DE60025905T2

DE60025905T2 - In vitro methode zur synchronisation von oozytenreifung

Info

Publication number: DE60025905T2
Application number: DE60025905T
Authority: DE
Inventors: Christian Grondahl; Host Thomas HANSEN; Alexander Rübig; Christa Hegele-Hartung
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: WO2000050066A1; EP1156822B1; US6585982B1; DE60025905D1; BR0008468A; HUP0200157A3; JP2002537349A; AU2794100A; KR20010093280A; CN1353617A; CZ20012967A3; EP1156822A1; HUP0200157A2; ES2258445T3; ATE317266T1

Description

GEBIET DIESER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft verbesserte Mittel zur in-vitro-Befruchtung (hier nachstehend bezeichnet als IVF; in vitro fertilisation).
HINTERGRUND DIESER ERFINDUNG
Seit die erste IVF-Schwangerschaft 1978 ausgetragen wurde, führte dieses Verfahren zu Tausenden von Schwangerschaften und öffnete eine gewaltige neue Forschungsgrenze und Behandlung für unfruchtbare Paare. Heutzutage besteht immer noch beträchtlicher Bedarf nach verbesserten Unfruchtbarkeitsbehandlungsmodalitäten. Es wird angenommen, dass etwa eines von sieben Paaren Probleme mit verminderter Fruchtbarkeit oder Unfruchtbarkeit haben.
Die IVF von menschlichen Oocyten wurde zur Behandlung von weiblicher oder männlicher verminderer Fruchtbarkeit verwendet. Die standardmäßige IVF-Behandlung schließt eine lange Phase der Hormonstimulation des weiblichen Patienten, z.B. 30 Tage, ein, die durch Unterdrücken des dem Patienten eigenen Follikel stimulierenden Hormons (hier nachstehend FSH bezeichnet) und luteinisierenden Hormons (hier nachstehend als LH bezeichnet) durch das Gonadotropin freisetzende Hormon (hier nachstehend als GnRH bezeichnet) initiiert wird, wonach Injektionen von exogenen Gonadotropinen, z.B. FSH und/oder LH zum Gewährleisten der Entwicklung von mehreren präovulatorischen Follikeln und die Absaugung von mehreren in-vivo-gereiften Oocyten unmittelbar vor dem Eisprung folgen. Die abgesaugte Oocyte wird anschließend in vitro befruchtet und typischerweise für eine Dauer von 3 Tagen vor dem Transferieren zurück in die Gebärmutter im 4-8-zelligen Stadium gezüchtet. Kontinuierliche Bemühungen wurden durchgeführt, dieses Verfahren zu optimieren und zu vereinfachen. Nichtsdestotrotz kann die Schwangeschaftsgesamtrate mit den gegenwärtigen Behandlungsmodalitäten nicht deutlich über etwa 20% erhöht werden. In einem Hauptteil der europäischen Uberlebensrate von IVF-Patienten wurde gefunden, dass 7,2 Oocyten von 11,5 abgesaugten Oocyten pro Patient unmittelbar vor der Befruchtung eine Meioseaufnahme erfuhren, nur 4,3 Oocyten befruchtet wurden und nur 2,2 Oocyten nach der Befruchtung und in-vitro-Züchtung das 8-zellige Embryostadium erreichten (ESHRE, Edinburgh, 1997).
Auf Grund der äußerst unvorhersagbaren Qualität des Zustands der künstlichen Embryos heutzutage müssen eben mehr als ein Embryo transferiert werden, um eine vernünftige Erfolgschance zu erhalten. Deshalb ist es üblich 2-3 Embryos (in einigen Ländern bis zu 5 Embryos) zu transferieren, was die erhebliche Nebenwirkung von Mehrlingsschwangerschaften mit der großer Unannehmlichkeit und großem Risiko sowohl für den Patienten als auch für das Kind birgt. Außerdem wurde nachgewiesen, dass die erhöhten Gesundheitsversorgungsunkosten auf Grund von Mehrlingsgeburten (Zwillinge, Drillinge usw.) die gesamten IVF-Unkosten übersteigen.
Damit gibt es mehrere Nachteile mit der gegenwärtigen Behandlung, wobei es sich bei den vier Bemerkenswertesten um Folgende handelt:

1. Das Risiko der Eierstockhyperstimulation beim Injizieren von Gonadotropinen, wobei es sich um einen möglicherweise tödlichen Zustand handelt, der einen Krankenhausaufenthalt erfordert,
2. Mehrlingsschwangerschaften (das 50-1000-fache der normalen Häufigkeit von Zwillingen bzw. Drillingen),
3. die Existenz von beträchtlichen Anteilen an Patienten, die das gegenwärtige Verfahren auf Grund z.B. von polyzystischem Eierstocksyndrom und vielen diabetischen Erkrankungen nicht tolerieren,
4. ein möglicherweise langfristiges Krebsrisiko.

Weiterhin wird von Gewichtszunahme, Blähungen, Brechreiz, Übelkeit, Stimmungsschwankungen und anderen Beschwerden des Patienten zusammen mit der Abneigung des Patienten, sich selbst zu injizieren, als Nachteile berichtet.
Es ist aus WO 96/00235 bekannt, dass bestimmte Sterolderivate zum Regulieren der Meiose verwendet werden können. Ein Beispiel für ein derartiges Sterol ist 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,14,24-trien-3β-ol (hier nachstehend al FF-MAS bezeichnet).
Hier bedeutet der Begriff MAS-Verbindungen Verbindungen, die die Meiose von Oocyten vermitteln. Insbesondere sind MAS-Verbindungen Verbindungen, die in dem im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Test einen prozentualen Keimbläschenabbau (hier nachstehend als GVB, gemicidal vesicle breakdown, bezeichnet) aufweisen, der deutlich höher als die Kontrolle ist. Bevorzugte MAS-Verbindungen sind diejenigen, die einen prozentualen GVB von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 80% aufweisen.
Beispiele für MAS-Verbindungen sind in WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 und 98/55498, insbesondere in Anspruch 1 davon, erwähnt.
In WO 95/000265 wurden einige potentielle die Meiose regulierende Substanzen an unreifen weiblichen Mäusen getestet. 48 Stunden vor dem Töten der Testtiere durch Zervixdislokation wurden ihnen eine einzelne Injektion menschlichen menopausalen Gondaotropins, enthaltend 20 IU FSH und 20 IU LH, verabreicht. Die Eierstöcke wurden entfernt, in ein Hypoxyanthinmedium gegeben und von irrelevantem Gewebe befreit. Dann wurden die Oocyten aus den Follikeln punktiert, von Cumuluszellen befreit und in einem Medium, enthaltend ein die Meiose regulierendes Derivat, gezüchtet.
Gegenwärtig erwies sich die in-vitro-Reifung in Menschen trotz des beträchtlichen Interesses und der klinischen Bemühungen als äußerst erfolglos.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein in-vitro-Verfahren zur Synchronisation von Kern-, Cytoplasma- oder Membranoozytenreifung und zum Vermindern der Häufigkeit von menschlichen Präembryos mit Chromosomabnormalitäten (Aneuploidie), wobei von einer Frau abgesaugte menschliche Oozyten, die während eines Zeitraums innerhalb von 30 aufeinander folgenden Tagen, wobei der Zeitraum mindestens etwa 7 Tage, vorzugsweise mindestens 10 Tage, stärker bevorzugt mindestens 14 Tage beträgt, mit einem Hypothalamushormon und/oder Hypophysenhormon oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon behandelt worden sind, mit einer MAS-Verbindung in einer Menge von 0,1 bis etwa 100 μmol pro Liter in Kontakt gebracht werden.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein pharmazeutischer Kit in Dosierungseinheitsform zur Verwendung bei einer in-vitro-Befruchtung, umfassend getrennte Dosierungseinheiten, wobei der Kit getrennte Dosierungseinheiten zur täglichen Folgeverabreichung eines Hpothalamushormons und/oder eines Hypophysenhormons oder eines Agonisten oder Antagonisten dafür oder eines wirksamen Derivats davon zur täglichen Folgeverabreichung und 1 Dosierungseinheit einer MAS-Verbindung umfasst.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die IVF wesentlich verbessert werden kann, wenn eine MAS-Verbindung im gewöhnlichen Durchführungsverfahren im Stadium der in-vitro-Befruchtung zugesetzt wird, in welchem es zu erwarten wäre, dass die Reifung in-vivo stattgefunden hat.
Kurz gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reifung oder Synchronisation in vitro von von einer Frau abgesaugten menschlichen Oocyten und die Verminderung der Häufigkeit von menschlichen Präembryos mit Chromosomabnormalitäten (Aneuploidie), die während eines Zeitraums innerhalb von 30 aufeinander folgenden Tagen mit einem Hypothalamushormon und/oder Hypophysenhormon oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon behandelt worden sind, wobei die Reifung oder Synchronisation durch Inkontaktbringen der Oocyten mit einer MAS-Verbindung in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 100 μmol pro Liter durchgeführt wird. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung sind diejenigen, die in den nachstehenden Unteransprüchen genannt sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DIESER ERFINDUNG
In Bezug auf den weiblichen Zyklus lautet ein wie hier beschriebener Weg zur Durchführung der Behandlung wie folgt:
Um Tag 21 in einem Zyklus bis um Tag 25 im folgenden Zyklus: Die Eier werden durch Behandeln der Frau mit GnRH, z.B. Synarel (400-600 μg pro Tag) stimuliert.
Um Tag 6-15 des zweiten Zyklus: Die Eier werden durch Behandeln der Frau mit FSH, z.B. Gonal-F, Puregon oder Humegon (150-400 IU pro Tag) stimuliert.
Um Tag 15-16 im zweiten Zyklus: Die Eier werden durch Behandeln der Frau mit hCG, z.B. Pregnyl oder Profasi (2000-5000 IU pro Tag) stimuliert.
Um Tag 18 im Zweiten Zyklus: Die Eier werden der Frau entnommen.
Um Tag 18-19 im Zweiten Zyklus: Die Eier werden mit einer MAS-Verbindung gereift, um die Meiose zu stimulieren. In diesem zusätzlichen Reifungsschritt kann die Konzentration der MAS-Verbindung im Bereich von 0,1-100 μmol pro Liter, z.B. 10-20 μmol pro Liter liegen. Die Dauer für diesen Reifungsschritt kann im Bereich von etwa 60 Stunden liegen. Werden die präovulatorischen Follikel zum Lutenisieren mit einem Lutenisierunghormon oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon und/oder menschlichen Choriongonadotropinen oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon induziert, dauert die Reifung der Oozyten mit der MAS-Verbindung etwa 1-15 Stunden, vorzugsweise etwa 6 Stunden. Werden jedoch die präovulatorischen Follikel zum Lutenisieren mit einem Lutenisierunghormon oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon und/oder mit menschlichen Choriongonadotropinen oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon nicht induziert, dauert die Reifung der Oozyten mit der MAS-Verbindung etwa 15-60 Stunden.
Um Tag 19-21 im zweiten Zyklus: Die Eier werden in vitro befruchtet.
Am Tag vor der Absaugung erhält die Frau ein Östrogen, z.B. Ostrogenvalerat (2 × 10 mg täglich). Zwei Tage später erhält sie täglich auch ein Progestogen, z.B. Progestane vegetoria, das die Auskleidung der Gebärmutter zur Aufnahme der zukünftigen Embryos empfänglicher macht. Die Dauer dieser Behandlung wird pro Patient individuell gestaltet. Der Arzt kann unter einer Vielzahl von Östrogenen und Progestogenen auswählen.
Um Tag 21 im zweiten Zyklus: Ein oder mehr Embryos werden in die Gebärmutter der Frau transferiert.
Die vorstehende Beschreibung dient der Zugabe von MAS zu dem bestehenden IVF-Protokoll zum Verbessern der Effizienz durch Vermitteln einer endgültigen oder vollständigen Reifung oder Synchronie des Oocyten. Alternativ dazu kann MAS zum Auffangen von Oocyten in Zyklen verwendet werden, die sonst auf Grund einer sichtbaren FSH-Hyperreaktion abgebrochen werden würden. In diesen Fall würde der verantwortliche Arzt eine Abbrechung auf der Basis des Estradiolprofils, von Ultrasonografie (PCO-ähnliche Reaktion) erwägen, wodurch die hCG-Behandlung vermieden wird. Die Oocyten werden zu dem Zeitpunkt um Tag 15-16 abgesaugt, indem die hCG-Behandlung ersetzt wird.
Neben dem zusätzlichen Reifungsschritt mit einer MAS-Verbindung wird die vorstehende IVF in üblicher Weise durchgeführt. Da zu erwarten ist, dass durch das traditionelle IVF-Verfahren die Eier ausreichend gereift wurden, wäre nicht zu erwarten, dass sie eine zusätzliche Wirkung zusätzlich zu diesen zusätzlichen Reifungsschritt aufweisen.
Der Hauptteil der Schritte in der vorstehenden Behandlung und dem vorstehenden Verfahren werden in bekannter Weise durchgeführt und die übrigen Schritte werden in einer an sich bekannten Weise durchgeführt. Mehr Einzelheiten über die Entfernung der Oocyten aus Follikeln im Eierstock, Züchten der isolierten Oocyten, das zu verwendende Kulturmedium, die Befruchtung mit Sperma und den Transfer des Embryos in den Eileiter ist in der Literatur z.B. in der US-Patentbeschreibung Nr. 5,693,534 zu finden.
Erfindungsgemäß wird die MAS-Verbindung dem verwendeten Kulturmedium zugesetzt. In diesem Medium liegt die Menge der MAS-Verbindung im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 μM.
Ein bevorzugter Grund zur Behandlung einer Frau mit einer aufeinander folgenden Dauer von 30 Tagen mit einem Hypothalamushormom und/oder einem Hypophysenhormon oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat ist der Erhalt von mehreren präovulatorischen Follikeln.
Hypothalamushormome sind Hormone, die im menschlichen Hypothalamus vorliegen. Hypophysenhormone sind Hormone, die in der menschlichen Hypophyse vorliegen. Gonadrotopische Hormone sind Hormone, die von dem vorderen Lappen der Hypophyse in Wirbelknochen und durch Säugerplazenta, die die Aktivität von Gonaden steuert, sekretiert wird. Chemisch sind sie Glycoproteine. Beispiele für gonadrotopische Hormone sind FAH, LH und Choriongonatropin, z.B. menschliches Choriongonatropin (hier nachstehend als hCG bezeichnet). FSH stimuliert das Wachstum von Eierstockfollikeln und deren Oocyten im Eierstock und die Bildung von Spermatozoten in Hoden. FSH kann z.B. menopausales FSH oder rekombinantes FAS sein. In Frauen aktiviert LH das Östrogen erzeugende Gewebe der Eierstöcke zur Herstellung von Progesteron, unterstützt möglicherweise die Endstadien der Entwicklung von Eierstockfollikeln, initiiert die endgültige Oocytenreifung, induziert den Eisprung und in Säugern die Entwicklung des Corpus luteum. Diese Hormone sind bekannt. Es ist dem Fachmann klar, dass alternativ dazu Agonisten oder Antagonisten für diese Hormone verwendet werden können. Es ist dem Fachmann auch klar, dass alternativ dazu aktive Analoga dieser Hormone verwendet werden können. Einige dieser Agonisten, Antagonisten und Analoga sind bekannt und andere können durch an sich bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispiele für derartige bekannte Verfahren sind die chemische Synthese und das genetische Manipulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, wobei die aufeinander folgende Dauer von 30 Tagen, in welcher die Frau mit einem Hypothalamushormom und/oder einem Hypophysenhormon oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon behandelt wurde, mindestens etwa 7 Tage, vorzugsweise mindestens etwa 10 Tage, stärker bevorzugt mindestens etwa 14 Tage dauerte.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, wobei die Frau auf Unfruchtbarkeit und/oder zum Verbessern der Reifung ihrer Oocyten und/oder zum Verbessern der Synchronie von Kern-, Cytoplasma- und/oder Membra-Oocytenreifung und/oder zum Verbessern der Fruchtbarkeit ihrer Oocyten und/oder zum Verbessern der Implantationsrate durch menschliche in-vitro-Reifung und -befruchtung behandelt wurde.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, in welchem die Folgedauer ein Menstruationszyklus war.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, in welchem die Reifung der Oocyten mit der MAS-Verbindung etwa 15 bis etwa 60 Stunden dauert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, in welchem präovulatorische Follikel zum Lutenisieren mit einem Lutenisierunghormon (LH) oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon und/oder menschlichem Choriongonadotropin (HCG) oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon induziert wurden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, wobei die Reifung der Oocyten mit der MSA-Verbindung etwa 1 bis etwa 15 Stunden, vorzugsweise etwa 6 Stunden dauert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, in welchem die Dosierung der verwendeten MAS-Verbindung etwa 0,01 bis etwa 100 μmol pro Liter, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 100 μmol pro Liter beträgt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, in welchem die MAS-Verbindung eine der in WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 und 98/55498 erwähnten Verbindungen, insbesondere der in Anspruch 1 davon erwähnten speziellen Verbindungen ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren, in welchem die MAS-Verbindung FF-MAS ist.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung einen pharmazeutischen Kit in Dosierungseinheitsform zur Verwendung durch in-vitro-Befruchtung, umfassend getrennte Dosierungseinheiten, wobei der Kit separate Dosierungseinheiten täglichen Folgeverabreichung eines Hypothalamushormoms und/oder eines Hypophysenhormons oder eines Agonisten oder Antagonisten dafür oder eines wirksamen Derivats davon zur täglichen Folgeverabreichung und eine Dosierungseinheit einer MAS-Verbindung umfasst. Der Kit kann die vorstehend beschriebenen bevorzugten Merkmale aufweisen.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Beschränkung angesehen werden sollen. Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Beispielen und in den Ansprüchen offenbarten Merkmale können sowohl getrennt voneinander als auch in beliebiger Kombination davon Material zum Realisieren der Erfindung in diversen Formen davon sein.
Beispiel 1
Verfahren, das zum Auserwählen von MAS-Verbindungen verwendet wird
Oocyten wurden von unreifen weiblichen Mäusen (C57BL/6J × DBA/2JF1, Bomholtgaard, Dänemark) mit einem Gewicht von 13-14 Gramm erhalten, die unter geregelter Temperatur (20-22°C), Licht (angeschaltetes Licht von 06:00-18:00) und relativer Feuchtigkeit (50-70%) gehalten wurden. Die Mäuse erhielten eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml Gonadotropinen (Gonal-F, Serono), enthaltend 20 IU FSH, und 48 Stunden später wurden die Tiere durch Zervixdislokation getötet. Die Eierstöcke wurden heraus seziert und die Oocyten in Hx-Medium (siehe nachstehend) unter einem Stereomikroskop durch manuellen Aufbruch der Follikel unter Verwendung eines Paars an 27-Gaugenadeln isoliert. Kugelförmige Oocyten, die ein intaktes Keimbläschen (hier nachstehend als GV bezeichnet) zeigten wurden in Cumulus umschlossene Oocyten (hier nachstehend als CEO bezeichnet) und nackte Oocyten (hier nachstehend als NO bezeichnet) unterteilt und in ein α-Minimalessenzmedium (α-MEM ohne Ribonukleoside, Gibco BRL, Kat-Nr. 22561), ergänzt mit 3 mg/ml Rinderserumalbumin (BAS, Sigma Kat-Nr. A7030), 5 mg/ml menschlichem Serumalbumin (HSA, Statens Seruminstitut, Dänemark), 0,23 mM Pyruvat (Sigma, Kat-Nr. 5-8636), 2 mM Glutamin (Flow Kat-Nr. 16-801), 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Flow, Kat-Nr. 16-700), gegeben. Diesem Medium wurden mit 3 mM Hypoxanthin (Sigma, Kat-Nr. H-9377) und bezeichnetem Hx-Medium ergänzt.
Die Oocyten wurden dreimal in Hx-Medium gespült und Oocyten mit gleichförmiger Größe wurden in die Gruppen CEO und NO unterteilt. CEO und NO wurden in 4-Mulden-Multischalen (Nunclon, Dänemark), in welchen jede Mulde 0,4 ml Hx-Medium und die zu testende Verbindung in einer Konzentration von 10 μM enthielt, gezüchtet. Eine Kontrollmulde (d.h. 35-45 Oocyten, gezüchtet in identischem Medium ohne Zugabe von Testverbindung) wurde immer gleichzeitig mit 3 Test-Mulden (35-45 Oocyten pro Mulde, ergänzt mit Testverbindung) gezüchtet.
Die Oocyten wurden in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft für eine Dauer von 24 Stunden bei 37°C gezüchtet. Am Ende der Züchtungsdauer wurde die Anzahl an Oocyten mit GV, GVB bzw. Polarkörperchen (hier nachstehend als PB bezeichnet) unter Verwendung eines Stereomikroskops (Wildt, Leica MZ 12) gezählt. Der Prozentanteil an GVB, definiert als Prozentanteil an Oocyten, die sich einem GVB unterzogen, pro Gesamtanzahl an Oocyten in der Mulde, wurde wie folgt berechnet: % GVB = ((Anzahl an GVB + Anzahl an PB)/Gesamtanzahl an Oocyten) × 100.
Beispiel 2
Verfahren
Alle IVF-Patienten mit einem Alter im Bereich von 20 bis 45 Jahren können potentiell diese Behandlung erhalten. Die Hormonbehandlung kann eine kurze oder lange Behandlung auf Gonadrotopin-Basis mit oder ohne Hypophysenherabregelung oder mit und ohne die Verwendung von GNRH-Antagonisten und mit oder ohne die Verwendung von hCG sein. Zukünftige geeignete Hormontherapien, die zur IVF bestimmt sind, können ebenfalls verwendet werden. Mittel- bis vollgroße Follikel (Größe 10-25 mm, vorzugsweise 16 bis 20 mm Follikel) werden unter Ultraschallleitung abgesaugt.
Das abgesaugte Fluid wird auf Cumulusoocytenkomplexe (COC) untersucht, und nach dem Identifizieren unter dem Stereomikroskop (mit oder ohne die Verwendung von Embryofiltern) wird der COC in die Kultur gegeben.
Die Einwirkung der FF-MAS kann von 1 bis 60 Stunden, vorzugsweise 4 bis 30 Stunden variieren und vor, während und bis zu 24 Stunden nach der Befruchtung erfolgen. Eine breite Vielfalt an Oocytenkulturmedien oder Medienbestandteile, die dem Fachmann bekannt sind, kann verwendet werden. Menschliches Serumalbumin (HSA) kann dem Medium zugesetzt werden oder nicht. Falls es zugesetzt wird, kann es in einer Konzentration von 0,1 bis 100 μg/ml, vorzugsweise 5 bis 15 mg/ml oder 0,5 bis 1,5% V-V zugesetzt werden. Die Formulierung von FF-MAS kann in Form einer ethanolischen Stammlösung, von DMSO oder anderen Lösung eines organischen Lösungsmittels oder in Form von mit gebrauchsfertigen FF-MAS/HSA trockenbeschichteten Mulden direkt durch Zugabe des geeigneten Kulturmediums vorliegen. Die Konzentration der FF-MAS kann von 0,1 μM bis 100 μM, vorzugsweise 10 bis 30 μM variieren.
Nach oder während der in-vitro-Kultur mir FF-MAS können die Oocyten durch herkömmliche IVF oder durch intracystoplasmatische Spermainjektion (ICSI) oder durch zukünftige geeignete Befruchtungsverfahren, die zu befruchteten Zygoten führen, befruchtet werden. Der entwickelnde Embryo kann am Tag 1 bis Tag 6 nach der Befruchtung, vorzugsweise am Tag 2 bis 3, entweder als einzelner Eitransfer oder eines mehrfachen Eitransfers transferiert werden.
Der Patient kann vor und nach dem Eitransfer in individuell gestalteten Protokollen zum Ansaugen und Tragen einer geeigneten endometrialen Empfängerabstammung eine Progesteron- und/oder Östrogentherapie erhalten.
Verglichen mit den bekannten Verfahren wurden unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens bessere Ergebnisse erhalten.
Beispiel 3
Verwendung von FF-MAS als Hilfsmittel für eine standardmäßige IVF-Behandlung auf FSH-Basis
Die Patienten unterzogen sich einer Verordnung mit rekombinantem FSH mit einer mittleren täglichen Dosis von 225 IU, startend am Tag 1 oder 2 des derzeitigen Zyklus, und verwendeten einen GnRH-Antagonisten, d.h. Cetrorelix (1 mg täglich, subkutan, ein Schuss) im derzeitigen Zyklus. Mindestens 3 Follikel mit 17 mm oder mehr lagen zum Zeitpunkt der Verabreichung von hCG, d.h. Profasi (10.000 IU, ein Schuss) vor. Die Follikel wurden abgesaugt, und Oocyten der Metaphase II wurden in Oocytenkultursystem, enthaltend standardmäßige in vitro-Befruchtungs(IVF)medien (IVF 20 (erhältlich von Scandinavian IVF Science AB, Gothenburg, Schweden)), ergänzt mit Humanserumalbumin (0,8%) und FF-MAS (5 μM), gezüchtet. Alle Oocyten wurden unter normalen Bedingungen bei 37°C im Inkubator gezüchtet. Jeder Oocyt wurde in einer Mulde in einer Vierkammerkulturschale als Kulturmediensystem gezüchtet. Die Einwirkungsdauer des Kul turmediums mit Behandlung betrug 4 Stunden (± 30 Minuten) vor der intracystoplasmischen Spermainjektion (hier nachstehend ICSI bezeichnet) und 20 Stunden (± 1 Stunde) nach der ICSI im vorstehenden IVF-20-Medium. Präembryos wurden auf Teilungsstadium und Fragmentierung/Morphologie am Tag 1, 2 und 3 vor der ICSI bewertet. Nach 3 Tagen Züchtung wurde eine Auswahl der besten Präembryos, typischerweise 2 Embryos in den weiblichen Patienten zurückverpflanzt. Der weibliche Patient enthielt ein Östrogen, d.h. Estrofern (6 mg/täglich) und ein Progesteron, d.h. Utrogestan (600 mg/täglich, mikronisiert, Vaginalzäpfchen), um die Endometriumauskleidung der Gebärmutter des Patienten für das Ermöglichen einer Implantation der transferierten Eier empfänglich zu machen. Die Fortdauer der unterstützten Steroidhormone war vom Patienten abhängig und wurde nach 3 bis 10 Wochen abhängig von Ultraschallscans und Bluttests seponiert.
Verglichen mit den bekannten Verfahren wurden unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens bessere Ergebnisse erhalten.
Beispiel 4
Verwendung von FF-MAS als Hilfsmittel für eine standardmäßige IVF-Behandlung auf FSH-Basis
Die Patienten unterzogen sich einer Verordnung mit einem GnRH-Analog, d.h. Synarel (Nasenspray, zwei Sprühstöße täglich) für eine Dauer von mindestens 14 (startend in der Lutealphase des vorhergehenden Zyklus oder am Tag 1 oder 2 in der Follikelphase des derzeitigen Zyklus), und Eierstockstimulation mit rekombinantem FSH mit einer mittleren täglichen Dosis von 225 IU. Mindestens 3 Follikel mit 17 mm oder mehr lagen zum Zeitpunkt der Verabreichung von hCG, d.h. Profase (10.000 IU, ein Schuss) vor. Die Follikel wurden abgesaugt, und Oocyten der Metaphase II wurden in Oocytenkultursystem, enthaltend standardmäßige in vitro-Befruchtungs(IVF)medien (IVF 20 (erhältlich von Scandinavian IVF Scien ce AB, Gothenburg, Schweden)), ergänzt mit Humanserumalbumin (0,8%) und FF-MAS (5 μM), gezüchtet. Alle Oocyten wurden unter normalen Bedingungen bei 37°C im Inkubator gezüchtet. Jeder Oocyt wurde in einer Mulde in einer Vierkammerkulturschale als Kulturmediensystem gezüchtet. Die Einwirkungsdauer des Kulturmediums mit Behandlung betrug 4 Stunden (± 30 Minuten) vor der intracystoplasmischen Spermainjektion (hier nachstehend ICSI bezeichnet) und 20 Stunden (± 1 Stunde) nach der ICSI im vorstehenden IVF-20-Medium. Präembryos wurden auf Teilungsstadium und Fragmentierung/Morphologie am Tag 1, 2 und 3 vor der ICSI bewertet. Nach 3 Tagen Züchtung wurde eine Auswahl der besten Präembryos, typischerweise 2 Embryos in den weiblichen Patienten zurückverpflanzt. Der weibliche Patient enthielt ein Ostrogen, d.h. Estrofern (6 mg/täglich) und ein Progesteron, d.h. Utrogestan (600 mg/täglich), mikronisiert, Vaginalzäpfchen), um die Endometriumauskleidung der Gebärmutter des Patienten für das Ermöglichen einer Implantation der transferierten Eier empfänglich zu machen. Die Fortdauer der unterstützten Steroidhormone war vom Patienten abhängig und wurde nach 3 bis 10 Wochen abhängig von Ultraschallscans und Bluttests seponiert.
Verglichen mit den bekannten Verfahren wurden unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens bessere Ergebnisse erhalten.
Beispiel 5
Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens mit der Maßgabe, dass statt FF-MAS in einer Konzentration von 5 μM FF-MAS in einer Konzentration von 20 μM verwendet wurde, wurden bessere Ergebnisse als mit den bekannten Verfahren erhalten.
Beispiel 6
Unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens mit der Maßgabe, dass statt FF-MAS in einer Konzentration von 5 μM FF-MAS in einer Konzentration von 20 μM verwendet wurde, wurden bessere Ergebnisse als mit den bekannten Verfahren erhalten.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Synchronisation von Kern-, Cytoplasma- oder Membranoozytenreifung und zum Vermindern der Häufigkeit von menschlichen Präembryos mit Chromosomabnormalitäten (Aneuploidie), wobei von einer Frau abgesaugte menschliche Oozyten, die während eines Zeitraums innerhalb von 30 aufeinander folgenden Tagen, wobei der Zeitraum mindestens etwa 7 Tage, vorzugsweise mindestens 10 Tage, stärker bevorzugt mindestens 14 Tage beträgt, mit einem Hypothalamushormon und/oder Hypophysenhormon oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon behandelt worden sind, mit einer MAS-Verbindung in einer Menge von 0,1 bis etwa 100 μmol pro Liter in Kontakt gebracht werden.
In-vitro-Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Frau auf Unfruchtbarkeit und oder auf die Verbesserung der Reifung ihrer Oozyten und/oder auf die Verbesserung der Fruchtbarkeit ihrer Oozyten und/oder auf die Verbesserung der Geschwindigkeit der Einpflanzung durch menschliche in-vitro-Reifung und -Befruchtung behandelt worden ist.
In-vitro-Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Zeitraum ein Menstruationszyklus ist.
In-vitro-Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei die Reifung der Oozyten mit der MAS-Verbindung etwa 15 bis etwa 60 Stunden dauert.
In-vitro-Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei präovulatorische Folikel zum Lutenisieren mit einem Lutenisierungshormon (LH) oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon und oder Humanchoriongonadotropin (HCG) oder einem Agonisten oder Antagonisten dafür oder einem wirksamen Derivat davon eingeschlossen sind.
In-vitro-Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei die Reifung der Oozyten mit der MAS-Verbindung etwa 1 bis etwa 5 Stunden, vorzugsweise etwa 6 Stunden dauert.
In-vitro-Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Dosierung der MAS-Verbindung etwa 0,01 bis etwa 100 μmol pro Liter, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 100 μmol pro Liter beträgt.
In-vitro-Verfahren nach dem vorherigen Anspruch, wobei die MAS-Verbindung FF-MAS ist.
Pharmazeutischer Kit in Dosierungseinheitsform zur Verwendung bei einer in-vitro-Befruchtung, umfassend getrennte Dosierungseinheiten, wobei der Kit getrennte Dosierungseinheiten zur täglichen Folgeverabreichung eines Hpothalamushormons und/oder eines Hypophysenhormons oder eines Agonisten oder Antagonisten dafür oder eines wirksamen Derivats davon zur täglichen Folgeverabreichung und 1 Dosierungseinheit einer MAS-Verbindung umfasst.