRANSGENICOS O LAS CELULAS ANIMALES SE USAN PARA DETECTAR COMPONENTES QUE ALTERAN EL CURSO PATOLOGICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER EVALUADOS POR SUS EFECTOS SOBRE LA CANTIDAD E HISTOPATOLOGIA DE PPA Y PEPTIDA BETA-AMILOIDE EN LOS ANIMALES Y POR ALTERACIONES CONDUCTUALES.
Description
Modelos de animales transgénicos para la
enfermedad de Alzheimer.
Se describe la tecnología transgénica para la
producción de animales que presenten los síntomas de la enfermedad
humana de Alzheimer, ya sea a través de la expresión de la proteína
precursora del Alzheimer como de una versión modificada de la
misma.
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden
degenerativo del cerebro; fue descrito por primera vez por Alois
Alzheimer en 1907, después de examinar a uno de sus pacientes, que
sufría una severa disminución de las funciones cognitivas y padecía
una demencia generalizada ("The early story of Alzheimer
Disease", editado por Bick K. Amaducci L. y Pepeu G. (Raven
Press, Nueva York, 1987). Esta enfermedad es la principal causa de
demencia en las personas de edad avanzada. Los pacientes con EA
presentan una creciente pérdida de la memoria y de las funciones
intelectuales, que van evolucionando hasta el punto de volverlos
incapaces de comportarse como individuos normales. Simultáneamente a
la pérdida de capacidades intelectuales, el paciente presenta
trastornos de la personalidad, alteraciones en su conducta social y
esquizofrenia ("A guide to the understanding of Alzheimer's
Disease and related disorders", editado por Jorm, A.F; (New York
University Press, Nueva York 1987). La EA es una enfermedad
devastadora, tanto para el enfermo como para su entorno familiar, ya
que no hay un tratamiento paliativo o preventivo efectivo que evite
la neurodegeneración progresiva. Los problemas más frecuentes del
paciente con Alzheimer son: incapacidad para vestirse sin ayuda,
agitación diurna, incontinencia urinaria y trastornos del sueño.
Los familiares han informado asimismo sobre episodios de
desconcierto, ansiedad, depresión, y sobre una progresiva retracción
a la vida social.
El impacto de la EA sobre la sociedad y la
economía nacional es enorme. Se espera que la demencia en la
población de edad avanzada de los Estados Unidos se incremente en un
41% para el año 2000. Resulta una enfermedad cara para los sistemas
sanitarios, que deben aportar cuidados institucionales y
suplementarios para los pacientes, con un coste anual estimado en 40
\textdollarbillones (Jorm, 1987; Fisher, L.M: New York Times, 23 de Agosto de 1989, D1 "Alzheimer's disease", editado por Reisberg, B., (The Free Press, Nueva York y Londres, 1983). Estos factores suponen que se deba implementar una acción de prevención para disminuir la incidencia de la EA, asignando recursos a la investigación de la misma.
A nivel macroscópico, el cerebro de los pacientes
con EA es generalmente más pequeño de lo normal, llegando algunas
veces a pesar menos de 1.000 gramos. A nivel microscópico, los
síntomas histopatológicos de la EA incluyen nódulos neurofibrilares
(NNF), placas neuríticas y degeneración neuronal. Los pacientes con
la EA muestran una degeneración de las células nerviosas del córtex
frontal y temporal, de las neuronas piramidales del hipocampo, de
las neuronas de la parte media, media-central y
cortical del núcleo de la amígdala, de las neuronas noradrenérgicas
en el locus ceruleus, y de las neuronas del sistema
colinérgico del presencéfalo basal. La pérdida neuronal en el
sistema colinérgico que se da en la EA, supone el correspondiente
déficit de los marcadores colinérgicos presinápticos (Reisberg,
1983; "Alzheimer's Disease and related disorders, research and
development" editado por Kelly W.E., (Charles C. Thomas,
Springfield, IL. 1984).
La EA se asocia con la presencia de placas
neuríticas, que llegan a medir hasta 200 \mum de diámetro, en el
córtex, el hipocampo, el subículum, la circunvolución del
hipocampo, y la amígdala. Uno de los principales componentes de las
placas neuríticas es el amiloide, sustancia susceptible de tinción
mediante Rojo Congo (Reisberg, 1983: Kelly, 1984). Las placas
amiloideas son extracelulares, aparecen coloreadas en rosa o en
color óxido, sobre un campo claro, y son birrefringentes a la luz
polarizada. Las placas están compuestas por fibrillas de polipéptido
y es frecuente encontrarlas alrededor de los vasos sanguíneos,
reduciendo así el suministro de sangre a varias de las neuronas del
cerebro.
Se han sugerido varios factores como posibles
mecanismos de la neuropatía EA: la predisposición genética, la
acción de agentes infecciosos, la presencia de toxinas, de metales,
y los traumas craneales. Sin embargo, las evidencias de las que se
dispone indican con toda claridad dos distintos tipos de
predisposición genética a la EA. En primer lugar, el análisis
molecular ha aportado evidencias de mutaciones en el gen de la
proteína precursora del amiloide (APP) en ciertas familias con
predisposición a la EA (Goate, y col., Nature 349,
704-706 (1991); Murrell, J. y col. Science
254, 97-99, 1991; Chartier-Harlin,
M-C, y col. Nature 353,
844-846 (1991). En segundo lugar, para otras
familias con una clara predisposición genética a la EA, se aportan
mapas de la mutación del cromosoma 21 que es diferente a la del
locus del APP (Tanzi, R.E., y col. Nature, 331,
528-530 (1988).
Las placas de amiloide están presentes de forma
abundante en los pacientes con la EA y en individuos con el Síndrome
de Down que sobreviven después de los 40 años. Las placas también
están presentes en el cerebro normal de las personas de edad
avanzada, aunque en una proporción inferior. Estas placas están
constituidas por el péptido \beta amiloide (\beta péptido)
(Glenner y Wong, y col. Biochem Biophys. Res. Comm. 120,
885-890 (1984), que es también la principal proteina
constituyente de los depósitos cerebrovasculares y de los nódulos
neurofibrilares. El \beta péptido es un material filamentoso,
dispuesto en láminas beta plegadas, con un peso molecular de
4.2-4.5 kd. Es un péptido hidrófobo que consta de
39-42 aminoácidos. La determinación de su secuencia
de aminoácidos llevó a la clonación del ADNc de la APP (Kang y col.,
Nature 325, 733-735 (1987); Goldgaber y col.,
Science 235, 877 - 880 (1987); Robakis y col. Proc. Natl.
Acad. Sci 84, 4190-4194 (1987); Tanzi y col.,
Nature 331, 528-530 (1988) y del ADN genómico
de la APP (Lemaire y col. Nucl. Acids Res. 17:
517-522; Yoshikai y col. Gene 87,
257-263 (1990). Se han aislado las tres formas de
ADNc de la APP (APP695, APP751, APP770), y las tres se originan a
partir de un único ARN precursor por medio del corte y empalme
alternativo. El gen se extiende por más de 175 Kb y tiene 18 exones
(Yoshikai, y col., 1990). La APP contiene tres dominios
extracelulares, una región transmebranosa y un dominio citoplásmico.
El \beta péptido consta exactamente de 28 aminoácidos fuera de la
membrana y de 14 residuos del dominio transmembranoso hidrófobo. Por
lo tanto, el \beta péptido es un producto de la escisión de la APP
que se encuentra presente de forma normal en el cerebro y en otros
tejidos, como por ejemplo: el corazón, los riñones y bazo. Sin
embargo, los depósitos de \beta péptido por lo general sólo están
presentes en el cerebro, a pesar de que Joachim y col.,
Nature 341: 226-228 (1989) han informado
sobre depósitos de \beta péptido fuera del cerebro: en la piel, el
intestino y los tejidos subuctáneos de muchos pacientes con la
EA.
Las formas alternativas más grandes de la APP
(APP751, APP770) constan de de todos los dominios de la APP695 más
uno o dos dominios adicionales. La APP751 consta de todos los
aminoácidos de la APP695 más un aminoácido 56 adicional que tiene
una homología con los inhibidores de serin-proteasa
(KP1) de la familia Kunitz (Tanzi y col., 1988; Weidermann y col.
Cell 57: 115-126 (1989); Kitaguchi y col.,
Nature 331:530-532 (1988); Tanzi y col.,
Nature 329, 156 (1987). La APP770 contiene la APP751 y un
dominio aminoácido 19 adicional, homólogo al antígeno
OX-2 de la superficie de la célula neuronal
(Weidermann y col., Cell 57: 115-126 (1989);
Kitaguchi y col., (1988). La APP se modifica después de la
traducción por medio de la supresión de la secuencia líder y de la
adición de grupos sulfato y sacárido.
Van Broeckhaben y col., Science 248:
1120-1122 (1990) han demostrado que el gen de la APP
está estrechamente relacionado con la hemorragia cerebral
hereditaria con amiloidosis (HCHWA-D) de dos
familias holandesas. Este hecho se pudo confirmar al encontrar una
mutación puntual en la región codificadora de la APP en dos
pacientes holandeses (Levy y col., Science
248:1124-1128 (1990). La mutación consistía en la
sustitución de una glutamina por ácido glutámico en la posición 22
del \beta péptido (posición 618 de la APP695). Además, algunas
familias muestran una predisposición genética a la enfermedad de
Alzheimer, una condición a la que se hace referencia como Enfermedad
de Alzheimer Familiar (EAF) y que es resultado de las mutaciones
que suponen una sustitución del aminoácido de la posición 717 de la
longitud completa de la proteína. (Goate, y col., 1991; Murrell y
col., 1991; Chartier-Harlin y col., 1991). Estas
mutaciones co-segregan la enfermedad de tipo
familiar y están ausentes en las familias que presentan un comienzo
tardío de la EA.
No hay modelos animales reconocidos que permitan
el estudio de la EA, a pesar de que el envejecimiento en los
primates no humanos parece desarrollar placas amiloideas de \beta
péptido en el parénquima cerebral y en las paredes de algunos vasos
meníngeos y corticales. A pesar de que los primates y las especies
caninas pueden servir como modelos animales, su mantenimiento
resulta caro y necesitan largos períodos de estudio. En los animales
no se producen mutaciones espontáneas con el suficiente grado de
similitud con la EA como para resultar útiles como modelos
experimentales. Se han propuesto varios modelos en los que se pueden
inducir algunos síntomas similares a la EA mediante electrolisis,
transplante de muestras de cerebro con EA, aporte de cloruro de
aluminio, de análogos del ácido kaínico o de la colina (Kisner y
col., Neurobiol. Aging 7: 287-292 (1986);
Mistry J. S., y col., J. Med Chem. 29;
337-343 (1986). Flood y col., Proc. Ntl. Acad.
Sci. 88:3363-3366 (1986), informaron sobre los
efectos amnésicos que aparecían en ratones con cuatro péptidos de
síntesis homólogos al \beta péptido. Dado que ninguno de estos
comparte con la EA ningún otro síntoma en común, ni bioquímico ni
patogénico, no es muy probable que puedan aportar mucha información
útil sobre la etiología o el tratamiento de la enfermedad.
Se han producido ratones transgénicos con el
promotor de la APP humana ligado a la
\beta-galactosidasa de E. Coli (Wirak,
D.O., y col., The EMBO J. 10; 289-296 (1991),
también se han producido ratones transgénicos que expresan el ADNc
de la APP751 humana (Quon, D., y col., Nature 352,
239-241 (1991) o un subfragmento del ADNc que
incluye el \beta péptido (Wirak, D.O., y col., Science 253,
323-325 (1991); Sandhu, F.A., y col. J. Bio.
Chem. 266, 21331-21334 (1991); Kawabata, S.
Nature 354: 476-478 (1991). Los resultados
obtenidos en los diferentes estudios parecen depender de la
procedencia del promotor y de la secuencia de codificación de la
proteína utilizada. Por ejemplo, Wirak y col. (1991) encontraron que
en ratones transgénicos que expresaban una forma del \beta
péptido, se observaba una reacción ante los anticuerpos preparados
para actuar contra la APP de los depósitos intracelulares del
material "similar al amiloide", pero no se encontraron otros
síntomas histopatológicos de la enfermedad. La naturaleza
intracelular del material que reacciona ante los anticuerpos, y la
falta de otros síntomas, sugirieron que este animal transgénico en
concreto no era un sistema que sirviese como un modelo fiable de la
enfermedad de Alzheimer. Kawabata y col. (1991), informaron sobre la
producción de placas de amiloide, de nódulos neurofibrilares, y de
la aparición de necropsia neuronal en sus animales transgénicos. En
cada uno de estos estudios, se expresaba el mismo fragmento de
péptido: el \beta péptido más los restantes 56 aminoácidos
C-terminales de la APP. Wirak y col. (1991), usaron
el promotor humano de la APP, mientras que Kawabata y col. (1991)
utilizaron el promotor humano del thy-1. Se
observaron depósitos extracelulares de material reactivo ante el
anticuerpo preparado contra la APP en los ratones transgénicos que
expresaban el ADNc de la APP751 a partir del promotor de la enolasa
específica de la neurona de Quon, D. y col. Nature 352,
239-241 (1991). Lo que no se pudo demostrar fue si
los depósitos contenían toda la longitud de la APP751 o del \beta
péptido o ambos, imposibilitando por lo tanto establecer cualquier
correlación entre estos depósitos y aquellos presentes en la
enfermedad de Alzheimer. Quon y col. (1991) también afirman que la
proteína codificada por el ADNc de la APP695 que se expresa a partir
del promotor de la enolasa específico de las neuronas no forma
depósitos extracelulares inmunoreactivos. Estos resultados dan lugar
a la posibilidad de que, a pesar de que el \beta péptido esté
incluido en el precursor de la APP695, el uso del promotor de la
enolasa específica de las neuronas junto con el ADNc de la APP695
puede no resultar un modelo fidedigno de la enfermedad de Alzheimer.
Es más, en su particular modelo transgénico, la presencia de
depósitos de APP inmunorreactivos no está relacionada ni con la edad
ni con la dosificación del gen.
La enfermedad de Alzheimer es un síndrome
complejo, que incluye aspectos patológicos y alteraciones del
comportamiento. Un modelo realmente útil de la enfermedad debería
tomar en cuenta toda esta complejidad. Hay múltiples proteínas que
se expresan a partir del gen, con predominancia de algunas formas en
un tejido dado. En el cerebro, la forma predominante es la 695, pero
también están presentes los ARNm de las formas adicionales (Golde y
col., Neuron 4: 253-267 (1990). No se sabe si
la proporción entre las diferentes formas cambia con la edad del
individuo. Las distintas formas de proteína que son resultado de los
cortes y empalmes alternativos, tales como la del dominio Kl y/o del
dominio OX-2, pueden estar presentes o no en la
proteína madura. Es más, el \beta péptido es consecuencia de un
proceso posterior a la traducción de la proteína precursora. Este
proceso puede variar tanto en el momento como con las edades del
individuo, y puede verse afectado por mutaciones que no repercutan
directamente en la estructura del \beta péptido como, por ejemplo,
las mutaciones que se producen en la posición 717 del aminoácido de
la longitud total de la proteína (Groate y col., 1991; Murrell y
col., 1991; Chartier-Harlin y col., 1991) observadas
en la enfermedad de Alzheimer familiar. Tomando en cuenta estas
consideraciones, la producción de modelos animales universales para
la enfermedad de Alzheimer exige la construcción de modelos animales
que tomen en cuenta los efectos de las mutaciones conocidas sobre el
fenotipo que resulta de la expresión de estas formas, y la
posibilidad de que cambie la proporción de las diferentes formas
durante el período de vida del animal.
El WO 92/06187está relacionado con los roedores
transgénicos que resultan útiles para el estudio de la enfermedad de
Alzheimer y que tienen un transgen que incluye al promotor de la
metalotioneína I de los mamíferos, operativamente ligado a una
secuencia de nucleótidos que codifica la APP operativamente ligada
la 3ª región no traducida de la hormona del crecimiento de los
mamíferos.
El WO 92/13069 está relacionado con un ADN que
codifica la APP que presenta la sustitución de un aminoácido en el
residuo 717 de la APP770.
El EP 0 451 700 se refiere a los ratones
transgénicos que tienen una APP con una construcción de
minigene.
Por lo tanto, uno de los objetos de la presente
invención es el proporcionar un modelo de la enfermedad de Alzheimer
en roedores, que esté construido usando tecnología transgénica.
Es un propósito adicional de la presente
invención el proveer de roedores transgénicos que reflejen con
precisión la expresión de las diferentes formas de la proteína
precursora del amiloide.
También es un objetivo adicional de la presente
invención el proveer de roedores transgénicos caracterizados por
ciertas anormalidades genéticas en la expresión de la proteína
precursora del amiloide.
Se describe la construcción de modelos de
roedores transgénicos para el ensayo de tratamientos potenciales
para la enfermedad de Alzheimer. Los modelos están caracterizados
por una mayor similitud con las condiciones existentes en la
aparición natural de la enfermedad de Alzheimer, basándose en la
habilidad para controlar la expresión de una o de más de tres formas
de la proteína precursora del \beta-amiloide
(APP): APP695, APP751, APP770; o de subfragmentos de la misma, así
como también de varias mutaciones puntuales basadas en las
mutaciones que se producen naturalmente, como ser las mutaciones de
la EAF en el aminoácido 717, y las mutaciones pronosticadas en el
gen de la APP. Las construcciones del gen de la APP se preparan
usando el promotor de la APP de origen humano, de ratones o de
ratas, que se ha producido de forma natural, así como también los
promotores inducibles, como ser el promotor de la metalotioneína del
ratón que se puede ajustar por medio de la adición de metales
pesados, como el zinc, al agua o la dieta de los animales. La
expresión neuronal específica de las construcciones se logra usando
el promotor específico de la enolasa de las neuronas de las
ratas.
Las construcciones se introducen en los embriones
de roedores utilizando técnicas estándar, como la microinyección o
las células madre embrionarias de roedores. Los modelos basados en
cultivos celulares también se pueden preparar mediante dos métodos:
los cultivos celulares se pueden aislar de roedores transgénicos o
se pueden preparar a partir de cultivos celulares establecidos
utilizando las mismas construcciones con técnicas estándar de
transfección celular.
Las construcciones de la invención son aquellas
que se especifican en la Reivindicación 11.
Los promotores se pueden seleccionar a partir de:
el promotor del gen humano de la APP, el promotor del gen de la APP
de los ratones, el promotor del gen de la APP de las ratas, el
promotor del gen de la metalotionina, el promotor del gen de la
enolasa específica de las neuronas de las ratas, el promotor del gen
humano de la \beta actina, el promotor del gen de la cadena del
factor de crecimiento humano derivado de las plaquetas B
(PDGF-B), el promotor del gen del canal de sodio de
la rata, el promotor del gen de la proteína básica de la mielina del
ratón, el promotor del gen humano de la superóxido dismutasa
cobre-zinc, y el promotor del gen regulador del
dominio POU de los mamíferos.
Los roedores o células de mamíferos transgénicas
de la invención son los descritos en la Reivindicación 1.
Estas construcciones se pueden introducir en los
roedores transgénicos y luego ser combinadas por medio de la cruza
de animales que expresen las diferentes construcciones.
Las células transgénicas de roedores, o de
mamíferos, se usan para ensayar compuestos que alteren el curso
patológico de la Enfermedad de Alzheimer, evaluándolos según sus
efectos sobre la cantidad y la histopatologia de la APP y del
\beta péptido en los animales, así como también por las
alteraciones que producen en el comportamiento.
Las porciones cerradas de los dibujos indican las
porciones de codificación de aminoácidos de las construcciones. Las
porciones rellenas indican los diversos dominios de la proteína, tal
y como se indica en el texto que acompaña a la ilustración. Las
líneas indican las secuencias de los clones, que son las secuencias
5ª o 3ª no traducidas, secuencias genómicas flanqueantes o intrones.
La ruptura en el trazado de la línea a la izquierda de las
construcciones de las Figuras 7 y 8 indica la presencia de una larga
secuencia de ADN.
La Figura 1a es una representación esquemática de
la secuencia de codificación del ADNc de la APP 770.
La Figura 1b es una representación esquemática de
la secuencia de codificación del ADNc de la APP770 que porta una
mutación en la posición 717.
La Figura 2a es una representación esquemática de
la secuencia de codificación del ADNc de la APP751.
La Figura 2b es una representación esquemática de
la secuencia de codificación del ADNc de la APP751 que porta una
mutación en la posición 717.
La Figura 3a es una representación esquemática de
la secuencia de codificación de la APP695.
La Figura 3b es una representación esquemática de
la secuencia de codificación del ADNc de la APP695 que porta una
mutación en la posición 717.
La Figura 4a es una representación esquemática de
la secuencia de codificación en la porción del grupo carboxilo
terminal de la APP.
La Figura 4b es una representación esquemática de
una secuencia de codificación de la porción carboxilo terminal de la
APP que porta una mutación en la posición 717.
La Figura 5 es una representación esquemática de
una secuencia de codificación de la porción del \beta péptido de
la APP.
La figura 6a es una representación esquemática de
una combinación genómica/secuencia de codificación del ADNc que
permite el corte y empalme alternativo entre los exones del Kl y el
OX-2.
La Figura 6b es un esquema de una combinación
genómica/secuencia de codificación del ADNc que porta una mutación
en la posición 717 y permite un corte y empalme alternativo de los
exones del Kl y el OX-2.
La Figura 7a es un esquema de una secuencia de
codificación de la APP humana en un YAC.
La Figura 7b es un esquema de una secuencia de
codificación de la APP humana que porta una mutación en la posición
717 en un YAC.
La Figura 8 es una representación esquemática de
la alteración genética del gen de la APP del ratón, lograda mediante
una recombinación homóloga dirigida entre el gen de la APP del ratón
en una célula ES de ratón y un vector portador del ADNc de la APP
humana (tanto de la forma normal como de la mutante de la EAF) en la
porción 9 del exón del gen. Como resultado de este acto de
recombinación, se sustituyen las secuencias del gen de la APP
cromosómica residente del ratón fuera del punto de recombinación del
exón 9 por las secuencias humanas análogas.
Las Figuras de la 1 a la 5 y la 7 y la 8 sólo
sirven con propósitos ilustrativos.
Las construcciones de células transgénicas de
roedores y mamíferos se preparan utilizando los métodos y materiales
que se describen a continuación.
Las endonucleasas de restricción se obtienen de
los proveedores comerciales convencionales, como ser: New England
Biolabs (Beverly, MA), Promega Biological Research Products
(Madison, WI), y Stratagene (La Jolla, CA), etc. Los materiales
radioactivos se obtienen de los proveedores comerciales
convencionales, como ser: Dupont/NEN o Amersham. Los
oligonucleótidos diseñados a medida para las mutagénesis puntuales
se pueden obtener de cualquiera de los diversos proveedores
comerciales para este tipo de materiales, como
Bio-Synthesis Inc. Lewisville, TX. Los equipos para
llevar a cabo las mutagénesis puntuales se pueden adquirir a través
de proveedores comerciales como Promega Biologycal Research
Products, Stratagene, etc. Los clones de ADNc, incluyendo las formas
del ARNm de la APP para la APP695, la APP751 y la APP770, se
obtuvieron directamente del Dr. Dmitry Godgaber, NIH. Los bancos de
DNA se pueden adquirir de proveedores comerciales como Stratagene,
La Jolla, CA, o Clontech, Palo Alto, CA. Las células PC12 Y 3T3 se
obtuvieron de ATCC (#CRL1721 y #CCL92, respectivamente). Se obtuvo
un linaje celular PC12 adicional del Dr. Charles Marotta de la
Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, y McLean
Hospital. Los medios de cultivo celular estándar apropiados para el
linaje celular se obtuvieron de los proveedores comerciales
convencionales, como Gibco/BRL. Las células madre murinas, cepa D3,
se obtuvieron del Dr. Rolf Kemler (Doetschman y col. J. Embryol
Exp. Morphol 87, 27 (1985). La lipofectina para la transfección
del ADN y el fármaco G418 para la selección de transformantes
estables se pueden obtener de Gibco/BRL.
Se seleccionó un banco de cósmido, construido a
partir de ADN placentario humano en el vector cósmido pWE15, por
medio de hibridación con una sonda etiquetada^{32p}, preparada
para una nick translation (Maniatis y col. Molecular Cloning: a
laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY 1989) del clon del ADNc de la APP770. Los clones que se
hibridaron con la sonda fueron seleccionados, purificados y
caracterizados por medio de un mapa de restricción, hibridación y
secuenciado del ADN. A partir de uno de dichos clones, que contenía
una 5ª región flanqueante larga, se aisló un fragmento de
restricción del ADN, de NotI a NruI, de
aproximadamente
25 kb. Este fragmento termina en dos nucleótidos situados antes del codón del iniciador de la metionina de la región de codificación de la proteína del Alzheimer. Este fragmento, o un subfragmento del mismo, es el origen del promotor humano de la APP para las construcciones descritas en este documento. Los fragmentos análogos de ADN aislados usando los mismos métodos a partir de bancos genómicos de ratón, o de rata, son el origen de los promotores del ratón o la rata.
25 kb. Este fragmento termina en dos nucleótidos situados antes del codón del iniciador de la metionina de la región de codificación de la proteína del Alzheimer. Este fragmento, o un subfragmento del mismo, es el origen del promotor humano de la APP para las construcciones descritas en este documento. Los fragmentos análogos de ADN aislados usando los mismos métodos a partir de bancos genómicos de ratón, o de rata, son el origen de los promotores del ratón o la rata.
El clon del ADNc de la APP-695 es
de la forma de ADNc descrita por Kang y col. Nature
325:733-735 (1987), y es la forma de la proteína del
Alzheimer presente en el cerebro con una mayor predominancia. El
clon del ADNc de la APP-751 es de la forma descrita
por Ponte, P., Nature 331: 525-527 (1988). El
clon del ADNc de la APP770 es de la forma descrita por Kitaguchi y
col., Nature 331:530-532 (1988). Esta forma
contiene un inserto de 225 nucleótidos relacionados con la forma
695. El inserto de nucleótido 225 codifica el dominio Kl así como
también el dominio
\hbox{OX-2.}
La caracterización del fago y de los clones de
cósmido de los clones del ADN genómico humano, se listan en la tabla
de más abajo, con un tamaño mínimo del gen del Alzheimer establecido
originalmente en, por lo menos, 100 kb. En el gen de la APP hay un
total de 18 exones (Lemaire y col. Nucl. Acid Res. 17;
517:522, 1989; Yoshikai y col, 1990). Estos resultados, tomados en
conjunto, indican que el tamaño mínimo del gen del Alzheimer es de
175 kb.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los clones portadores de varias porciones de la
secuencia del gen humano de la APP mostrados en las Figs.
1-5, se construyen de forma análoga. En primer lugar
se clona la señal de adición del polyA del virus SV40 como un par
base 253 BclI en un fragmento BamHI de un vector
modificado de la serie pUC (Reddy y col. Science 200;
494-502 (1978). A continuación, se insertan las
secuencias codificadoras del ADNc (770, 751 ó 695). Se determina la
correcta orientación y el contenido de los fragmentos insertados por
medio del mapa de restricción de la endonucleasa y la secuenciación
limitada.
Los clones portadores de varias porciones con
carboxilo terminal de la secuencia del gen humano de la APP que
aparecen en las Figs. 4 y 5 se construyen por medio de varias
etapas, además de las ya indicadas. Primero que nada, se digiere un
clon del ADNc de la APP770 con Asp718, que divide después de la
posición 56 (sistema de numeración de Kang y col., 1987). La 5ª
extensión resultante, se completa usando la enzima de Klenow
(Maniatis y col. 1989) y se liga a un hexanucleótido con la
siguiente secuencia: AGATCT, el punto de reconocimiento para el
BglII. Después de la división con BglII, que también
corta después de la posición 1769 y de la religadura, se conserva el
marco de lectura de la traducción de la proteína. La proteína así
truncada y codificada contiene la secuencia líder, seguida por
aproximadamente 6 aminoácidos que preceden al \beta péptido, a los
que siguen el \beta péptido y los 56 aminoácidos terminales de la
APP. El clon de la Fig. 5 se crea a través de la introducción, por
medio de una mutagénesis puntual, del nucleótido 1913 del clon de la
Fig 4a (sistema de numeración de Kang y col. 1987) en un T, creando,
por lo tanto, un codón de terminación directamente enseguida del
último codón de aminoácido del \beta péptido. Cada una de las
secuencias del ADNc de la APP de los clones que se muestran en las
Figs. 1-5 contiene un único punto NruI, con
dos nucleótidos en dirección ascendente a partir del codón del
iniciador de la metionina que se usa para la inserción de los
diferentes promotores utilizados para completar cada construcción.
Todo lo anterior se aplica únicamente con propósitos ilustrativos a
las Figuras de la 1 a la 5.
También se construyen clones de expresión
idénticos a éstos, pero portando mutaciones en el aminoácido 717 del
largo total de la proteína, el punto de la mutación de la EAF. Las
mutaciones en el aminoácido 717 se crean por mutagénesis puntual
(Vincent y col., Genes y Devel 3; 334-347
(1989) e incluyen mutaciones del tipo normal del codón val a uno de
los siguientes codones: ile, phe, gly, tyr, leu, ala, pro, trp, met,
ser, thr, asn, g/n.
El método preferido para la construcción de la
combinación ADNc/clones de expresión genómica de la Figura 6 es el
siguiente: por medio de una mutagénesis puntual se convierte el
punto TaqI de la posición 860 (sistema de numeración de Kang
y col. 1967) de un ADNc de la APP770 en un punto XhoI. La
escisión del plásmido resultante con XhoI corta por el nuevo
punto XhoI y por un punto preexistente en 930, y libera la
secuencia de codificación del Kl y el OX-2.
El plásmido así generado sirve como aceptante
para el módulo de corte y empalme alternativo del Kl y el
OX-2. El módulo de corte y empalme alternativo se
crea a través de una serie de etapas de clonación. En primer
término, por medio de una mutagénesis puntual, se convierte el punto
TaqI de la posición 860 (sistema de numeración de Kang y col.
1987) del clon genómico que contiene el exón 6 y el intrón adyacente
en sentido descendente, en un punto XhoI. La división del
plásmido resultante con XhoI corta por el nuevo punto
XhoI y un nuevo punto XhoI dentro del intrón
adyacente. Se clona este fragmento en el punto XhoI de un
vector plásmido. En segundo lugar, se divide mediante XhoI
(posición 930) el clon genómico que contiene el exón 9 y el intrón
adyacente en dirección ascendente, y se clona en el punto
XhoI de un vector plásmido. Estos dos fragmentos de unión
exón/intrón se liberan de sus respectivos esqueletos plásmidos
mediante escisión con XhoI, o también con BamHl o con
BglII, y se clonan en el punto XhoI de un vector
plásmido. El fragmento XhoI resultante se divide con
BamHI o con BglI y se inserta el segmento BamHI
de 6.6 kb (Kitaguchi y col., 1988), que contiene la región
codificadora del Kl y el OX-2 junto con las
secuencias flanqueantes del intrón. Después de la escisión con
XhoI, se inserta este segmento de ADN en el punto del
XhoI del ADNc de la APP770 construido según se indica
anteriormente. Estas etapas de clonación generan una combinación de
ADNc/clon de expresión genómica que permite a las células de un
roedor transgénico regular la inclusión de los dominios Kl y
OX-2 por medio de un mecanismo natural de corte y
empalme alternativo. Se construye un gen análogo, portador de una
mutación en el aminoácido 717, utilizando la forma mutada del ADNc
de la APP770 descrita anteriormente.
Se usan diferentes secuencias del promotor para
controlar la expresión de las secuencias codificadoras de la APP. Se
cree que la capacidad para regular la expresión del gen de la APP en
los roedores transgénicos resultará útil para evaluar el papel de
los diferentes productos del gen de la APP en la EA. Se piensa que
la capacidad para regular la expresión del gen de la APP en las
células cultivadas, resultará útil en la evaluación de la expresión
y el procesado de los diferentes productos del gen de la APP y que
podría proporcionar una base para la evaluación de fármacos en
células cultivadas.
El promotor de la metalotionina (MT) está bien
caracterizado, ha sido empleado en roedores transgénicos y su
expresión se puede regular por medio de la modulación de los niveles
de zinc y de hormona glucocorticoide (Palmiter y col. Nature
300, 611-615 (1982).
El promotor humano de la APP también está
caracterizado con respecto a su expresión en el CNS (Wirak y col.
1991). Se supone que este promotor es útil para una reproducción
precisa de la expresión temporal y espacial de las secuencias de la
APP humana en los roedores con CNS transgénico. Además del promotor
humano de la APP, se usa el promotor de la APP de los ratones y de
las ratas junto a las diferentes secuencias codificantes de la APP
normal y mutante. A pesar de que el promotor humano de la APP ha
demostrado tener actividad en las regiones pertinentes del cerebro
de los ratones transgénicos (Wirak y col., 1991), se piensa que el
uso de un promotor de la APP de ratón, o de rata, en una rata
transgénica ofrecerá un patrón aún más fidedigno de su expresión en
el CNS de los animales transgénicos.
Se usa el promotor específico del gen de la
enolasa neuronal de la rata como una alternativa para el control de
la expresión de la APP humana en las neuronas. Se ha demostrado que
este promotor es el rector de la expresión directa de las secuencias
de codificación en las neuronas (Forss-Petter y
col., Neuron 5; 197-197 (1990).
Otras de las alternativas que se pueden usar para
controlar la expresión de la APP humana en las neuronas, incluyen al
promotor del gen de la \beta actina (Ray y col., Genes and
Development 5:2265-2273 (1991), al promotor del
gen de la cadena del factor de crecimiento humano derivado de las
plaquetas B (PDGF-B) (Sasahara y col. Cell
64:217-227 (1991), al promotor del gen del canal de
sodio de la rata (Maue y col., Neuron 4;
223-231 (1990), al promotor del gen humano de la
superóxido dismutasa cobre-zinc
(Ceballos-Picot y col. Brain Res. 552;
198-214 (1991), y a los promotores de los miembros
de la familia de los genes reguladores del dominio POU de los
mamíferos (Xi y col., Nature 340; 35-42
(1989). El dominio POU es la región de similitud entre los cuatro
factores de transcripción de los mamíferos Pit-1,
Oct-1, Oct-2 y
Unc-86, y representa una porción del dominio
ADN-fijación. Se sabe, o se cree, que estos
promotores dan como resultado la expresión específicamente dentro de
las neuronas de los animales transgénicos.
La expresión de la APP humana en células
cerebrales no neuronales puede ser regida por el promotor de la
proteína básica de la mielina de los ratones. (Readhead y col.,
Cell 48; 703-712 (1987).
Las construcciones que aparecen en la Figura 7
están construidas de la manera siguiente: cuando se clonan grandes
segmentos de ADN genómico humano en ciertos vectores, se los puede
propagar en las células de levadura como unidades con replicación
autónoma. Dichos segmentos portados por el vector se llaman
cromosomas artificiales de levadura (YAC; Burke y col.
Science 236; 806 (1987). Hay un banco de YAC humanos
disponible a nivel comercial (Clontech, Palo Alto, CA), con un
tamaño medio de inserto de 250.000 pares de bases (gama de 180.000 a
500.000 pares de bases). Se puede aislar un clon del gen del
Alzheimer directamente de un YAC, seleccionándolo del banco con el
ADNc humano de la APP770. Se deberá confirmar la inclusión de todas
las regiones esenciales del gen en el clon mediante un análisis por
PCR.
Se establece el clon de la APP en el YAC que
aparece en la Figura 7a en las células madre embrionarias (ES) de
roedores, seleccionándolo por medio de la resistencia a la
neomicina, codificada en el vector YAC. Las células ES portadoras
del clon de la APP-YAC se usan para producir ratones
transgénicos por medio de los métodos establecidos que se describen
más abajo, en "Ratones Transgénicos" y "Métodos con Células
Madre Embrionarias de Roedores". El gen de la
APP-YAC que porta una mutación en el aminoácido 717
(Fig. 7b) se produce a través de la generación de un banco de YAC
utilizando el ADN genómico de una persona afectada por una mutación
en el aminoácido 717 (Fig. 7b). Se identifica el clon y se lo
establece en células ES de roedores tal y como se ha descrito
anteriormente.
La homología entre la secuencia de nucleótidos de
los genes humanos y murinos de la proteína del Alzheimer es de,
aproximadamente, el 85%. Hay tres diferencias entre los aminoácidos
de la región codificadora del \beta péptido de las dos secuencias.
El residuo val que aparece mutado en el aminoácido 717 se mantiene
tanto en ratones como en ratas y en humanos. Los ratones de tipo
silvestre no desarrollan la enfermedad de Alzheimer, ni depósitos,
ni placas análogas a aquellas presentes en los CNS de los seres
humanos enfermos de Alzheimer. Por lo tanto, es posible que sea la
forma humana del B péptido, pero no la forma de los roedores, la que
es capaz de provocar la enfermedad. Se puede usar la recombinación
homóloga (Capecchi, MR Science 244; 1288-1292
(1989) para convertir el gen del Alzheimer del ratón in situ
en un gen que codifique el B péptido humano. Esta recombinación se
dirige hacia un punto situado hacia abajo de los dominios Kl y
OX-2, por ejemplo, dentro del exón 9, de manera que
se puedan emplear los mecanismos naturales de corte y empalme
alternativo, apropiados para todas las células del animal
transgénico, para la expresión del producto final del gen.
Para producir modelos transgénicos que expresen
tanto la forma normal como la mutante de la APP, se usan tanto la
forma normal (Fig. 8, esquema "a") como la mutante (Fig. 8,
esquema 2"b") del ADNc humano. El vector de recombinación se
construye a partir de un ADNc humano de la APP (forma 695 o 770), ya
sea del tipo normal o del que contiene una mutación en el aminoácido
717. La escisión del vector de recombinación, por ejemplo en el
punto XhoI del exón 9, promueve una recombinación homóloga en
las secuencias inmediatamente adyacentes (Capecchi, 1989).
También se construyen clones de expresión
idénticos a estos pero portando mutaciones en el aminoácido 717 del
largo total de la proteína, el punto de las mutaciones de la EAF.
Las mutaciones del aminoácido 717 se crean mediante mutagénesis
puntual (Vincent y col. 1989) e incluyen mutaciones del codón val
del tipo normal a uno de los siguientes codones: ile, phe, gly, tyr,
leu, ala, pro, trp, met, ser, thr, asn, gln. También se han descrito
mutaciones del val-717 a ile, phe y gly (Goate y
col., 1991; Murrel y col., 1991; Chartier-Harlin y
col., 1991). Ninguna de estas mutaciones que se producen de forma
natural son aminoácidos cargados o inertes. Por lo tanto, se piensa
que la sustitución del val-717 por algún otro de los
aminoácidos mencionados también puede promover el síndrome de la EAF
y tener propiedades que puedan ser útiles en los modelos animales de
la EA.
Se dividen los clones para la microinyección por
medio de las enzimas adecuadas, como por ejemplo: Sal1,
Not1, etc., y se someten los fragmentos de ADN a
electroforesis en geles de agarosa al 1% en tampón TBE (Maniatis y
col. 1989). Las bandas de ADN se visualizan mediante la tinción con
bromuro de etidio, se las divide y se las coloca en una bolsa de
diálisis que contenga acetato de sodio 0,3 M, a un pH 7,0. Se
electroleviga el ADN en las bolsas de diálisis, se lo extrae con
fenol-cloroformo (1:1), y se lo precipita por medio
de dos volúmenes de etanol. Se redisuelve el ADN en 1 ml de tampón
con baja salinidad (NaCl 0,2 M, Tris^{TM} 20mM, a un pH de 7,4, y
EDTA 1 mM) y se lo purifica en una columna
Elutip-D^{TM}. Primero que nada, se preinyecta la
columna con 3 ml de tampón con alta salinidad (NaCl 1M, Tris^{TM}
20mM, a un pH 7,4, y EDTA 1 mM) y luego se efectúa un lavado con 5
ml de tampón con baja salinidad. Se pasan las soluciones de ADN a
través de la columna tres veces para fijar el ADN a la matriz de la
columna. Después de un lavado con 3 ml de tampón con baja salinidad,
se arrastra el ADN con 0,4 ml de tampón con alta salinidad y se lo
precipita mediante dos volúmenes de etanol. Se miden las
concentraciones de ADN por absorción a 260 nm en un
espectrofotómetro UV. Para la microinyección, se ajustan las
concentraciones de ADN a 3\mug/ml en Tris^{TM} 5 mM, a un pH de
7,4 y EDTA 0,1 mM. También se describen tres métodos para la
purificación del ADN para microinyectar en Hogan y col.,
Manipulating the mouse embryo (Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY (1986), en Palmiter y col. Nature 300, 611
(1982), en "The Qiagenologist, Application Protocols",
3ª edición, publicada por Qiagen, Inc., Chatsworth, CA., y en
Mainatis y col., Molecular Cloning: a laboratory manual (Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Los roedores adecuados para los experimentos
transgénicos se pueden obtener de los proveedores comerciales
habituales, como por ejemplo: Charles River (Wilmington, MA),
Taconic (Germantown, NY) Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN),
etc. Se prefieren las hembras Swiss Webster para la recuperación y
transferencia de embriones. Se pueden usar los machos D6D2F_{1}
para las cruzas y sementales Swiss Webster vasectomizados para
estimular la pseudopreñez. También se pueden obtener los ratones y
las ratas vasectomizados de los mismos proveedores.
En Hogan y col. "Manipulating the mouse
embryo", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1086) se describen con detalle los procedimientos para la
manipulación de los embriones de roedores y para la microinyección
de ADN.
Se induce a superovular a las hembras de ratón
con seis semanas de edad, utilizando para ello una inyección de 5 UI
(0,1 cc, ip) de suero de gonadotropina (PMSG, Sigma) de yegua
preñada, seguida a las 48 horas por una inyección de 6 UI (0,1 cc,
ip) de gonadotropina coriónica humana (hCG; Sigma). Inmediatamente
después de la inyección con hCG, se pone a las hembras con los
machos. Veintiuna horas después de la hCG, se sacrifica a las
hembras apareadas mediante asfixia con CO_{2} o por dislocación
cervical y se recuperan los embriones de los oviductos seccionados y
se los coloca en solución salina tampón de Dulbecco con un 5% de
suero de albúmina bovina (BSA; Sigma). Se retiran los cúmulos de
células circundantes con hialuronidasa (1 mg/ml). Se lavan entonces
los embriones pronucleares, se colocan en una solución salina de
Earle equilibrada que contenga un 0,5% de BSA (EBSS) y en una
incubadora a 37,5ºC, con una atmósfera húmeda con un 5% de CO_{2}
y un 95% de aire hasta el momento de la inyección.
Se aparean hembras adultas de ratón con ciclos
aleatorios con los machos vasectomizados. Para este fin se pueden
usar hembras Swiss Webster o de otras razas similares. Las hembras
receptoras se aparean al mismo tiempo que las hembras donantes. En
el momento de la transferencia del embrión se anestesia a las
hembras receptoras con una inyección intraperitoneal de 0,015 ml de
avertina al 2,5% por gramo de peso corporal. Se dejarán expuestos
los oviductos mediante una única incisión en la línea media del
dorso. Se hace luego una incisión a través de la pared del cuerpo
directamente sobre el oviducto. Después se rasga la bolsa ovárica
usando pinzas de relojero. Se colocan los embriones a transferir en
DPBS y en la punta de una pipeta de porte (unos
10-12 embriones). La punta de la pipeta se inserta
en el infundíbulo y se transfiere el embrión. Después de la
transferencia, se cierra la incisión con dos suturas.
El procedimiento para generar ratas transgénicas
es similar al utilizado con los ratones (Hammer y col. Cell
63; 1099-1112 (1990). Cuando las ratas tienen
treinta días se les da una inyección subcutánea de 20 UI de PMSG
(0,1 cc) y cuarenta y ocho horas más tarde se pone a cada hembra con
un macho probado. Al mismo tiempo, se colocan las hembras de
40-80 días de edad en jaulas junto a machos
vasectomizados. Esto va a proveer de madres adoptivas para la
transferencia de embriones. A la mañana siguiente se controlan los
tampones vaginales de las hembras. Se dejan aparte, hasta que sea el
momento de la transferencia, a las hembras que se hayan apareado con
machos vasectomizados. Se sacrifican las hembras donantes que se
hayan apareado (CO_{2}, asfixia) y se les retiran sus oviductos,
se los coloca en DPBS (solución salina tampón fosfato de Dulbecco)
con un 0,5% de BSA y se recogen los embriones. Se quitan los cúmulos
de células que circundan al embrión por medio de hialuronidasa
(1mg/ml). Entonces, se lavan y se colocan los embriones en EBSS
(solución salina equilibrada de Earle) conteniendo un 0,5% de BSA y
en una incubadora hasta el momento de la microinyección.
Una vez que se han inyectado los embriones, los
embriones vivos se cambian a DPBS para transferirlos a las madres
adoptivas. Se hace una incisión en la línea media del dorso a través
de la piel y queda expuesto el ovario; se accede al oviducto por
medio de una incisión a través de la capa muscular situada
directamente sobre el ovario. Se rasga la bolsa ovárica, se recogen
los embriones con la pipeta de porte, y se inserta la punta de la
pipeta de porte en el infundíbulo. Se transfieren aproximadamente
unos 10-12 embriones a cada oviducto de rata a
través del infundíibulo. Se sutura entonces la incisión, y se aloja
individualmente a las madres adoptivas.
En Teratocarcinomas and embryonic stem cells,
a practical approach, Ed. E. J. Robertson (IRL Press, 1987) se
describen con detalle los métodos para el cultivo de células ES y la
consiguiente producción de roedores transgénicos para la
introducción del ADN en las células por medio de diversos métodos
como ser: la electoporación, la precipitación del fostafo de
calcio/ADN, y la inyección directa. Hay varios métodos para lograr
la selección de los clones requeridos de células ES que contengan el
transgén. En los casos que impliquen una integración aleatoria de
los genes, se coprecipita un clon de APP con un gen codificador de
la resistencia a la neomicina. Se lleva a cabo la transfección por
medio de uno de los distintos métodos descritos en detalle por
Lovell-Badge, en Teratocarcinomas and embryonic
stem cells, a practical approach, Ed. E. J. Robertson (IRL
Press, 1987) o en Potter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81, 7161 (1984). Los métodos preferidos son: la precipitación del
fosfato de calcio/ADN, la inyección directa, y la electroporación.
En estos procedimientos, se extienden 0,5 X 10^{6} células ES en
placas de cultivo de tejidos y se las transfecta con una mezcla del
clon linealizado de la APP y 1 mg de ADN del pSV2neo (Southern and
Berg. J. Mol. Appl. Gen. 1; 327-341 (1982)
precipitado en presencia de 50 mg de lipofectina en un volumen final
de 100 \mul. Las células se nutren con un medio selectivo que
contenga un 10% de suero fetal bovino en DMEM, suplementado con G418
(entre 200 y 500 \mug/ml). Se aislan las colonias de células
resistentes al G418 usando aros de clonación y se las expande. Se
extrae el ADN de los clones resistentes al fármaco y se usan las
técnicas de transferencia de Southern, utilizando una sonda de ADNc
de la APP770 para identificar a los clones que portan las secuencias
APP. En algunos ensayos, se usan los métodos de la PCR para
identificar los clones que puedan presentar interés.
También se pueden integrar las moléculas de ADN
introducidas en las células ES de roedores en el cromosoma por medio
del proceso de recombinación homóloga, descrita por Capecchi,
(1989). La inyección directa supone una alta eficiencia en la
integración. Se identifican los clones deseados por medio de una PCR
del ADN preparado a partir de grupos de células ES inyectadas. Se
identifican las células positivas de los grupos por medio de una PCR
posterior a la clonación celular (Zimmer y Gruss, Nature 338;
150-153 (1989). La introducción de ADN mediante
electroporación es menos eficiente y requiere de una etapa de
selección. Joyner y col. Nature 338, 153-156
(1989) y Capecchi, (1989) han descrito los métodos para la selección
positiva de la recombinación (por ejemplo: neo resistencia) y la
doble selección positiva-negativa (por ejemplo, la
neo resistencia y la resistencia al ganciclovir) y la consecuente
identificación de los clones requeridos por medio de una PCR.
Para obtener embriones para la implantación de
células ES de roedor, se usan hembras de ratón con ciclos
aleatorios, o superovuladas, apareadas con machos. Cuando se usan
ratones, es preferible utilizar para estos fines la cepa C57B. Se
recuperan los embriones de ratón de la edad adecuada a los 3,5 días
del apareamiento que resulte fructífero. Las hembras apareadas se
sacrifican por asfixia con CO_{2} o por dislocación cervical, se
extraen los embriones de las trompas del útero abiertas y se los
coloca en el medio esencial de Dulbecco modificado mediante el
agregado de un 10% de suero de ternera para inyectar con células ES.
Se inyectan aproximadamente 10-20 células en los
blastocistos usando una microaguja de vidrio con un diámetro interno
de aproximadamente 20 \mum.
Se aparean hembras adultas de ratón con ciclos
aleatorios con machos vasectomizados. Para este propósito se pueden
usar razas de ratón como la Swiss Webster, la ICR u otras. Se
aparean las hembras receptoras de manera que cuando se las necesite
para implantarles los blastocistos que contienen las células ES de
roedores, hayan pasado de 2,5 a 3,5 días después del apareamiento.
En el momento de la transferencia del embrión, se anestesia a las
hembras con una inyección intraperitoneal de 0,015 ml de avertina,
al 2,5%, por gramo de peso corporal. Se dejan al descubierto los
ovarios haciendo una incisión en la pared del cuerpo, directamente
sobre el oviducto y se dejan expuestos el ovario y el útero. Se hace
un agujero en la trompa uterina con una aguja calibrada a través de
la cual se transfieren los blastocitos. Después de la transferencia,
se empujan hacia dentro del cuerpo el ovario y el útero y se cierra
la incisión con dos suturas. Si se han de hacer transferencias
adicionales se repite el procedimiento en el otro lado.
Se quitan muestras de la cola
(1-2 cm) de los animales de tres semanas. Se prepara
y se analiza el ADN tanto por medio de la técnica de Southern como a
través de una PCR para detectar a los fundadores transgénicos
(F_{0}) y a su progenie (F_{1} y F_{2}).
Se sacrifican, mediante asfixia producida por
CO_{2}, los distintos animales F_{0}, F_{1} y F_{2} que
portan el transgen microinyectado y se los analiza
inmunohistológicamente en busca de placas neuríticas y nódulos
neurofibrlares (NNFs) en el cerebro. Se fijan los cerebros de
ratones y de ratas de cada una de las líneas transgénicas con
paraformaldehído al 4% y se seccionan en un crióstato. Se tiñen las
secciones con anticuerpos reactivos ante la APP y/o el B péptido. En
segundo lugar, se usan los anticuerpos conjugados con fluorescina,
rhodamina, peroxidasa del rábano picante o fosfatasa para detectar
el anticuerpo primario. Estas pruebas permiten la identificación de
las placas de amiloide y la regionalización de estas placas en áreas
específicas del cerebro. Las placas cuyos tamaños van desde 9 a 50
\mum se producen, de forma característica, en los cerebros de los
pacientes con EA, ubicándose en el córtex cerebral, pero también se
pueden observar en la materia gris a mayor profundidad, incluyendo
el núcleo de la amígdala, el cuerpo estriado y del diencéfalo.
También se tiñen las secciones con otros anticuerpos de diagnóstico
para las placas del Alzheimer, antígenos de reconocimiento como el
Alz-50, tau, A2B5, neurofilamentos, enolasa
específica de las neuronas, y otros que son característicos de las
placas del Alzheimer (Wolozin y col., Science 232, 648
(1986); Hardy y Allsop, Trends in Pharm. Sci. 12,
383-388 (1991); Selkoe, Ann. Rev. Neurosci.
12, 463-490 (1989); Arai y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 2249-2253 (1990); Majocha y
col., Amer. Assoc. Neuropathology Abs; 99, 22 (1988);
Masters y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 82,
4245-4249; Majocha y col., Can J. Biochem Cell
Biol 63; 577-584 (1985). También se lleva a cabo
la tinción con tioflavinas y Rojo congo para analizar la
co-localización de los depósitos de \beta péptido
dentro de las placas neuríticas y los NNFs.
ARNm: se aisla el ARNm por medio del
método de extracción ácida del tiocianato de guanidina
fenol-cloroformo (Chomczynsky y Sacchi, Anal
Biochem 162; 156-159 (1987) a partir de los
linajes celulares y de los tejidos de animales transgénicos para así
determinar los niveles de expresión por medio de las técnicas de
Northern.
Proteína: Se detectan la APP y el \beta
péptido usando los anticuerpos policlonales y monoclonales que son
específicos para el dominio extra-citoplásmico, la
región del \beta péptido, y el C-terminal.
Análisis con la técnica de Western: Se
aislan las fracciones proteínicas de homogeneizados de tejido y de
lisados celulares y se someten al análisis de transferencia de
Western según describen Harlow y col., Antibodies: A laboratory
manual, (Cold Spring Harbor, NY, 1988); Brown y col. J.
Neurochem; 40: 299-308 (1983); y
Tate-Ostroff y col. Proc. Natl. Acad. Sci.
86; 745-749 (1989). A continuación sólo se hace una
breve descripción.
Se desnaturalizan las fracciones de las proteínas
con tampón de muestra de Laemmli y se las somete a electroforesis en
geles de SDS-Poliacrilamida. Se transfieren luego
las proteínas a filtros de nitrocelulosa por medio de
electrotransferencia. Se bloquean los filtros, se incuban con
anticuerpos primarios, y finalmente se los hace reaccionar con
anticuerpos secundarios conjugados con enzimas. La posterior
incubación con el sustrato cromogénico adecuado revela la posición
de las proteínas APP.
Se lleva a cabo la inmunohistología y la tinción
con tioflavina S tal y como se describe en este mismo documento.
Hibridaciones in situ : Se
usan sondas radioactivas o etiquetadas enzimáticamente para detectar
in situ el ARNm. Las sondas están graduadas a aproximadamente
100 nucleótidos de longitud para una mejor penetración de las
células. Más abajo, se describe brevemente el procedimiento de Chou
y col., J. Psych. Res. 24; 27-50 (1990) para
muestras fijadas e incluidas en parafina, a pesar de que se pueden
emplear procedimientos similares a éste con muestras seccionadas de
material congelado. Se desenceran con xileno los portaobjetos de
parafina para la hibridación in situ, y se los rehidrata por
medio de una serie graduada de etanoles y finalmente se enjuagan con
solución salina tamponada de fosfato (PBS). Posteriormente se fijan
las secciones en fresco con paraformaldehido al 4%. Se lavan dos
veces los portaobjetos con PBS durante 5 minutos para quitar el
paraformaldehido. Luego, se permeabilizan las secciones por medio de
un tratamiento con 20 \mum/ml de solución de proteinasa K. Se
vuelven a fijar las secciones con paraformaldehido al 4%, y se
acetilan las moléculas básicas que pueden dar lugar a un
aglutinamiento en el fondo de la sonda, con una solución 0,1M de
trietanolamina, 0,3 M de anhidrido acético durante 10 minutos. Se
lavan los portaobjetos en PBS, luego se los deshidrata con una serie
graduada de etanoles y se los seca al aire. Las secciones se
hibridan usando una sonda de antiflujo, utilizando una sonda de
flujo como control. Después del lavado apropiado, se detectan las
sondas cebadas radiactivas mediante autoradiografía o se detectan
las sondas etiquetadas enzimáticamente mediante la reacción con los
sustratos cromogénos adecuados.
Se emplean tests de comportamiento para evaluar
los déficits en la capacidad de aprendizaje y en la memoria. Un
ejemplo de dichos tests es el de los laberintos de Morris Water
(Morris, Learn Motivat, 12; 239-260 (1991).
En este procedimiento, se coloca al roedor en una piscina circular
llena de agua con una plataforma de escape sumergida exactamente
debajo de la superficie del agua. Se coloca un marcador visible en
la plataforma de manera que el roedor pueda encontrarlo navegando
hacia una referencia visual próxima. Alternativamente, se dará a los
roedores una forma del test más compleja, en la cual no hay
referencias formales que indiquen la ubicación de la plataforma. De
esta forma, el roedor debe aprender la ubicación de la plataforma en
relación con las referencias visuales distales.
Los procedimientos que se aplican para testar a
las ratas transgénicas son similares a los usados para los ratones
transgénicos.
Se usan las células de roedores y de mamíferos
transgénicos para evaluar compuestos, investigando su efecto
potencial en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y
utilizando para ello la metodología estándar. Se le administra el
compuesto a los roedores, o se introduce en el medio de cultivo,
durante un período de tiempo y en diferentes dosificaciones, se
examinan luego las células de roedores o de mamíferos buscando
alteraciones en la expresión de la APP, en la histopatología o en el
comportamiento utilizando para ello los procedimientos descritos
anteriormente.
El clon pMTAPP-1 es un ejemplo de
vector de expresión, que se muestra en la Fig. 1a, donde el promotor
usado es el promotor de la metalotionina. Los linajes de células
establecidos han sido obtenidos por medio de la transfección de los
llnajes celulares NIH3T3 y PC12 (ATCC#CCL92 y CRL1721). Se extienden
0.5 x 10^{6} células en placas de
100 mm y se las transfecta con una mezcla de 5 mg del fragmento SalI y 1 mg de ADN del pSV2neo (46) precipitado en presencia de 50 mg. de lipofectina (Gibco, BRL) con un volumen final de 100 \mul. Se usaron placas recubiertas de polilisina para las células PC12, ya que normalmente no se adhieren bien a las placas de cultivo de tejidos. Las células se nutrieron con un medio de selección que contenía un 10% de suero fetal bovino en DMEM o RPMI y un suplemento de G418. Se usaron quinientos mg/ml (peso biológico) y 250 mg/ml de G418 para seleccionar células de las formas de colonia NIH3T3 y PC12, respectivamente. Quince días después de la transfección, se aislaron las colonias de células resistentes al G418 usando aros de clonación y expandiéndolas en probetas. Se detectó la presencia de ADNc de la APP en las células por medio de una PCR, utilizando el procedimiento de Mullis y Faloona, Methods Enzymol, 155; 335-350 (1987).
100 mm y se las transfecta con una mezcla de 5 mg del fragmento SalI y 1 mg de ADN del pSV2neo (46) precipitado en presencia de 50 mg. de lipofectina (Gibco, BRL) con un volumen final de 100 \mul. Se usaron placas recubiertas de polilisina para las células PC12, ya que normalmente no se adhieren bien a las placas de cultivo de tejidos. Las células se nutrieron con un medio de selección que contenía un 10% de suero fetal bovino en DMEM o RPMI y un suplemento de G418. Se usaron quinientos mg/ml (peso biológico) y 250 mg/ml de G418 para seleccionar células de las formas de colonia NIH3T3 y PC12, respectivamente. Quince días después de la transfección, se aislaron las colonias de células resistentes al G418 usando aros de clonación y expandiéndolas en probetas. Se detectó la presencia de ADNc de la APP en las células por medio de una PCR, utilizando el procedimiento de Mullis y Faloona, Methods Enzymol, 155; 335-350 (1987).
Se analizó mediante inmunotinción la expresión de
la APP en 25 colonias de cada linaje celular (Majocha y col. 1988).
Se cultivaron las células hasta la subconfluencia y se las fijó en
una solución que contenía un 4% de paraformaldehído, 0,12 M de NaCl
y 20 mM de Na_{3}PO_{4}, con un pH7.Se incubaron durante toda la
noche con un anticuerpo monoclonal primario contra una secuencia de
\beta péptido sintético (Masters y col., 1985) proporcionado por
el Dr. Ronald Majocha, Massachusetts General Hospital, Boston, MA,
seguido por un anticuerpo antiratón conjugado con biotina (Jackson
InmunoResearch Labs, PA). Luego se llevó a cabo una inmunotinción
por medio de la adición de peroxidasea de
avidina-rábano picante (HRP) (Vector Labs,
Burlingame, CA) y diaminobencidina como cromógeno (Majocha y col.
1985). Los resultados indicaron que el vector
pMTAPP-1 expresaba la APP tanto en las células
NIH3T3 como en las PC12.
El pEAPP-1es un ejemplo del
promotor del gen humano de la APP de 25 kb enlazado a, y controlando
la expresión de, el ADNc humano de la APP770, tal y como se
muestra en la construcción de la Figura 1a. El ADN de esta
construcción fue transfectado en células PC12 como se describe más
arriba. Algunos clones de las células transfectadas con
pEAPP-1 mostraban una diferenciación del fenotipo
morfológicamente similar a la mostrada por las células PC12 tratadas
con el factor de crecimiento nervioso (NGF). Las células PC12
normalmente son células completamente redondas y planas. Las que
habían sido trasnfectadas con pEAPP-1 tienen
prolongaciones citoplasmáticas que las asemejan a las neuritas. Las
células PC12 tratadas con NGF presentan extensiones neuríticas
sumamente largas. Se seleccionaron y se propagaron trece clones de
células PC12 transfectadas con pEAPP-1.Ocho de esos
clones celulares mostraron el fenotipo espontáneo de diferenciación,
con los clones 1-8, 1-1, y
1-4 mostrando los fenotipos más evidentes. La
tinción de células PC12 transfectadas con pEAPP-1con
un anticuerpo contra el \beta péptido tal y como se ha descrito,
indicó que aquellas células que mostraban la diferenciación también
expresaban la APP. Dado que las células PC12 transfectadas con el
clon pMTAPP1 no mostraban este fenotipo, incluso cuando se expresaba
el ADNc de la APP770, estos resultados sugieren que la expresión de
la APP770 del promotor humano tiene nuevas propiedades en lo que se
refiere a la fisiología de la célula.
El pMTA4 es un ejemplo del tipo de construcción
que se muestra en la Figura 4a, donde el promotor utilizado es el
promotor de la metalotionina. La proteína codificada en esta
construcción difiere ligeramente de la representada en la Figura 4.
Se digirió un clon de ADNc de la APP770 con Asp718 el cual divide
después de la posición 56 (sistema numérico de Kang y col., 1987).
La 5ª extensión resultante se completó utilizando la enzima de
Klenow (Maniatis). Se escindió la misma preparación de ADN con
EcoRI, que también corta después de la posición 1795 y la 5ª
extensión resultante se completó utilizando la enzima de Klenow
(Maniatis). La auto-ligadura de esta molécula da
como resultado un clon de expresión en el cual la proteína truncada
y por lo tanto codificada, contiene la secuencia líder seguida por
una versión acortada del \beta péptido que comienza con la
secuencia
phe-arg-val-gly-ser-of
del B péptido, seguida por los 56 aminoácidos terminales de la APP.
El ADN de esta construcción es transfectado en células PC12 según se
ha descrito.
Se obtuvieron los ratones transgénicos por medio
de una microinyección del vector pMTAPP1 del ADN en embriones
pronucleares de ratón. El pMTAPP1 es un ejemplo del tipo de
construcción que aparece en la Fig. 1a, el cual está ligado
operativamente al promotor de la metalotionina. Los procedimientos
para la microinyección en los embriones de ratón se describen en
"Manipulating the mouse embryo", por B. Hogan y col.
(1986). Más abajo se da únicamente una breve descripción de los
procedimientos a emplear.
Los ratones se obtuvieron de Taconic Laboratories
(German Town, Nueva York). Se usaron hembras de Swiss Webster para
la recuperación e implantación de embriones. Se usaron B6D2F_{1}
para el apareamiento y Swiss Webster vasectomizados como sementales
para simular la pseudopreñez.
Recuperación de embriones de ratón: Se
indujo a superovular a hembras de ratón de entre 4 a 8 semanas de
edad, usando 5 UI de suero de gonadotropina de yegua preñada (PSMG;
Sigma) seguido, 48 horas después, por 5 UI de gonadotropia coriónica
humana (hCG; Sigma). Las hembras se pusieron con machos
inmediatamente después de la inyección con hCG. Se recogieron los
embriones de ratón de los oviductos abiertos de las hembras
apareadas, 21 horas después de la hCG, colocándolos en solución
salina tampón fosfato de Dulbecco con un 0,5% de suero de albúmina
bovina (BSA: Sigma). Se quitaron los cúmulos de células circundantes
con hialuronidasa (1mg/ml). Luego se lavaron los embriones de ratón
pronucleares, se los colocó en una solución salina equilibrada de
Earle conteniendo un 0,4% de BSA (EBSS) y en una incubadora a
37,5ºC, con una atmósfera humidificada con un 7% de CO_{2}, un 5%
de O_{2}, y un 88% de N_{2} hasta el momento de la
inyección.
Microinyección: Para la microinyección, se
disolvió ADN Sal1 purificado Elutip-D^{TM}
en 5mM de Tris (pH 7,4) y 0,1 mM de EDTA a una concentración de
3\mug/ml. Se extrajeron microagujas y pipetas de porte de tubos de
coagulación de Fisher (Fisher) de un extractor de pipetas DKI modelo
720. Se rompieron luego las pipetas de porte a aproximadamente
70\mum (O.D.) y se las pulió a fuego hasta un I.D. de alrededor de
30\mum en una microforja Narishige (modelo
MF-83). Se montaron las pipetas en
micromanipuladores Narishige que se sujetaron a un microscopio Nikon
Diaphot. Se llenó la pipeta de inyección rellena de aire con una
solución de ADN a través de su punta, después de romper la punta
contra la pipeta de porte. Se colocaron los embriones de ratón, en
grupos de 30 a 40, en gotas de
100 \mul de EBBS bajo aceite de parafina para la micromanipulación. Se orientó y se sostuvo un embrión de ratón con la pipeta de porte. Se insertó entonces la pipeta de inyección en el pronúcleo del macho (normalmente el más grande). Si la pipeta no podía abrirse paso a través de la membrana de forma inmediata, se golpeaba suavemente la plataforma para ayudar a la penetración. Se inyectaba entonces el núcleo y se controlaba la inyección a través de la inflamación del núcleo. Enseguida de la inyección, el grupo de embriones de ratón se colocaba en EBSS hasta su transferencia a las hembras receptoras.
100 \mul de EBBS bajo aceite de parafina para la micromanipulación. Se orientó y se sostuvo un embrión de ratón con la pipeta de porte. Se insertó entonces la pipeta de inyección en el pronúcleo del macho (normalmente el más grande). Si la pipeta no podía abrirse paso a través de la membrana de forma inmediata, se golpeaba suavemente la plataforma para ayudar a la penetración. Se inyectaba entonces el núcleo y se controlaba la inyección a través de la inflamación del núcleo. Enseguida de la inyección, el grupo de embriones de ratón se colocaba en EBSS hasta su transferencia a las hembras receptoras.
Transferencia: Se aparearon hembras
adultas con ciclos aleatorios con machos Swiss Webster
vasectomizados. En el momento de la tranferencia, se anestesiaba a
las hembras con avertin. Se dejaron expuestos los oviductos por
medio de una única incisión en la línea media dorsal. Se hizo luego
una incisión a través del cuerpo directamente sobre el oviducto. Se
rasgó posteriormente la bolsa ovárica con pinzas de relojero. Los
embriones de ratón a transferir se colocaron en DPBS y en la punta
de una pipeta de porte (alrededor de 10-12
embriones). La punta de la pipeta se insertó en el infundíbulo y se
transfirieron los embriones de ratón. Después de la transferencia,
se cerró la incisión con dos suturas.
Análisis de los ratones para la integración
transgénica: Se extrajeron las muestras de la cola, de alrededor
de 1 cm. de longitud, para analizar el ADN, a las tres semanas de
edad. Las muestras de cola fueron digeridas mediante incubación con
vibración durante toda la noche a 55ºC, en presencia de 0,7 ml de
Tris 5mM, con un pH 8,0, EDTA 100 mM, 0,5% de SDS y 350 \mug de
proteinasa K. El material digerido fue extraído una vez con un
volumen igual de fenol y otra con un volumen igual de
fenol-cloroformo (mezcla 1:1). Las sustancias
sobrenadantes se mezclaron con 70 \mul de acetato de sodio 3 M
(0,6 pH) y se precipitó el ADN agregando un volumen igual de etanol
al 100%. Los ADNs fueron centrifugados en una microcentrífuga,
lavados una vez con un 70% de etanol, secados y disueltos en 100
\mul de tampón TE (Tris 10 mM, pH 8,0, y EDTA 1 mM).
Se redujeron 10-20 \mul de ADN
con BamHI, se los sometió a electroforesis en geles de
agarosa al 1%, se los trasladó a papel de nitrocelulosa, y se los
hibridó con un fragmento etiquetado^{-32p} de ADNc de la APP. Se
identificaron los animales transgénicos mediante
auto-radiografía de los filtros de nitrocelulosa
hibridados. Se analizaron también los ADNs mediante una PCR llevada
a cabo con cebadores sintéticos para generar un fragmento de 800
bp.
Se microinyectaron un total de 671 embriones
pronucleares de ratón, de los cuales nacieron 73 crías vivas y 6
muertas. El análisis del ADN permitió identificar 9 ratones
transgénicos (5 hembras y 4 machos) que fueron criados para generar
animales transgénicos F_{1} y F_{2}. Estos animales se pueden
analizar para encontrar la expresión del ARNm y de la proteína APP
en diferentes tejidos y para detectar las alteraciones en el
comportamiento y las anormalidades histopatológicas descritas
anteriormente.
Claims (13)
1. Una célula transgénica de roedor, o de
mamífero, que contenga una construcción genética que comprenda un
promotor ligado operativamente a una combinación de ADNc/clon de
expresión genómica,
- en donde dicho clon de expresión contenga una secuencia de ADNc que codifique la APP770, o una secuencia de ADNc que codifique la APP770 con una mutación que se produzca de forma natural,
- en donde una secuencia genómica del ADN de la APP, que conste del exón 6 y de una determinada cantidad del intrón adyacente en sentido descendente, que sea suficiente como para cortar y empalmar la región codificadora del Kl y del OX-2 y una cierta cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y descendente suficientes para el corte y empalme, y el exón 9 y una cierta cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para el corte y empalme, sea sustituida en la región correspondiente de la secuencia del ADNc que codifique la APP770, o del ADNc que codifique la APP770 con una mutación que se produzca de forma natural, y
- en donde la construcción sea transcripta y cortada y empalmada alternativamente en las células de mamíferos para formar moléculas de ARNm que codifiquen y se traduzcan en APP695, APP751 y APP770.
2. Las células transgénicas de roedores o
mamíferos, de la Reivindicación 1 en donde el promotor sea
seleccionado de entre el grupo que consta de: el promotor humano de
la APP, el promotor en ratones de la APP, el promotor en ratas de la
APP, el promotor de la metalotionina, el promotor específico de la
enolasa neuronal de la rata, el promotor del gen de la \beta
actina, el promotor del gen de la cadena del factor de crecimiento
humano derivado de las plaquetas B (PDGR-B), el
promotor del gen del canal de sodio de la rata, el promotor del gen
de la proteína básica de la mielina de los ratones, el promotor del
gen humano de la superóxido dismutasa cobre-zinc, y
el promotor del gen regulador del dominio POU de los mamíferos.
3. Las células transgénicas de roedor, o de
mamífero, de la Reivindicación 1 en donde la construcción esté
integrada en el cromosoma de la célula del roedor o del
mamífero.
4. Las células cultivadas a partir del ratón
transgénico de la Reivindicación 3.
5. El roedor de la Reivindicación 1 en donde el
codón que codifica el residuo de la valina en el punto 717 de la
proteína del tipo común de la APP770 ha sido mutado para codificar
un amioácido seleccionado del grupo consistente en: ile, phe, gly,
leu, ala, pro, trp, met, ser, thr, asn, y gin.
6. El roedor de la Reivindicación 1 en donde el
promotor es el promotor de la APP de las mismas especies de origen
que en el roedor.
7. Un método para hacer un modelo transgénico de
la enfermedad de Alzheimer que comprenda la introducción en las
células de roedor, o en embriones de roedor, de una construcción
genética que incluye un promotor ligado operativamente a una
combinación de ADNc/clon genómico de expresión
- en donde dicho clon de expresión contiene una secuencia del ADNc que codifica la APP770, o una secuencia de ADNc que codifica la APP770 con una mutación producida de forma natural,
- en donde una secuencia genómica del ADN de la APP, que consista en el exón 6 y una cantidad del intrón adyacente en sentido descendente suficiente para el corte y empalme, la región de codificación del Kl y del OX-2 y una cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y descendente suficientes para el corte y empalme, y el exón 9 y una cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para el corte y empalme, hayan sido sustituidos en la región correspondiente de la secuencia del ADNc que codifica la APP770, o del ADNc que codifica la APP770 con una mutación que se ha producido naturalmente, y
- en donde la construcción se transcribe y se corta y empalma de forma alternativa en células de mamíferos para formar moléculas de ARNm las cuales codifican y son traducidas en APP695, APP751 y APP770.
8. El método de la Reivindicación 7 en donde el
modelo transgénico es un roedor con alteraciones en su
comportamiento.
9. Un método para comprobar la utilidad de un
compuesto en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que
incluya la determinación en una célula de roedor, o de mamífero,
transgénico que haya sido expuesta al compuesto a probar y teniendo
integrada en el cromosoma una construcción genética,
- en donde la construcción comprenda un promotor ligado operativamente a una combinación de ADNc/clon de expresión genómica, en donde dicho clon de expresión contenga la secuencia de ADNc que codifique la APP770 o un ADNc que codifique la APP770 con una mutación que se ha producido de forma natural,
- en donde una secuencia genómica del ADN de la APP consistente en el exón 6 y una cantidad del intrón adyacente en sentido descendente suficiente para el corte y empalme, las regiones de codificación del Kl y el OX-2 y una cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y descendente suficientes para el corte y empalme, y el exón 9 y una cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para el corte y empalme es sustituido en la secuencia del ADNc que codifique la APP770, o en la secuencia del ADNc que codifica la APP770 con una mutación producida naturalmente, y
- en donde la construcción esté transcripta y cortada y empalmada de forma alternativa en la célula del roedor o del mamífero para formar ARNm el cual se traduce en APP695, APP751 y APP770.
- si hay una expresión o procesado modificados de la APP, en donde la presencia de la expresión o el procesado alterados de la APP sea indicativa de un efecto del compuesto sobre la enfermedad de Alzheimer.
10. El método de la Reivindicación 9, utilizando
roedores transgénicos que comprenda, además, la determinación de si
los roedores transgénicos presentan alteraciones histopatológicas, o
en su comportamiento, después de la administración del
compuesto.
11. Una construcción genética que comprenda un
promotor ligado operativamente a una combinación ADNc/clon genómico
de expresión, en donde el clon de expresión comprenda una secuencia
de ADNc que codifique la APP770, o la APP770 que incluya una
mutación producida de forma natural, en donde una secuencia genómica
del ADN de la APP que conste del exón 6 y de una cantidad del intrón
adyacente en sentido descendente suficiente para el corte y
empalme, la región de codificación del Kl y el OX-2
y una cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y
descendente suficiente para el corte y empalme, y el exón 9 y una
cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para
el corte y empalme, esté substituido en la secuencia del ADNc que
codifica la APP770, o de la APP770 que incluya una mutación
producida de forma natural, y en donde la construcción se transcribe
y corta y empalma de forma alternativa en células de mamíferos para
formar moléculas de ARNm las cuales codifican a, y se traducen en,
la APP695, la APP751 y la APP770.
12. Una construcción genética conforme a la
Reivindicación 11 en donde el promotor se selecciona de un grupo en
el que figuren el promotor humano de la APP, el promotor de la APP
del ratón, el promotor de la APP de la rata, el promotor de la
enolasa específica de la neurona de la rata, el promotor del gen
humano de la actina, el promotor del gen de la cadena del factor de
crecimiento humano derivado de las plaquetas B
(PDGF-B), el promotor del gen del canal de sodio de
la rata, el promotor del gen de la proteína básica de la mielina del
ratón, el promotor del gen humano de la superóxido dismutasa
cobre-zinc, y el promotor del gen regulador del
dominio POU en los mamíferos.
13. Una construcción genética conforme a la
Reivindicación 11 en donde la construcción es capaz de integrarse en
el cromosoma de la célula de mamífero.
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