JP2005518823A - 未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟 - Google Patents

Abstract

本発明は、未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法を提供する。一つの態様として、本発明は：（ａ）女性ヒト被験体において内因性黄体形成ホルモンレベルの増加を誘導する段階（該被験体は、該誘導段階の前に卵巣刺激プロトコルを受けていない）；（ｂ）該被験体から未成熟卵母細胞を採取する段階；および（ｃ）該卵母細胞を成熟するまで培養する段階を含んでなる、未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法を提供する。

Description

関連出願へのクロスリファレンス
本願は、引用することにより本明細書に組み込まれる、２００２年３月８日に出願された、米国仮特許出願第６０／３６２，３９５号の利益を請求する。

本発明は補助生殖技術（ＡＲＴ）の分野に、特に、未成熟ヒト卵母細胞をそれらが受精しそして生存可能な胚を形成することができる中期−ＩＩ期まで成熟するように培養する方法に関する。

体外受精（ＩＶＦ）による最初の成功したヒト妊娠が１９７８年に行われて以来、ＡＲＴは不妊症の問題を克服するために何百万人もの女性に役立っている。

通常、女性の生殖周期の卵胞期の間に、単一の卵胞のみが排卵前の段階まで成長し、そして起こり得る受精のためにその卵母細胞を放出する。しかしながら、現在のＩＶＦ処置は、多数の卵母細胞が採取されることを必要とする。それ故、通常、女性はゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨａ）で約２もしくは３週間前処置される。下垂体抑制が得られた後、多数の卵胞の発育を誘導するためにヒト閉経期ゴナドトロピン（ＨＭＧ）もしくは精製された卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が投与される。いったん２個の主要な（ｌｅａｄｉｎｇ）卵胞が少なくとも約１８〜２０ｍｍの直径に達すると、典型的には、最終卵母細胞成熟を誘発するために患者に５，０００〜１０，０００ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）を与える。約３６時間後に、多数の卵母細胞（平均して１０個）が採取される。

次に、採取した卵母細胞を精子で受精させる。ヒト不妊症の多くの場合において、受精は細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）により行われる。成功するＩＶＦは、一般に、受精を試みる前に卵母細胞が中期−ＩＩ（Ｍ−ＩＩ）期に達していることを必要とする。Ｍ−ＩＩ卵母細胞は、精子を受け入れそして受精する状態にある。中期−ＩＩは、細胞質からの１個の極体の排除を特徴とし、そして典型的には顕微鏡下で視覚的識別により検出される。

採取した卵母細胞は、卵母細胞の最終成熟および発育を支えそして促進する卵丘細胞に取り囲まれたままである。卵丘細胞はＩＣＳＩを妨害し、そして卵母細胞の顕微鏡観察を分かりにくくする。従って、ＩＣＳＩの前に、卵母細胞成熟のレベルの決定を可能にするために卵母細胞から卵丘細胞を剥離することが必要である。これは、一般に、卵丘細胞の酵素的および機械的剥離により成し遂げられる。

残念なことに、卵母細胞が卵巣刺激において採取される場合にそれらの全てがＭ−ＩＩ期まで成熟しているわけではない。卵胞非同期性の結果として、一般に、卵母細胞の少なくとも１０〜１５％は未成熟のままであり、そして採取の時点で、卵核胞（ＧＶ）もしくは中期−Ｉ（Ｍ−Ｉ）期である。卵丘細胞を剥離したこれらの未成熟卵母細胞は、大部分のＩＶＦ診療所で廃棄される。

現在廃棄されているこれらの未成熟ＧＶおよびＭ−Ｉ期卵母細胞をもし体外で成熟させ、そして次に成功して受精させることができるなら望ましい。さらに、刺激していない卵巣から未成熟卵母細胞を採取しそしてそれらを体外成熟（ＩＶＭ）によりＭ−ＩＩ期まで成熟させ、それによりＧｎＲＨａでの女性の処置およびゴナドトロピンでの卵巣の刺激の全処方計画を回避できることは望ましい。卵巣刺激のこれらの方法は、多大の費用で、頻繁な血液採取および超音波モニタリングを必要とする。さらに、現在のＩＶＦ処置は、かなりの不快感をもたらし、そしてある場合には、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）および／もしくは死さえもたらす。また、繰り返される卵巣刺激の長期効果は、卵巣癌、子宮内膜癌および乳癌の危険を増大し得るという不安もある。

従って、卵巣刺激により成熟卵母細胞を採取することよりむしろ、卵母細胞の体外成熟に依存するＩＶＦ技術を開発することにかなりの関心がある。しかし、体外で成熟した卵丘剥離卵母細胞からほんのわずかな生児出生しか得られていない（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。従って、明らかに、体外で成熟した卵丘剥離未成熟卵母細胞の成熟および発育能力を向上する機会がある。

未成熟卵母細胞の回収、その後のこれらの未成熟卵母細胞のＩＶＭは、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）関連不妊症にかかっている女性の潜在的に有用な処置である。ＰＣＯＳは、妊娠可能年齢の女性における最も一般的な生殖障害の一つである。それは、臨床的には無排卵およびアンドロゲン過剰症を特徴とし、そして骨盤超音波検査では卵巣内に多数の卵胞（ａｎｔｒａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）を示す、不均一所見を有する（非特許文献４）。正常な卵巣と比較してこの群の女性ではＯＨＳＳの有意に高い危険性がある（非特許文献５）。ＰＣＯＳにかかっている女性から取り出した後にＩＶＭを行う未成熟卵母細胞からの最初の妊娠および生児出生が報告されているが、卵母細胞成熟率は比較的低いので成功率は依然として低い。

ＩＶＭ培地および方法を開発するいくつかの試みは、卵胞内の状態を模倣しようとして、ヒト卵胞液の使用を伴っている。疾病の伝達の危険、アレルギー反応などを考慮して、ＩＶＭ技術における生体液の使用は大部分の国々において禁止されている。その代わりに、成分の全ての化学組成が既知である「化学的に定義された培地」の使用が好ましい。

卵胞から取り出した哺乳類の未成熟卵母細胞は、単純培地（ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）において培養した場合にホルモン刺激なしに自発的に減数分裂を再開する（非特許文献６）。しかしながら、体外での卵母細胞成熟は、培養条件により大いに影響を受ける。

ヒトＩＶＭでの大部分の試みは、未成熟卵母細胞の成熟培地として組織培養培地１９９（ＴＣＭ−１９９）を使用している（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＴＣＭ−１９９は多数の成分を含有する複雑な培地であり、そして生殖細胞ではなく体細胞の体外培養用に考案された。特に、ＴＣＭ−１９９はいかなる増殖因子も含有しない。ＴＣＭ−１９９は、最初にヒツジ卵母細胞ＩＶＭに使用され（非特許文献１３）、そしてそれ以来ウシ卵母細胞ＩＶＭに日常的に使用されている（非特許文献１４）。

ヒト卵母細胞を成熟させるために異なる培養培地が使用されているが（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献７；非特許文献１７；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）、これらの培養培地の使用から卵母細胞成熟、受精および胚発育に明らかな利益はないことが最近示されている。

従って、ヒト卵母細胞を体外で成熟させる方法の必要性が依然としてある。
Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊａｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｅｄｉｒｉｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ ＭａｃＤｏｕｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｉｎｃｕｓ ＆ Ｅｎａｍａｎｎ，１９３５ Ｔｒｏｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｃｈｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ａ Ｃｈｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ｂ Ｃｈｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｃｈｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍｏｏｒ ＆ Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，１９７７ Ｂｒａｃｋｅｔｔ ＆ Ｚｕｅｌｋｅ，１９９３ Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，１９７５ Ｃｈａ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｃｈａ ＆ Ｃｈｉａｎ，１９９８

［発明の要約］
本発明は、未成熟ヒト卵母細胞を成熟するまで培養するのに有用な体外成熟方法を提供する。

広義の態様として、本発明は、
（ａ）女性ヒト被験体において内因性黄体形成ホルモンレベルの増加を誘導する段階（該被験体は、該誘導段階の前に卵巣刺激プロトコルを受けていない）；
（ｂ）該被験体から未成熟卵母細胞を採取する段階；および
（ｃ）該卵母細胞を成熟するまで培養する段階
を含んでなる未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法を提供する。

好ましくは、段階（ａ）の前に、被験体はゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、ヒト閉経期ゴナドトロピン、ＨＣＧ、もしくは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）で処置されていない。

一つの態様として、段階（ａ）は、被験体にＨＣＧもしくは黄体形成ホルモン（ＬＨ）、または両方を投与することを含んでなる。好ましい態様として、ＨＣＧは約５０００〜約２０，０００ＩＵ、より好ましくは約１０，０００ＩＵの量で投与される。

未成熟ヒト卵母細胞は、好ましくは、Ｍ−Ｉ期もしくはＧＶ期卵母細胞である。卵母細胞は、好ましくは、Ｍ−ＩＩに達するまで培養される。

一つの態様として、未成熟ヒト卵母細胞は卵丘細胞を本質的に含まず、そして少なくとも一つの無機塩；
必須アミノ酸もしくはその供給源；
エネルギー源；および
少なくとも一つの増殖因子
を含んでなる培養培地において培養される。

一つの態様として、増殖因子は繊維芽細胞増殖因子もしくは上皮増殖因子、または両方である。

一つの態様として、培養培地は少なくとも一つのホルモン、例えばインシュリンをさらに含んでなる。好ましい態様として、培養培地は０．５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌのインシュリンを含んでなる。

一つの態様として、培養培地はヒトトランスフェリン、好ましくは５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリンをさらに含んでなる。

一つの態様として、培養培地は０．０００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌの繊維芽細胞増殖因子を含んでなる。

一つの態様として、培養培地は０．０００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの上皮増殖因子を含んでなる。

一つの態様として、培養培地は一つもしくはそれ以上のビタミン、好ましくは、ビオチン、Ｄ−Ｃａパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキサル・ＨＣｌ、リボフラビン、およびチアミン・ＨＣｌを含んでなる。

培養培地は、ヒドロコルチゾンもしくはセレナイト、または両方をさらに含んでなることができる。

好ましい無機塩には、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３およびＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏが包含される。

好ましいエネルギー源には、Ｄ−グルコースおよびピルビン酸ナトリウム、もしくはＤ−グルコースとピルビン酸ナトリウムの両方が包含される。

一つの態様として、アミノ酸はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含んでなる。

一つの態様として、培養培地は無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表１に記載の他の成分を含んでなり、そして各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分は、表１に特定する量の±５０％（重量／容量）、より好ましくは±１０％（重量／容量）の量で存在する。

別の態様として、卵母細胞は、無傷であるかもしくは少なくとも部分的に無傷である卵丘を有し、そして／または卵母細胞を卵丘細胞の存在下で培養する。

この態様として、卵母細胞は上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ヒトトランスフェリン、インシュリン、セレナイト、およびヒドロコルチゾンの一つもしくはそれ以上を本質的に含まない培養培地において培養することができる。

一つの態様として、卵母細胞を無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分を含んでなる培養培地において培養し、そして各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分は、表２に特定する量の±５０％（重量／容量）、より好ましくは±１０％（重量／容量）の量で存在する。

一つの態様として、培養培地は無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に特定する他の成分から本質的になる。

別の態様として、培養培地は無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に特定する他の成分からなる。

別の態様として、本発明は未成熟ヒト卵母細胞を
少なくとも一つの無機塩；
必須アミノ酸もしくはその供給源；
エネルギー源；および
少なくとも一つの増殖因子
を含んでなる培養培地において培養することを含んでなる、未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法を提供する。

この態様は、未成熟ヒト卵母細胞が卵丘細胞を本質的に含まない場合に特に有用である。

別の態様として、本発明は、未成熟ヒト卵母細胞を無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分を含んでなる培養培地において培養することを含んでなる、未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法を提供する。この態様は、未成熟ヒト卵母細胞を卵丘細胞の存在下で培養する場合に特に有用である。

好ましい態様として、培養培地は無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分から本質的になる。

別の好ましい態様として、培養培地は無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分からなる。

特に好ましい態様として、各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分は、表２に特定する量の±５０％、より好ましくは±１０％（重量／容量）の量で存在する。

別の態様として、表１および２の「他の成分」の欄に記載する成分のいくつかは、培地に存在しなくてもよい。存在しなくてもよい成分には、フェノールレッド、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、およびヒト血清アルブミンが包含されるが、これらに限定されるものではない。これは本明細書において表１もしくは２に言及するところであれば当てはまることができる。

本発明の方法により、本発明によるＩＶＭ培地における成熟の開始後６時間、１２時間、２４時間もしくは４８時間で測定した場合に：
（ａ）Ｍ−ＩＩ期に達する卵母細胞の総数；
（ｂ）受精した卵母細胞の総数；
（ｃ）８細胞期まで発育する胚の総数；および
（ｄ）形成される胚盤胞の総数；
の一つもしくはそれ以上において増加を得ることができる。少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％もしくは５００％の（ａ）〜（ｄ）の一つもしくはそれ以上の増加を都合よく得ることができる。
［発明の詳細な記述］
ＩＶＭの候補者
生存可能な卵母細胞を有する任意の女性ヒト被験体は、ＩＶＭ治療の候補者である。典型的には、被験体は不妊症のなんらかの形態を患っている。例えば、被験体は、例えばＰＣＯＳもしくはＰＣＯＳ様卵巣におけるように、正常な卵母細胞生産を経験することができるが受精への障害を有する。ＩＶＭはまた、子宮内膜症、卵管のいずれかもしくは両方の閉塞などを有する女性不妊症においても有用である。典型的なＰＣＯＳでは、多数の卵胞が、優性卵胞の出現なしに、卵巣において同時に成熟する。被験体の月経周期は、規則的、不規則的であるかもしくは存在しないことができる。ＩＶＭは、ＯＨＳＳにかかりやすいかもしくはそれを患っており、それ故、卵巣刺激プロトコルを含む従来の体外受精技術の適当な候補者ではない女性において特に有用であることができる。

あるいはまた、被験体は、例えば男性因子不妊症の場合におけるように、不妊症を患っていないかもしくは何であれいかなる生殖障害にもかかっていないが、それにもかかわらず体外受精方法が依然として望ましい個体であることができる。
卵巣刺激プロトコルがないこと
従来の体外受精方法と異なり、本発明によるＩＶＭは、必ずしも卵巣刺激プロトコルを含まない。従来のＩＶＦでは、通常、２つの「卵巣刺激プロトコル」、「長期プロトコル」もしくは「短期プロトコル」の一方が用いられる。長期プロトコルには２段階がある。第一段階は、下垂体活性をダウンレギュレーションするために被験体をＧｎＲＨａで２もしくは３週間前処置することを含む。いったん下垂体抑制が得られると、第二段階として、多数の卵胞の発育を誘導するためにＨＭＧもしくはＦＳＨを投与する。短期プロトコルは、卵巣刺激段階のみを含むが、ダウンレギュレーション段階を含まない。

卵巣刺激は、卵母細胞を採取の前にＭ−ＩＩ期まで成熟させるために従来のＩＶＦ技術において必要とされる。卵母細胞を未成熟段階で、すなわち、Ｍ−ＩＩ期に達する前に採取する本発明では、卵巣刺激を用いる必要はない。すなわち、被験体をＧｎＲＨａ、ＨＭＧおよび／もしくはＦＳＨで前処置する必要はない。
黄体形成ホルモン（ＬＨ）の内因性レベルを増加すること
未成熟卵母細胞を取り出す前に、被験体においてＬＨの内因性レベルの増加を誘導する（本明細書において「プライミング」とも記述する）。これは、例えば、被験体に有効量のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）（Ｐｒｏｆａｓｉ Ｓｅｒｏｎｏ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）もしくはＬＨを投与することにより成し遂げることができ、これらのいずれも内因性ＬＨ生産を促す。閉経前の女性の血漿におけるＬＨの基準濃度は、通常、約２〜４ｍＩＵ／ｍｌであり、そして月経中期ピークで２５〜３５ｍＩＵ／ｍｌまでであることができる。「女性ヒト被験体において内因性黄体形成ホルモンレベルの増加を誘導する」という表現は、血漿ＬＨ濃度を基準濃度より上に上げることを意味する。好ましくは、血漿ＬＨ濃度は、基準濃度より上に少なくとも１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、もしくは２０００％増加される。

ＨＣＧもしくはＬＨの投薬量および投与形態は、患者および状況により異なることができ、そして当業者により決定されることができる。他の投与形態を用いることができるが、皮下注射が好ましい投与形態である。約５０００〜約２０，０００ＩＵのＨＣＧの単回注射は一般に十分であり、約１０，０００ＩＵのＨＣＧの単回投与が好ましい。

規則的な月経周期を有する被験体の場合、誘導の時期は、「０日目」と考える月経出血の開始に対して決定することができる。不規則な月経周期を有するかもしくは月経周期のない被験体では、月経出血の開始（すなわち、「０日目」の開始）を当該技術分野において既知である方法により、例えば、約３００ｍｇ／日の量で１０日間、例えば膣内に、プロゲステロン（例えば、Ｐｒｏｍｅｔｒｉｕｍ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃｌａｉｒｅ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａから入手可能）を投与することにより行うことができる。

典型的には、３日目および８日目に、卵胞のサイズおよび数を評価するために卵巣を超音波で調べる。通常、優性卵胞は１０〜１４日目までに少なくとも約１６ｍｍの直径に達する。

優性卵胞が存在する場合（例えば、正常な卵巣機能におけるように、健康な被験体または例えば子宮内膜症もしくは卵管閉塞を患っている被験体の場合におけるように）、優性卵胞が約１５〜１７ｍｍ、好ましくは少なくとも約１６ｍｍの直径に達すると内因性ＬＨ活性の増加を誘導する（例えば、ＨＣＧの投与により）。

例えばＰＣＯＳの場合におけるように、優性卵胞が存在しない場合、内因性ＬＨレベルの増加の誘導は、好ましくは、卵胞が約１２ｍｍ未満の直径である場合に行う。
未成熟卵母細胞の回収
卵母細胞は、一般に、プライミングの約３２〜約４０時間後、より好ましくはプライミングの約３４〜３８時間後、そしてさらにより好ましくはプライミングの約３６時間後に取り出す。卵母細胞を取り出す手段は、当該技術分野において既知である。一つの態様として、経膣超音波誘導卵母細胞採取（ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ−ｇｕｉｄｅｄ ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を１７〜２０ゲージ、好ましくは１９ゲージのシングルルーメン（ｓｉｎｇｌｅ−ｌｕｍｅｎ）吸引針を約５〜約１０ｋＰａ、好ましくは約７．５ｋＰａの吸引圧力で用いて行う。
未成熟卵母細胞の培養
本明細書に用いる場合、「未成熟ヒト卵母細胞」という用語は、中期−ＩＩ（Ｍ−ＩＩ）にまだ達していないヒト卵母細胞を意味する。先に説明したように、中期−ＩＩは細胞質からの１個の極体の排除を特徴とする。本発明に使用する未成熟ヒト卵母細胞は、典型的には、卵核胞（ＧＶ）もしくは中期−Ｉ（Ｍ−Ｉ）期である。

卵母細胞は、それらの卵丘を無傷で、「卵丘卵母細胞複合体」（ＣＯＣ）として知られている形態で培養することができ、または卵母細胞を卵丘細胞から部分的にもしくは完全に剥離することができる。ＣＯＣは、ＨＥＰＥＳ緩衝培地において８５ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼで剥離し、そして卵母細胞が剥離されるまで機械的にピペッティングすることができる。「卵丘細胞を本質的に含まない」卵母細胞は、卵丘細胞が卵母細胞への検出可能な生理的影響をもたないように十分に少ない卵丘細胞と会合する卵母細胞である。

ヒト卵母細胞の培養条件は当該技術分野において既知であり、そして本発明にとって重要ではない。適当な培養条件には、例えば、卵母細胞を高い湿度、例えば１００％の湿度で、９５％の空気および５％のＣＯ_２の大気において３７℃で培養することが包含される。５％のＯ_２、５％のＣＯ_２および９０％のＮ_２の「トリプルガス」大気もまた用いることができる。蒸発および／もしくは温度を制御するために鉱油を培地上にかぶせることができる。卵母細胞は、典型的には、１ｍｌの培養培地もしくはそれ以上を含有するウェルにおいて培養され、または培養皿中の液滴において１０μｌの培養培地もしくはそれ未満で培養することができる。

未成熟卵母細胞は、例えば、約２４〜約４８時間培養することができる。約６０％の卵母細胞は、典型的に、２４時間の培養後に成熟（Ｍ−ＩＩ）に到達するので、卵母細胞を無傷のもしくは部分的に無傷の卵丘細胞と培養する場合、それらを約２４時間で剥離し、そして卵母細胞成熟を評価するために顕微鏡下で観察することができる。卵母細胞への卵丘細胞の生理的影響は、培養における約最初の１２時間のみ持続し、従って、培養における約２４時間後に卵母細胞を剥離することは、ほとんどもしくは全くマイナスの影響がない。
卵丘細胞を本質的に含まない卵母細胞の培養培地
卵母細胞の成熟への卵丘細胞の影響のために、卵母細胞を卵丘細胞の存在下で最初の１２〜２４時間培養する場合にいくらか異なる培養培地を用いることができる。これは、例えば、卵母細胞をＣＯＣとして培養するかもしくは部分的に剥離する場合にまたは剥離した卵母細胞を卵丘細胞の存在下で共培養する場合に行うことができる。

ＩＶＭ培地における無機塩、必須および非必須アミノ酸、ならびにエネルギー源は、本発明にとって重要ではない。適当な塩、アミノ酸およびエネルギー源は、当該技術分野において既知である。

無機塩は、培地のｐＨを好ましくは約７．２〜７．４の範囲内に調節するためにそして卵母細胞と培地との適切な浸透圧を維持するために与えられる。培養培地に用いる場合に適当な無機塩およびその濃度は、当該技術分野において既知である。典型的な無機塩には、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ、ＦＥ（ＮＯ_３）_３・９Ｈ_２Ｏ、ＫＨ_２ＰＯ_４、酢酸Ｎａ、Ｎａ_２Ｈ_２ＰＯ_４などが包含される。

ＩＶＭ培地は、少なくとも一つのアミノ酸もしくはその供給源を含有する。好ましくは、少なくとも必須アミノ酸、もしくはその供給源がＩＶＭ培地に含まれる。「必須」アミノ酸は、卵母細胞において合成されずそしてタンパク質合成に必須であるアミノ酸である。必須アミノ酸は、一般に、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリンであると考えられる。これら８種の必須アミノ酸ならびに残りの非必須アミノ酸のいくつかもしくは全てを含有する市販のアミノ酸混合物を都合よく用いることができる。当該技術分野において既知であるような天然に存在しないアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体もまた、ＩＶＭ培地に含むことができる。特に好ましい態様として、本発明のＩＶＭ培地はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含んでなる。

ＩＶＭ培地は、好ましくは、培養培地における含有が当該技術分野において既知であるようなビタミンを含有する。培地に含むことができるビタミンには、ビタミンＡ１（レチノール）、Ａ２（レチノールの代替形態）、Ｂ１（チアミン）、Ｂ２（リボフラビン）、Ｂ６（ピリドキシン）、Ｂ９（葉酸）、Ｂ１２（シアノコバラミン）、Ｂ１７、Ｃ（アスコルビン酸）、Ｄ、Ｄ２（カルシフェロール）、Ｄ３（コレカルシフェロール）、Ｅ（トコフェロール）、Ｈ（ビオチン）、Ｋ、Ｋ１（フィロキノン）、Ｋ２、Ｋ３（メナジオン）、Ｐなどが包含されるが、これらに限定されるものではない。ビタミンの特に好ましい組み合わせは、ビオチン、Ｄ−Ｃａパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキサル・ＨＣｌ、リボフラビン、およびチアミン・ＨＣｌを含んでなる。

ＩＶＭ培地は、少なくとも一つの増殖因子（ＧＦ）を含有する。大まかに言えば、増殖因子は、細胞増殖および／もしくは分化を活性化するという主要な結果を有する、細胞表面上の受容体に結合するタンパク質である。多数の増殖因子はかなり用途が広く、多数の異なる細胞タイプにおいて細胞分裂を促し、一方、あるものは特定の細胞タイプに特異的である。増殖因子は、卵母細胞成熟を積極的に促すように卵母細胞の膜に作用することができる（Ｍａｒｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｇｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。本発明との関連で有用な増殖因子には、以下の増殖因子スーパーファミリー：上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリー；インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）ファミリー；神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリー；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）ファミリー；繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）ファミリー；造血増殖因子；およびサイトカインから選択されるものが包含される。

好ましい態様として、ＩＶＭ培地における増殖因子は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含んでなる。ＦＧＦおよびＥＧＦは、商業的供給源から容易に入手可能であり、そして細胞増殖サプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）において一緒に購入することができる。ＩＶＭ培地は、好ましくは０．０００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／ＬのＦＧＦ、より好ましくは０．０００２ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／ＬのＦＧＦ、そしてさらにより好ましくは約０．０００５ｍｇ／ＬのＦＧＦを含有する。ＩＶＭ培地は、好ましくは０．０００１〜０．０１ｍｇ／ＬのＥＧＦ、より好ましくは０．０００５ｍｇ／Ｌ〜０．００２ｍｇ／ＬのＥＧＦ、そしてさらにより好ましくは約０．００１ｍｇ／ＬのＥＧＦを含有する。

ＩＶＭ培地はまた、好ましくは、少なくとも一つのホルモンも含有する。好ましいホルモンには、インシュリン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）が包含される。ヒト閉経期ゴナドトロピン（ＨＭＧ）は、一般に、ＦＳＨの代わりに用いることができ、そしてヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）は、一般に、ＬＨの代わりに用いることができる。好ましい態様として、ＩＶＭ培地はインシュリンを含んでなる。通常、インシュリンはエネルギー代謝および細胞へのアミノ酸輸送に関与する。ＩＶＭ培地は、好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌのインシュリン、より好ましくは０．２５ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのインシュリン、そしてさらにより好ましくは約５ｍｇ／Ｌのインシュリンを含有する。特に好ましい態様として、ＩＶＭ培地はエストラジオール、ＬＨおよびＦＳＨをさらに含んでなる。エストラジオールの量は、好ましくは約１μｇ／ｍｌ±１０％、±２０％、±３０％、±４０％もしくは±５０％である。ＦＳＨおよびＬＨの各々の量は、好ましくは約０．０８ＩＵ／ｍｌ±１０％、±２０％、±３０％、±４０％もしくは±５０％である。

好ましい態様として、ＩＶＭ培地はまたヒトトランスフェリン（ＴＦ）も含有する。ＴＦは、６７９個のアミノ酸および２本のグリカン鎖を含有する７５ｋＤａの糖タンパク質である。各々で、最後の残基は、ノイラミニダーゼで加水分解することができるシアル（Ｎ−アセチルノイラミン）酸である。ＴＦは全ての細胞外液において鉄を輸送するだけでなく、細胞増殖促進を包含する多数の追加特性も及ぼす（Ｇｒｏｓｓ−Ｗｅｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ＩＶＭ培地は、好ましくは５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／ＬのＴＦ、より好ましくは２５ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／ＬのＴＦ、そしてさらにより好ましくは約５０ｍｇ／ＬのＴＦを含有する。

上記の増殖因子、ホルモンおよびトランスフェリンは、天然に存在するか、合成もしくは組み換え体であることができ、そして天然に存在するか、合成もしくは組み換え的に生産される物質の生物学的活性の少なくともいくらかを保持するこれらの物質の生物学的に活性のフラグメント、バリアント、誘導体およびホモログを包含する。限定されない例として、タンパク質はその生物学的活性を実質的に下げずに１個もしくはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換もしくは改変を含むことができる。

エネルギー源の選択は本発明にとって重要ではなく、そして例えば、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、乳酸塩、またはこれらのエネルギー源のいくつかもしくは全ての混合物であることができる。

ＩＶＭ培地は、セレナイトもしくはセレニウムおよびヒドロコルチゾンのような追加の成分をさらに含有することができる。

フェノールレッドのようなｐＨ指示薬がそうであるように、Ｈｅｐｅｓのような、培地のｐＨを制御するためのバッファーを加えることができる。

ペニシリンＧおよびストレプトマイシンのような抗生物質は、汚染を防ぐためにＩＶＭ培地に加えることができる。

合成血清サプリメント（ＳＳＳ）は、卵母細胞のタンパク質の供給源としてそして体外培養中に細胞がガラス器具に付着するのを防ぐためにＩＶＭ培地に含むことができる。ＳＳＳは、ヒトＩＶＦ用に規制機関の承認を受けているという利点があり、そして市販されている。

特に好ましい態様として、ＩＶＭ培地は表１に記載する成分を含む。各成分の絶対量および相対量は、例えば±１０％、±２０％、±３０％、±４０％もしくは±５０％重量／容量までで、実質的に異なることができる。
卵丘細胞の存在下の卵母細胞の培養培地
上記の培養培地はまた、無傷であるかもしくは少なくとも部分的に無傷である卵丘を有し、そして／または卵丘細胞と共培養する未成熟卵母細胞を培養するのにも有用である。しかし、培養の最初の１２〜２４時間における卵丘細胞の存在は、増殖因子の必要性をなくし、従って、培養培地は繊維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子などのような増殖因子を含有する必要はない。

また、前節に記述する培養培地は、好ましくは、ヒトトランスフェリン、インシュリン、セレナイトおよびヒドロコルチゾンを含有するが、卵母細胞を卵丘細胞の存在下で培養する場合にこれらは実質的に有益ではなく、従って、一般に培養培地に存在しない。

さらに一般に、組織培養培地（例えばＴＣＭ−１９９）のような複雑な培養培地は、卵母細胞培養用よりむしろ体外での体細胞培養用に特に考案されている多数の成分を含有する。ＴＣＭ−１９９のような複雑な培養培地の使用は、本明細書に記述するようなあまり複雑でない培地を使用する場合より悪い結果を与える。従って、特に好ましい態様として、卵丘細胞を本質的に含まない卵母細胞は、表１に記載する成分からなるかもしくは本質的になる培地において培養し；そして卵丘細胞の存在下で培養する卵母細胞は、表２に記載する成分からなるかもしくは本質的になる培地において培養する。

「含んでなる」という用語は、包括的であるかもしくは制限がないものとし、そして追加の列挙されていない要素もしくは方法段階を除外しない。「からなる」という用語は、特定の成分もしくは物質と通常は関連する不純物を除いて、特定されないあらゆる要素、段階、もしくは成分を除外するものとする。「から本質的になる」は、「含んでなる」と「からなる」の間の中間の位置を占め、そして特定の物質もしくは段階および本明細書における本発明の基本的なそして新規な特性に実質的に影響を与えないもの以外を除外するものとする。
卵母細胞の受精および胚の培養
卵母細胞を受精させそして胚を培養する技術は、当該技術分野において既知である。

一つの態様として、受精は細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）により成し遂げられる。一般に、精子は遠心分離による勾配分離によりもしくは「スイムアップ」およびその後の１０％ ＳＳＳを補足したＨＴＦのような適当な培地での洗浄により調製することができる。単一の精子をＭ−ＩＩ卵母細胞に注入することができる。ＩＣＳＩの後に、卵母細胞を例えば組織培養皿における１０％ ＳＳＳを補足した受精培地に移すことができる。受精は、ＩＣＳＩの約１６〜１８時間後に２個の別個の前核および２個の極体の出現により検出することができる。

一つの態様として、受精した卵母細胞は、ＩＣＳＩ後に約７２時間まで受精培地において培養し、そして次に鉱油下の組織培養皿における例えば胚発育培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）にさらに４８時間移すことができる。

本明細書に用いる場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形には、その文脈が明らかに他に指示しないかぎり複数の言及が包含される。他に特定されない限り、本明細書に用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する当該技術分野における当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。

本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによりさらに説明される。

未成熟卵母細胞の供給源
全部で５２１個の未成熟卵母細胞（ＧＶ期の２１３個の卵母細胞およびＭ−Ｉ期の３０８個の卵母細胞）をインフォームドコンセント下で制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）卵巣刺激およびＩＣＳＩ周期を受けた１８３人の女性（２８〜４０歳の間の年齢範囲）から集めた。卵巣刺激は、標準的なプロトコルを用いてＧｎＲＨａ、ＨＭＧもしくはＦＳＨおよびＨＣＧで行った。

ＨＣＧ注射の３６時間後に、超音波誘導経膣プローブを用いて卵母細胞回収を行った。集めたＣＯＣは、それらをそれらの卵丘細胞から剥離する前に１０％の合成血清代替品（ＳＳＳ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したヒト卵管液培地（ＨＴＦ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において培養し、そして５％ ＣＯ_２インキュベーター（高い湿度で３７℃）に少なくとも１時間置いた。

ＣＯＣをＨＴＦ培地中８５ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼおよび機械的ピペッティングで剥離した。全ての卵母細胞をそれらの卵丘細胞から完全に剥離した。剥離した卵母細胞を卵母細胞成熟に関して評価するために倒立顕微鏡下で観察した。成熟卵母細胞は、第一極体放出（１ＰＢ）の存在により決定した。目に見える極体を有する卵母細胞（Ｍ−ＩＩ）は、直ちにＩＣＳＩ処置を行うために臨床用途に提供した。未成熟卵母細胞は、１ＰＢの欠如により特定し、そして次に卵母細胞が顕微鏡下で細胞質に目に見えるＧＶを含有するかどうかによりＧＶもしくはＭ−Ｉ期と同定した。細胞質にＧＶがない未成熟卵母細胞は、Ｍ−Ｉ期とみなした。これらの未成熟卵母細胞を体外成熟に使用した。

未成熟卵母細胞は、成熟培地に移す前に３７℃および５％ ＣＯ_２インキュベーターに置いた１０％のＳＳＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したＨＴＦ培地において培養した。未成熟卵母細胞を成熟培地に移した時点を培養における成熟の開始点と定義する。通常、卵母細胞回収から卵母細胞成熟の開始まで約３〜４時間かかる。
未成熟卵母細胞の体外成熟
未成熟卵母細胞を２群に分けた。一つはＧＶ期卵母細胞（ｎ＝２１３）であり、もう一つはＭ−Ｉ期卵母細胞（ｎ＝３０８）であった。各群の卵母細胞をそれぞれ２種の成熟培地：（１）ＴＣＭ−１９９（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１１５３）もしくは（２）ＩＶＭ培地（表１）の一方において無作為に培養した。ＴＣＭ−１９９およびＩＶＭ培地の両方に１０％のＳＳＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．０７５ＩＵ／ｍｌのＦＳＨ＋ＬＨ（Ｈｕｍｅｇｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）および１．０μｇ／ｍｌのエストラジオール（Ｓｉｇｍａ）を補足した。ＴＣＭ−１９９への追加のサプリメントには、０．２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．０５ユニット／ｍｌのペニシリンＧおよびストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）が含まれた。

培養の前に、未成熟卵母細胞を成熟培地において少なくとも２回洗浄した。未成熟卵母細胞は、高い湿度で５％のＣＯ_２および９５％の空気の大気中３７℃で１ｍｌの成熟培地（ＴＣＭ−１９９もしくはＩＶＭ培地）を含有する器官組織培養皿（６０ Ｘ １５ｍｍ；Ｆａｌｃｏｎ）において培養した。最大で５個の卵母細胞（１〜５個）を各器官組織培養皿に置いた。

培養の後、卵母細胞の成熟をＭ−Ｉ期卵母細胞に対して６時間でそして次にＭ−ＩおよびＧＶ期卵母細胞の両方に対して２４時間および４８時間で顕微鏡下で決定した。
細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）
体外で成熟した卵母細胞を患者の夫の精子でＩＣＳＩにより受精させた。全ての精液サンプルは、臨床利用のための射精精液から得られた。残りのサンプルは、インフォームドコンセント下で本実験のために提供された。

ＩＣＳＩ用の精子は、５６０ｇで２０分間のＰｕｒｅＳｐｅｒｍ（Ｎｉｄａｃｏｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）勾配分離（４５％、７０％および９０％）により調製した。勾配分離の後、精子ペレットを１０％のＳＳＳを補足した２ｍｌのＨＴＦ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２回洗浄した（２００ｇ）。

単一の精子を各Ｍ−ＩＩ卵母細胞に注入した。ＩＣＳＩの後、各卵母細胞を鉱油（Ｓｉｇｍａ）下の組織培養皿（３５ Ｘ １０ｍｍ；Ｆａｌｃｏｎ）における１０％のＳＳＳを補足したＨＴＦ培地の２０μｌの液滴中に移した。

受精は、ＩＣＳＩの１６〜１８時間後に２個の別個の前核および２個の極体の出現に関して評価した。卵母細胞は培養後に同時に成熟していなかったので、それぞれ６時間、２４時間もしくは４８時間でのＩＣＳＩによるさらなる受精のために精子サンプルを１０％のＳＳＳを補足した０．５〜１．０ｍｌのＨＴＦ培地を含有する５ｍｌのファルコンチューブ（きついチューブキャップ）において室温で保持した。
胚の培養
受精した卵母細胞（２個の前核を有する）を１０％のＳＳＳを補足したＨＴＦ培地においてＩＣＳＩ後７２時間まで培養し、そして次に各胚を鉱油（Ｓｉｇｍａ）下の組織培養皿（３５ Ｘ １０ｍｍ；Ｆａｌｃｏｎ）におけるＧ２．２培地（ＶｉｔｒｏＬｉｆｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）の２０μｌの液滴中に移し、さらに４８時間培養した。胚発育は、培養後２４時間間隔で５日目（１２０時間）まで記録した。全ての胚は、患者からの同意指示の後に５日目に破棄した。
統計分析
群間の卵母細胞成熟、受精および発育のパーセンテージの統計的有意差は、スチューデント・ニューマン・クールズ検定（Ｓｔｅｅｌ ＆ Ｔｏｒｒｉｅ，１９８０）により決定し、比較した。＜０．０５のＰ値は、統計的に有意であるとみなした。
結果
表３に示すように、Ｍ−Ｉ期卵母細胞の５２．０％および４６．１％が、それぞれ、ＩＶＭ培地およびＴＣＭ−１９９における培養後６時間で成熟した。２４時間および４８時間のさらなる培養の後、ＩＶＭ培地（７６．０％および７８．６％）とＴＣＭ−１９９（６７．５％および７０．８％）との間で卵母細胞成熟率の差はなかった。

表４に示すように、最終受精率もまた、これら２種の培地間で異ならなかった（９０．０％対８４．４％）。

図１は、それぞれ、ＩＶＭ培地もしくはＴＣＭ−１９９において６時間（９３．８％対９０．１％）、２４時間（８９．２％対８４．９％）および４８時間（５０．０％対０．０％）で成熟した卵母細胞の受精率を示す。

受精した卵母細胞の最終卵割率は、これら２種の培地において成熟した卵母細胞間で異ならず（表４；９７．３％対９８．９％）、そしてまた卵母細胞をそれぞれ６時間（１００．０％対９８．４％）および２４時間（９３．９％対１００．０％）成熟させた場合にもこれら２種の培地において差はなかった（図２）。

ＩＶＭ培地（６３．７％）およびＴＣＭ−１９９（５７．１％）において成熟した卵母細胞間で８細胞期まで発育した胚の有意な差はなく、そしてまた卵母細胞がこれら２種の培地においてそれぞれ６時間（６６．７％対６０．３％）、２４時間（５４．６％対５０．０％）および４８時間（０．０％対０．０％）成熟した場合にも８細胞期まで発育した胚のパーセンテージは異ならなかった。

しかしながら、総胚盤胞形成率は、ＩＶＭ培地とＴＣＭ−１９９との間でそれぞれ有意に異なった（Ｐ＜０．０５）（表４；１９．６％対７．７％）。さらに、胚盤胞形成のパーセンテージは、卵母細胞が培養における成熟後６時間成熟した場合にこれら２種の培地で異なった（Ｐ＜０．０５）（２４．０％対７．９％）（表３ｂ）。

しかしながら、卵母細胞がそれぞれ２４時間（９．７％対７．１％）および４８時間（０．０％対０．０％）成熟した場合にこれら２種の培地間で差はなかった。

表５に示すように、ＧＶ期卵母細胞を体外で成熟させた場合、２４時間（５０．１％対３４．０％）および４８時間（７５．７％対５５．７％）でそれぞれＩＶＭ培地とＴＣＭ−１９９との間で成熟率の有意な差があった（Ｐ＜０．０１）。

しかしながら、表６に示すように、最終受精率は、ＩＶＭ培地（８６．４％）とＴＣＭ−１９９（７８．０％）との間で異ならなかった。

また、卵母細胞を２４時間（８８．９％対８３．３％）および４８時間（８１．５％対６９．６％）成熟させた場合にもこれら２種の培地間で受精率の差はなかった（図４）。

最終卵割率は、これら２種の培地間で異ならなかった（表６、１００．０％対９５．６％）。受精した卵母細胞の卵割率はまた、卵母細胞が２４時間（１００．０％対９６．７％）および４８時間（１００．０％対９３．８％）成熟した場合にもこれら２種の培地間で異ならなかった（図５）。

しかしながら、ＩＶＭ培地とＴＣＭ−１９９との間で８細胞期および胚盤胞期まで発育した胚に有意な差があった（Ｐ＜０．０５）（表６、それぞれ、５８．６％対４０．９％および１２．９％対０．０％）。

卵母細胞を２４時間成熟させた場合、８細胞期（図６ａ；７５．０％対５１．７％）および胚盤胞期（図６ｂ；１８．８％対０．０％）まで発育した胚のパーセンテージは、それぞれ、ＩＶＭ培地とＴＣＭ−１９９との間で有意に異なった（Ｐ＜０．０５）。

しかしながら、卵母細胞を４８時間成熟させた場合、これら２種の培地間で８細胞期（図６ａ；２２．７％対２０．０％）および胚盤胞（図６ｂ；０．０％対０．０％）まで発育した胚に差はなかった。

ＰＣＯＳにかかっている全部で４０人の女性が、４０の完了したＩＶＭ処置周期を受けた。全ての患者は４０歳未満の年齢であり（平均３２．３±３．９）、そしてある患者は不規則な月経周期もしくは無排卵を示した。全ての患者は、最低２年の不妊症の病歴があった。

患者が不規則な月経周期を有する場合、１０日間毎日３００ｍｇの用量の膣内プロゲステロン（Ｐｒｏｍｅｔｒｉｕｍ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｐｏｉｎｔｅ−Ｃｌａｉｒ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の投与により処置周期を開始した。消退出血は、最後の投薬の後３日以内に起こった。

月経出血の開始後２もしくは３日目に、卵巣嚢胞が存在しないことを確実にするために患者はベースライン超音波スキャンを受けた。経膣超音波スキャンは、優性卵胞の発育を除くために８日目に繰り返された。超音波スキャンでの全ての卵胞のサイズは、周期の８日目で直径＜１０ｍｍでなければならなかった。

卵母細胞回収は、周期の１０〜１４日目に行った。卵母細胞採取の３６時間前に、患者にプライミング用の１０，０００ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）をｓ．ｃ．で与えた。

経膣超音波誘導卵母細胞採取は、特に考案された１９Ｇのシングルルーメン吸引針（Ｃｏｏｋ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を７．５ｋＰａの吸引圧力で用いて行った。全ての小さな卵胞の吸引は、局所麻酔下で行った。卵母細胞は、２ＩＵ／ｍｌのヘパリン（Ｂａｘｔｅｒ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を含有する２．０ｍｌの温かい０．９％食塩水が入っている１０ｍｌの培養管（Ｆａｌｃｏｎ，ＵＳＡ）に集めた。

卵母細胞採取の後、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を高い湿度で５％のＣＯ_２および９５％の空気の大気中３７℃で１ｍｌの改変ＩＶＭ培地（表２）を含有する器官組織培養皿（６０ Ｘ １５ｍｍ；Ｆａｌｃｏｎ）において培養した。

２４および４８時間の培養の後、成熟卵母細胞（中期−ＩＩ期）をＩＣＳＩにより受精させた。受精は、ＩＣＳＩの１８時間後に２個の別個の前核および２個の極体の出現に関して評価した。胚移植は、ＩＣＳＩ後２もしくは３日目に行った。卵母細胞は培養後２４時間もしくは４８時間のいずれかで受精させたので、胚の発育段階は多様であった。

子宮内膜の準備には、卵母細胞回収の日に開始して、患者に分割用量の卵母細胞回収の日の子宮内膜の厚さによって決まるエストラジオール（Ｅｓｔａｃｅ；Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を与えた。卵母細胞回収の日の子宮内膜の厚さが＜４ｍｍであった場合には、１０ｍｇの用量を投与し；＞６ｍｍであった場合には、６ｍｇの用量を与えた。黄体補助（ｌｕｔｅａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ）は、卵母細胞採取の翌日から開始して１６日間毎日２回４００ｍｇの膣内プロゲステロン（Ｐｒｏｍｅｔｒｉｕｍ）により与えた。

ＩＶＭ処置を受けたＰＣＯＳにかかっている４０人の女性から全部で６５３個の未成熟卵母細胞を集めた。４８時間の培養の後、８１．５％（５３２／６５３）の卵母細胞は成熟した。胚移植の後、１３人の患者は妊娠した（３２．５％＝１３／４０）。結果を表７に集計する。

本明細書に引用する全ての参考文献は、各個々の参考文献が引用することにより組み込まれると特にそして個々に示されるように引用することにより本明細書に組み込まれる。任意の参考文献の引用は、出願日より前のその開示に対してであり、先行する発明という理由で本発明がそのような参考文献に先行する資格がないという承認と解釈されるべきではない。

前述の本発明は、理解の明確さのために説明および実施例によりいくらか詳しく記述されているが、添付の請求項の精神もしくは範囲からそれずに本発明にある種の変更および改変を実施できることは本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかである。

それぞれ、６時間、２４時間もしくは４８時間の成熟後に刺激およびＩＣＳＩ周期から得られるＭ−Ｉ期卵母細胞の受精率を示す。 それぞれ、６時間、２４時間もしくは４８時間の成熟後に刺激およびＩＣＳＩ周期から得られるＭ−Ｉ期卵母細胞の卵割率を示す。 刺激およびＩＣＳＩ周期から得られるＭ−Ｉ期卵母細胞の６時間、２４時間もしくは４８時間の成熟後に８細胞期（Ａ）および胚盤胞期（Ｂ）まで発育する胚を示す。 ２４時間もしくは４８時間の成熟後に刺激およびＩＣＳＩ周期から得られるＧＶ期卵母細胞の受精率を示す。 ２４時間もしくは４８時間の成熟後に刺激およびＩＣＳＩ周期から得られるＧＶ期卵母細胞の卵割率を示す。 刺激およびＩＣＳＩ周期から得られるＧＶ期卵母細胞の２４時間もしくは４８時間の成熟後に８細胞期（Ａ）および胚盤胞期（Ｂ）まで発育する胚を示す。 体外で２４時間の成熟後にＧＶ期卵母細胞から得られる胚盤胞を示し、そして体内で成熟した卵母細胞と形態の差がないことを例示する。縮尺バーは、５μｍの長さを示す。

Claims (68)

1. （ａ）女性ヒト被験体において内因性黄体形成ホルモンレベルの増加を誘導する段階（該被験体は、該誘導段階の前に卵巣刺激プロトコルを受けていない）；
   （ｂ）該被験体から未成熟卵母細胞を採取する段階；および
   （ｃ）該卵母細胞を成熟するまで培養する段階
   を含んでなる未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法。
2. 段階（ａ）が該被験体にヒト絨毛性ゴナドトロピンもしくは黄体形成ホルモン、または両方を投与することを含んでなる請求項１に記載の方法。
3. 段階（ａ）が該被験体に約５０００〜約２０，０００ＩＵの量のヒト絨毛性ゴナドトロピンを投与することを含んでなる請求項１に記載の方法。
4. 該未成熟ヒト卵母細胞がＭ−Ｉ期卵母細胞を含んでなる請求項１に記載の方法。
5. 該未成熟ヒト卵母細胞がＧＶ期卵母細胞を含んでなる請求項１に記載の方法。
6. 該未成熟ヒト卵母細胞をそれがＭ−ＩＩに達するまで培養する請求項１に記載の方法。
7. 段階（ｃ）において、該未成熟ヒト卵母細胞が卵丘細胞を本質的に含まず、そして少なくとも一つの無機塩；
   必須アミノ酸もしくはその供給源；
   エネルギー源；および
   少なくとも一つの増殖因子
   を含んでなる培養培地において培養される請求項１に記載の方法。
8. 該少なくとも一つの増殖因子が繊維芽細胞増殖因子および上皮増殖因子よりなる群から選択される請求項７に記載の方法。
9. 該培養培地が繊維芽細胞増殖因子および上皮増殖因子の両方を含んでなる請求項７に記載の方法。
10. 該培養培地が少なくとも一つのホルモンをさらに含んでなる請求項７に記載の方法。
11. 該ホルモンがインシュリンを含んでなる請求項１０に記載の方法。
12. 該培養培地が０．５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌのインシュリンを含んでなる請求項１１に記載の方法。
13. 該培養培地がヒトトランスフェリンをさらに含んでなる請求項７に記載の方法。
14. 該培養培地が５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリンを含んでなる請求項１３に記載の方法。
15. 該培養培地が０．０００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌの繊維芽細胞増殖因子を含んでなる請求項７に記載の方法。
16. 該培養培地が０．０００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの上皮増殖因子を含んでなる請求項７に記載の方法。
17. 該培養培地が一つもしくはそれ以上のビタミンを含んでなる請求項７に記載の方法。
18. 該一つもしくはそれ以上のビタミンがビオチン、Ｄ−Ｃａパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキサル・ＨＣｌ、リボフラビン、およびチアミン・ＨＣｌを含んでなる請求項１７に記載の方法。
19. 該培養培地がヒドロコルチゾンを含んでなる請求項７に記載の方法。
20. 該培養培地がセレナイトを含んでなる請求項７に記載の方法。
21. 該無機塩がＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを含んでなる請求項７に記載の方法。
22. 該エネルギー源がＤ−グルコース、もしくはピルビン酸ナトリウム、またはＤ−グルコースとピルビン酸ナトリウムの両方を含んでなる請求項７に記載の方法。
23. 該アミノ酸がアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含んでなる請求項７に記載の方法。
24. 該培養培地が無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表１に記載の他の成分を含んでなり、そして各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表１に特定する量の±５０％（重量／容量）の量で存在する請求項７に記載の方法。
25. 各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表１に特定する量の±１０％（重量／容量）の量で該培養培地に存在する請求項２４に記載の方法。
26. 段階（ｃ）において、該卵母細胞が、無傷であるかもしくは少なくとも部分的に無傷である卵丘を有し、そして／または該卵母細胞を卵丘細胞の存在下で培養する請求項１に記載の方法。
27. 該卵母細胞を上皮増殖因子を本質的に含まない培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
28. 該卵母細胞を繊維芽細胞増殖因子を本質的に含まない培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
29. 該卵母細胞をヒトトランスフェリンを本質的に含まない培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
30. 該卵母細胞をインシュリンを本質的に含まない培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
31. 該卵母細胞をセレナイトを本質的に含まない培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
32. 該卵母細胞をヒドロコルチゾンを本質的に含まない培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
33. 該卵母細胞を上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ヒトトランスフェリン、インシュリン、セレナイト、およびヒドロコルチゾンを本質的に含まない培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
34. 該卵母細胞を無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分を含んでなる培養培地において培養し、そして各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表２に特定する量の±５０％（重量／容量）の量で存在する請求項２６に記載の方法。
35. 各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表２に特定する量の±１０％（重量／容量）の量で該培養培地に存在する請求項３４に記載の方法。
36. 該卵母細胞を無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分から本質的になる培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
37. 該卵母細胞を無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分からなる培養培地において培養する請求項２６に記載の方法。
38. 段階（ａ）の前に、該被験体がゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、ヒト閉経期ゴナドトロピンもしくは卵胞刺激ホルモンで処置されていない請求項１に記載の方法。
39. 未成熟ヒト卵母細胞を
    少なくとも一つの無機塩；
    必須アミノ酸もしくはその供給源；
    エネルギー源；および
    少なくとも一つの増殖因子
    を含んでなる培養培地において培養することを含んでなる、未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法。
40. 該少なくとも一つの増殖因子が繊維芽細胞増殖因子および上皮増殖因子よりなる群から選択される請求項３９に記載の方法。
41. 該培養培地が繊維芽細胞増殖因子および上皮増殖因子の両方を含んでなる請求項３９に記載の方法。
42. 該培養培地が少なくとも一つのホルモンをさらに含んでなる請求項３９に記載の方法。
43. 該ホルモンがインシュリンを含んでなる請求項４２に記載の方法。
44. 該培養培地が０．５ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌのインシュリンを含んでなる請求項４３に記載の方法。
45. 該培養培地がヒトトランスフェリンをさらに含んでなる請求項３９に記載の方法。
46. 該培養培地が５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリンを含んでなる請求項４５に記載の方法。
47. 該培養培地が０．０００１ｍｇ／Ｌ〜０．００１ｍｇ／Ｌの繊維芽細胞増殖因子を含んでなる請求項３９に記載の方法。
48. 該培養培地が０．０００１〜０．０１ｍｇ／Ｌの上皮増殖因子を含んでなる請求項３９に記載の方法。
49. 該培養培地が一つもしくはそれ以上のビタミンを含んでなる請求項３９に記載の方法。
50. 該一つもしくはそれ以上のビタミンがビオチン、Ｄ−Ｃａパントテン酸塩、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキサル・ＨＣｌ、リボフラビン、およびチアミン・ＨＣｌを含んでなる請求項４９に記載の方法。
51. 該培養培地がヒドロコルチゾンを含んでなる請求項３９に記載の方法。
52. 該培養培地がセレナイトを含んでなる請求項３９に記載の方法。
53. 該無機塩がＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを含んでなる請求項３９に記載の方法。
54. 該エネルギー源がＤ−グルコース、もしくはピルビン酸ナトリウム、またはＤ−グルコースとピルビン酸ナトリウムの両方を含んでなる請求項３９に記載の方法。
55. 該アミノ酸がアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含んでなる請求項３９に記載の方法。
56. 該培養培地が無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表１に記載の他の成分を含んでなり、そして各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表１に特定する量の±５０％（重量／容量）の量で存在する請求項３９に記載の方法。
57. 各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表１に特定する量の±１０％（重量／容量）の量で該培養培地に存在する請求項５５に記載の方法。
58. 該培養培地が無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表１に記載の他の成分から本質的になる請求項３９に記載の方法。
59. 該培養培地が無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表１に記載の他の成分からなる請求項３９に記載の方法。
60. 各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表１に特定する量の±５０％（重量／容量）の量で存在する請求項５７もしくは５８に記載の方法。
61. 各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表１に特定する量の±１０％（重量／容量）の量で存在する請求項５７もしくは５８に記載の方法。
62. 該未成熟ヒト卵母細胞が卵丘細胞を本質的に含まない請求項３９に記載の方法。
63. 未成熟ヒト卵母細胞を無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分を含んでなる培養培地において培養することを含んでなる、未成熟ヒト卵母細胞の体外成熟の方法。
64. 該培養培地が無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分から本質的になる請求項６２に記載の方法。
65. 該培養培地が無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび表２に記載の他の成分からなる請求項６２に記載の方法。
66. 各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表２に特定する量の±５０％（重量／容量）の量で存在する請求項６２〜６４のいずれか一つに記載の方法。
67. 各無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分が表２に特定する量の±１０％（重量／容量）の量で存在する請求項６２〜６４のいずれか一つに記載の方法。
68. 該卵母細胞を卵丘細胞の存在下で培養する請求項６２に記載の方法。

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