DE60034057T2

DE60034057T2 - Behandlung von menschlicher unfruchtbarkeit

Info

Publication number: DE60034057T2
Application number: DE60034057T
Authority: DE
Inventors: Christian Grondahl
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 2000-11-23
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2020-11-24
Also published as: DE60034057D1; AU1692901A; ES2284542T3; ATE357507T1; JP2003514580A; EP1235899A1; EP1235899B1; WO2001038493A1

Description

BEHANDLUNG VON MENSCHLICHER UNFRUCHTBARKEIT
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Embryolaborverfahren und ein Arzneimittel und dessen Verwendung zum Behandeln von menschlicher Unfruchtbarkeit. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Behandlung von menschlicher Unfruchtbarkeit durch In-vitro-Verfahren, welche den menschlichen Oozyten in der Prophase der ersten meiotischen Teilung aktiv hemmen und anschließend diese Meioseblockade entweder durch Zugabe von mindestens einer meiosestimulierenden Verbindung oder durch Züchtungsbedingungen, die zur endogenen Bildung von meiosestimulierenden Molekülen im Oozyt-Cumulus-Komplex führen, aktiv umkehren. Kurz gesagt, betrifft diese Erfindung ein verbessertes Verfahren der In-vitro-Befruchtung (hier nachstehend als IVF bezeichnet).
HINTERGRUND DIESER ERFINDUNG
Bei der Meiose handelt es sich um den einzigartigen und endgültigen Keimzellenvorgang, auf welchem die geschlechtliche Vermehrung basiert. Die Meiose umfasst zwei meiotische Teilungen. Während der ersten Teilung findet ein Austausch zwischen Mutter- und Vatergenen statt, bevor die Chromosomenpaare in die zwei Tochterzellen aufgeteilt werden. Diese enthalten nur die Hälfte der Anzahl (1n) an Chromosomen und 2c DNA. Die zweite meiotische Teilung verläuft ohne eine DNA-Synthese. Die Teilung führt deshalb zur Bildung der haploiden Keimzellen mit nur 1c DNA.
Die Meisoevorgänge sind in den männlichen und weiblichen Keimzellen gleich. jedoch unterscheiden sich der Zeitplan und die Differenzierungsprozesse, die zu Eizellen und Spermien führen, tief greifend. Alle weiblichen Keimzellen treten in frühen Jahren, häufig vor der Geburt, in die Prophase der ersten meiotischen Teilung ein, werden jedoch alle als Oozyten später in der Prophase (Dictyatzustand) bis zum Eisprung nach der Pubertät gehemmt. Folglich weist die Frau von frühen Jahren an einen Oozytenbestand auf, von welchem bis zum Verbrauch des Bestands bezogen wird. Die Meiose ist bei Frauen erst nach der Befruchtung beendet und führt zu nur einer Eizelle und zwei abgehenden Polarkörperchen pro Keimzelle. Im Gegensatz dazu treten nur einige der männlichen Keimzellen von der Pubertät an in die Meiose ein und lassen während des gesamten Lebens zurück eine Stammpopulation an Keimzellen. Nach dem Initiieren verläuft die Meiose in der männlichen Zelle ohne eine erhebliche Verzögerung und erzeugt 4 Spermien.
Es ist nur wenig über die Mechanismen bekannt, die die Meiose bei Mann und Frau steuern. Im Oozyten weisen jüngste Studien darauf hin, dass Follikelpurine, wie Hypoxanthin und Adenosin, für die Meiosehemmung verantwortlich sein könnten (Downs, S.M., et al. (1985) in Dev. Biol. 82: 454-458; Eppig, J.J., et al. (1986) in Dev. Biol. 119: 313-321; und Downs, S.M., et al. (1993) in Mol. Reprod. Dev. 35: 82-94). Diese Purinbasen wurden immer dann in Follikelfluid gefunden, wenn die durch Purinbasen induzierte Hemmung umkehrbar war. Dies wurde durch Versuche bereitgestellt, in welchen Oozyten der Maus und des Menschen für eine Dauer von 24 Stunden mit Hypoxanthin in Meiosehemmung gehalten wurden, gefolgt von einer 16-30stündigen Züchtung in hemmstofffreiem Medium (Downs, S.M., et al. (1986) in Gamet Res. 15: 305-316; und Cha, K.Y., et al. (1992) in Reprod. Fertil. Dev. 4: 695-701). Nahezu 100% der gehemmten Oozyten der Maus nahmen die Reifung wieder auf, und darüber hinaus wurden die reifen Oozyten erfolgreich befruchtet und zeigten eine vollständige Vor- und Nachimplantationsentwicklung. Diese Daten unterstützen insgesamt die Vorstellung, dass Purine wie Hypoxanthin und Adenosin bei den Mechanismen, die die Meiosehemmung in vivo steuern, physiologisch bedeutend sind.
Cyclisches Adenosin-5'-monophosphat (hier nachstehend als cAMP bezeichnet) spielt während der Meiose im Oozyten eine Schlüsselrolle als zweiter Botenstoff im Signalübertragungsweg. cAMP wird durch die Wirkung von Adenylatcyclase (hier nachstehend als AC bezeichnet) gebildet. cAMP wird durch die Familie der Phosphodiesteraseenzyme (hier nachstehend als PDE bezeichnet) abgebaut, die inaktive zweite Botenstoffprodukte erzeugent. Hypoxanthin (hier nachstehend als Hx bezeichnet) ist ein Hemmer für cAMP PDE (Eppig, J.J., et al. (1985) in Biol. Reprod. 33: 1041-1049). Als solcher kann Hx die Hydrolyse von Oozyten-cAMP verhindern und dadurch erhöhte Spiegel an cAMP im Oozyten aufrechterhalten. Außer Hypoxanthin sind Wirkstoffe, die stromaufwärts oder stromabwärts von cAMP agieren, in der Lage, die cAMP-Spiegel zu erhöhen. Auf diese Weise führen die Aktivierung von AC mit Forskolin, die Hemmung von PDE mit nicht-selektivem 3-Isobutyl-1-methylxanthin) (hier nachstehend als IBMX bezeichnet) oder die Hemmung der Oozyten-spezifischen Isoform PDE3 mit einem spezifischen PDE3-Hemmer, z.B. Milrinon, durch Bewahren von erhöhten cAMP-Spiegeln in den Oozyten zur Meiosehemmung (Downs, S.M., und Hunzicker-Dunn, M., (1995) in Dev Biol 172: 72-85; und Tsafiri, A., et al. (1996) in Dev Biol 178: 393-402).
Ein PDE3-spezifischer Hemmer wurde als Kontrazeptivum beschrieben (WO98/10765).
In der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 99/61010 ist ein Arzneimittel beschrieben, das eine cAMP-erhöhende Verbindung in derart geringer Dosis umfasst, dass es bei dessen Verwendung zur Behandlung der Unfruchtbarkeit in Säugern zur Meiosereifung ohne Induzieren einer Meiosehemmung führt.
Die Gegenwart einer diffusionsfähigen meioseregulierenden Substanz wurde zuerst in fötalen Gonaden der Maus beschrieben (Byskov, A.G., et al. (1976) in Dev. Biol. 52: 193-200). Eine meioseaktivierende Substanz (MAS) wurde in den Eierstöcken von Mäuseföten sezerniert, in welchen die Meiose voranschritt, und eine meioseverhindernde Substanz (hier nachstehend als MPS bezeichnet) wurde aus den morphologisch differenzierten Hoden mit ruhenden, nicht-meiotischen Keimzellen freigesetzt. Es wurde deshalb nahe gelegt, dass die relativen Konzentrationen von MAS und MPS den Beginn, den Hemmung und die Wiederaufnahme der Meiose in den männlichen und in den weiblichen Keimzellen regulieren (Byskov, A.G., und H∅yer, P.E., (1994) in The Physiology of Reproduction, Knobil, E., und Neill, J.D., (Herausgeber), Raven Press, New York, S. 487-540). Ein neuerer Artikel (Byskov, A.G., et al. (1995) in Nature 374: 559-562) beschreibt die Isolierung von bestimmten Sterolen aus der Eierstockfollikelflüssigkeit, definiert als FF-MAS, und testikulären Bullenhoden, definiert als T-MAS, die die Oozytenmeiose aktivieren. Dies wurde jüngst bestätigt (Gr∅ndahl et al. (1998) in Biol. Reprod. 1998; 58:1297-1302), indem gezeigt wurde, dass neu synthetisiertes FF-MAS die Wiederaufnahme der Meiose in Oozyten der Maus vermitteln kann.
Die kanadische Patentanmeldung Nr. 2,199,663 beschreibt ein Verfahren zum Züchten von unreifen Säugeroozyten für eine Dauer von 5 bis 7 Tagen für das Wachstum und die Entwicklung einer nachfolgenden Entwicklungskompetenz.
Seit dem Austragen der ersten IVF-Schwangerschaft im Jahre 1978 führte dieses Verfahren zu Tausenden von Schwangerschaften und eröffnete einen riesigen neuen Forschungs- und Behandlungsspielraum für unfruchtbare Paare. Dennoch besteht heute immer noch ein erheblicher Bedarf nach verbesserten Behandlungsmodalitäten für Unfruchtbarkeit. Es wird angenommen, dass etwa jedes siebente Paar Probleme mit verminderter Fruchtbarkeit oder Unfruchtbarkeit erfährt.
Die IVF von menschlichen Oozyten ist zur üblicherweise angewandten Behandlung verminderter Fruchtbarkeit bei Frau und Mann geworden. Die standardmäßige IVF-Behandlung schließt eine lange Phase der Hormonstimulation der Patientin, z.B. für eine Dauer von 30 Tagen, ein, die durch Unterdrücken des patienteneigenen follikelstimmulierenden Hormons (hier nachstehend als FSH bezeichnet) und luteinisierenden Hormons (hier nachstehend als LH bezeichnet) durch gona dotropinfreisetzendes Hormon (hier nachstehend als GnRH bezeichnet) initiiert wird, worauf Injektionen von exogenen Gonadotropinen, z.B. FSH und/oder LH, um die Entwicklung von mehreren präovulatorischen Follikeln zu sicherzustellen, sowie die Absaugung der mehreren in vivo gereiften Oozyten unmittelbar vor dem Eisprung folgen. Der abgesaugte Oozyt wird anschließend in vitro befruchtet und typischerweise für eine Dauer von drei Tagen gezüchtet, bevor er im 4-8-zelligen Zustand in die Gebärmutter rückverpflanzt wird. Kontinuierliche Bemühungen fanden statt, um dieses Verfahren zu optimieren und zu vereinfachen. Nichtsdestoweniger kann die Gesamtschwangerschaftsrate mit den gegenwärtigen Behandlungsmodalitäten nicht deutlich über etwa 20% erhöht werden. In einer groß angelegten europäischen Bewertung von IVF-Patientinnen wurde gefunden, dass unmittelbar vor der Befruchtung 7,2 Oozyten von 11,5 abgesaugten Oozyten pro Patientin eine Wiederaufnahme der Meiose erfahren hatten, nur 4,3 Oozyten befruchtet wurden und nur 2,2 Oozyten den 8-zelligen Embryozustand nach der Befruchtung und In-vitro-Züchtung erreichten (ESHRE, Edinburgh 1997).
Aufgrund der recht unvorhersagbaren Qualität der Embryos nach heutigem Stand der Technik muss, nur um eine vernünftige Erfolgschance zu erhalten, mehr als ein Embryo direkt eingepflanzt werden. Deshalb ist es üblich, 2-3 Embryos (bis zu 5 Embryos in einigen Ländern) einzupflanzen, was die sehr große Nebenwirkung von Mehrfachschwangerschaften mit großer Unbequemlichkeit und großem Risiko sowohl für die Patientin als auch die Kinder mit sich bringt. Darüber hinaus wurde geschätzt, dass die erhöhten Gesundheitskosten aufgrund von Mehrfachgeburten (Zwillinge, Drillinge usw.) die gesamten IVF-Kosten übersteigen.
Daher gibt es verschiedene Nachteile mit der gegenwärtigen Behandlung, wobei die vier bemerkenswertesten folgende sind:

1. das Risiko der Eierstocküberstimulierung durch Injizieren von Gonadotropinen, was zu einem möglicherweise tödlichen Zustand führt, der einen Krankenhausaufenthalt erfordert,
2. Mehrfachschwangerschaften (das 50-1000-Fache der normalen Häufigkeit von Zwillingen bzw. Drillingen),
3. die das Vorhandensein von beträchtlichen Patientenanteilen, die das gegenwärtige Verfahren, z.B. aufgrund eines polyzystischen Eierstocksyndroms, nicht tolerieren, und von vielen Diabetikern und
4. ein mögliches längerfristiges Krebsrisiko.

Weiterhin wird von Gewichtszunahme, Blähungen, Übelkeit, Erbrechen, Stimmungsschwankungen und anderen Patientenunbequemlichkeiten zusammen mit der Abneigung des Patienten, sich selbst zu injizieren, als Nachteile berichtet.
Gegenwärtig hat sich die In-vitro-Reifung beim Menschen trotz des erheblichen Interesses und der klinischen Bemühungen als wenig erfolgreich erwiesen.
ZUSAMMENFASSUNG DIESER ERFINDUNG
Jüngst entdeckten wir, dass die spontane Reifung und die MAS-induzierte Reifung verschiedene Signalmechanismen verwenden. Die spontane Reifung verwendet keinen Choleratoxin-empfindlichen Signalmechanismus, im Gegensatz zum MAS-induzierten Signalmechanismus. Dies legt nahe, dass verschiedene Rezeptoren, d.h. G-Protein-gekuppelte Rezeptoren, an den beiden Signalmechanismen beteiligt sind. Des Weiteren beobachteten wir, dass die Kinetik der spontanen und der FF-MAS-induzierten Oozytenreifung völlig unterschiedlich ist. Der Oozyt der Nacktmaus reift spontan innerhalb von 4 Stunden, wohingegen der meiosegehemmte Oozyt der Maus (gehemmt entweder durch massive Cumuluszellumschließung oder durch verschiedene Purine) durch FF-MAS- oder FSH-Aktivierung innerhalb von 16-20 Stunden reift.
Wir beobachteten auch. dass FF-MAS in Cumulus-umschlossenen Oozyten des Menschen nicht nur die kern- sondern auch die zytoplasmische Reifung verbessert (Gr∅ndahl et al., 1999 Alpha Abstract. Kopenhagen).
Obwohl die Verwendung von FF-MAS die Fruchtbarkeitsrate verglichen mit den gegenwärtig angewandten Verfahren verbessert, ist es immer noch erwünscht, diese Rate noch weiter zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung der Unfruchtbarkeitsbehandlung durch die Vermeidung dessen, dass eine spontane Reifung in vitro stattfindet und eine aktive Induktion der Reifung bevorzugt wird.
Dies wird durch Verfahren erzielt, durch welche die Oozytenreifung blockiert wird. Anschließend wird diese Meioseblockierung aktiv umgekehrt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DIESER ERFINDUNG
Eines der hier erfundenen und beanspruchten Verfahren wird an einem Oozyten durchgeführt, der von einer Frau, z.B. einer menschlichen Patientin oder einer menschlichen Spenderin entfernt oder entnommen wurde. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

1) Unterziehen eines aus einer Frau entfernten Oozyten Bedingungen, die eine Oozytenhemmung (hier nachstehend als der Hemmschritt bezeichnet) verursachen, durch Blockieren der Oozytenreifung durch Züchten von Cumulusumschlossenen Oozyten allein oder zusammen in gemeinsamer Kultur mit Cumuluszellen, Theca-Zellen, Granulosa-Zellen, somatischen Zellen oder in konditionierten Medien mit einer Konzentration an Auto- und Paracrin-Faktoren, die die vorstehend aufgezählten Zellen in Kultur herstellen können, oder durch Zugabe eines beliebigen chemischen Meiosehemmers zu dem Medium, z.B. von Purinen, wobei die Zeitdauer, in welcher die Bedingungen, die bewirken, dass der Oozyt eine Meiosehemmung beibehält, etwa 1 Stunde beträgt,
2) Unterziehen des Oozyten Bedingungen, in welchen der gehemmte Zustand umgekehrt wird (hier nachstehend als der Umkehrschritt bezeichnet) durch die Zugabe von MAS, wobei die Zeitdauer, in welcher der Oozyt den Bedingungen unterzogen wird, in welchen der gehemmte Zustand umgekehrt wird, etwa 1 bis etwa 48 Stunden, vorzugsweise etwa 4 bis etwa 36 Stunden beträgt, und
3) Befruchten des Oozyten (hier nachstehend als der Befruchtungsschritt bezeichnet), mit der Maßgabe, dass von dem Moment an, in dem der Oozyt aus der Patientin oder Spenderin entfernt wird, und in den folgenden 16 Stunden, vorzugsweise den folgenden 8 Stunden, stärker bevorzugt den folgenden 4 Stunden, noch stärker bevorzugt den folgenden 2 Stunden und noch stärker bevorzugt in der folgenden Stunde, keine oder im Wesentlichen keine spontane Reifung stattfindet.

Alternativ dazu wird die Maßgabe in dem vorstehenden Verfahren wie folgt formuliert: „mit der Maßgabe, dass von dem Moment an, in dem der Oozyt aus der Patientin oder Spenderin entfernt wird, und in den folgenden 16 Stunden, vorzugsweise den folgenden 8 Stunden, besonders bevorzugt den folgenden 4 Stunden, keine oder im Wesentlichen keine Keimbläschenspaltung auftritt, bevor die Wiederaufnahme der Meiose aktiv induziert wird".
Vor dem Durchführen des vorstehenden Verfahrens wird mindestens ein Oozyt aus einer Frau, z.B. einer Patientin oder Spenderin, entfernt. Diese Entfernung kann in der bekannten Weise, z.B. wie von Itskovitz-Eldor & Thaler (In Reproductive, Endocrinology, Surgery and Technology Kapitel 107 S.1991-2030, Herausgeber: Adashi, Rock und Rosenwaks, 1995, Lippencott-Raven Verlag) beschrieben, durchgeführt werden. Gewöhnlich werden 5-15 Oozyten entfernt. Alle der entfernten Oozyten oder nur einige davon können dem Verfahren dieser Erfindung unterzogen werden.
Die für diese Erfindung verwendeten Oozyten sollten ihre Wachstumsphase vollendet haben, in welcher sie die vollständige Kompetenz zum Wiederaufnehmen der Meiosereifung erlangen. Die Vollendung der Wachstumsphase findet während den follikulären Dynamiken statt. Vorzugsweise weisen die Follikel einen Durchmesser von mindestens etwa 5 mm auf, und vorzugsweise weisen die Follikel einen Durchmesser von nicht mehr als etwa 10 mm auf.
Die Patientin ist eine Frau, für welche entschieden wurde, dass eine IVF durchgeführt wird. Alternativ dazu kann eine Eispenderin verwendet werden.
Der Hemmschritt
Nach der Entfernung eines Oozyten aus dem meiosehemmenden Milieu, einem Follikel einer Patientin oder Spenderin wird der Oozyt Bedingungen, die verursachen, dass der Oozyt eine Meiosehemmung beibehält oder, mit anderen Worten, Bedingungen, durch welche die spontane Reifung des Oozyten vermieden wird, d.h. dem Hemmschritt, unterzogen. Die Bedingung, die die Hemmung des Oozyten verursacht, kann auf jede beliebige bekannte Weise erhalten werden. Zum Beispiel kann diese meiosehemmende Bedingung durch Blockieren der Oozytenreifung mit einem beliebigen Verfahren, z.B. durch Züchten von Cumulusumschlossenen Oozyten allein oder zusammen in gemeinsamer Kultur mit Cumuluszellen, Theca-Zellen, Granulosazellen, somatischen Zellen, oder in konditionierten Medien mit einer Konzentration an Auto- und Paracrin-Faktoren, die die vorstehend aufgelisteten Zellen in Kultur herstellen können, oder durch Zugabe eines beliebigen chemischen Meiosehemmers zu dem Medium, z.B. von Purinen, erhalten werden.
Der Meiosezustand der Oozyten kann durch das Fortschreiten der Kernreifung, z.B. der Gegenwart oder Abwesenheit einer intakten Kernmembran, beobachtet und verfolgt werden. Die unreifen (meiosegehemmten) Oozyten zeigen ein kugelförmiges Keimbläschen (hier nachstehend als GV bezeichnet), das durch Wieder aufnahme der Meiose eine Membranspaltung (Keimbläschenspaltung (hier nachstehend als GVB bezeichnet)) erfährt, die durch lichtmikroskopische Untersuchungen der lebenden Oozyten unter Verwendung eines Umkehrmikroskops mit Nomarksi- oder Hoffamann-Optiken erkannt werden kann.
Die Zeitdauer, in welcher die Bedingungen, die verursachen, dass der Oozyt die Meiosehemmung bewahrt, beträgt etwa 1 Stunde und vorzugsweise bis etwa 48 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 8 Stunden und etwa 22 Stunden.
Während der Oozyt Bedingungen unterzogen wurde, die diese Meiosehemmung (auch bezeichnet als Oozytenhemmung) verursachen, kann es erwünscht sein, den Oozyten für eine Zeitdauer zu züchten. Günstigerweise beträgt die Zeitdauer für die Züchtung nicht mehr als etwa 44 Stunden, vorzugsweise liegt sie im Bereich von etwa 4 Stunden bis etwa 36 Stunden. Vorzugsweise wird der Oozyt in einem Medium wie TCM-199 oder einer einfachen ausgewogenen Earle-Salzlösung gezüchtet, siehe Bavister oder Gardner. Die Lagerung wird vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 36°C und etwa 39°C, vorzugsweise im Bereich von etwa 37°C und etwa 37,5°C durchgeführt.
Die Zeitdauer, ab wann der Oozyt Bedingungen unterzogen wird, die verursachen, dass er die Meiosehemmung beibehält, und bis der Oozyt Bedingungen unterzogen wird, in welcher der gehemmte Zustand umgekehrt wird, beträgt weniger als etwa 24 Stunden, vorzugsweise etwa 1 Stunde bis etwa 4 Stunden.
Umkehrschritt
Während der Oozyt Bedingungen unterzogen wird, die die Meiosehemmung verursachen, wird der Oozyt Bedingungen unterzogen, in welchen der gehemmte Zustand oder mit anderen Worten die Meioseblockierung umgekehrt wird. Daher kann an einem Schritt, an welchem der Hemmschritt umgekehrt wird, der Bestandteil, der im vorhergehenden Schritt die Hemmung verursacht, immer noch vorliegen. Vorzugsweise wird der gehemmte Zustand durch die Zugabe von einer oder mehreren meioseaktivierenden Substanzen (hier nachstehend als MAS bezeichnet) oder durch eine Medienzusammensetzung, die dafür sorgt, dass die gezüchteten Zellen eine Wiederaufnahme der Meiose vermittelnde Substanzen erzeugen oder sezernieren umgekehrt.
Es ist aus WO 96/00235 bekannt, dass bestimmte Sterolderivate zur Regulierung der Meiose verwendet werden können. Ein Beispiel für ein derartiges Sterol ist 4,4-Dimethyl-5α-cholesta-8,14,24-trien-3β-ol (hier nachstehend als FF-MAS bezeichnet).
Hier bezeichnet der Begriff MAS Verbindungen, die die Meiose von Oozyten vermitteln. Spezieller ist MAS eine Verbindung, die in dem im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Test eine prozentuale Keimbläschenspaltung (hier nachstehend als GVB bezeichnet) aufweist, die deutlich höher als die Kontrolle ist. Eine bevorzugte MAS ist eine Verbindung mit einem prozentualen GVB von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 80%.
Beispiele für MAS sind in WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 und 98/55498, insbesondere in Anspruch 1 davon, erwähnt.
In WO 95/000265 wurden einige mögliche MAS bei unreifen weiblichen Mäusen getestet. 48 Stunden vor dem Test wurden die Tiere durch Cervixentfernung getötet, ihnen wurde eine einzelne Injektion an menopausalem Humangonadotropin, enthaltend 20 IU FSH und 20 IU LH, verabreicht. Die Eierstöcke wurden entfernt, in ein Hypoxanthinmedium gegeben und von Fremdgewebe befreit. Dann wurden die Oozyten aus den Follikeln punktiert, von Cumuluszellen befreit und in einem ein meioseregulierendes Derivat enthaltenden Medium gezüchtet.
Die Zeitdauer, in welcher der Oozyt Bedingungen unterzogen wird, in welchen der gehemmte Zustand umgekehrt wird, beträgt etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, vorzugsweise etwa 4 Stunden bis etwa 36 Stunden.
Befruchtung
Nachdem der Oozyt Bedingungen unterzogen wurde, in welchen der gehemmte Zustand umgekehrt wird, wird der Oozyt befruchtet. Die Befruchtung wird in einer an sich bekannten Weise entweder durch eine standardmäßige In-vitro-Befruchtung (IVF) oder durch intrazytoplasmische Spermainjektion (ICSI), z.B. wie in einem Überblicksartikel von Davis & Rosenwaks (in Reproductive Endocrinology, Surgery and Technology, Kapitel 124, S. 2319-2334, Herausgeber: Adashi, Rock und Rosenwaks, 1995, Lippencott-Raven Verlag) beschrieben, durchgeführt.
Nach dem Befruchten des Oozyten lässt man den Zygoten für eine Dauer von wenigen Tagen sich in der Kultur entwickeln, wonach er in die Gebärmutter der Patientin überführt oder kryokonserviert wird. Vorzugsweise wird dies in einer an sich bekannten Weise durchgeführt.
Die meisten der Schritte in der vorstehenden Behandlung werden in einer an sich bekannten Weise durchgeführt, und die übrigen Schritte werden in einer an sich bekannten Weise durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

(a) Entfernen eines Oozyten von einer Patientin oder Spenderin,
(b) Unterziehen des Oozyten eine Meiosehemmung verursachenden Bedingungen,
(c) Unterziehen des Oozyten Bedingungen, in welchen der gehemmte Zustand umgekehrt wird,
(d) Befruchten des Oozyten, und Entwickelnlassen des Zygoten vor der Überführung oder Kryokonservierung.

Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht als Beschränkung des Schutzumfangs angesehen werden sollen. Die in der vorstehenden Beschreibung und in den folgenden Beispielen offenbarten Merkmale können in beliebiger Kombination davon Material zum Verwirklichen der Erfindung in unterschiedlichen Formen davon sein.
Beispiel 1
Verfahren, das zum Auswählen einer MAS verwendet wird Oozyten wurden von unreifen weiblichen Mäusen (C57B1/6J x DBA/2J F1, Bomholtgaard, Dänemark) mit einem Gewicht von 13-16 Gramm, die unter kontrollierter Temperatur (20-22°C), Licht (eingeschaltet von 06.00-18.00) und relativer Feuchtigkeit (50-70%) gehalten wurden, erhalten. Die Mäuse erhielten eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml Gonadotropinen (Gonal-F, Serono), enthaltend 20 IU FSH, und 48 Stunden später wurden die Tiere durch Cervixentfernung getötet. Die Eierstöcke wurden heraus seziert und die Oozyten durch manuellen Aufbruch der Follikel unter Verwendung eines Paars von Nadeln mit 27 Gauge in Hx-Medium (siehe nachstehend) unter einem Stereomikroskop isoliert. Kugelförmige Oozyten, die ein intaktes Keimbläschen (hier nachstehend als GV bezeichnet) zeigten, wurden in Cumulus-umschlossene Oozyten (hier nachstehend als CEO bezeichnet) und nackte Oozyten (hier nachstehend als NO bezeichnet) aufgeteilt und in α-Minimal-Essenzialmedium (α-MEM ohne Ribonukleoside, Gibco BRL, Kat.-Nr. 2261), ergänzt mit 3 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA, Sigma, Kat.-Nr. A-7030), 5 mg/ml Humanserumalbumin (HSA, State Serum Institute, Dänemark), 0,23 mM Pyruvat (Sigma, Kat.-Nr. S-8636), 2 mM Glutamin (Flow, Kat.-Nr. 16-801), 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Flow, Kat.-Nr. 16-700) gegeben. Dieses Medium wurde mit 3 mM Hypoxanthin (Sigma, Kat.-Nr. H-9377) ergänzt und als Hx-Medium bezeichnet.
Die Oozyten wurden dreimal in Hx-Medium gespült, und Oozyten mit einheitlicher Größe wurden in Gruppen von CEO und NO aufgeteilt. CEO und NO wurden in 4-Mulden-Multischalen (Nunclon, Dänemark) gezüchtet, wobei jede Mulde 0,4 ml Hx-Medium und die zu testende Verbindung in einer Konzentration von 10 μM enthielt. Eine Kontrollmulde (d.h. 35-45 Oozyten, gezüchtet in identischem Medium ohne Zugabe von Testverbindung) wurde immer gleichzeitig mit 3 Testmulden (35-45 Oozyten pro Mulde, ergänzt mit Testverbindung) gezüchtet.
Die Oozyten wurden in einer befeuchteten Atmosphäre aus 5% CO₂ an Luft für eine Dauer von 24 Stunden bei 37°C gezüchtet. Am Ende der Züchtungsdauer wurde die Anzahl der Oozyten mit GV, GVB bzw. Polarkörperchen (hier nachstehend als PB bezeichnet) unter Verwendung eines Stereomikroskops (Wildt, Leica MZ 12) gezählt. Der Prozentanteil an GVB, definiert als Prozentanteil Oozyten, die sich einer GVB unterzogen, pro Gesamtzahl an Oozyten in dieser Mulde, wurde berechnet als: % GVB = ((Anzahl an GVB + Anzahl an PB)/Gesamtzahl an Oozyten) × 100.
Beispiel 2
Verfahren, das zum Isolieren und Züchten von Oozyten des Menschen verwendet wird Die Patientin ist eine Frau, für welche es entschieden wurde, dass eine IVF oder ICSI durchgeführt wird. Die Patientin wird nach einer gynäkologischen Untersuchung der folgenden Hormonvorbehandlung unterzogen: Herabregulierung mit gonadotropinfreisetzenden Hormonen, Stimulierung des Follikelwachstums mit exogenem rekombinantem oder Human-FSH auf Harnbasis und Oozytenendreifung, induziert durch Human-Chorion-Gonadotropin (hier nachstehend als hCG bezeichnet), das LH-Aktivität zeigt. Die Oozyten werden unter Beruhigung durch Ultraschall-geleitete transvaginale Follikelabsaugung von Follikeln mit mittlerer bis großer Größe (Follikel mit 12-20 mm im Durchmesser) abgesaugt.
Nach der Entfernung eines Oozyten aus dem meiosehemmenden Milieu eines Follikels einer Patientin wird der Oozyt Bedingungen unterzogen, die verursachen, dass der Oozyt die Meiosehemmung beibehält oder, mit anderen Worten, die die spontane Reifung des Oozyten vermeiden. Diese meiosehemmende Bedingung wird durch Blockieren der Oozytenreifung durch Züchten von Cumulusumschlossenen Oozyten zusammen in gemeinsamer Kultur mit Cumuluszellen/Granulosazellen oder durch Zugabe des physiologischen PDE-Hemmers Hypoxanthin zu dem Medium, z.B. in einer Konzentration von 3 mM, erhalten.
Nach einer Dauer von 1 Stunde im Granulosazellen und Hypoxanthin einschließenden Medium TCM-199 zum Gewährleisten der Meiosehemmung wurden 20 μM FF-MAS dem Medium zugesetzt, was dann für eine Dauer von 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37,4°C zum Überwinden der Meiosehemmung gezüchtet wurde.
Beispiel 3
Verfahren, das zum Isolieren und Züchten von unreifen Oozyten des Menschen verwendet wird
Die Patientin ist eine Frau, für welche es entschieden wurde, dass eine IVF oder ICSI durchgeführt wird. Die Patientin wird nach einer gynäkologischen Untersuchung der folgenden Hormonvorbehandlung unterzogen: Am Tag 6 im Zyklus (Tag 0 ist der erste Tag der Menstruation) wird eine kurze Stimulation von kleinen Follikeln mit einer 3-tägigen Injektion von 225 IE exogenem rekombinantem oder Human-FSH auf Harnbasis induziert. Die unreifen Oozyten werden unter Beruhigung durch Ultraschall-geleitete transvaginale Follikelabsaugung von Fol likeln mit kleiner bis mittlerer Größe mit einem Durchmesser von 6-12 mm abgesaugt. Nach der Entfernung eines Oozyten aus dem meiosehemmenden Milieu eines Follikels einer Patientin wird der Oozyt Bedingungen unterzogen, die verursachen, dass der Oozyt die Meiosehemmung beibehält oder, mit anderen Worten, die die spontane Reifung des Oozyten vermeiden. Die meiosehemmende Bedingung wird durch Blockieren der Oozytenreifung unter Züchtung von Cumulusumschlossenen Oozyten zusammen in gemeinsamer Kultur mit Cumuluszellen/Granulosazellen oder durch Zugabe des physiologischen PDE-Hemmers Hypoxanthin zu dem Medium, z.B. in einer Konzentration von 3 mM, erhalten.
Nach der Dauer von 1 Stunde im Granulosazellen und Hypoxanthin einschließenden Medium TCM-199 zum Gewährleisten der Meiosehemmung wurden 20 μM FF-MAS dem Medium zugesetzt, was dann für eine Dauer von 36 Stunden zum Überwinden der Meiosehemmung gezüchtet wurde.
Beispiel 4
Ziel: Optimieren der Kulturbedingungen für Säugeroozyten durch Hemmen der spontanen Reifung für eine Dauer von 4 Stunden vor dem Initiieren der Oozytenreifung durch Zugabe einer angemessenen Konzentration an FF-MAS.
Oozyten wurden von unreifen (21-24 Tage alten) weiblichen Mäusen (C57B1/6J x DBA 1J F1-Hybride, M&B, Dänemark) mit einem Gewicht von 13-16 Gramm, die unter kontrollierter Beleuchtung und Temperatur gehalten wurden, erhalten. Die Mäuse erhielten eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml Gonadotropinen (Gonal-F, Serono), enthaltend 20 IU FSH, und 48 Stunden später wurden die Tiere durch Cervixentfernung getötet. Die Eierstöcke wurden heraus seziert und die Oozyten in Hx-Medium (siehe nachstehend) durch manuelles Aufbrechen der Follikel unter Verwendung eines Paars Nadeln mit 27 Gauge unter einem Stereomikroskop isoliert. Kugelförmige Oozyten, die ein intaktes Keimbläschen (GV) zeigten, wurden ausgewählt und in α-Minimal-Essenzialmedium (α-MEM ohne Ribonukleoside, Gibco BRL, Kat.-Nr. 22561), ergänzt mit 3 mM Hypoxanthin (Sigma Kat.-Nr. H-9377), 8 mg/ml Humanserumalbumin (HSA, State Serum Institute, Dänemark), 0,23 mM Pyruvat (Sigma, Kat.-Nr. S-8636), 2 mM Glutamin (Flow, Kat.-Nr. 16-801), 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Flow, Kat.-Nr. 16-700), gegeben. Dieses Medium wurde als Hx-Medium bezeichnet. Genau das gleiche Medium ohne Hx wurde als Hx-freies Medium bezeichnet.
So wurden die Oozyten in 4-Mulden-Multischalen (Nunclon, Dänemark) gezüchtet, wobei jede Mulde 0,4 ml Hx-Medium oder Medium ohne Hx (zum Gewähren der spontanen Reifung) und 35-45 Oozyten enthielt.
Verschiedene Behandlungsgruppen:

1. Kontrollen: Keine Hemmung, Kein FF-MAS
2. MAS: Keine Hemmung und 10 μM FF-MAS
3. Hemmung und dann spontane Reifung: Hx-Medium für eine Dauer von 4 Stunden, dann Überführung in Hx-freies Medium
4. Hemmung und FF-MAS-Induktion: Hx-Medium für eine Dauer von 4 Stunden und Zugabe von FF-MAS zu Hx-Medium
5. Hemmung und Entfernung der Hemmung und dann anschließend FF-MAS-Induktion: Hx-Medium für eine Dauer von 4 Stunden, Spülen, Überführen in Hx-freies Medium und Zugabe von FF-MA In-vitro-Befruchtung nach 16-20-stündiger Reifung.

Endpunkte: Befruchtungsrate und In-vitro-Embryoentwicklung. Ergebnisse
Eine von 5 Behandlungen war in Bezug auf die Oozytenqualität, bewertet als Befruchtungsrate und embryonische Entwicklungskapazität, höherwertiger als die anderen.
Die 4. Behandlungsmodalität, d.h. Hemmung und FF-MAS-Induktion gegenüber den anderen Behandlungsalternativen war deutlich höherwertig.

Claims

Verfahren, umfassend a) Ex-vivo-Aussetzen eines Oozyten des Menschen an Bedingungen, die die Oozytenhemmung durch Blockieren der Oozytenreifung verursachen, durch Züchten von Cumulus-umschlossenen Oozyten allein oder zusammen in gemeinsamer Kultur mit Cumuluszellen, Theca-Zellen, Granulosa-Zellen, somatischen Zellen oder in konditionierten Medien mit Auto- und Paracrin-Faktoren, die die vorstehend aufgezählten Zellen in Kultur herstellen können, oder durch Züchten in Gegenwart eines beliebigen chemischen Meiosehemmers, wobei die Zeitdauer, in welcher die Bedingungen, die bewirken, dass der Oozyt eine Meiosehemmung beibehält, etwa 1 Stunde bis etwa 43 Stunden beträgt, und b) Aussetzen des Oozyten an Bedingungen, in welchen der gehemmte Zustand umgekehrt wird, durch die Zugabe von MAS, wobei die Zeitdauer, in welcher der Oozyt den Bedingungen unterzogen wird, in welchen der gehemmte Zustand umgekeht wird, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden beträgt, mit der Maßgabe, dass von dem Moment an, in dem der Oozyt aus der Patientin oder Spenderin entfernt wird, und in der folgenden Stunde keine als frühe GVB visualisierte spontane Reifung stattfindet. bevor die Wiederaufnahme der Meiose durch MAS aktiv induziert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei von dem Moment an, in welchem der Oozyt aus der Patientin oder Spenderin entfernt wird, und in den folgenden 2 Stunden keine als frühe GVB visualisierte spontane Reifung stattfindet, bevor die Wiederaufnahme der Meiose durch MAS aktiv induziert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei von dem Moment an, in welchem der Oozyt aus der Patientin oder Spenderin entfernt wird, und in den folgenden 4 Stunden keine als frühe GVB visualisierte spontane Reifung stattfindet, bevor die Wiederaufnahme der Meiose durch MAS aktiv induziert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei von dem Moment an, in welchem der Oozyt aus der Patientin oder Spenderin entfernt wird, und in den folgenden 8 Stunden keine als frühe GVB visualisierte spontane Reifung stattfindet, bevor die Wiederaufnahme der Meiose durch MAS aktiv induziert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei von dem Moment an, in welchem der Oozyt aus der Patientin oder Spenderin entfernt wird, und in den folgenden 16 Stunden keine als frühe GVB visualisierte spontane Reifung stattfindet, bevor die Wiederaufnahme der Meiose durch MAS aktiv induziert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zeitdauer, in welcher die Bedingungen, die verursachen, dass der Oozyt die Meiosehemmung beibehält, etwa 8 Stunden bis etwa 22 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zeitdauer, in welcher der Oozyt Bedingungen unterzogen wird, in welchen der gehemmte Zustand umgekehrt wird, etwa 4 Stunden bis etwa 36 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der chemische Meiosehemmer ein Purin ist.