DE60034662T2

DE60034662T2 - Behandlung von unfruchtbarkeit

Info

Publication number: DE60034662T2
Application number: DE60034662T
Authority: DE
Inventors: Christian Grondahl
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: ATE361091T1; WO2000050065A1; JP2002537348A; EP1156821A1; EP1156821B1; HUP0200079A2; CA2363074A1; AU2794000A; HUP0200079A3; KR20010093276A; DE60034662D1; CZ20012968A3; ES2286008T3; US6281013B1

Description

GEBIET DIESER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren der in-vitro-Befruchtung (hier nachstehend als IVF bezeichnet).
HINTERGRUND DIESER ERFINDUNG
Seit die erste IVF-Schwangerschaft 1978 ausgetragen wurde, führte dieses Verfahren zu Tausenden von Schwangerschaften und erschloss enorme neue Forschungs- und Behandlungsmöglichkeiten für die unfruchtbaren Paare. Immer noch besteht heutzutage ein erheblicher Bedarf für verbesserte Modalitäten der Unfruchtbarkeitsbehandlung. Es wird vermutet, dass etwa eines von sieben Paaren Probleme mit verminderter Fruchtbarkeit oder Unfruchtbarkeit hat.
Die IVF von menschlichen Oozyten wurde zu einer üblichen Verwendung zur Behandlung von weiblicher und männlicher verminderter Fruchtbarkeit. Die standardmäßige IVF-Behandlung schließt eine lange Phase der Hormonstimulierung der Patientin, z.B. 30 Tage, ein, die durch Unterdrücken des dem Patienten eigenen Follikel-stimulierenden Hormons (hier nachstehend als FSH bezeichnet) und lutenisierenden Hormons (hier nachstehend als LH bezeichnet) durch das Gonadotropin-freisetzende Hormon (hier nachstehend als GnRH bezeichnet) eingeleitet wird, welchem Injektionen von exogenen Gonadotropinen, z.B. FSH und/oder LH folgen, um die Entwicklung von mehrfachen präovulatorischen Follikeln und die Absaugung von mehrfachen in vitro gereiften Oozyten direkt vor dem Eisprung zu gewährleisten. Der abgesaugte Oozyt wird anschließend in vitro befruchtet und typischerweise für eine Dauer von drei Tagen kultiviert, bevor er im 4-8-zelligen Stadium zurück in die Gebärmutter verpflanzt wird. Kontinuierliche Bestrebungen wurden durchgeführt, dieses Verfahren zu optimieren und zu vereinfachen. Dennoch kann die Rate der Gesamtschwangerschaften mit den gegenwärtigen Behandlungsmodalitäten nicht wesentlich über etwa 20% erhöht werden. In einer groß angelegten europäischen Befragung von IVF-Patienten wurde gefunden, dass von 11,5 abgesaugten Oozyten pro Patient 7,2 Oozyten direkt vor der Befruchtung eine Wiederaufnahme der Meiose durchmachten, nur 4,3 Oozyten befruchtet wurden und nur 2,2 Oozyten nach der Befruchtung und in-vitro-Kultivieren das 8-zellige Embryostadium erreichten (ESHRE, Edinburgh, 1997).
Aufgrund der äußerst unvorhersagbaren Qualität der Embryos des Stands der Technik heutzutage, musste mehr als ein Embryo verpflanzt werden, um eine vernünftige Erfolgschance zu erhalten. Daher ist es üblich 2-3 Embryos (in einigen Ländern bis zu 5 Embryos) zu verpflanzen, was die sehr große Nebenwirkung von Mehrlingsschwangerschaften mit großen Unannehmlichkeiten und Risiken sowohl für den Patienten als auch die Kinder mit sich bringt. Darüber hinaus wurde geschätzt, dass die erhöhten Gesundheitskosten aufgrund von Mehrlingsgeburten (Zwillingen, Drillingen usw.) die IVF-Gesamtkosten übersteigen.
Daher birgt die gegenwärtige Behandlung mehrere Nachteile, wobei es sich bei den vier Beträchtlichsten um Folgende handelt:

1. Das Risiko der Eierstocküberstimulation beim Injizieren von Gonadotropinen, was ein möglicherweise verhängnisvoller Zustand ist, der einen Krankenhausaufenthalt erfordert;
2. Mehrlingsschwangerschaften (das 50-1000fache der normalen Häufigkeit von Zwillingen bzw. Drillingen);
3. Die Existenz von erheblichen Patientenanteilen, die das gegenwärtige Verfahren z.B. aufgrund eines polyzystischen Eierstocksyndroms nicht tolerieren, und vielen Diabetikern; und
4. ein möglicherweise lang anhaltendes Krebsrisiko.

Weiterhin wird über Gewichtszunahme, Blähungen, Übelkeit, Erbrechen, Stimmungsschwankungen und andere Unannehmlichkeiten der Patienten zusammen mit der Abneigung des Patienten, sich selbst zu injizieren, als Nachteile berichtet.
Es ist aus WO 96/00235 bekannt, dass bestimmte Sterolderivate zum Steuern der Meiose verwendet werden können. Ein Beispiel für ein derartiges Sterol ist 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,14,24-trien-3β-ol (hier nachstehend als FF-MAS bezeichnet).
Hier bezeichnet der Begriff MAS Verbindungen, die die Meiose von Oozyten vermitteln. Insbesondere handelt es sich bei MAS Verbindungen um Verbindungen, die im in nachstehend beschriebenem Beispiel 1 einen prozentualen Keimbläschenabbau (hier nachstehend als GVB bezeichnet) aufweisen, der deutlich höher als die Kontrolle ist. Bevorzugte MAS-Verbindungen sind derart, dass sie einen prozentualen GVB von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 80% aufweisen.
Beispiele für MAS-Verbindungen sind in WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 und 98/55498, insbesondere in Anspruch 1 davon, erwähnt.
In WO 95/000265 wurden einige möglicherweise die Meiose steuernde Substanzen an unreifen weiblichen Mäusen getestet. 48 Stunden vor dem test wurden die Testtiere durch Zervixentfernung getötet, ihnen wurde eine einzelne Injektion von humanem menopausalem Gonadotropin, das 20 IU FSH und 20 IU LH enthielt, verabreicht. Die Eierstöcke wurden entfernt, in ein Hypoxantinmedium gegeben und von Fremdgewebe befreit. Anschließend wurden die Oozyten aus den Follikeln heraus punktiert, von Kumuluszellen befreit und in einem ein die Meiose steuerndes Derivat enthaltenden Medium kultiviert.
Gegenwärtig erwies sich die in-vitro-Reifung bei Menschen trotz des beträchtlichen Interesses und klinischer Bestrebungen als äußerst erfolglos.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Unfruchtbarkeit beim Menschen zu behandeln.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Reifung von menschlichen Oozyten zu verbessern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Gleichzeitigkeit der Kern-, Zytoplasma- und/oder Membranoozytenreifung zu verbessern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Fruchtbarkeit von Oozyten zu verbessern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Implantationsrate von Oozyten durch in-vitro-Reifung und Befruchtung beim Menschen zu verbessern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Vorkommen von menschlichen Präembryos mit Chromosomenabnormalitäten (Aneuploidie) zu vermindern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Teilungsrate von menschlichen Präembryos zu verbessern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Qualität von menschlichen Präembryos zu verbessern.
ZUSAMMENFASSUNG DIESER ERFINDUNG
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die IVF-Behandlung und der Grad an Nebenwirkungen erheblich verbessert werden können, wenn die Frau in einer Folgedauer von 30 Tagen eine Behandlung mit einem Hypothalamushormon und/oder einem Hypophysenhormon oder einem Agonisten oder Antagonisten davon oder einem wirksamen Derivat davon vermeidet (hier nachstehend wird diese Behandlung als exogene Stimulation) bezeichnet) oder wenn die Behandlung durch exogene Stimulation der Frau nur für eine kurze Zeitdauer, z.B. weniger als 7 Tage, vorzugsweise weniger als 4 Tage durchgeführt wird. Unter Verwendung dieses verbesserten Verfahrens unter Beteiligung einer geringen oder von keiner exogenen Stimulation wird eine MAS-Verbindung zum aktiven Reifen und Synchronisieren von menschlichen Oozyten in vitro verwendet, was zur Befruchtung und Embryoentwicklung führt.
Die Erfindung lautet wie in den Ansprüchen definiert.
In Kürze betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in-vitro-Reifung von menschlichen Oozyten, in welchem ein unreifes Ei oder unreife Eier, das/die aus einer Frau entnommen wurden, die innerhalb einer Folgedauer von 30 Tagen mit einem Hypothalamushormon und/oder einem Hypophysenhormon oder einem wirksamen Derivat davon für eine Zeitdauer, die weniger als 7 Tage, vorzugsweise weniger als 4 Tage beträgt, behandelt worden ist, in vitro in einer synchronisierenden Weise unter Verwendung einer wie hier definierten MAS-Verbindung für eine Zeitdauer von 22-36 Stunden und in einer Dosierung im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 μM gereift wird/werden. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung sind diejenigen, die in den nachstehenden Unteransprüchen genannt sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DIESER ERFINDUNG
In Bezug auf den weiblichen Zyklus lautet ein Weg des Durchführens der IVF-Behandlung dieser Erfindung wie folgt:
Um Tag 6-9 im Zyklus: Stimulation mit FSH, z.B. 75-600 IU pro Tag, vorzugsweise 150-225 IU pro Tag, z.B. für eine Dauer von 3 Tagen.
Um Tag 9: Die Eier werden unter Verwendung einer durch Ultraschall geführten Absaugung von kleinen bis mittelgroßen Follikeln mit einem Durchmesser von etwa 6-12 mm, vorzugsweise 8-10 mm aus der Frau entnommen.
Um Tag 9-11: Die Eier werden mit einer MAS-Verbindung gereift, um die Meiose zu stimulieren. In diesem Reifungsschritt kann die Konzentration der MAS-Verbindung im Bereich von etwa 0,1-100 μmol pro Liter, z.B. 10-20 μmol pro Liter liegen. Dieses Medium kann Humanserumalbumin (hier nachstehend als HSA bezeichnet), z.B. 0,8%, enthalten und kann zusätzlich etwas Ethanol, z.B. 0,4%, enthalten, der zum Lösen von MAS verwendet worden ist. Die Dauer für diesen Reifungsschritt liegt im Bereich von etwa 22-36 Stunden.
Um Tag 11-13: Die Eier werden in vitro befruchtet.
Um Tag 12-16: Die Eier werden in vitro in einem geeigneten Medium kultiviert.
Von dem Tag vor der Absaugung an erhält die Frau ein Östrogen, z.B. Östrogenvalerat (2 × 10 mg täglich). Zwei Tage später erhält sie täglich auch ein Progestogen, z.B. Progestan vagetoria, wodurch die Gebärmutterauskleidung für die Empfängnis des zukünftigen Embryos bereiter wird. Die Dauer dieser Behandlung wird für jeden Patienten individuell bestimmt. Der Arzt wählt unter einer Vielfalt an Östrogenen und Progestogenen aus.
Um Tag 15-16: Ein oder mehrere Embryos werden in die Gebärmutter der Frau verpflanzt.
Demzufolge dauert die komplette Behandlung insgesamt etwa 10-15 Tage.
In Bezug auf den weiblichen Zyklus lautet ein anderer Weg der Durchführung der IVF-Behandlung dieser Erfindung wie folgt:
Um Tag 2-8 im Zyklus: Stimulation mit FSH, z.B. 75-600 IU pro Tag, vorzugsweise 150-225 IU pro Tag, z.B. für eine Dauer von 3 Tagen, letztendlich über 6 Tage verteilt.
Um Tag 7-9: Die Eier werden unter Verwendung einer durch Ultraschall geführten Absaugung von kleinen bis mittelgroßen Follikeln mit einem Durchmesser von etwa 6-15 mm, vorzugsweise 8-12 mm aus der Frau entnommen.
Um Tag 7-11: Die Eier werden mit einer MAS-Verbindung gereift, um die Meiose zu stimulieren. In diesem Reifungsschritt kann die Konzentration der MAS-Verbindung im Bereich von etwa 0,01-100 μmol pro Liter, z.B. 5-20 μmol pro Liter liegen. Dieses Medium kann Humanserumalbumin (hier nachstehend als HSA bezeichnet), z.B. 0,8%, enthalten und kann zusätzlich etwas Ethanol, z.B. 0,1-0,4%, enthalten, der zum Lösen von MAS verwendet worden ist. Die Dauer für diesen Reifungsschritt liegt im Bereich von etwa 22-36 Stunden.
Um Tag 9-13: Die Eier werden in vitro befruchtet.
Um Tag 10-16: Die Eier werden in vitro in einem geeigneten Medium kultiviert.
Von dem Tag vor der Absaugung an erhält die Frau ein Östrogen, z.B. Östrogenvalerat (2 × 10 mg täglich). Zwei Tage später erhält sie täglich auch ein Progestogen, z.B. Progestan vagetoria, wodurch die Gebärmutterauskleidung für die Empfängnis des zukünftigen Embryos bereiter wird. Die Dauer dieser Behandlung wird für jeden Patienten individuell bestimmt. Der Arzt wählt unter einer Vielfalt an Östrogenen und Progestogenen aus.
Um Tag 13-16: Ein oder mehrere Embryos werden in die Gebärmutter der Frau verpflanzt.
Demzufolge dauert die komplette Behandlung insgesamt etwa 10-15 Tage.
Der Hauptteil der Schritte in der vorstehenden Behandlung und in der vorstehenden Vorgehensweise wird in einer bekannten Weise durchgeführt, und die restlichen Schritte werden in einer an sich bekannten Weise durchgeführt. Weitere Details über die Entfernung der Oozyten aus Follikeln im Eierstock, das Kultivieren der isolierten Oozyten, das zu verwendende Kulturmedium, die Befruchtung mit Sperma und die Verpflanzung des Embryos in den Eileiter sind in der Literatur, z.B. in der US-Patentschrift Nr. 5,693,534 zu finden.
Erfindungsgemäß wird die MAS-Verbindung dem zu verwendenden Kulturmedium zugesetzt. In diesem Medium liegt die Menge der MAS-Verbindung im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 μM.
Durch das reduzierte Risiko von Nebenwirkungen wird das erfindungsgemäße Verfahren zu einer attraktiven Alternative für die gegenwärtigen Verfahren, in welchen vor dem Entnehmen der Eier GnRH für eine Dauer von etwa 22 Tagen und FSH für eine Dauer von etwa 9 Tagen und anschließend ein Progestogen für eine Dauer von mehreren Wochen verwendet wird. Demzufolge ist im erfindungsgemäßen Verfahren die Dauer, in welcher die Patientin mit einem Hypothalamushormon und/oder einem Hypophysenhormon behandelt wird, um etwa 80-90% reduziert. Die Gesamtbehandlungsdauer durch die gegenwärtigen Verfahren beträgt etwa 4 Wochen. Demzufolge ist die Gesamtbehandlungsdauer unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens um etwa 50-60% reduziert.
Hypothalamushormone sind Hormone, die im menschlichen Hypothalamus vorliegen. Hypophysenhormone sind Hormone, die in der menschlichen Hypophyse vorliegen. Gonadotropinhormone sind Hormone, die durch den Lobus anterior der Hypophyse in Wirbeltieren und durch die menschliche Plazenta abgesondert werden, die die Gonadenaktivität steuern. Chemisch gesehen sind sie Glycoproteine. Beispiele für Gonadotropinhormone sind FSH, LH und Choriongonadotropin, z.B. Humanchoriongonadotropin (hier nachstehend als hCG bezeichnet). FSH stimuliert das Wachstum von Eierstockfollikeln und derer Oozyten im Eierstock und die Bildung von Spermien im Hoden. FSH kann z.B. menopausales FSH oder rekombinantes FSH sein. Bei Frauen aktiviert LH das Östrogen produzierende Gewebe der Eierstöcke zur Produktion von Progesteron, fördert vermutlich die Endstadien der Entwicklung von Eierstockfollikeln, führt die Oozytenendreifung herbei, leitet den Eisprung ein und führt in Säugern die Gelbkörperentwicklung herbei. Diese Hormone sind bekannt. Es ist dem Fachmann klar, dass alternativ dazu Agonisten oder Antagonisten dieser Hormone verwendet werden können. Es ist dem Fachmann auch klar, dass alternativ dazu aktive Analoga dieser Hormone verwendet werden können. Einige dieser Agonisten, Antagonisten und Analoga sind bekannt und andere können durch an sich bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispiele für derartige Verfahren sind die chemische Synthese und die Gentechnik.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die Dauer, in welcher die Frau mit einem Hypothalamushormon und/oder einem Hypophsenhormon oder einem wirksamen Derivat davon behandelt worden ist, 0 (null) Tage beträgt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die Frau auf Unfruchtbarkeit und/oder auf Verbesserung der Reifung ihrer Oozyten und/oder auf Verbesserung der Gleichzeitigkeit der Kern-, Zytoplasma- und/oder Membranoozytenreifung und/oder auf Verbesserung der Fruchtbarkeit ihrer Oozyten und/oder auf Verbesserung der Implantationsrate ihrer Oozyten durch eine Human-in-vitro-Reifung und -Befruchtung behandelt worden ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die Folgedauer einen Menstruationszyklus beträgt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die Hormone Gonadotropin freisetzende Hormone oder ein Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon oder Gonadotropinhomone oder ein Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon waren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem das Gonadotropinhormon FSH oder ein Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon war.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die Dauer, in welcher die Patientin mit FSH oder einem Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon vor der Entnahme des Eis behandelt worden ist, weniger als 7 Tage, vorzugsweise weniger als 4 Tage und mindestens 1 Tag betrug.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die Dauer, in welcher die Patientin mit FSH oder einem Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon behandelt worden ist, 2, 3 oder 4 Tage betrug.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem kein Choriongonadotropin, z.B. Humanchoriongonadotropin oder Agonist oder Antagonist davon oder keine Analoga davon verwendet worden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betriff die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem kein Gonadotropin freisetzendes Hormon, z.B. GnRH oder kein Agonist oder Antagonist davon oder keine Analoga davon verwendet worden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die Dosierung an MAS-Verbindung im Bereich von etwa 0,01 μM pro Liter bis etwa 100 μM pro Liter, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 μM pro Liter bis etwa 100 μM pro Liter liegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die MAS-Verbindung eine der Verbindungen, die in WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 und 98/55498 erwähnt sind, insbesondere der in Anspruch 1 davon erwähnten Verbindungen ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, in welchem die MAS-Verbindung FF-MAS ist.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittelset in Dosierungseinheitsform zur Verwendung durch in-vitro-Befruchtung, das 1 bis 8 separate Dosierungseinheiten umfasst, wobei das Set weniger als 7, vorzugsweise weniger als 4 und mindestens 1 separate Dosierungseinheit/en zur aufeinander folgenden täglichen Verabreichung eines Hypothalamushormons und/oder eines Hypophysenhormons oder eines wirksamen Derivats davon zur aufeinander folgenden täglichen Verabreichung und 1 Dosierungseinheit einer MAS-Verbindung umfasst. Dieses Set kann die vorstehend beschriebenen bevorzugten Merkmale aufweisen.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Beschränkung betrachtet werden sollen. Die in der vorstehenden Beschreibung, in den folgenden Beispielen und in den Ansprüchen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in Kombination davon Stoff zum Verwirklichen der Erfindung in verschiedenen Formen sein.
Beispiel 1
Zum Auswählen von MAS-Verbindungen verwendetes Verfahren
Oozyten wurden von unreifen weiblichen Mäusen (C57BL/6J X DBA/2J F1, Bomholtgaard, Dänemark) mit einem Gewicht von 13-16 Gramm erhalten, die unter geregelter Temperatur (20-22°C), Licht (eingeschaltet von 06.00-18.00) und relativer Feuchtigkeit (50-70%) gehalten wurden. Die Mäuse erhielten eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml 20 IU FSH enthaltenden Gonadotropinen (Gonal-F, Serono), und 48 Stunden später wurden die Tiere durch Zervixentfernung getötet. Die Eierstöcke wurden heraus seziert und die Oozyten in Hx-Medium (siehe nachstehend) unter einem Stereomikroskop durch manuellen Aufbruch der Follikel unter Verwendung eines Paars Nadeln mit 27 Gauge isoliert. Kugelförmige Oozyten, die ein intaktes Keimbläschen (hier nachstehend als GV bezeichnet) zeigten, wurden in Kumulus-umschlossene Oozyten (hier nachstehend als CEO bezeichnet) und nackte Oozyten (hier nachstehend als NO bezeichnet) unterteilt und in α-Minimalessenzmedium (α-MEM ohne Ribonukleoside, Gibco BRL, Kat.-Nr. 22561), ergänzt mit 3 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA, Sigma, Kat.-Nr. A-7030), 5 mg/ml Humanserumalbumin (HSA, Statens Seruminstitut, Dänemark), 0,23 mM Pyruvat (Sigma, Kat.-Nr. S-8636), 2 mM Glutamin (Flow, Kat.-Nr. 16-801), 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Flow, Kat.-Nr. 16-700), gegeben. Dieses Medium wurde mit 3 mM Hypoxanthin (Sigma, Kat.-Nr. H-9377) ergänzt und als Hx-Medium bezeichnet. Die Oozyten wurden dreimal in Hx-Medium gespült, und Oozyten mit gleichförmiger Größe wurden in CEO- und NO-Gruppen unterteilt. CEO und NO wurden in 4-Mulden-Mehrfachschalen (Nunclon, Dänemark) kultiviert, wobei jede Mulde 0,4 ml Hx-Medium und die zu testende Verbindung in einer Konzentration von 10 mM enthielt. Eine Kontrollmulde (d.h. 35-45 in identischem Medium ohne Zugabe von Testverbindung kultivierte Oozyten) wurde immer gleichzeitig mit 3 Testmulden (35-45 Oozyten pro Mulde, ergänzt mit Testverbindung) kultiviert. Die Oozyten wurden in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ an Luft für eine Dauer von 24 Stunden bei 37°C kultiviert. Am Ende der Kulturdauer wurde die Oozytenanzahl mit GV, GVB bzw. Polarkörpern (hier nachstehend als PB bezeichnet) unter Verwendung eines Stereomikroskops (Wildt, Leica MZ42) gezählt. Der Prozent anteil von GVB, definiert als Prozentanteil von einem GVB durchmachenden Oozyten pro Gesamtanzahl an Oozyten in dieser Mulde, wurde wie folgt berechnet: % GVB = (GVB-Anzahl + PB-Anzahl)/Oozytengesamtanzahl) × 100.
Beispiel 2
Patienten für eine in-vitro-Befruchtung (IVF) unterziehen sich normalerweise einem langen (4-wöchigen) Protokoll auf Gonadotropin-Basis, was zur Absaugung von in vivo gereiften Oozyten führt. Diese Oozyten werden anschließend in vitro befruchtet und als 4-8zellige Embryos durch einen Zervixkatheter in die Gebärmutter des Patienten zurück verpflanzt.
In-vitro-Reifung mit FF-MAS
Vorgehensweise
Alle IVF-Patienten mit einem Alter im Bereich von 20 bis 45 Jahren, die entweder ein polyzystisches Eierstocksyndrom (PCO) zeigen oder nicht und entweder einen regelmäßigen Zyklus aufweisen oder nicht, können potentiell diese Behandlung erhalten. Im Falle eines unregelmäßigen Zyklus' oder von Amenorrhoe (keine Zyklusaktivität) könnte dieser Vorgehensweise unterschiedlich lang (1-10 Monate) ein orales Empfängnisverhütungsmittel vorausgehen und dieses nach dem Einleiten der folgenden Vorgehensweise wieder abgesetzt werden. Zu Beginn (Tag 1-6, vorzugsweise Tag 3-6) des Zyklus' (Tag 1 = 1. Tag der Menstruation) wird der Patient klinisch untersucht und kann einen kleinen vorbereitenden FSH-Stimulus, der individuell auf jeden Patienten abgestimmt ist, (Dauer: 1-7 Tage, Dosen: 75 IU bis 750 IU, vorzugsweise 3-4 Tage mit Dosen von 150 bis 300 IU rekombinantem FSH oder FSH auf Harn-Basis) mit oder ohne die Verwendung eines GnRH-Antagonisten und mit oder ohne hGC erhalten oder nicht. Kleine bis mittelgroße Follikel (Follikelgröße: 4 bis 16 mm, vorzugsweise 8 bis 12 mm) werden unter Ultraschallführung unter Verwendung eines geringen/reduzierten Saugdrucks und speziell gestalteten (starreren) Nadeln abgesaugt. Das abgesaugte Fluid wird auf Kumulusoozytenkomplexe (COC) durchsucht, und nach Identifizieren unter dem Stereomikroskop (mit der oder ohne die Verwendung von Embryofiltern) werden die COC in Kultur gesetzt. Eine breite Vielfalt an dem Fachmann bekannten Oozytenkulturmedien oder -medienbestandteilen kann verwendet werden, jedoch wird die Wiederaufnahme der Meiosereifung der Oozyten durch FF-MAS herbeigeführt. Humanserumalbumin (HSA) kann dem Medium zugesetzt werden oder nicht. Falls es zugesetzt wird, kann es in einer Konzentration von 0,1 bis 100 mg/ml, vorzugsweise 5 bis 15 mg/ml oder 0,5 bis 1,5 Vol.-% vorliegen. Die Formulierung von FF-MAS kann in Form einer Ethanolstammlösung, DMSO- oder einer anderen organischen Lösungsmittellösung oder in Form von mit FF-MAS/HSA trockenbeschichteten Mulden, die erst durch Zugabe des geeigneten Kulturmediums verwendungsbereit sind, vorliegen. Die Dauer der in-vitro-Reifung kann von 4 bis 60 Stunden, vorzugsweise 30 bis 40 Stunden variieren. Die FF-MAS-Konzentration kann von 0,01 μM bis 100 μM, vorzugsweise von 0,1 μM bis 100 μM, stärker bevorzugt von 5 μM bis 30 μM, noch stärker bevorzugt von 10 μM bis 30 μM variieren. Nach der in-vitro-Reifung können die Oozyten durch herkömmliche IVF oder durch intrazytoplasmatische Spermainjektion (hier nachstehend als ICSI bezeichnet) oder durch zukünftige geeignete Befruchtungsverfahren, die zu befruchteten Zygoten fuhren, befruchtet werden, und der sich entwickelnde Embryo kann an Tag 1 bis Tag 6 nach der Befruchtung, vorzugsweise an Tag 2 bis 3 entweder als Einzeleiverpflanzung oder Mehrfacheiverpflanzung verpflanzt werden. Der Patient kann vor und nach der Verpflanzung in individuell abgestimmten Protokollen eine Progesteron- und/oder Östrogentherapie erhalten, um eine geeignete empfängnisbereite Endometriumauskleidung vorzubereiten oder zu bewahren.
Verglichen mit den bekannten Vorgehensweisen wurden unter Verwendung der vorstehenden Vorgehensweise bessere Ergebnisse erhalten.
Beispiel 3
Verwendung von FF-MAS zur in-vitro-Reifung von unreifen menschlichen Oozyten
Bei der Patientin wurde an Tag 2 im Zyklus mit einer kurzen Eierstockstimulation mit rekombinantem FSH mit einer täglichen Durchschnittsdosis von 225 begonnen und diese insgesamt dreimal an abwechselnden Tagen, d.h. am 2., 4. und 6. Tag im Zyklus fortgesetzt. Mindestens 3 Follikel von 10 mm oder mehr führen an Tag 7 zur Absaugung von reifen Follikeln mit einer Größe zwischen 8-12 mm. Die Follikel wurden abgesaugt, und unreife (GV-Stadium) Kumulusumschlossene Oozyten wurden in Oozytenkultursystem, enthaltend ein standardmäßiges in-vitro-Kultur(IVC)-Medium (IVF 20 (das von Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Schweden, erhältlich ist)), zusätzlich enthaltend Humanserumalbumin (0,8%) und FF-MAS (5 μM), kultiviert. Alle Oozyten wurden unter normalen Bedingungen bei 37°C im Inkubator kultiviert. Jeder Oozyt wurde in einer Mulde in einer Vierkammerkulturschale als Kulturmediensystem kultiviert. Die Einwirkungsdauer des Kulturmediums mit Behandlung betrug 30 Stunden vor der Durchführung einer ICSI oder in-vitro-Befruchtung. Präembryos wurden auf Teilungsstadium und Aufteilung/Morphologie an den Tagen 1, 2 und 3 nach ICSI/IVF bewertet. Nach 3tägiger Kultur wurde eine Auswahl der besten Präembryos, typischerweise zwei Präembryos in die Patientin zurück verpflanzt.
Verglichen mit den bekannten Vorgehensweisen wurde ein ähnliches klinisches Ergebnis erhalten. Jedoch wurde in diesem Beispiel verglichen mit den bekannten Vorgehensweisen eine reduzierte Hormoneinwirkung verwendet und demzufolge hier ein reduziertes Nebenwirkungsprofil erhalten.
Beispiel 4
Unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehensweise wurde mit der Maßgabe, dass anstelle der Verwendung von FF-MAS in einer Konzentration von 5 μM FFMAS in einer Konzentration von 20 μM verwendet wurde, in dieser Vorgehensweise ein ähnliches klinisches Ergebnis wie mit den bekannten Vorgehensweisen erhalten. Jedoch wurde in diesem Beispiel verglichen mit den bekannten Vorgehensweisen eine reduzierte Hormoneinwirkung verwendet und demzufolge hier ein reduziertes Nebenwirkungsprofil erhalten.

Claims

Verfahren zur in-vitro-Reifung von menschlichen Oozyten, wobei ein Ei oder Eier, das/die aus einer Frau entnommen wurde/n, die innerhalb einer Folgedauer von 30 Tagen mit einem Hypothalamushormon und/oder Hypophysenhormon oder einem aktiven Derivat davon für eine Dauer, die weniger als etwa 7 Tage, vorzugsweise weniger als etwa 4 Tage beträgt, behandelt worden ist, unter Verwendung einer wie hier definierten MAS-Verbindung für eine Zeitdauer von 22-36 Stunden und in einer Dosierung im bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 μM gereift wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Frau auf Unfruchtbarkeit und/oder auf Verbesserung der Reifung ihrer Oozyten und/oder auf Verbesserung der Gleichzeitigkeit der Kern-, Zytoplasma- und/oder Membranoozytenreifung und/oder auf Verbesserung der Fruchtbarkeit ihrer Oozyten und/oder auf Verbesserung der Implantationsrate ihrer Oozyten durch eine Human-in-vitro-Reifung und -Befruchtung behandelt worden ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem die Dauer, in welcher die Frau mit einem Hypothalamushormon und/oder einem Hypophsenhormon oder einem wirksamen Derivat davon behandelt worden ist, 0 (null) Tage betrug.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem die Folgedauer einen Menstruationszyklus betrug.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem die Hormone Gonadotropin freisetzende Hormone oder ein Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon oder Gonadotropinhomone oder ein Agonist oder Antagonist davon oder ein Analoga davon waren.
Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, in welchem das Gonadotropinhormon FSH oder ein Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon war.
Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, in welchem die Dauer, in welcher die Patientin mit FSH oder einem Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon vor der Entnahme des Eis behandelt worden ist, weniger als 7 Tage, vorzugsweise weniger als 4 Tage und mindestens 1 Tag betrug.
Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, in welchem die Dauer, in welcher die Patientin mit FSH oder einem Agonist oder Antagonist davon oder Analoga davon behandelt worden ist, 2, 3 oder 4 Tage betrug.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, in welchem kein Choriongonadotropin, z.B. Humanchoriongonadotropin oder Agonist oder Antagonist davon oder keine Analoga davon verwendet wurden.
Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, in welchem kein Gonadotropin freisetzendes Hormon, z.B. GnRH oder Agonist oder Antagonist davon oder keine Analoga davon verwendet wurden.
Verfahren nach dem vorangehenden Anspruch, in welchem die MAS-Verbindung FF-MAS ist.
Arzneimittelset in Dosierungseinheitsform zur Verwendung durch in-vitro-Befruchtung, das 1 bis 8 separate Dosierungseinheiten umfasst, wobei das Set weniger als 7, vorzugsweise weniger als 4 und mindestens 1 separate Dosierungseinheiten zur aufeinander folgenden täglichen Verabreichung eines Hy pothalamushormons und/oder eines Hypophysenhormons oder eines wirksamen Derivats davon zur aufeinander folgenden täglichen Verabreichung und 1 Dosierungseinheit einer MAS-Verbindung umfasst.