DE3636991A1 - Verfahren zur uebertragung organischer und/oder anorganischer substanzen auf ei- und/oder somazellen von tieren sowie entsprechende zusammensetzungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Übertragung organischer und/oder anorganischer Substanzen auf Ei- und/oder Somazellen von Tieren, Zusammensetzungen zur Durchführung dieses Verfahrens, Vorstufen solcher Zusammensetzungen sowie entsprechende transgene Tiere.

Es wird ein Verfahren zur Übertragung von organischen und/oder anorganischen Substanzen durch Spermien auf entsprechende Zielzellen beschrieben. Die zu übertra­ genden Substanzen werden zum Schutz vor Verdünnung, enzymatischer oder andersartiger Modifikation in Vesi­ kel oder Granula gehüllt. Diese Umhüllungen werden dann an Spermien gebunden. Die Spermien transportieren die Vesikel bzw. Granula zu den entsprechenden Zielzellen - vor allem Eizellen- und penetrieren deren äußere Hül­ len. Der Vesikelinhalt bzw. die Granulakomponenten wer­ den im Zellinneren freigesetzt, wo sie ihre spezifi­ schen Wirkungen hervorrufen. Das Verfahren eignet sich besonders für Übertragung von Nukleinsäuren auf Eizel­ len zum Zwecke der Erzeugung transgener Organismen so­ wie für Studien zur Teratologie und Genregulation in der frühen Embryogenese.

Es ist bekannt, daß Gene bisher ausschließlich durch Ei- bzw. Embryomanipulation oder unter Verwendung von Viren auf einen Organismus übertragen wurden (Palmiter et al., 1982: Nature, 300:611, Brackett et al., 1971: PNAS 68 (2):353). Die Verwendung von ganzen Viren als Genvektoren ist als sehr problema­ tisch anzusehen und im Interesse von Experimentator, Tierhalter, Verbraucher und nicht zuletzt der Ver­ suchsobjekte wegen entschieden abzulehnen.

Methoden, wie transgene Tiere erzeugt werden können, sind in einem Schema von Palmiter und Brinster (1986, Ann. Rev. Genet. 20) zusammengefaßt. Dabei ist die gebräuchlichste die der Pronukleusinjektion (Abb. 1).

siehe Abbildung 1

• 1. An erster Stelle stand bisher die Mikroinjek­ tion von Genen (gelöst in einem physiologischen Puffer) in einen der Pronuklei des befruchte­ ten Eies. Einige tausend transgener Mäuse (als klassische Versuchstiere) sind seit 1980 auf diese Weise erstellt worden, dazu kommen eini­ ge wenige transgene Schafe, Schweine und Ka­ ninchen.
• Die Injektionsprozedur bedarf jedoch einer hochspezifischen Ausrüstung und eines sehr großen technischen Geschicks. Einflußfakto­ ren auf die Integration hinsichtlich des injizierten Gens sind die Konzentration der DNS, Art der Pufferlösung, Injektionszelle, Form des Plasmids sowie die Herkunft des Em­ bryos (Mäusestamm). Hingegen beeinflußt die Länge der DNS-Moleküle (0,5-10,0 kb) die In­ tegrationsfrequenz nicht.
• Der Mechanismus der Integration mikroinjizier­ ter DNS ist unbekannt. In den meisten Fällen kann eine Tandemkonfiguration bei Anwesenheit mehrerer Kopien festgestellt werden. Jedoch sind auch verschiedene Loci auf mehreren Chro­ mosomen bekannt. Da lineare DNA fünfmal besser integriert als zirkuläre, scheinen die Enden der Fragmente am Einbau beteiligt zu sein.
• Generell ist die integrierte Fremd-DNS stabil für viele Generationen. Gelegentlich ist ei­ ne Amplifikation oder Deletion möglich.
• Eine weitere Methode zur Erzeugung transgener Tiere bestand darin, die in Frage kommende DNS in das Zytoplasma der Zygote, der Blastomeren des Zweizellers oder in das Blastozoel der Blastozyste zu injizieren. Hierbei ist die Erfolgsrate wesentlich niedriger, gleichzei­ tig wird Mosaikbildung sehr wahrscheinlich.
• 2. Eine sehr ineffiziente Methode, transgene Tiere zu erzeugen, ist der Kernaustausch. Dazu müssen die Kerne von in vitro trans­ fizierten, totipotenten Zellen mikromanipu­ latorisch isoliert werden, in dem die Plas­ mamembran mit dem größten Teil des Zytoplas­ mas entfernt wird. Der isolierte Kern wird nun mittels einer Mikropipette in ein soeben befruchtetes Ei transferiert. Nach Absetzen dieses Kernes werden beim Zurückziehen der Pipette aus dem Ei sowohl der weibliche als auch männliche Pronukleus abgesaugt. Die Eizelle besitzt nun einen diploiden Kern, der ein (vorher in vitro transfiziertes) Gen enthält. Das Verfahren erfordert extrem gute Beherrschung der mikromanipulatorischen Techniken und ist bei äußerst geringen Erfolgs­ raten sehr kostenaufwendig.
• 3) Eine weitere Transfermethode war es, terato­ karzinome Zellen zu transfizieren und sie als Genträger in Embryonen (Blastozysten) zu trans­ ferieren. Dadurch entstehen Chimären, deren ei­ ne Zellinie transgen ist. Allerdings treten hier­ bei beträchtliche Schwierigkeiten hinsicht­ lich Expressionsselektion und Diploidie der gewünschten Zellen auf, abgesehen von der Tatsache, daß auch hier die Transmission in die Keimbahn ein Zufallsergebnis ist.
• 4. Genetisch manipulierte Retroviren als wei­ tere Transfervariante sind in der Lage, Em­ bryonen zu infizieren. Allerdings ist es bisher nicht möglich, die potentielle Ex­ pression retroviraler, nativer Gene sicher auszuschließen, womit die Gefährlichkeit in Umgang und Verwendung von Viren diese zumindest für die Praxis ausschließt.

Zur Problematik der gezielten Integration konnte in Experimenten mit Zellkulturen gezeigt werden, daß der Einbau fremden Erbmaterials an eine exakt definierte Stelle eines kompletten Genoms durch­ führbar ist ( Smithies et al. 1985, Nature 317:230). Der Einbau kann, je nach Struktur des verwendeten Plasmids bzw. Vektors, zur Insertion eines neuen Genes, Zerstörung eines bereits vorhandenen Genes (Ziel: Entfernung einer negativen Mutation) oder aber Ersatz eines vorhandenen Genes führen.

Alle diese bislang diskutierten Möglichkeiten zur Erstellung transgener Tiere benötigen Eier oder Embryonen in vitro. Das bedeutet, daß Spen­ dertiere hormonell stimuliert werden müssen, da­ mit zum einen möglichst viele Eier und zum ande­ ren diese auch zu einem bestimmten Zeitpunkt ovulieren. Die hormonelle Stimulation an sich ist ein künstlicher Eingriff, der den Hormon­ haushalt eines Tieres beeinflußt, Antikörper gegen die Hormone (PMSG = pregnant mare serum gonadotropin) verursacht und schließlich kost­ spielig ist. Gleichzeitig müssen die behandel­ ten Tiere von Tierarzt und Pflegepersonal ge­ nau beobachtet werden, und dies während einer langen, auf die eigentliche Brunst vorberei­ tenden Phase.

In der Regel wird ein Spendertier nach der künstlichen Besamung blutig (=chirurgisch) gespült, um die Embryonen zu erhalten. Nur beim Rind geschieht dies ohne operativen Ein­ griff; jedoch muß hier eine eigens ausgebil­ dete Arbeitskraft eingesetzt werden. Bei der unblutigen Spülung wird ein Katheter am Ute­ rusende plaziert und mittels eines Gummiballons gegen die Zervix abgedichtet. Dann wird durch Pump- und Sogwirkung eine Pufferlösung in den Uterus gebracht. Beim Absaugen dieser Lösung werden auch die Embryonen mit ausgespült und sind nur mikroskopisch zu finden.

Bei Schwein und Schaf werden die Embryonen aus dem operativ freigelegten Uterus in ähnlicher Weise gespült. Der operative, chirurgische Ein­ griff bedarf einer ausgefeilten und teuren Narkosetechnik sowie einer aseptischen Öffnung des Peritoneums von der Bauchseite her. Hierzu ist ein umfangreiches, wertvolles Instrumenta­ rium notwendig (Operationstisch,-besteck) und nicht zuletzt Fachpersonal.

Erst wenn die Embryonen nach zeitraubender mikrosko­ pischer Suche vorliegen, kann mit den oben erwähn­ ten Methoden die eigentliche Arbeit des Gentransfers begonnen werden.

Nach dem Gentransfer sind zwischen 20 und 80 % aller Embryonen unbrauchbar für den Rücktransfer in eine Ammenmutter, da durch die Injektion die Plasma-, bzw. Kernmembran zerstört ist.

Die restlichen intakten Embryonen können nun in eine Ammenmutter zurücktransferiert werden. Beim Rind geschieht dies wieder unblutig, bedarf aber eines hormonell synchronisierten Empfängertieres, um die physiologischen Gegebenheiten im Uterus de­ nen eines trächtigen Tieres anzugleichen, was eine entsprechende, aufwendige Vorbereitung bedeutet. Bei Schaf und Schwein ist für den Transfer wiederum ein operativer Eingriff nötig (zeitaufwendig und teuer), um die Embryonen in eine Ammenmutter zu brin­ gen, die sie austragen soll. Die letztendlich gebore­ nen Jungen sind nur mehr ein geringer Prozentsatz der ursprünglich verfügbaren Embryonen. Von den gebo­ renen Jungen sind wiederum maximal 25 % (Maus) und weniger als 0,1% bis 1% bei Schaf, Schwein und Ka­ ninchen transgenisch.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient nun zur Einbrin­ gung bestimmter Substanzen in Zellen von Tieren, mit dem Ziel, diese Zellen zu verändern oder aber die Wir­ kung von Substanzen in diesen Zellen zu untersuchen.

Die für derartige Untersuchungen bzw. Ausführun­ gen wirtschaftlich und auch wissenschaftlich in­ teressantesten Zellen stellen z.B. die schwer er­ reichbaren Eizellen dar, und derartige Arbeits­ weisen sind spezielle Ausführungsformen der Er­ findung.

Das neue Verfahren basiert auf der Ausnutzung ei­ ner biologischen, lange von der Natur erprobten Methode des DNS-Transportes - nämlich der Verwen­ dung von Spermien als Transfervehikel. Es be­ dient sich weiterhin der seit langem etablierten Routine der künstlichen Besamung (vorrangig bei Nutztieren), die hier nicht näher erläutert zu werden braucht.

Unter Ausnutzung der natürlichen Befruchtungsvor­ gänge sowie unter Zuhilfenahme der künstlichen Be­ samung wird Sperma zweckmäßig für kurze Zeit mit künstlich hergestellten Vesikeln oder Granula in­ kubiert, wobei sich diese unter den gewählten Be­ dingungen an die Spermien anlagern. Diese Vesikel­ tragenden Spermien werden anschließend an den Be­ fruchtungsort gebracht, wo sie in die Eizellen ein­ dringen. Die Vesikelpräparation erfolgt in Anwesen­ heit von Nukleinsäuren, die für ein oder mehrere zu transferierende Gene kodieren, oder aber in An­ wesenheit von anderen Substanzen, die in Ei- oder Somazellen übertragen werden sollen. Bei der Vesi­ kel- bzw. Granulabildung werden die zu transferie­ renden Substanzen eingeschlossen und damit während des Transports zu den Zielzellen geschützt. Die Spermien bringen die Vesikel in das Zytoplasma der Zielzellen. Dort werden die Granula aufgelöst oder die Vesikelmembran durch zelleigene En­ zyme lysiert und der Vesikelinhalt freigesetzt. Werden Nukleinsäuren übertragen und in das Ge­ nom der Zygote eingebaut, so ist die Präsenz des neuen Gens bzw. der neuen Gene in allen Zellen des sich entwickelnden Organismus mög­ lich. Bei einer Etablierung in den Keimzellen werden die transferierten Gene auch auf alle Nachkommen dieses Organismus weitervererbt.

Ein zentraler Aspekt der vorliegenden Erfindung ist dabei folgender: Spermien übertragen an ihre Oberfläche gebundene Substanzen, beispielsweise auf Eizellen. Um diese Substanzen durch die Sper­ mien transportieren zu können, müssen sie an den Spermien befestigt werden. Damit jedoch auch gleichzeitig keine Verdünnung oder Abänderung dieser Substanzen durch Faktoren der Umgebung beim Transport erfolgen kann, werden die zu über­ tragenden Substanzen verpackt. Demzufolge werden die eigentlich wirkungsvollen Substanzen erst in eine entsprechende Verpackung eingebracht, und diese Verpackung wird dann an der Spermienoberflä­ che befestigt. Zur Befestigung können Stoffe die­ nen, die in der Lage sind, die Oberflächen der Spermien mit denen der Verpackung fest zu verbinden. Trifft das Spermium auf die Zielzelle, so dringt es in diese Zielzelle ein, und die zu übertragenden Substanzen werden im Innern der Zielzelle freigesetzt. Durch die nachfolgende Beschreibung wird klargelegt, daß die Art und Weise der Herstellung der Verpackung für die zu übertragenden Substanzen stets mittels ana­ loger Techniken durchführbar ist.

Die Spermien (=Spermatozoen) aller höheren Vielzeller unterscheiden sich sowohl in Gestalt als auch in ihrer molekularen Zusammensetzung. Grob lassen sich Spermien in einen Kopf und einen Schwanz gliedern. Im Kopf liegt das Erbmaterial in kondensierter Form vor, während der Schwanzteil ein praktisch autarkes Bewegungsorgan dar­ stellt. Die äußere Umhüllung der Spermien bildet eine hochdifferenzierte Plasmamembran (Plasmalemma), die sich über die gesamte Spermienstruktur (Kopf und Schwanz) erstreckt. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Plasmamembran variieren je nach dem Reifestadium der Spermien (epididymal oder ejakuliert). Ein Verlust spe­ zifischer Spermien-bedeckender Moleküle und die Anrei­ cherung neuer Substanzen an der Spermienoberfläche konn­ ten während der Spermiogenese nachgewiesen werden. Dies zeigt sich besonders bei dem ständigen Zunehmen von Con­ canavalin-A-Rezeptoren auf der Spermienoberfläche während der Reifung in der Epididymis (Fournier-Delpech et al.1977, Ann.Biol.Anim.Biochim.Biophys.17: 207).

Studien über Glykoproteine auf der Oberfläche epididy­ maler Rattenspermien haben aufgedeckt, daß ein bestimm­ tes Glykoprotein nur in der Plasmamembran des Schwanz­ teiles vorhanden ist. Dieses und mehrere andere Arten Spermien-bedeckender Glykoproteine, die im männlichen Genitaltrakt sekretiert werden, gleichen den Fibronek­ tinen, einer großen Gruppe adhäsiver Glykoproteine, die auf Zelloberflächen, Bindegeweben und in einigen Körperflüssigkeiten vorkommen. Alle diese Glykopro­ teine sind assoziiert mit Membranen und für zelluläre Adhäsionen mitverantwortlich.

Genauere Informationen über die biochemische Zu­ sammensetzung der Spermienplasmamembran beruhen meist auf indirekten Nachweisen, wie Unterschiede in der Ladung und Orientierung im elektrischen Feld, Agglutinationsverhalten, lokale Expression von H-Y Antigen, Verhaltensänderungen nach Neura­ minidasebehandlung, Bindungsvermögen von kolloida­ lem Eisen und vor allem unterschiedliche Bindungs­ affinitäten verschiedener Plasmamembranarreale mit Lektinen, die an Kohlenhydratseitenketten bin­ den. Derartige Kohlenhydratketten haben auch bei Spermien ihre Aufgabe in der Zellerkennung. Bei den Enzymen, die derartige Kohlenhydratketten herstellen, handelt es sich hauptsächlich um Gly­ kosyltransferasen und Glukosidasen, die sich durch eine hohe Zell-spezifische Aktivität auszeichnen. Dadurch begründen sich auch die bemerkenswerten Unterschiede im chemischen Aufbau und in der Funk­ tion von Kohlenhydratgruppen in einzelnen Zellty­ pen. Einige dieser Enzyme können von Zellen aktiv aus dem umgebenden extrazellulären Raum aufgenommen werden. Dies ist besonders im Hinblick auf die ver­ schiedenartigen akzessorischen Sekretionen bedeut­ sam, mit denen die Spermien innerhalb des reproduk­ tiven Traktes in Berührung kommen.

Eine regionale Differenzierung der Plasmamembran zeigt sich auch in der sehr charakteristischen Verteilung verschiedener membrangebundener Enzyme, wie ATPase oder anderer Phosphatasen. Unterschied­ liche Substanzen (bestimmte Toxine, Alkaloide, Iono­ phore) binden gerade an diese membranständige ATP­ ase der Spermien. Ähnliche Rezeptormechanismen erklä­ ren auch die guten Bindungen einer Vielzahl von Sub­ stanzen an die Spermienoberfläche, wie die Bindung von Thalidomid, Tetrazyklin und alpha-Bungarotoxin.

Insbesondere kann die Membran der Spermien eine Rei­ he von Steroidhormonen und sog. "second messenger" wie zyklisches AMP binden. Rinderspermien nehmen ei­ ne Vielzahl von Steroiden auf, von denen Progesteron am stärksten bindet, gefolgt von Östradiol, Dihydro­ testosteron, Androstanediol und Eticholanon.

Ein weiterer Bestandteil der äußeren Spermienplasma­ membran ist das sog. membrangebundene Substrat-binden­ de Transportprotein (Carboglutelin). Dieses Protein ist für die Bindung und Aufnahme verschiedener Zucker aus der die Spermien umgebenden Flüssigkeit verant­ wortlich und versorgt somit die Spermien mit der nöti­ gen Energie.

Regionale Bindungseigenschaften der Spermienplasmamem­ bran wurden auch mittels anderer Methoden demonstriert. Mittels der Immunfluoreszenz konnten die Bindungsstel­ len für Prostaglandine und Laktat-Dehydrogenase X an Kaninchen- und Mäusespermien lokalisiert werden. Diiodo­ fluoreszeinisothiocyanat und Radioiodination ermöglich­ ten Erkenntnisse über die regionale Differenzierung der Plasmamembran und Eigenschaften von Oberflächenpro­ teinen und Lipiden bei Spermien von Seeigel, Goldham­ ster und Rind. Fluoreszierendes Chlortetrazyklin wurde bei Mäusespermien erfolgreich eingesetzt, um Verände­ rungen in der Plasmamembran bei der Akrosomenreaktion und der Befruchtung zu erkennen. Wertvolle Erkenntnisse lieferten auch Studien mit 1-Anilinonaphtalen-8-Sulpho­ nat vor allem in bezug auf Substanzen, die von außen auf die Spermienoberfläche abgelagert werden (Edelmann and Millette, 1971, PNAS 68:2436; Mercado and Rosado,1973, Biol.Reprod. 14:632).

Diese Ausführungen sollen aufzeigen, daß zahlreiche Möglichkeiten zur Befestigung von Fremdsubstanzen auf der Oberfläche von Spermien existieren. Ausschlag­ gebend ist die molekulare Zusammensetzung der Ober­ fläche der jeweils verwendeten Spermien, die wiederum abhängig ist von dem Reifungsgrad der Spermien und der Spezies, von welcher die Spermien gewonnen wurden. In manchen Fällen mag es auch vorteilhaft sein, die Spermien vor der Verbindung mit den Verpackungen ei­ ner Modifikation ihrer Plasmamembranoberfläche zu un­ terziehen. Enzymatische Behandlungen können dabei die Bindung störende Oberflächenstrukturen entfernen oder aber entsprechende Moleküle an der Oberfläche synthetisieren, um die Bindungsfähigkeit zu erhöhen.

Bei der Übertragung von Substanzen durch Spermien auf Somazellen dürfte es in manchen Fällen (Gensubsti­ tution, somatische Gentherapie) ebenfalls effektiver sein, den haploiden Genomsatz der Spermien mittels io­ nisierender Strahlung zu eliminieren, um kein zusätz­ liches genetisches Material mit in die diploiden Ziel­ zellen einzubringen. Eine Nutzung von Spermien als "genomlose" Transfervehikel ist vor allem nach hochin­ tensiver, kurzwelliger Bestrahlung der Spermien möglich.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren beschriebenen viel­ fältigen Arten von Bindungen zwischen der Spermien­ hülle und der Verpackungseinheit sollen durch folgende Modellvorstellungen näher erläutert werden:.

Die Oberflächen biologischer Strukturen, wie z.B. die äußere Plasmamembran der Spermien, weisen nach außen dreidimensionale Strukturelemente (Molekül­ gruppen) auf, die aus der Oberfläche (Membranmatrix) herausragen. Die eigentliche Membran (Grundgerüst) wird durch eine Lipid-Doppelschicht aufgebaut, die sich nach beiden Seiten hydrophil verhält. In die­ ser Lipid-Doppelschicht sind u.a. verschiedene Ar­ ten von Proteinen mit deren lipophilen Aminosäure­ sequenzen verankert. Nach außen ragen hydrophile Seitenketten der Proteine und Lipide. Meist handelt es sich dabei um Oligo- oder Polysaccharide oder um hydrophile Aminosäurebereiche von Proteinen. Diese Teile zeichnen sich durch eine spezielle räumliche Struktur aus, die zudem durch elektrische Ladungen, hydrophile und hydrophobe Wechselwirkungen, van der Waal′sche Kräfte und chemisch-physikalische Parame­ ter der Umgebung eine weiterecharakterisierung er­ fahren. Eine Vielzahl derartiger "herausragender" Merkmale eignen sich als Anheftungspunkte zur Bin­ dung von Stoffen, die von außen an die Plasmamem­ bran herangebracht werden. Ähnliche räumliche Struk­ turmerkmale charakterisieren auch die Oberflächen der zur Stoffumhüllung verwendeten verschiedenen Ver­ packungen.

Dem Verfahren liegt die Idee zugrunde, bestimmte nach außen ragende, räumliche Strukturen der Sper­ mienoberfläche mit Oberflächenstrukturen der Ver­ packungen zu verbinden. Je nach Beschaffenheit der spermalen Plasmamembran, der Art der Verpackung und der Art der Bindung kann die Verbindung zur Spermien­ plasmamembran zu einer Anlagerung (Adsorption) oder aber bei einem Verschmelzen der beiden Einheiten zu einer Fusion und der damit verbundenen Endozytose des Verpackungsinhaltes führen. Den relativ "invari­ ablen" Teil des Verfahrens stellt das Spermium dar, das normalerweise nur auf Grund des Reifezustandes und der Spezies, von der es stammt, variieren kann, d.h. je nach Spezies weisen die Spermien eine mehr oder weniger verschiedenartige Zusammensetzung ihrer Oberfläche auf. Je nach Spezies ist daher auch die Möglichkeit zu einer anderen Art der Bindung gegeben, wobei jedoch viele Arten von Spermien (höhere Wir­ beltiere) über einige gemeinsame Oberflächenstruk­ turen verfügen, wie bestimmte endständige Zucker. Grundsätzlich kann davon ausgegangen werden, daß die für den jeweiligen Zweck verwendeten Spermien durch deren spezifische Oberflächenbeschaffenheit die Zusammensetzung der Verpackungen (in bezug auf Oberflächeneigenschaften) implizieren und damit auch die geeignetste Art der Bindung zwischen Verpackung und Spermien vorgegeben ist. Es besteht aber auch die Möglichkeit, Oberflächeneigenschaften von Spermien gezielt zu verändern (Modifikation). So können etwa durch Inkubation mit dem Enzym Neuraminidase die in großer Anzahl vorhandenen endständigen Sialinsäure­ reste abgespalten werden. Dies führt zu einer Ver­ minderung der negativen Oberflächenladung und gleich­ zeitig zu einem Freilegen vieler, meist unterschied­ licher Zuckermoleküle, die vor der enzymatischen Be­ handlung unter den Sialinsäuren verborgen lagen (Cryptantigene). Diese nun freiliegenden, endständi­ gen Zuckermoleküle ermöglichen wiederum spezielle Bindungen. Auch eine "Neubeschichtung" der Spermien­ oberfläche kann durch enzymatische Behandlung er­ reicht werden. So übertragen Glykosyltransferasen spezifische Zuckermoleküle auf die Spermienober­ fläche. Dadurch werden wiederum andere Bindungs­ möglichkeiten geschaffen.

Alle hierfür in Frage kommenden Formen von Bindun­ gen können in zwei Bereiche getrennt werden:

a) Direkte Bindung von Verpackungen an Spermien

Eine Oberflächenstruktur der Verpackungshülle ("Schloß") paßt sterisch (räumlich) und physikalisch-chemisch (z.B. entgegengesetzte Ladungen) zu einer erhabenen Struktur ("Schlüssel") der Spermienmembran (Schlüssel- Schloß-Prinzip). Je exakter der Schlüssel zum Schloß paßt, um so fester wird die Bindung. Auch rein physika­ lische Phänomene, wie etwa entgegengesetzte Ladungen von Spermienoberfläche und Verpackung vermitteln eine direkte Bindung. Zur direkten Bindung sei das Beispiel spezieller Virusrezeptoren angeführt, die an exakt de­ finierte Strukturen der Spermienoberfläche binden. Ele­ mente der Verpackung (Virushüllproteine = Virusrezepto­ ren) ermöglichen als Schloß-ähnliche Mechanismen an be­ stimmten Oberflächeneigenschaften der Spermien (Schlüssel) die kompletten Viren (Verpackungsproteine mit Genom) zu verankern. Derartige Spermien-spezifische Virusrezepto­ ren können in die Verpackungshüllen (vor allem membran­ artige Verpackungen) mit eingebaut werden und als Bin­ dungsmoleküle zu den Spermien dienen. Über ähnliche Re­ zeptoren verfügen auch verschiedene Mikroorganismen wie bestimmte Mykoplasmen und Bakterien. Ferner besteht die Möglichkeit Spermien-spezifische Moleküle wie Antikörper oder Lektine kovalent an Komponenten der Verpackungshüllen zu binden. Hierbei erfüllen sie bei der Bindung die gleichen Funktionen wie die oben erwähnten Virusrezeptoren. Auch Gemische unterschied­ licher Bindungsmoleküle können eingesetzt werden.

b). Indirekte Bindung von Verpackung (Vesikel oder Granula) an Spermien durch Vermittlersubstanzen

Eine Vermittlersubstanz - eine Art Klebstoff - bindet sowohl an bestimmte Strukturen der Spermienoberfläche wie an bestimmte Strukturen der Verpackung. Der Kleb­ stoff selbst kann dabei sowohl aus zwei oder mehreren "Schlössern", wie auch aus einem "Schlüssel" und ein oder mehreren "Schlössern" bestehen.

Die indirekte Bindung umfaßt eine weit komplexere Viel­ falt an Bindungsmöglichkeiten.

Eine einfache Möglichkeit der Bindung läßt sich durch positiv geladene Ionen (Fe⁺⁺, Fe⁺⁺⁺, Zn⁺⁺ u.v.a.) zwischen den negativ geladenen Oberflächen der Spermien und Verpackungen erzielen. Nachteilig dabei können gewisse Instabilitäten sein, bedingt durch die Unspe­ zifität der Ladungsbindung und wahrscheinlich durch Chelatkomplex-bildende Stoffe, die oftmals die posi­ tiven Ionen neutralisieren.

Eine ebenfalls unspezifische Art, dafür aber sehr sta­ bile Art der Bindung wird durch Substanzen erreicht, welche die Fusion von Zellmembranen begünstigen (Sper­ mienplasmamembran und lipidhaltige Verpackungen).Das dabei verwendete Polyethylenglykol (PEG) führt jedoch meistens zu mehr oder weniger starken Beeinträchtigun­ gen der Mobilität der Spermien durch Agglutination oder Inhibition der Geiselbewegung. Ebenfalls unspezi­ fisch Spermien mit Verpackungen verbindend, aber mit ähnlichem Agglutinationsphänomen behaftet, haben sich bestimmte Zell-adhäsive Glykoproteine (Fibronektine) erwiesen.

Keine derartigen Probleme gibt es bei der Verwendung spezifischer Bindungsbrücken, wie etwa den Lektinen (Phytoagglutinine, Hämagglutinine oder Invertebraten­ agglutinine). Die am meisten verwendeten Pflanzenlek­ tine zeichnen sich durch eine hohe Bindungsspezifität und teilweise extrem hohe Bindungsaffinität für be­ stimmte Zuckermoleküle aus. Fast immer wird nur der endständige Zucker einer Oligo- oder Polysaccharid­ kette erkannt, die wiederum an einem Lipidmolekül (Glykolipid) oder einem Proteinmolekül (Glykoprotein) kovalent verankert ist. Einzelne Lektine binden unter gewählten Bedingungen immer nur eine bestimmte Art von Zuckermolekülen, andere Lektine wiederum können auch verschiedene Zucker binden. Da ein einzelnes Lektin­ molekül über zwei oder mehr Bindungsstellen (bi- oder polyvalent) verfügt, können Lektine Oberflächen mit gleichen endständigen Zuckermolekülen verkleben. Die Stärke der Verbindung zwischen der Spermienoberfläche und der Verpackung richtet sich dabei nach der Anzahl endständiger Zucker auf den zu verbindenden Oberflächen bzw. der Zuckerdichte, sowie nach der Zahl der Bindungs­ stellen (Valenzen) und der Bindungsstärke (Affinität) der Lektine, vorausgesetzt, die Lektine werden im Überschuß zugegeben. Bedingt durch die große Menge endständiger alpha-Mannose (bzw. alpha-Glukose; denn beide Zucker werden von Concanavalin A = Con A gebun­ den) auf den Spermien sehr vieler höherer Wirbeltiere bietet sich die Verwendung des Lektins Con A besonders an. Als sehr einfach zu handhaben hat sich dabei eine Übersättigung alpha-Mannose-tragender Lipidmembranen (Verpackungen) mit Con A herausgestellt, bei der - theoretisch gesehen - durch die Menge an zugeführtem Con A jeder einzelne Zuckerrest von nur einem Con A- Molekül besetzt wird. Damit ragen viele "freie" Manno­ sebindungsstellen des polyvalenten Con A von der Ver­ packungsoberfläche weg. Werden derartig Con A-beschich­ tete (bindungsaktive) Verpackungen zu den Spermien ge­ geben, so binden diese mit den noch freien Bindungs­ stellen der Con-A-Moleküle an die alpha-Mannosereste der Spermienoberfläche und adhärieren so die Verpackun­ gen an die Spermien. Ein großer Überschuß Bindungs­ aktiver Verpackungen verhindert dabei eine Agglutina­ tion der Spermien, da die gesamten Spermienoberflächen durch die Verpackungen abgesättigt werden.

Dieses Verfahren der Bindungsaktivierung kann eben­ falls auf Spermien angewendet werden. Eine Inkubation von Spermien (in verdünnter Suspension) mit Con A im Überschuß führt zu einer Absättigung aller Con-A-Bin­ dungsstellen auf der Spermienmembran. Die Spermien­ oberfläche ist danach bedeckt von einer großen Anzahl nach außen ragender, freier Zuckerbindungsstellen, die nun wiederum Verpackungen mit den entsprechenden Zuckern (alpha-Mannose, bzw.-Glukose) an ihrer Ober­ fläche an die Spermien binden.

Bei einer anderen Art von Bindungsmolekülen, den Antikörpern, kann ebenfalls, begründet durch die Bi­ oder Polyvalenz dieser Moleküle, die Technik der Übersättigung der Verpackungen mit anschließender Bin­ dung an die Spermien angewendet werden. Die Verwen­ dung Spermienantigen-spezifischer Antikörper erfordert natürlich das Vorhandensein von Spermienantigenen auf den Verpackungen. Dieses ist am leichtesten durch Iso­ lation von Spermienplasmamembranen und deren Nutzung als Verpackung zu erreichen. Spermienantigen-spezifi­ sche Antikörper bzw. Antiseren können aus den Seren weiblicher Tiere nach wiederholter Immunisierung mit gewaschenen Spermien gewonnen werden. Der Verwendung Spermienantigen-spezifischer, hochaffiner, monoklonaler IgM-Antikörper kommt wegen der zehn Bindungsstellen (dekavalent) die beste Bindungseigenschaft zu. Die Bindungsstärke kann dabei diejenige von kovalenten Bin­ dungen erreichen. Mit den heutigen gentechnologischen Methoden wird auch die Herstellung von sog. Hybridanti­ körpern möglich. Derartige Antikörper können im Gegen­ satz zu den natürlich vorkommenden Antikörpern zwei oder mehr Bindungsstellen besitzen, die unterschiedli­ che Strukturen erkennen und binden. Dadurch könnten Ver­ packungen an Spermien gebunden werden, ohne daß identi­ sche Oberflächenstrukturen vorhanden sind. Eine ähnliche "ungleiche" Bindung ist auch durch ein Protein (Protein A) aus der Zellwand des Mikroorganismus Staphylococcus aureus und ganz normalen Spermienantigen-spezifischen Antikörpern möglich. Dieses Protein A besitzt die Fähig­ keit, an den nicht-Antigen-bindenden Teil von Antikör­ pern (F_c-Teil) spezifisch und mit hoher Affinität zu bin­ den. Wird Protein A an membranständige proteine der Verpackungen gebunden und werden diesen Protein A tragenden Verpackungen dann Spermienantigen-spezifische Antikörper angeboten, so binden die Antikörper mit ihren F_c-Teilen an die Verpackungen und "strecken" da­ bei ihre spermienspezifischen Antigen-Bindungsstellen nach außen. Derartig mit Protein A und Antikörpern be­ schichtete Verpackungen binden sehr spezifisch und fest an Spermien.

Ein weiteres Phänomen, das sich die unspezifische Ad­ sorption von Proteinen an Oberflächen zunutze macht, er­ laubt sehr feste, spezifische Bindungen von Verpackungen an die Spermienoberfläche. Dieses sog. "coating" (Bedecken) von Oberflächen beruht auf dem hohen, unspezifi­ schen Bindungvermögen von Proteinen an bestimmte Ober­ flächen, wie z.B. von Zellmembranen, Plastik oder Glas. Besonders gut für dieses "coating" eignen sich u.a. die Antikörper. Für das hier vorgestellte Verfahren werden spermienspezifische Antikörper zum Bedecken der Verpackungen (Vesikel, insbesondere Liposomen) verwendet. Das "coating" kann dabei durch Spermienantigen-spezifische monoklonale Antikörper, gereinigte polyklonale Antikör­ per oder durch ein einfach herzustellendes, hochtitriges Antiserum erreicht werden. Mit solch spezifischen Bin­ dungsmolekülen bedeckte Verpackungen weisen folgende Vorteile auf:.

• a) Einfache und schnelle Herstellung bindungsaktiver Verpackungen,
• b) hohe Stabilität dieser bindungsaktiven Verpackungen, z.B. keine Autoagglutination der Verpackungen selbst,
• c) bei hochtitrigen Antikörpern bzw. Antiseren ist keine vorhergehende Reinigung der eigentlich spermienspe­ zifischen Antikörper erforderlich,
• d) sehr gute Bindungseigenschaften an die Spermien.

Sowohl bei der indirekten als auch bei der direkten Bindung von Verpackungen an Spermien können die entsprechenden Bindungsstrukturen durch Zusatz von bindungsfördernden Molekülen (z.B. Albumin, Trans­ ferrin) stabilisiert werden.

Die Verpackung der durch die Spermien zu übertragen­ den Substanzen dient zum einen dem Schutz der Inhalts­ stoffe vor enzymatischer oder andersartiger Modifi­ kation und zum andern zur Bindung an die Spermien. Als Verpackungen werden hierbei alle Systeme bezeich­ net, welche die zu übertragenden Substanzen einhüllen bzw. mit ihnen aggregieren können.

Zur Einhüllung dienen vorzugsweise vesikuläre, bläs­ chenförmige Strukturen, in deren wäßrigem Lumen die zu übertragenden Substanzen eingeschlossen sind oder in deren Wandung zu übertragende lipophile Substan­ zen integriert sind.

Die Wandung dieser Vesikel besteht häufig aus Lipiden oder lipidähnlichen Materialien, die in wäßrigem Mi­ lieu sehr stabil bleiben.

Zur Aggregation eignen sich Stoffe, die eine direkte Anlagerung (ohne Lumen) an die zu übertragenden Sub­ stanzen ermöglichen, ohne diese jedoch zu denaturieren. Eine derartige Granulation beispielsweise von Nuklein­ säuren wird durch Calciumphosphat oder Histonproteine ermöglicht.

Derartige Verpackungen sollten folgende Kriterien erfüllen:.

• a) Sie sollen aus Molekülen bestehen, die in der La­ ge sind, andere Substanzen einzuhüllen ohne sie zu beeinträchtigen.
• b) Sie sollen Strukturen an ihrer Oberfläche tragen, die es erlauben, eine Bindung zur Spermienober­ fläche durchzuführen.
• c) Die Art der Bindung soll sich nicht negativ auf das Leistungsvermögen der Spermien (oder Teile davon) zur Fusion mit den Zielzellen auswirken.
• d) Die Größe der Umhüllungen soll nur einen Bruch­ teil der Größe der jeweiligen Spermien betragen.
• e) Die Umhüllungen sollen in der Zielzelle auf Grund enzymatischer oder andersartiger Degradation zer­ fallen und die zu übertragenden Substanzen frei­ setzen.

Die nachfolgenden Ausführungen sollen zeigen, wie viel­ gestaltig die Arten der Verpackung trotz Einschränkung durch die zuvor gestellten Forderungen sind.

Wie schon vorher erwähnt, besitzen einige Mikroorganis­ men und Viren Rezeptoren an ihrer Oberfläche, die ih­ nen eine spezifische Bindung an Spermien erlauben. Ein auf Fischspermien spezialisiertes Virus infiziert mit­ tels Oberflächenbindung an Spermien die Eizellen und findet auf diese Weise seinen obligaten Wirt. Da virale Hüllstrukturen oder Zellwände von Mikroorganis­ men ebenfalls eine Art Verpackung darstellen, so wür­ den diese Hüllstrukturen sich zuerst für Übertragungs­ verfahren mit Spermien anbieten. Sie erlauben jedoch nur eine begrenzte Auswahl von Substanzen aufzunehmen und sind zudem technisch schwieriger zu handhaben (Isolation, Reaggregation der Bestandteile) als die nachfolgend beschriebenen natürlichen oder artifiziel­ len Lipidmembranen. Bestimmte Rezeptoren aus den Hüll­ strukturen dieser Viren oder Mikroorganismen lassen sich auch in Lipidmembranen integrieren und fungieren dort als spezifische Bindungsstrukturen (Virusrezepto­ ren, Protein A usw.) zur Spermienoberfläche.

Lipidmembranen lassen sich aus praktisch allen tieri­ schen Zellen ohne Schwierigkeiten gewinnen. Bei dem hier beschriebenen Verfahren kommt es lediglich darauf an, diejenigen Zellen bzw. Plasmamembranen dafür aus­ zuwählen, deren Oberflächenmerkmale eine direkte oder indirekte Bindung zur Spermienoberfläche ermöglichen. Dies hängt primär von der Art der durchzuführenden Bin­ dung ab. Es können z.B. Zucker-bindende Lektine als Vermittlermoleküle zwischen Spermien und der Lipidmem­ bran dienen, und man kann dann Erythrozytenmembranen (sog. "ghosts") als einfach zu gewinnende Ausgangssub­ stanz verwenden, da diese über eine Fülle nach außen ragender Zuckerreste verfügen. Auch hier besteht nun wiederum die Möglichkeit, die Zusammensetzung der nach außen ragenden Strukturen der Lipidmembranen zu verän­ dern, mit dem Ziel, je nach Art der Bindung an die Sper­ mien neue bzw. bessere Bindungsvoraussetzungen zu schaffen. So können durch Inkubation der Lipidvesikel mit dem Enzym Neuraminidase (vor oder nach Ein­ schluß der zu übertragenden Substanzen) endstän­ dige Sialinsäuremoleküle abgespalten werden. Die daraus resultierende Reduktion der negativen Ober­ flächenladung sowie das Freilegen vieler, vorher verborgener Zuckerreste schaffen je nach den Gege­ benheiten neue Bindungsmöglichkeiten. Die Anwen­ dung weiterer sowohl Zucker- wie Protein-spalten­ der Enzyme zur Optimierung einer bestimmten Art der Bindung an die Spermien ist ebenfalls möglich. Auch eine "Neubeschichtung" der Oberfläche der Lipidmembranen kann durch enzymatische Behandlung erzielt werden. Hervorzuheben sind hierbei Glyko­ syltransferasen, die bestimmte Zuckermoleküle ko­ valent an die Zuckergerüste der Lipidmembranen bin­ den und damit neue Bindungsmöglichkeiten schaffen.

Nach einer anderen Ausführung wird die Bindung durch spermienspezifische Antikörper vermittelt, und es bieten sich zuerst Verpackungen an, die aus Spermien­ plasmamembranen hergestellt wurden. Durch gleiche antigene Strukturen auf Spermien und Verpackung kön­ nen bi- oder polyvalente Antikörper sehr einfach die beiden Einheiten miteinander verbinden. Die Art der biochemischen Präparation solch biologischer Membranen verhindert, daß dabei unerwünschte Substanzen, wie et­ wa ubiquitär vorhandene Viren, mit übertragen werden.

Derartige Lipidmembranen lassen sich auch künstlich aus den entsprechenden Lipiden konstruieren. Dabei müssen aber Moleküle (Cerebroside, Glykoproteine usw.) mit in das Lipidgemisch eingebaut werden, deren über die Oberfläche hinausragende Strukturen eine direkte oder indirekte Bindung zu den Spermien ermöglichen.

Zur Verpackung der zu übertragenden Substanzen sind aber auch andere organische und/oder anorga­ nische Substanzen geeignet. Eine Form der granulä­ ren Verpackung speziell von Nukleinsäuren ergibt sich durch die Calciumphosphat-Präzipitation von DNS. Die physikochemischen Eigenschaften, die ei­ ne Bindung Calciumphosphat-präzipitierter DNS an Zellmembranen ermöglichen, sind zwar noch nicht im Detail aufgeklärt, jedoch praktisch durchführ­ bar.

Eine natürliche Art der granulären Verpackung der DNS höherer Organismen stellt auch ihre Verbindung mit Histonproteinen dar. Die Histonverpackung dient sowohl zur Stabilisierung wie auch teilweise zum Schutz vor enzymatischer Degradation der DNS. Zur Bindung an die Spermienoberfläche empfiehlt es sich jedoch, Histon-assoziierte DNS in Vesikelstrukturen einzubauen, die wesentlich bessere Bindungseigen­ schaften und einen zusätzlichen Schutz gewähren.

Die Art der auf die Zielzellen zu transferierenden Substanzen richtet sich nach dem speziellen Zweck der Übertragung. Dieses Verfahren kann z.B. drei Ziele verfolgen:

• a) die Erzeugung transgener Organismen oder trans­ gener Zellen.
• b) Die Verwendung als Testsystem zum Wirkungsnachweis von Substanzen im Inneren von Somazellen und vor allem Eizellen.
• c) Die Verwendung als Technik für Studien zur Embryo­ genese und Teratologie in vivo und in vitro.

Entsprechend der Zielsetzung ergibt sich eine große Anzahl von Stoffen, die mit dem hier geschilderten Verfahren übertragen werden können. Die Methodik der Herstellung der Verpackungen bei gleichzeitiger Umhüllung der zu übertragenden Substanzen ermöglicht, die unterschiedlichsten Substanzen auf die gleiche Art und Weise ohne Entwicklung neuer Verfahrenstech­ niken zu verpacken. Die Bindung an Spermien - und damit auch die Übertragung auf die Zielzellen - ist ebenfalls unabhängig von der Art der Substanzen in­ nerhalb der Verpackung.

Die Erzeugung transgener Organismen oder transgener Zellen ist nur durch Übertragung genetischen Mate­ rials in Form von Nukleinsäuren möglich. Hier stehen bereits heute oder in Kürze eine Anzahl unterschied­ licher Gene zur Verfügung, die produktionsverbessernd eingesetzt werden können. Hervorzuheben sind dabei das Gen für Somatotropin (Wachstumshormon), Gene für verschiedene Milchproteine (Caseine), der Einsatz von Anti-sense DNS zur gezielten Krankheitsbekämpfung und die Verwendung von Genen zur Vakzineproduktion in großen Mengen (genetic farming).

Erfindungsgemäß wird unter Ausnutzung der natürlichen Befruchtung (Verschmelzen von Spermium und Ei) und der künstlichen Besamung (künstliche Übertragung des Sper­ mas) der Gentransfer in Organismen wesentlich verein­ facht, wobei die heute gängigen Techniken wie Spülung, Mikromanipulation, Operation und Transfer der Embryo­ nen umgangen werden.

Wie bei den bisherigen Methoden zur Erstellung trans­ gener Organismen bleibt der Arbeitsprozess bezüglich der Herstellung der gewünschten Substanzen (Gene) im wesentlichen der gleiche. Um die Integration und Ex­ pression des eingebrachten Gens zu erleichtern, ist es empfehlenswert, besonders geeignete Expressions­ und Integrationsverstärker (Metallothioneinpromotor, long terminal repeats) zu verwenden. Die Nukleinsäu­ ren (Gene) werden in linearer oder zirkulärer Form entweder in künstliche Vesikel verpackt oder mit speziellen Proteinen bzw. anorganischen Salzen als Granula eingehüllt.

Viele Substanzen müssen vor ihrer eigentlichen An­ wendung in der Medizin oder am Arbeitsplatz des Men­ schen auf ihre Unbedenklichkeit für die Gesundheit des Menschen getestet werden. Die zunehmende Kritik der Öffentlichkeit an den entsprechenden Vortests im Tierversuch veranlaßte die Regierungen verschie­ dener Länder, Alternativen zu fordern. Das erfindungs­ gemäße Verfahren ermöglicht die Testung einer Viel­ zahl von Substanzen bezüglich eines potentiellen patho­ genen Effektes direkt an Somazellen, vor allem an Ei­ zellen und den ersten embryonalen Stadien, ohne die bisher verwendeten, mit starken Nebeneffekten behaf­ teten Techniken wie Fusion oder Mikroinjektion einzu­ setzen. Die Art der zu testenden Substanzen kann da­ bei z.B. eine Aminosäure, ein Porphyrin oder auch ein Antibiotikum sein.

Um letztendlich die Übertragung derartig geringer Kon­ zentrationen an schwer nachweisbaren Substanzen über­ prüfen zu können, können sog. "Tracer"-Substanzen in denselben Verpackungen mitübertragen werden. Ein Bei­ spiel dafür sind mit der weiteren Embryonalentwicklung sich selbst replizierende kleine Genomeinheiten (epi­ somaler Bovine Papilloma Virus u.v.a.), deren Vorhan­ densein mittels DNS-Hybridisierungstechniken relativ einfach in den zu untersuchenden Embryonen nachweis­ bar ist. Diese Substanztestung läßt sich nicht nur in vitro, sondern in vivo ohne den Weg über den müt­ terlichen Organismus ausführen. Der enzymatische Um­ bau vieler Substanzen durch den mütterlichen Organis­ mus verhindert heute in vivo Untersuchungen zur Embryo­ pathogenese an vielen verschiedenen Substanzen.

Viele Phänomene der Genregulation bei Vielzellern lassen sich mit den heutigen Techniken nur unzurei­ chend untersuchen. Die Übertragung genregulativ wirk­ samer Substanzen wie Peptidhormone, Steroidhormone, bestimmter Formen von Nukleinsäuren (Viren, Enhancer, Antisense RNS) durch Spermien auf Ei- oder Somazellen umgeht die störenden Effekte gegenwärtig praktizier­ ter Techniken und erleichtert auch die Technik wesent­ lich. Auch Studien zur Genregulation, Embryogenese, Or­ ganogenese und Teratologie lassen sich mit dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren in vivo und in vitro methodisch sehr vereinfacht durchführen.

Als Zielzellen der Substanz-beladenen Spermien kommen grundsätzlich zwei Arten von Zellen in Betracht: Die natürlichen Zielzellen der Spermien, die Eizellen, und alle anderen Arten von Zellen eines vielzelligen Orga­ nismus, auch transformierte Zellen wie etwa Teratokar­ zinomzellen.

Eizellen sind bei vielen Invertebraten, Fischen und Amphibien extrakorporal zugänglich (Ablaichen), bei den meisten höheren Wirbeltieren ruhen sie mehr oder weniger stark verborgen in den primären weiblichen Ge­ schlechtsorganen. Dort sind sie oft nur durch chirur­ gische Maßnahmen erreichbar. Nur Spermien vermögen die Eizellen in den weiblichen Geschlechtsorganen zu errei­ chen und mit Hilfe des hier vorgestellten Verfahrens zusätzliche Substanzen in die Eizellen einzubringen. Die lange Strecke zwischen der Spermiendeponierung (natürliche oder künstliche Besamung) in der Nähe der Cervix bis zum ovariellen Ende des Eileiters legen die Spermien beim Rind in nur wenigen Minuten zurück. Die geringe Eigenbewegung der Spermien von 0.2 mm/sec. wird dabei durch Aktivitäten ciliarer Bewegungen und sekretorischer Flüssigkeiten des weib­ lichen Genitaltraktes stark unterstützt. Bei allen höheren Wirbeltieren (mit intrakorporaler Besamung) sind die Eizellen von einer schützenden Schicht von Nährzellen, der sog. Corona radiata, und einer inne­ ren Mucopolysaccaridschicht, der sog. Zona pellucida, umgeben. Die im Akrosom der Spermien enthaltenen lyso­ somalen Enzyme ermöglichen den Spermien die Schutz­ schicht zu durchdringen und mit der Eizelle zu ver­ schmelzen. Die Spermien verlieren bei dieser sog. Akro­ somenreaktion den vorderen Kopfteil ihrer äußeren Plas­ mamembran, behalten aber den hinteren Plasmamembranteil einschließlich der daran haftenden Substanzen, bis sie in das Zytoplasma der Eizellen gelangen. Bei in vitro Befruchtungen werden die das Ei umgebenden Materialien häufig durch physikochemische Behandlungen entfernt, bevor die Spermien zugegeben werden.

In vitro, unter artifiziellen Bedingungen, können Sper­ mien auch in somatische Zellen eindringen (Brackett et al. 1971: PNAS 68 (2): 353).

Damit ergibt sich eine weitere Anwendung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens, Substanzen auch auf somatische und transformierte embryonale Zellen auszuweiten, z.B. mit dem Ziel, eine somatische Gentherapie durchzuführen.

Die Vorteile der Erfindung liegen in der einfachen Behandlung der Spermien, welche die Vesikel oder Granula und damit die zu transferierenden Substan­ zen nicht notwendigerweise endozytieren müssen, sondern diese im Huckepack an der Spermienmembran ins Innere der Ei- oder Somazellen bringen, wo die transferierten Substanzen wirksam werden.

Zur Durchführung des Verfahrens bei der Erstellung transgener Tiere bedarf es keiner besonderen Aus­ rüstung. Benötigt wird ein Behältnis für das Sperma, in das aus einem zweiten, postalisch zustellbaren Behältnis das Vesikel- oder Granula-Puffergemisch zugegeben wird. Je nach Art der Bindung wird auch die Zugabe einer "neutralisierenden" Lösung nötig, wenn überzählige Bindungsstellen der vesikelbelade­ nen Spermien abgesättigt werden sollen. Der Inseminator entnimmt nach ausreichender Inkubations­ zeit das Gemisch und besamt das östrische Tier (in vivo, intrakorporale Befruchtung), bzw. bringt die­ ses Gemisch mit den Eiern zusammen (in vitro, extra­ korporale Befruchtung). Bei dem Verfahren wird jedes Spermium zu einem Vesikel- bzw. Granulaträger. Die Zahl der transgenen Nachkommen hängt damit von der Einschlußrate (Prozent der DNS-haltigen Vesikel, ge­ bunden pro Spermium) und der natürlichen Befruchtungs­ rate ab (erfolgreiche Trächtigkeit nach Insemination).

Besonders hinsichtlich der Erstellung transgener Nutztiere kann sich das Verfahren der etablierten Organisation der Tierzuchtpraxis bedienen. An erster und mit Abstand wichtigster Stelle sind hier die Be­ samungsstationen zu nennen. In ihnen werden nahezu alle Inseminationsportionen gewonnen, mit denen die weiblichen Tiere besamt werden, woraus die ganze Nachfolgegeneration entsteht.

Die bisherige Zucht bedient sich zur Verbesserung einer jeden neuen Tiergeneration (einziger und sinn­ voller Zweck der Zucht überhaupt) hauptsächlich der Selektion der besten Vatertiere, die aufgrund von langdauernden Leistungsprüfungen ausgewählt werden. Neben der Selektionsschärfe ist der Zuchtfortschritt je Jahr auch vom Generationsintervall abhängig. Dies beträgt zwischen 5 und 7 Jahre beim Rind und etwa 2 Jahre bei Schaf und Schwein. Eine neue Eigenschaft (Merkmal, Gen) in einer Population durch Einkreuzen zu etablieren, ist ein langwieriges Unterfangen, weil als Elterngeneration meist nur sehr wenige Tiere in Frage kommen. Abhängig also von der Zahl der Gründer­ tiere, dem Generationsintervall und der Selektions­ schärfe verzögert sich die Einführung neuer Gene in die Gesamtpopulation, wenn nach den bisherigen Züch­ tungsmethoden verfahren wird. Hinzukommt, daß mit dem erwünschten Gen, wegen dessen die Kreuzung oder Selektion durchgeführt wird, eine Vielzahl unnützer und meist auch schädlicher Gene in die Tochtergeneration weiter­ gegeben wird.

Der Vorteil der Erfindung liegt in der Ausschaltung vieler behindernder Faktoren. Erstens kann ein be­ stimmtes Gen übertragen werden, also ohne unnütze oder unerwünschte andere Gene, wie dies bei einer Kreu­ zung der Fall ist. Zweitens kann ein ausgewähltes Gen zu einem bestimmten Zeitpunkt in alle Nachkommen einer Population gebracht werden. Zu diesem Zweck müs­ sen lediglich alle Spermaportionen mit dem Vesikel­ (bzw.Granula-) Gen-Konstrukt behandelt werden. Die daraus entstehenden Nachkommen können leicht auf die Präsenz des transferierten Gens in ihrem Organismus überprüft werden (etwa durch Blutentnahme), wodurch drittens auch das Generationsintervall wegen des früh­ möglichen Zuchteinsatzes verkürzt wird. Aus diesen Gründen hat die Erfindung eine außerordentliche wirt­ schaftliche Bedeutung. Hinzu kommt, daß eine Viel­ zahl von Genen zur Verfügung steht, die man zweckmäßi­ gerweise nicht alle auf einmal, sondern einzeln, ein Gen (oder wenige) je Individuum, bei der natürlichen Befruchtung einschleust. Dies ist insbesondere für Test­ zwecke die Methode der Wahl, wo (neue) Einzelgene auf ihre spezifische Wirkung, Leistung oder ihren Positions­ effekt getestet werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren kommt der allgemeinen Zuchtpraxis sehr entgegen. Aber auch für spezielle Fälle ist es geeignet, wenn etwa Embryonen des billi­ gen Transportes wegen im- oder exportiert werden sollen. In dieser Situation bietet sich die in vitro-Befruchtung präovulatorischer Eier mit entsprechend angereichertem Sperma an, welche nach erfolgreicher Entwicklung zum Morulastadium tiefgefroren oder kurzzeitkonserviert an jeden beliebigen Ort als transgene Embryonen gebracht werden können.

Auch für Forschungszwecke werden transgene Tiere ge­ braucht, um spezielle Fragen zu untersuchen. Da die künstliche Besamung bei Labortieren leicht möglich ist, bietet sich die Erfindung auch hier für die Labor­ praxis an wie auch bei Experimenten mit in vitro-Be­ fruchtung. Bei Anwendung des Verfahrens entfallen die zeit- und personalaufwendigen traditionellen (Embryo- und) Gentransferarbeiten.

Beispiel 1. Gewinnung und Anreicherung eines Gens

Ein Strukturgen kann generell mittels RNS-abhängiger DNS-Polymerase (reverse Transkriptase) von gewebeiso­ lierter Messenger-RNS als cDNS gewonnen werden. Mit die­ ser cDNS wiederum ist es möglich, die genomische DNS, also das natürliche Gen, zu identifizieren und zu iso­ lieren. Die Gewinnung genomischer DNS-Fragmente gehört zum Stand der Technik (generelle Beschreibung: Cooper, T.G. 1981: Biochemische Arbeitsmethoden,Walter de Gruy­ ter, Berlin; Old,R.W., Pimrose, S.B. 1981: Principles of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford; Maniatis et al. 1982: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor). Heute stehen viele bekannte DNS-Fragmente in sogenannten Genbanken von mannigfachen Spezies zur Verfügung. Weiter­ hin gibt es heute mehr als 4000 sequenzierte Gene, die aus verschiedensten Lebewesen stammen, angefangen von SV 40-DNS bis zum Caseingen des Rindes. Die einzelnen Ge­ ne zählen bis zu einigen tausend Basenpaaren (kb). Bei der Genanalyse wird meist auch eine Restriktionsenzym­ karte erstellt, was entweder empirisch durch alle mögli­ chen Endonukleasen oder bei bekannter Nukleotidsequenz durch Tetra- bzw. Hexanukleotidvergleich mit allen bisher bekannten Restriktionsenzymen bewerkstelligt wird (Daten­ information des European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg).

Jedes Strukturgen kann mit einem beliebigen Promoter (zum Zwecke der gesteigerten Genexpression) verknüpft wer­ den. Als Promoter wird derjenige Teil eines Gens bezeich­ net, der die Transkription veranlaßt.

Beispielsweise liegt das Strukturgen des Wachstumshor­ mons zwischen zwei Bam HI-Restriktionsenzymerkennungs­ stellen. Die Isolierung des Bam HI-Fragments erfolgt durch Verdau von 100 µg DNS des Wachstumshormongen enthal­ tenden Plasmids mit 100 Einheiten Bam HI (37°C, zwei Stunden). Die Verdaureaktion wird mit einer Stopper-Lö­ sung (Maniatis et al.1982: Molecular Cloning,Cold Spring Harbor) zum Stillstand gebracht, und das Gemisch auf ein 0.7 %iges Agarosegel aufgetragen. Über Elektrophorese werden die durch das Enzym erzeugten DNS-Fragmente ihrer Größe nach aufgetrennt, aus dem Gel eluiert und mit Phe­ nol/ Chloroform gereinigt. Die DNS-Menge wird photome­ trisch bestimmt (OD₂₆₀ · 50 · Verdünnungsfaktor = µg/ml). In gleicher Weise wird ein Promoter (Metallothionein) iso­ liert, der in einem Plasmid pMMT 342 kommerziell erhält­ lich ist.

Der Metallothioneinpromoter (MT) liegt innerhalb eines Eco RI - Bgl II - Fragments. Nachdem das Fragment rein vorliegt (siehe oben), werden dieses und das Strukturgen miteinander ligiert (zur Methode: Maniatis et al.1982:. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor). Die Ligierung ist mit kleinsten Mengen möglich. Um größere Mengen des neu­ en Konstrukts zu erhalten, werden Promoter und Struktur­ gen in ein Plasmid eingebaut (ligiert), das nach Trans­ formation in Bakterien nahezu beliebig vermehrt werden kann. Ein sehr gebräuchliches Plasmid ist pBR 322, das der Prototyp vieler heute verwendeter Plasmide ist. Es hat verschiedene essentielle Funktionselemente: den "Origin of replication (Ori)" und zwei Gene, die Resistenz gegen Anti­ biotika verleihen (Ampicillin, Tetracyclin). Weiterhin be­ sitzen solche Plasmide mehrere bekannte Stellen, an denen Restriktionsenzyme schneiden können. Zunehmend finden auch sog. Polylinker Verwendung, die innerhalb einer sehr kur­ zen Nukleotidfolge (50 bp) möglichst viele Restriktions­ enzymerkennungsstellen besitzen und somit für die Rekom­ bination viele Varianten bieten. Der Polylinker pSP 64 bzw. seine Variante pSP 65 wurden mit großem Erfolg für derartige Zwecke eingesetzt.

Plasmide vermehren sich extrachromosomal in Bakterien und vervielfachen die eingefügte DNS-Sequenz, wodurch es möglich ist, das gewünschte Gen zu klonieren und in größeren Mengen zu gewinnen (10-1000 µg je Präparationsan­ satz).

Das MT-Strukturgen-Fragment wird in den Polylinker pSP 65 ligiert. Das Fragment liegt in der Form Eco RI- Bgl II/ Bam HI-Bam HI vor. Im pSP 65 existieren ebenfalls eine Eco RI und eine Bam HI - Stelle, durch deren Öffnen das Plasmid linearisiert wird. Damit sind zwei unterschied­ liche kohäsive Enden geschaffen, die denen des einzufü­ genden Fragments entsprechen. Durch Ligation entstehen zwei zirkuläre Plasmide, einmal das ursprüngliche durch Selbstligation und zum andern das gewünschte Plasmid mit einer Größe von 6.9 kb.

Diese Prozedur ist mit nahezu jedem beliebigen Gen, in Verbindung mit jedem beliebigen Promoter oder zusätzli­ chen Verstärkerelementen möglich.

Die Konstruktion eines modifizierten Gens (also nicht die Verwendung der natürlichen Genregulatoren vor dem Strukturgen) ist nach der oben beschriebenen Art in vie­ len Varianten denkbar. Einerseits kann jedes Strukturgen, andererseits irgendein Promoter, weiterhin ein zusätz­ licher Verstärker (Enhancer) oder auch eine Tandemkonfi­ guration verschiedener Promotoren benutzt werden, um die Aktivität (Transkription) des Strukturgens selbst zu er­ höhen.

Das Gen liegt nun in der Regel als Teil eines zirkulä­ ren oder linearen Plasmids vor. Als solches wird es nach Reinigung in Phenol/Chloroform in TE-Puffer (0.01 Tris, 0.001 M EDTA, 0.15 M PBS, pH7.2) ge­ löst. Für die weitere Durchführung des Verfahrens sollte die Konzentration bei 200-500 µg/ml liegen. Die Konzentration wird üblicherweise mit dem Pho­ tometer bestimmt.

2. Präparation der Liposomenbestandteile

Spermien transportieren ein ganzes Genom innerhalb ihrer die DNS schützenden Hüllen, so daß diese auf dem z.T. langen Weg bis zum Ei keinerlei degradie­ renden Substanzen ausgesetzt ist. Spermien haben sich evolutiv so entwickelt, daß sie die in ihnen kompaktierte DNS ziemlich zuverlässig an den Ziel­ ort bringen. Allerdings ist die DNS so dicht gepackt, daß alle Versuche, zusätzliche Gene in Spermien zu bringen, scheiterten.

Wenn also zusätzliche DNS am Spermium ins Ei gelangen soll, so muß sie geschützt werden. Dazu bieten sich in erster Linie künstliche Vesikel in Form von Li­ posomen an. Liposomen werden aus den natürlichen Bestandteilen tierischer Zellen hergestellt. Kommer­ ziell sind solche Bestandteile in Form von Phospho­ lipiden (Lezithin, Phosphatidylethanolamin u.a.) er­ hältlich. Für eine optimale Präparation von Liposo­ men werden weitere stabilisierende Faktoren, etwa Cholesterin und Phosphatidylserin o.ä. verwendet. Ein einfacher Weg, die wesentlichen Membranbestand­ teile zu erhalten, ist die Verwendung von sog. "ghosts", fettlöslicher Membranfragmente von Erythrozyten. Zu diesem Zweck wird natives Kaninchenblut mit 0,15%igem Natriumheparin versetzt (ca. 50 ml für einen Präpa­ rationsansatz). Das Frischblut wird bei 3000 rpm zentrifugiert, und das Plasma abgehoben. Durch zweifache Wiederholung, unter Zugabe von 0.15 M PBS werden die Erythrozyten gewaschen und dabei die Leukozyten, die in der Interphase liegen, mit verworfen.

Anschließend werden die Zellen in destilliertem Wasser mit 0.1% Triton 100 über Nacht lysiert, so daß alle Zellmembranen aufbrechen und der Zell­ inhalt (Hämoglobin) in Lösung geht. Ein dreimali­ ges Zentrifugieren bei 20.000 g (4oC) trennt die Membranfragmente vom hämoglobinhaltigen Überstand. Das Pellet wird nun in einem Chloroform/Methanol- Gemisch (20 ml, 5:1) aufgenommen und unter ständi­ gem Schütteln über Nacht gemischt. Dabei lösen sich alle lipoiden Moleküle in Chloroform, die hydrophi­ len Substanzen verbleiben im Rest der wäßrigen Pha­ se. Danach wird das Gemisch bei 3000 rpm zentrifu­ giert. In der oberen Phase befinden sich die wasser­ löslichen Komponenten, in der Interphase die amphi­ philen und in der unteren (Chloroform) Phase die lipoiden Bestandteile, z.B. Phosphatidylcholin, Cho­ lesterin und Glykolipide, die die bindungsspezifi­ schen Epitope der späteren Liposomen darstellen. Eine Konzentrationsbestimmung der Hauptbestandteile erfolgt über HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), ist aber bei standardisierten Präparationsbedingungen nicht notwendig.

4 ml der gewonnenen Lipid-Chloroformlösung werden für die folgende Liposomenpräparation verwendet. Dazu be­ nötigt man einen 25 ml-Rundkolben, in dem das Chloro­ form mittels eines Rotavapors oder einer Wasserstrahl­ pumpe bei etwa 30°C verdampft wird.

Zurück bleibt ein zäher Schleim, bestehend aus den na­ türlichen Lipiden der Erythrozytenmembran, der mit Stickstoff belüftet wird. Die Lipide werden nun in 1 ml Diäthyläther gelöst.

Bei einer weiteren der vielen Möglichkeiten der erfin­ dungsgemäßen Arbeitsweise kann man beispielsweise alle Bestandteile kommerziell erwerben, etwa in der Zusammen­ stellung Phosphatidylcholin, Cholesterin, Phosphatidyl­ serin und eines alpha-Mannose-endständigen Glykolipids. Diese werden im Verhältnis 5:1:3:2 gemischt und einge­ dampft, wie oben beschrieben.

Sehr stabile und zellverträgliche Liposomen erhält man durch die Verwendung von Phosphatidylcholin und Phospha­ tidylethanolamin im Verhältnis 4:1. Diese Zusammensetzung eignet sich besonders für die (weiter unten beschriebene) Detergenz-Methode.

Eine andere Ausführungsform ist die Verwendung von Spermienhüllen. Vom Seminalplasma gereinigte Spermien werden unter ständigem Schütteln in einem Chloroform/ Methanolgemisch (5:1 v/v) behandelt, wobei die lipoiden Membranbestandteile in Lösung gehen. Durch Zentrifuga­ tion (3000 upm) wird die Chloroformphase mit den ge­ wünschten Bestandteilen von den übrigen getrennt. Der Zweck dieser Methode beruht darin, alle notwendigen, na­ türlichen Membrankomponenten zu gewinnen, einschließlich der für das Verfahren wichtigen Epitope, die eine spezi­ fische Bindung ermöglichen.

3. Verpackung der DNS in Liposomen

Nach dem Lösen der membranbildenden Bestandteile in Di­ äthyläther erfolgt nun die eigentliche Liposomenpräpa­ ration mit Verpacken der DNS oder anderer beliebiger Moleküle. Dazu ist keine spezielle DNS-Form (zirkulär oder linear) nötig. Vielmehr beruht die Einschlußrate auf der Konzentration der DNS in wäßriger Lösung, deren Herstellung oben beschrie­ ben wurde. Es ist leicht einzusehen, daß bei ei­ ner willkürlichen Entnahme (Einkapselung) von weni­ gen fl (Femtolitern) aus einer Lösung um so mehr gelöste Moleküle enthalten sind, je höher die Kon­ zentration des gelösten Stoffes ist. Damit nun die Liposomen gebildet und wäßrige Volumina einge­ schlossen werden können, wird die DNS in 500 µl gelöst (100 µg DNS in 200 µl TE-Puffer und 300 µl PBS) zu­ gegeben. Dadurch bilden sich zwei Phasen, die wäßrige unten und die Ätherphase oben. Nun werden die beiden Phasen auf einem Vortexschüttler emulgiert (2-5 min, 30°C) bis eine feine Emulsion entsteht. Aus energetischen Gründen bilden sich sphärische, uni- bis multilamellare Strukturen aus den lipoiden Substanzen, wobei der Äther sich teilweise verflüch­ tigt. Die Vesikelbildung vollzieht sich unter Ein­ schluß eines kleinen Volumens der wäßrigen Phase, womit auch die gelösten DNS-Fragmente in das Innere der Liposomen gelangen. Die kugelige Formation der Membranbestandteile ist stabil, sofern kein organi­ sches Lösungsmittel diese Struktur angreift. Deswe­ gen muß die Emulsion möglichst schnell vom Restäther befreit werden. Dies geschieht durch sofortige Ver­ dampfung mittels Rotavapor oder Wasserstrahlpumpe unter ständigem Schütteln (20 min).

Die Liposomenpräparation kann auch nach der Detergens­ methode erfolgen. Die fettähnlichen Bestandteile wer­ den wiederum in einem Rundkolben mittels Rotavapor eingedampft. Im Unterschied zur Äthermethode wird hier jedoch vor der Verdampfung des Chloroforms ein Detergens (Natriumcholat) zugemischt (20 µg bei 2o-50 µg Phospholipidgehalt).

Nach Verflüchtigung des Chloroforms verbleibt eine fetthaltige Schicht an der Innenfläche des Kolbens, die sich beispielsweise aus 50 µg Lezi­ thin (Phosphatidylcholin), Cholesterin, natürli­ chen Zellbestandteilen und Na-Cholat(=5:1:2:3) zusammensetzt. Durch Zugabe von 1 ml PBS mit 300 µg DNS gehen die fettähnlichen Bestandteile in Lösung (Na-Cholat). Dieses Volumen (1 ml) wird nun unter vorsichtiger Bewegung gegen PBS 3 Stun­ den dialysiert, wodurch die Liposomen formiert werden und DNS-haltige wäßrige Lösungen ein­ schließen.

Damit liegen jetzt künstliche Vesikel vor, deren Oberfläche denen von Erythrozyten oder denen von Spermien ähnelt, jedenfalls Epitope besitzt, die eine Bindung an Spermien ermöglichen und die im Innern eine wäßrige Phase mit gelöster DNS ent­ halten. Da die Liposomen makromolekularen Substan­ zen gegenüber undurchlässig sind, ist die einge­ schlossene DNS optimal vor Degradierung (z.B. DNasen) geschützt. In gleicher Weise kann jedes beliebige Molekül in Liposomen verpackt werden. Die Liposomen werden bei 40.000 g abzentrifugiert und in PBS aufgenommen. Das Verhältnis Pellet zum Lösungsmittel kann 1:5 bis 1:10 betragen. PBS kann durch andere Pufferlösungen ersetzt werden, sofern der pH-Bereich zwischen 6.9 und 7.3 liegt und die physiologische Konzentration von 0.15 M nicht ab­ weicht (bei Säugerzellen als Zielzellen). Als Pufferlösung eignet sich u. a. die sog. Ringer-Lösung, die folgende Zusammensetzung hat:

• 0,9% NaCl (100 ml),
  1,15% KCl (4 ml),
  2,11% KH₂PO₄ (1 ml),
  3,82% MgSO₄ · 7 H₂O (1 ml),
  1,3% NaHCO₃ (2 ml, CO₂ gesättigt).

Zur Unterstützung der Energiezufuhr für die Spermienmotilität wird der Ringer-Lösung 0,5% Fruktose zugesetzt.

4. Adsorption der Spermien

Die zu transferierende DNS (ein oder mehrere funk­ tionelle Gene beliebiger Art) ist zu mehreren Ko­ pien, abhängig von der Konzentration der DNS-Lösung, in wäßriger Lösung in ein Gebilde (Vesikel oder Gra­ nula) eingeschlossen, das aus der Oberfläche heraus­ ragende Strukturen (Epitope) besitzt, welche mit be­ stimmten Bindungsmolekülen (Lektinen oder Antikör­ pern) einen engen Kontakt herstellen können. Diese Epitope der Liposomen sind denen der Spermienober­ fläche sterisch gleich oder sehr ähnlich, können aber auch bei Anwendung unspezifischer Bindungsarten ("coating") vollkommen unterschiedlich sein oder sogar fehlen.

Spermien werden durch künstliche Absamung gewonnen, wie dies für alle Nutztiere und Labortiere beschrie­ ben ist (Paufler, S.K., 1974: Künstliche Besamung I, Schaper, Hannover). Das Ejakulat wird durch Zentrifu­ gation (400 rpm) vom Seminalplasma gereinigt und mit einer Pufferlösung versetzt (Ringer-Lösung mit 0.5 % Fruktose). In der Praxis wird die Spermaportion (einige Milliarden Spermien je Ejakulat) mit einem Verdünner portioniert, so daß je nach Spezies 20 (Kaninchen) bis 100 (Bulle) Besamungsportionen pro Ejakulat gewonnen werden können.

Für das vorliegende Verfahren ist es wichtig, daß der verdünner keine Moleküle enthält, die mit dem verwendeten Bindungsmolekülen interagieren.

Bevor die Spermien mit den Liposomen vermischt wer­ den, muß die Bereitschaft der Liposomen zur Bindung an die Spermien hergestellt werden. Dazu wird die Liposomendispersion mit einem Überschuß Concanava­ lin A versetzt (500 µl + 50 µl ConA (50 mM). Dadurch sättigen sich die spezifischen Epitope mit Con A ab. Schematisch dargestellt ergibt sich folgendes Bild:
sh. Abbildung 2

Aufgrund des Überangebotes an Lektin (Con A) werden alle Epitope der Liposomenoberfläche besetzt, so daß die Liposomen nicht agglutinieren, was bei einer niedrigen Lektinkonzentration der Fall wäre. Die Zu­ gabe von Lektin zu den Lipsomen erfolgt bei Raum­ temperatur. Die Sättigung ist bei intensiver Durch­ mischung innerhalb von 30 min. abgeschlossen.

Um die Zahl der bindungsaktiven Zuckermoleküle auf den Lipsomen, die aus Zellmembranbestandtei­ len hergestellt werden, zu erhöhen, werden zu der Liposomendispersion 10 µl Neuraminidase (1 mg/ ml, Boehringer, Mannheim) zugegeben und 20 Minu­ ten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird mit PBS und 0.5 % BSA gewaschen und das Pellet wiederum in PBS aufgenommen. Dadurch sind jetzt die end­ ständigen Sialinsäuren abgetrennt, und die darun­ terliegenden Zucker liegen frei.

Eine weitere Möglichkeit der Bindung von Liposomen an Spermien besteht in der Verwendung spermienspe­ zifischer Antikörper. Zur Gewinnung solcher Antikör­ per werden weibliche Tiere (Kaninchen) im Alter von 3-5 Monaten mit einem vom Seminalplasma gereinigten Ejakulat subkutan immunisiert (inkomplettes Freund­ sches Adjuvans). Zwei Wochen später erfolgt die zweite, eine Woche darauf die dritte Immunisierung. Nach wei­ teren vier Tagen wird von den immunisierten Tieren Blut gewonnen (10-20 ml), das gekühlt und dann bei 3000 upm zentrifugiert, und das Serum gewonnen wird. Darin sind die (polyklonalen) Antikörper gegen die auf der Spermienoberfläche vorhandenen Epitope enthalten. Die so gewonnenen Antiseren führen noch bei einer Ver­ dünnung von 1:1000 zur Agglutination von Kaninchen­ spermien.

Mit Spermienantigen-spezifischen Antikörpern sind zwei Arten von Bindungen zwischen Verpackung und Spermium möglich. In einem Fall werden die Bestandteile für die Verpackungen aus Spermienmembranen gewonnen. Die Her­ stellung derartiger Membranen erfolgt wie oben beschrie­ ben. Bei dieser Art der Bindung werden durch die bi­ bzw. polyvalenten Antikörper gleiche oder ähnliche Oberflächenstrukturen auf Verpackung und Spermium ge­ bunden.

Im anderen Fall nützt man die unspezifische Adhäsion von Antikörpern aus, um damit die Oberfläche der Ver­ packungen zu bedecken (coating). Dabei ragen die spe­ zifischen Spermienantigen-Bindungsstellen der Anti­ körper von den Verpackungoberflächen weg und ermöglichen dadurch die Bindung an Spermien.

Im konkreten Fall wurden 0.5 ml eines mit Ringer-Lösung 1:50 verdünnten Antiserums (Spermienagglutinations­ titer bei einer Verdünnung von 1:1000 ) zu 0.5 ml Li­ posomensuspension gegeben und über Nacht bei 4°C in­ kubiert. Danach werden die überschüssigen Antikörper mittels eines kleinporigen Vorsatzfilters (Millipore, 0.2 µm) aus dem Gemisch gewaschen (2 ml Ringer-Lösung) und die gereinigten Liposomen aus dem Filter in 0.5 ml Ringer-Lösung aufgenommen (gegenläufige Flußrichtung). Die Liposomensuspension wurde bei 12.000 upm zwei Minuten lang zentrifugiert, wodurch sich die großen, unbrauchbaren Liposomen im Pellet abscheiden, während die Liposomen der gewünschten Größe (200-800 µm) im Überstand verbleiben.

Nun erfolgt die Bindung der Liposomen mittels freier Lektin- bzw. Antikörper-Bindungsstellen an die Sper­ mienoberfläche. Liposomen und Spermien werden bei Raumtemperatur vorsichtig gemischt, so daß die Adsorp­ tion der bindungsmolekülbeladenen Liposomen an die spezifischen Epitope der Spermienoberfläche innerhalb 20 Minuten vollzogen wird.

Spermien mit adsorbierten, großen Liposomen erkennt man unter dem Lichtmikroskop an den stabilen , (durch einen Waschvorgang nicht zu entfernenden) kuge­ ligen Gebilden. Es wurde Ethidiumbromid-haltige DNS in Liposomen verpackt und an Spermien ad­ sorbiert. Ethidiumbromid in wäßriger Lösung läßt sich ebenfalls in Liposomen einschließen, die un­ ter UV-Licht rosafarben leuchtet. Ethidiumbromid bindet (interkaliert) zudem spezifisch an DNS, die in Liposomen nun grün erscheint. Nach Adsorp­ tion an Spermien umgibt diese deshalb ein grüner Saum.

Bei Verwendung lektinbeschichteter Verpackun­ gen an die Spermien ragen sehr viele ungesättigte Lektin-Bindungsstellen nach außen. Damit die Sper­ mien deshalb nicht an zuckerbeschichteten Ober­ flächen im weiblichen Genitaltrakt festkleben (Immo­ bilisierung), empfiehlt es sich, die überzähligen Lektinbindungsstellen (Con A) kurz vor der Insemina­ tion durch Zugabe von 10 bis 50 µl alpha-Mannose bzw. alpha-Glukose (0.01 M) abzusättigen. Die genaue Menge an zugegebenem Zucker hängt von der Anzahl der verwendeten Verpackungen, dem Lektin und den Spermien ab und kann für jedes System durch ein­ fache Vorversuche bestimmt werden.

5. Künstliche Besamung

Nach der Bindung der Liposomen an die Spermien wird die Spermaportion zur künstlichen Besamung verwen­ det. Die künstliche Besamung beim Kaninchen erfor­ dert eine Ovulationsauslösung mittels eines gonado­ tropen Hormons (LH = Luteinisierendes Hormon; HCG = Human Chorion Gonadotropin), das intravenös verabreicht wird. Unmittelbar anschließend wird die Sperma­ portion mit einer Besamungspipette intravaginal deponiert. Die Spermien wandern im Genitaltrakt des Weibchens aufwärts bis zum Befruchtungsort (Ampulle), wo die frisch ovulierten Eier pene­ triert werden.

Mit dem Spermium, das als einziges durch alle Eihüllen zu dringen in der Lage ist, gelangen auch die Genkopien in den Bereich des amphi­ miktischen Kerns, wo die Formation des diploi­ den Chromosomensatzes erfolgt.

Bei den spontan ovulierenden Spezies wie Rind, Pferd, Schwein und Schaf, wird der Besamungszeit­ punkt gemäß des natürlichen Östrus′ abgewartet, um dann die künstliche Besamung durchzuführen.

6. Nachweis der integrierten DNS

Nachdem die Liposomen mit dem Spermium in das Eiinnere gelangt sind, werden sie durch zellstän­ dige Enzyme lysiert. Die freigesetzte DNS ist von sich aus in der Lage, in das Genom zu integrieren. Der Nachweis für die erfolgreiche Integration in den Embryo wird mittels einer in situ-Hybridisie­ rung durchgeführt. Dazu werden die (transgenen) Em­ bryonen (ab Zweizell- bis Blastozystenstadium) aus dem Eileiter bzw. Uterus einer Häsin gespült (im konkreten Fall chirurgisch) und auf einem Objekt­ träger mit einer Fixierlösung (Methanol/Eisessig 3 : 1 v/v) immobilisiert.

Sodann wird die Präparation (Objektträger mit fixierten Blastozysten) auf 90°C erhitzt, wobei die komplementären DNA-Stränge der Chromosomen denaturieren. Anschließend wird die Hybridisie­ rung mit einer radioaktiven oder Biotin-markier­ ten Probe (im konkreten Falle mit dem Wachstums­ hormongen) durchgeführt. Zur Methode der in situ- Hybridisierung wird auf die Literatur verwiesen. (Gall and Pardue,1969: PNAS 63: 378-383 u.a.).

Claims (14)

1. Verfahren zur Übertragung organischer und/ oder anorganischer Substanzen auf Ei- und/ oder Somazellen von Tieren, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man gegebenenfalls chemisch oder physikalisch modifizierte Spermien der betreffenden Art mit Vesikel oder Granula, die die organische oder anorganische Substanz enthalten, kombiniert und die auf diese Wei­ se beladenen Spermien unter intra- oder extra­ korporalen Bedingungen mit der Ei- oder Soma­ zelle in Kontakt bringt bzw. kommen läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß als Vesikel oder Granula mit einer Um­ hüllung bzw. Verpackung versehene organische oder anorganische Substanzen verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Umhüllung erstens natürlich vorkommende Zellbestandteile, zweitens Stoffe viralen und/oder mikrobiellen Ursprungs oder drittens (synthetische) anorganische oder orga­ nische Materialien verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als Umhüllung Lipide, Phos­ pholipide, Glykolipide, Isoprenoidlipide, Lipo­ proteine, Proteine, Glykoproteine, Saccharide und/oder organische bzw. anorganische Salze ver­ wendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Vesikel oder Granula an die Spermien durch Anlagerung, Fusion mit der Spermienhülle oder Endozytose gebunden werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Vesikel oder Granula an die Spermien aufgrund von van der Waal′schen Kräften,Wasserstoffbrückenbindungen, Ionenbin­ dungen und/oder kovalenten Bindungen gebunden werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Vesikel oder Granula an die Spermien durch Zugabe organischer und/ oder anorganischer Substanzen gebunden werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich­ net, daß die Bindung der Vesikel oder Granula an die Spermien durch Antikörper bzw. Antiseren, Lektine, Agglutinine oder durch virale, proka­ ryontische oder eukaryontische Rezeptoren oder rezeptorähnliche Moleküle erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als zu übertragende Substanz eine Aminosäure, ein Peptid, ein Protein, ein Glykoprotein, ein Lipoprotein, ein Coenzym, ein Stoffwechselmetabolit, ein Enzyminhibitor, ein Transkriptions- bzw. Translationsinhibitor, ein Stoffwechselinhibitor, ein Mitogen, ein Nukleosid, ein Nukleotid, eine Nukleinsäure, ein Porphyrin, ein Lipid, vorzugsweise Phos­ pholipid, Glycolipid oder Isoprenoidlipid, ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid, ein Polysaccharid, ein Glycosid, ein Hormon, ein Vitamin, ein Pharmazeutikum oder eine anorga­ nische Substanz, vorzugsweise metallische Ver­ bindung verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als zu übertragende Substanz Nukleinsäuren, vorzugsweise DNS in linearer oder zirkulärer Form, einzel- oder doppel­ strängig, als Heteroduplex oder RNS verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch ge­ kennzeichnet, daß entsprechend der Zielzelle Spermien von Metazoa, insbesondere von Tieren des Stammes der Arthropoda, des Unterstammes der Vertebraten, der Klasse der Osteichthyes, der Klasse der Aves, der Klasse der Mammalia, d.h. der Ordnung der Perissodactyla, der Ordnung der Artiodactyla, der Ordnung der Lagomorpha, der Ordnung der Rodentia, der Ordnung der Carni­ vora, der Ordnung der Primaten, der Unterordnung der Prosimiae, der Überfamilie der Ceboi­ dea, der Überfamilie der Cercopithecoidea, der Familie der Hylobatidae oder der Fa­ milie der Pongidae verwendet werden.

12. Zusammensetzungen auf der Basis von Spermien von Tieren, an welche Vesikel oder Granula, die eine organische oder anorganische Sub­ stanz enthalten, gebunden sind.

13. Zusammensetzungen zur Verwendung beim Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die zu übertragenden Substanzen und gegebenenfalls der zu deren Verpackungen oder Bindung an die Spermien geeigneten Stoffe in wäßrigem Medium, Konservierungsstoff und/oder insbesondere Pufferstoffe zur Einstellung von einem pH-Bereich von vorzugsweise 3-10 und einer Gesamtmolarität zwischen 0,001-2,0 enthalten.

14. Transgene Tiere, erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 1 bis 11.