CN1161615C

CN1161615C - 预测取出用于体外受精的卵细胞的时间的方法和应用

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Publication number: CN1161615C
Application number: CNB998099309A
Authority: CN
Inventors: ˹�ġ��ֵǱ�; 斯文·林登堡; ��ɭ; 安妮·利斯·米克尔森
Original assignee: Medi-Cult AS
Current assignee: Medi-Cult AS
Priority date: 1998-06-22
Filing date: 1999-06-22
Publication date: 2004-08-11
Anticipated expiration: 2019-06-22
Also published as: WO1999067365A1; IL140283A0; EP1088056A1; NO20006545L; ES2313785T3; ATE407363T1; IL140394A0; EP1090300A1; DE69939468D1; HRP20000888A2; CA2335793A1; NO20006545D0; NO20006519L; EP1090300B1; US20010028878A1; TR200003830T2; SK19152000A3; IS5768A; JP2002519640A; EE200000763A

Abstract

本发明涉及检测哺乳动物标本中至少一种预测标记的测定法，其中至少一种预测标记的特异反应指示哺乳动物中存在能够在体外成熟(IVM)和随后体外受精(IVF)的未受精卵细胞的时间。本发明尤其在确定何时吸出体外的未受精卵在体外发育成熟至MF-II期后，在将其植入雌性哺乳动物体内后具有受精和受孕能力方面非常有用。本测定法所使用的标本来自机体分泌物、痰、血液、尿、子宫分泌物和细胞。

Description

预测取出用于体外受精的卵细胞的时间的方法和应用

技术领域

本发明涉及预测取出用于体外受精的卵细胞的时间的方法和应用。

发明背景

正常的排卵期妇女在每次月经周期中大约募集300个左右不成熟的卵母细胞(卵)。这些细胞通常经过一个细胞凋亡过程，除一个细胞外，其余所有细胞均在排卵前死亡。传统的体外受精(IVF)法，即用于治疗一些严重男性和妇女不孕症的特殊病例的方法，是以重新恢复成熟人卵母细胞为基础，继而使成熟的卵母细胞用精子受精。人成熟的卵母细胞的募集是通过几种复杂的方式如激素疗法进行的，常常给受试妇女带来不适或危险。这些激素疗法尤其在将来将成为问题，因为IVF越来越多地用于治疗由患者丈夫的精子质量低而导致不育的正常妇女。再者，每个治疗周期中，该疗法通常获得20％的受孕率。

由于激素刺激存在危险、不适和费用高，在过去几年里，已尝试了其他几种方法。动物的体外成熟(IVM)已经成为制造用于IVF的卵母细胞的一种有效方法，但迄今为止临床上人IVM的成功率还比较低(Cha，Trounson，Barnes，Russell)。避免激素刺激的最简单的方法之一就是根本不能用激素刺激。但是这种治疗方法只能使有限的患者受孕，并且计算出每次治疗过程中的受孕率从未超过5％。

本发明概述

本发明涉及一种预测不用外源性激素治疗的妇女中特异的健康、活化的前期卵细胞在体外进一步发育至MF-II的时程和进展的检测系统的能力，并且由此避免大多数卵细胞的退化，即使该妇女不用激素治疗。与以前所有的其他激素测定法总是重点在卵细胞发育的晚期阶段，通常为MF-II期卵相反，本发明的检测目的在于获取未受精卵的时机，这些未受精卵能够在体外发育成熟、受精。使用该方法可以获得15％以上的受孕率。

在本发明的一个方面，提供了用于检测来自哺乳动物的机体分泌物、痰、血液、血清或尿的标本中抑制素A或雌二醇的存在或量的测定法在预测哺乳动物中何时存在能在体外成熟并继而受精的未受精卵中的应用，所述测定法包括：(a)在月经周期的不同时间从雌性哺乳动物获得标本；(b)测定抑制素A或雌二醇的存在或量；和(c)比较抑制素A或雌二醇的相对浓度与基准，以确定是否存在能在体外成熟并继而受精的未受精卵；以及随后从所述哺乳动物取卵子。

在另一方面，本发明提供确定吸出时机的方法，所述吸出时机即哺乳动物中存在能在体外成熟并继而受精的未受精卵的时机，所述方法包括：(a)在月经周期的不同时间从雌性哺乳动物获得标本；(b)测定抑制素A或雌二醇的存在或量；(c)比较抑制素A或雌二醇的相对浓度与基准，以确定是否存在能在体外成熟并继而受精的未受精卵；以及随后从所述哺乳动物取卵子。

本发明的详细描述

科学背景

卵细胞核的发育停止在双线期即为胚泡，将此称之为双线期。该期的主要特征是染色体高度弥散，这类核中的DNA对Feulgen试剂几乎没有亲和性。双线期的卵细胞的染色体带有条状和环状侧突(lateral projection)，表明核糖核酸(RNA)正在复制。它们非常像“灯刷状”染色体，后者几乎广泛存在于低等脊椎动物和无脊椎动物的卵细胞中。RNA可以作为卵细胞自身中指导蛋白质合成的信使。根据青蛙和蟾蜍卵细胞的研究结果，提示有些RNA可以作为哺乳动物早期发育的机化中心。无论需要阐明这些复杂问题的其他研究结果如何，双线期很显然不应称为休眠期，因为在卵泡膜仅由少量扁平上皮细胞组成时，卵母细胞表现为很高的代谢和合成活性。

人的卵母细胞/卵泡的发育是一种受时间和生物过程调控的机制。99％的卵细胞甚至在出生前就停止在减数分裂前期(也就是双线期)。从这个库中，每月(月经周期)有几百个卵细胞选择性地活化，进一步发育，重新开始减数分裂，尽管胚泡崩溃(GVB)，以及从中期I(MF-I)至中期II(MF-II)，以及卵泡的生长。

妇女的生殖状态周期性地与下丘脑、脑垂体前叶和卵巢之间存在复杂的交互作用，最终导致排卵。该周期重复出现，平均大约28-30天一次(范围在25-35天)。初期，月经期，持续4-5天。月经周期的第一天就是初期的第一天，也就是月经来潮的第一天。卵巢的第二个卵泡期与子宫内膜的增殖相关，并持续10-16天(即高度变异)。接着就是排卵期(36小时)，最后为黄体期，后者与子宫内膜的分泌期相关，通常维持在14天左右。三种成分在理解月经周期中非常重要：

1.下丘脑的GnRH调控的FSH/LH释放

2.卵巢卵泡发育至排卵，以及随后的黄体形成和

3.卵巢激素FSH/LH分泌的反馈调控。

在生殖周期的第二半程，黄体发育，并分泌雌激素和孕激素。雌激素继续促进子宫内膜的增生活性。另一方面，孕激素造成子宫内膜的腺体增大，充满分泌物，包括糖原(对胚胎发育时植入非常重要)。子宫内膜的血流增多，并且螺旋动脉呈卷曲和扭曲。月经周期的第二阶段称为黄体期(卵巢)或分泌期(子宫)。如果不发生植入，那么机体的黄体就消退，雌激素和孕激素就迅速降低，由于细胞外液的丧失，螺旋动脉的收缩，子宫内膜发生萎缩，子宫内膜的血流随着细胞的死亡和血管破裂而降低。最终出现子宫出血期，但此时只有子宫内膜的基底膜脱落。实际上，子宫出血的第一天就是月经周期的第一天。

卵细胞的成熟就是卵细胞发育的终末阶段，为受精和胚胎发育作准备。可以分为两个过程：细胞核成熟和细胞质成熟。细胞核成熟称为是重新开始减数分裂和MF-II发育，而细胞质成熟称为基因组外的改变，是为卵的活化、原核形成以及早期胚胎发生作准备。

双线期卵细胞周围的卵泡是由一层扁平的颗粒细胞组成。卵和卵泡进一步发育的标志包括颗粒细胞进一步增加，还包括液体进入颗粒细胞间的空腔通道。由于液体量的增加，液体所占的空腔体积也增加，并汇合成窦。此时的卵泡称为Graafian型。随着窦的进一步扩大，卵存在于卵泡一端，由两层或多层颗粒细胞包绕。这些细胞的最里层呈柱状，由辐射冠组成，后者与卵丘的最里层类似，辐射冠在排卵后的一段时间内围绕在卵的周围。

细胞核成熟与卵泡的发育平行进行。因此，在窦的形成过程可以观察到GVB和MF-I期的卵，窦是在窦状卵泡和窦前卵泡之间。到窦完全发育好时，完成减数分裂，并能看到第一极体。

在每次月经周期中，有几百个卵可以到达此期。但是，由于一些目前还不能解释的原因，大多数的卵闭锁，此时卵发生凋亡和死亡。颗粒状细胞的最里层部分发生溶解，而卵还一直在卵泡内，或在它离开后发生早熟，这是一个确定的指征，说明发生退变将导致卵的死亡。只有少数卵，通常只有一个卵可以继续发育。

IVF的技术背景

如果妇女接受了FSH治疗，不止一个卵泡将进一步发育到MF-II期，防止发生闭锁。

MF-II期的细胞为带有一个极体的卵母细胞，并且进一步扩大的卵丘复合物，最终经历一个胚泡的衰退过程。这些卵母细胞可以由普通的技术人员逐渐鉴别出来，筛出用于IVF的卵细胞。MF-II卵细胞是一类分离出的可以与精子进行受精的卵。有可能在卵发育的不太早的时期就出现。

传统的的体外受精(IVF)治疗目的在于尽可能多的获得处于MF-II期的卵细胞。这需要通过外源激素对妇女进行治疗，激素包括卵泡刺激素(FSH)、重组FSH，或尿源性FSH，使用剂量为100-250IU/天。通常用药8-10天。此后每天再用GNRH激动剂如不舍瑞林(Buserelin)进行辅助治疗。这种治疗可以避免大多数活化的卵细胞发生退化。这种激素治疗总是带有过度刺激综合征的风险和其他副作用，如可以增加患卵巢癌的危险性、恶心、不适、水肿、疼痛、药物过敏反应、抑郁和体重增加。很难对这些症状进行准确区分，如果妇女身体健康，并且进行IVF治疗是因为男方有严重的不育症。因此，目前全世界30％多的IVF治疗均是让妇女服用大量药物开始的，尽管问题出在男方。

为了获得健康的MF-II卵细胞，妇女的激素治疗还要监视血清中雌二醇、FSH、LH、孕激素、PP14和/或PP12等激素的水平作为辅助手段。取健康MF-II期卵的时间可以进一步通过超声扫描卵泡发育来辅助。所有这些临床检测均可以提高富集到健康和足够的MF-II期卵母细胞。

IVM

IVM优选从非成熟或没有完全成熟的配子开始。在妇女中卵子被识别为带有致密积块、没有可见的极体或核泡的卵母细胞。这些卵子被常规IVF治疗中涉及的人员容易地识别为未成熟的卵子。

如果不给予激素，将仅有一个卵母细胞成熟，如在正常排卵妇女中所见。通过在其中卵子发生闭锁的凋亡开始之前使未成熟的卵母细胞从卵巢中释放，并随后使卵子进一步在体外成熟，妇女可以免受与激素治疗相关的危险和不适，并且仍然能获得足够数量的成熟中期II(MF-II)卵子，用于随后的体外受精。

能够获得细胞核发育到MF-II期的卵母细胞，但是不能完成植入前期的发育。细胞质对发育能力的调控的重要性已经在非成熟的猴子卵中观察到。应用微技术操作，移去MF-II卵母细胞的卵质，并将其注入前期I的卵母细胞。接受细胞质的卵母细胞的猴子，与没有接受卵质注射(血)的猴子相比，其受孕率增加7倍。

迄今为止所出版的IVM实验操作指南中，要么是根据以前排卵或月经开始计算月经周期中固定的某一天，要么仅仅在窦性卵泡发育完成之前的某合适的一天。这种方法可以获得受孕率为0％-10％。

本发明

本发明涉及如下发现，即特异的信号激素的测量将可以预测用于IVM的卵细胞吸出的合适时间。这种提示取卵时间的测定方法，能获得可以特异地进一步在体外成熟、受精和发育的可观数量的卵细胞。鉴定可以作为预测标记的特异信号激素，可以预测能够在体外成熟，并随后受精，分裂，植入和受孕的未受精卵何时存在，从而可以大大地提高IVM的成功率。

在本发明中使用的未受精卵为未成熟的卵(即卵母细胞)，即当其与成熟的精子接触时不能完成减数分裂，不能够从精子细胞中获得遗传物质，不能形成受精细胞。现在可以预测卵细胞成熟时的内分泌和卵巢内调节，将使卵具备精确的但复杂的具有特异浓度或浓度比的物质组成，从而在体外发育成熟至MFII期后未受精卵将能够受精，继而分裂，然后在植入雌性哺乳动物可以使之受孕。

因此本发明一个方面涉及检测哺乳动物标本中至少一种预测标记的存在和量的测定法，其中，确定至少一种预测标记的存在和量，提示了哺乳动物何时存在在体外能够成熟并能随后受精的未受精卵。

用于检测至少一种预测标记的测定法是基于来自雌性哺乳动物的标本。在本发明中的一个实施方案中，标本选自例如机体分泌物、体液、细胞养分、卵泡内容物、痰、血液、尿、排泄物、子宫或阴道的分泌物和成分、月经成分、上皮和上皮衍生成分、皮肤成分，和死细胞或活细胞。本领域中的熟练的人员会明白如何采集上述标本。

本发明的一个实施方案中，标本来自哺乳动物，如宠物，如猫、狗或豚鼠；或动物园中的动物如灵长类。在另一个实施方案中，哺乳动物为实验室动物，如大鼠或小鼠。在进一步的优选的实施方案中，哺乳动物为部分产业化的，优选农用动物，如牛、马、猪、貂、山羊或绵羊。最优选的实施方案为人。

本发明的一个方面中，在取卵前先对雌性哺乳动物进行检测。有可能不止进行一种检测。绝对的截断水平或相对的测量如平台期，上述所选择标记的增高或降低可以预测用于IVM的取卵的时机。

在本发明中，预测标记应理解为在生物、物理或化学试验中，浓度、颜色、结构、构型和/或反应类型发生改变的任何物质。应当清楚存在许多潜在的预测标记。在本发明的一个实施方案中，所述测定法是这样的测定法，其中，至少一种预测标记为激素，其选自促性腺激素(如FSH、LH、催乳素和HCG)，甲状腺激素(如TSH、T3和T4)，和类固醇激素(如性激素：雌二醇、雌激素、雌三醇，黄体酮和睾酮；雄激素：皮质酮和皮质醇)。在本发明的另一个实施方案中，所述的测定法是这样的测定法，其中至少一种预测标记为小肽激素(如GIP或VIP)。在本发明的另一个实施方案中，所述的测定法是这样的测定法，其中至少一种预测标记为肽激素(如PP12、PP14、抑制素：抑制素A和B：激动素，或α1或α2球蛋白)。在本发明另一个实施方案中，所述的测定法是这样的测定法，其中至少一种预测标记为脂类分子，其选自减数分裂活化固醇(MAS)脂和前列腺素。在本发明的另一个实施方案中，所述的测定法是这样的测定法，其中至少一种预测标记为核酸，其选自DNA片段、mRNA和tRNA。在本发明的另一个实施方案中，所述的测定法是这样的测定法，其中至少一种预测标记为一种标记，选自LFN1、LFN2、LFN3、复合糖、碳水化合物、细胞养分、整合素如整合素1，和碳水化合物表位。在本发明的另一个实施方案中，所述的测定法是这样的测定法，其中至少一种预测标记为细胞内或细胞间的信使如cAMP。在本发明的另一个实施方案中，所述的测定法是这样的测定法，其中至少一种预测标记为酶，如磷酸二酯酶或磷酸二酯酶的抑制剂。

由于蛋白质间和蛋白质与激素、脂质、核酸、细胞内信使和酶之间的相互作用非常复杂，所以目前预测取出未受精卵的时间应依靠某些预测标记的截断水平和/或对某种或多种预测标记的有关测量值，即相同标记在不同时间的有关测量值，或者相同时间的一个标本的两个或多个标记的有关测量值。

本发明测定法包括至少一种预测标记，也就是说为两种、或者三种、四种、五种或六种预测标记。

更有可能的是，如果将两种或多种预测标记结合起来，本发明测定法的预测价值将显著提高。

根据实施例1和实施例2中关于两个预测标记抑制素A和雌二醇之间的相关性如何与IVM的结果相关的描述，本领域的熟练技术人员将能够确定其它预测标记之间的这种相关性。在一个实施方案中，IVM的受孕机会与在取卵之前的第1、2、3、4、5、6、7、8、甚至9天的标本中检测的预测标记浓度相对增加或相对降低之间有显著的相关性。在另一个实施方案中，受孕机会和预测标记的浓度绝对升高、绝对降低或处于平台期显著相关，检测标本来自取卵前的第1、2、3、4、5、6、7、8、甚至9天。在另一个实施方案中，取卵前第1、2、3、4、5、6、7、8、甚至9天的标本中，预测标记的浓度与受孕机会呈显著性相关。这个实施方案中的一个方面，所检测标本中的预测标记的浓度与受孕机会的显著相关性降低到二元关系(binary correlation)，从而设定一截断水平，受孕机会与检测的预测标记浓度是否高于或低于截断水平有关。

在本发明的一个实施方案中，其中取卵的时间已经用本发明中所述的一种测定法设定，IVM周期研究的受孕率大于10％，如13％、15％、18％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％，甚至40％。

本发明优选的实施方案中，选择两个预测标记，也就是抑制素A和雌二醇。正如实施例1和2中所说明的，抑制素A和雌二醇的升高预示着IVM周期的成功。

有时可以观察到雌二醇在抑制素A升高前就开始升高。在这种情况下，观察到抑制素升高时，雌二醇的浓度可能降低，或到达平台期。在这种情况下，还认为雌二醇的升高可以增加受孕成功率，因为抑制素A升高是主要因素。在FSH刺激时，尤其如此(见实施例3)。

在本发明最优选的一个实施方案中，测定法包括两种选择标记的三种特异反应和结果。第一个特异反应是在月经周期的第三天测定血清抑制素A的浓度低于10pg/ml。第二个特异反应和结果为从月经周期的第三天到取卵时抑制素A的浓度升高了80％多。第三个特异反应和结果为从第三天到取卵时雌二醇的浓度升高了87％多。因此，这个实施方案的一个方面为，妇女将在月经周期的第三天取血进行检测，并确定抑制素A和雌二醇的浓度。如果血中抑制素A的浓度低于10pg/l，本周期就不能进行IVM。但是，如果血中抑制素A的浓度高于或等于10pg/ml，那么还要在第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16天时取血进行检测，除非观察到第二个和第三个特异反应。如果观察到第二个和/或第三个特异反应，这一天就是取卵日。根据实施例2的结果，可以推测如果取卵的时间已经完全符合上述三个特异反应，IVM周期的受孕率将超过12％，如16％、22％、25％、26％，甚至28％。

正如本领域技术熟练人员所理解的，测量哺乳动物标本中预测标记为常规方法。本发明的一个方面中，测定法按照如下方式进行准备：可比较和遵守特异的反应，而不需要医生或高级医疗设备的辅助。但是，正如本领域熟练的技术人员所知，有相当一部分预测标记如果不借助贵重设备不能进行测量，因此需将标本转移至实验室中，在实验室中测定法的结果将指导哺乳动物的取卵时间。

由于浓度、相对升高、相对降低、绝对升高、绝对降低、平台期和截断值的复杂性，本发明的一个方面是一种需在考虑进行IVM治疗的月经周期中填充的图表。在一个实施方案中，图表的列代表月经周期中每一天，行代表每种预测标记，从而当获得预测标记的测量值时填写在每一格中。自动和半自动以及针对性手工计算预测标记的改变，可以很容易的解释特异反应的结果。

超声指导

在本发明中的一个实施方中，用于预测标记的测定法用作首选标准。如果满足这一标准，那么该妇女可以超声检测子宫和卵巢。如果超声测量的评价确定了：

---大量的窦性卵泡，

---前导卵泡的大小约10mm，

---一组相同形态的卵泡，

---子宫内膜厚度大约超过3毫米，和

---子宫内膜的表层结构为三层结构

成功找到可以成功取卵、体外成熟至MF-II、受精、植入和受孕的恰当时机的可能性就非常高。

在本发明优选的实施方案中，卵细胞得自具有直径为8-12毫米的卵巢卵泡的妇女。这种小卵泡的优点为它们在月经周期中的数量相当大，而不需要经过前面所述的严格的激素治疗，通过超声可以看到它们。为了找到卵母细胞，可以在超声指导下施行经阴道穿刺卵泡。

本领域的技术熟练人员将清楚其他大小卵细胞应该从其他哺乳动物体内获得。

在本发明的一个实施方案中，将妇女的月经周期常识与取卵时间结合起来。因此，通常取卵在月经周期的第6和第17天之间，也就是通常第9和第11天。

因此，在本发明的一个实施方案中，决定取卵时间的方法包括以下步骤：

a)检测哺乳动物标本中至少一种预测标记；

在该时间，a)中的特异反应结果预测哺乳动物中能在体外成熟继而受精的未受精卵的存在，

b)评价该时间与月经出血第一天的时间的关系，如果这一天在月经周期的第6天和第17天之间，则

c)评价哺乳动物的卵巢的超声图；

如果卵泡大小介于8毫米到12毫米之间，并且所有的卵泡形态一致，则

d)评价哺乳动物的子宫的超声图；

如果子宫内膜的厚度超过3毫米，并且子宫内膜的里层为三层结构，此时就是取卵的最佳时机。

但是，如果不符合上述所有步骤，那么该周期可能不适合进行IVM，取卵应推迟到下次月经周期，再重复上述步骤。

IVM卵母细胞的完成减数分裂并发育成熟的能力可以在取卵母细胞前用FSH刺激加以提高。在进行人IVM时，短暂的FSH刺激可以使每个患者中获得的卵母细胞数成倍增加，同时还可以提高在48小时后到达MF-II期的卵母细胞的比例。在本发明的一个实施方案中，在月经周期的第3天，和/或第4天，和/或第5天用激素如FSH对妇女进行治疗，然后再进行间断治疗。在实施例3中，最后一次注射和取卵之间有一延迟的FSH刺激组和无延迟的FSH刺激组相比，发现成熟率和裂解率升高。在最后一次注射和吸卵之间有一延迟的FSH刺激组中，与未刺激组的卵母细胞相比，成熟率升高，但是成熟的MF-II卵母细胞的裂解率未受影响，在这两组中均很高。就发育胜任性而言，卵泡生长的早期凋亡期或人工平台期可能模仿最终的排卵期前卵泡成熟过程。按照这种方式，可以获得雌二醇水平的人工平台期或者降低，造成卵巢中凋亡过程，结果将上述信号传至未成熟卵母细胞。预期雌二醇水平在月经周期的第10天发生这种降低。没有激素刺激，妇女的卵母细胞的取出最好在月经周期的第10天，因为据统计此时有大量的卵母细胞处在前期。

本发明的一个方面中，妇女于月经周期的第3、4和5天开始用激素如FSH治疗，然后是一个间断治疗，将对妇女有好处。在这种治疗方法中，通过监测妇女血中的雌二醇含量，挑选成熟的卵母细胞，通过没有生长(生长暂停)的卵泡进行间接测定。最终注定要凋亡的早期凋亡的卵母细胞，在施行卵泡穿刺时可以很容易的从卵巢中分离出来，并具有一个致密的团块。然后雌二醇处于平台期或下降时，获取卵母细胞。雌二醇的浓度稳定或下降是由于在月经周期的第3天和取卵日之间雌二醇的浓度提前升高。在一个实施方案中，取卵日就是雌二醇浓度升高时，也就是在雌二醇的浓度处于稳定和下降之前。在另一个优选的实施方案中，监测雌二醇的浓度还可以进一步借助于检测抑制素A的浓度加以辅助。

因此，本发明的一个实施方案是包含合适的FSH药物和上述测定法的试剂盒。任选地，试剂盒还可包括采集测定用一或多个标本的手段。

参考文献

Flood J，Chillik CF，van Uem JFHM，Iritani A，Hodgen GD.卵质输入：通过显微注射中期II的卵质使前期的胚性囊泡卵母细胞发育成熟.生育与不育，1990；53：1049-54

Cha KY，Koo JJ，Ko JJ，Choi DH，Han SY，Yoon TK.从未经刺激处理的周期中获得的人卵泡卵母细胞在体外受精后的怀孕，卵母细胞的体外培养以及在供体卵母细胞中的转移.生育与不育，1991；54：109-13

Russell JB，Knezevich KM，Fabian K，Dickson JA.未受刺激的未成熟卵母细胞的拯救：子宫内膜的刺激早期与中期卵泡.生育与不育，1997；67：616-20

Barnes FL，Kausche AK，Tiglias J，Wood C Wilton L，Trounson A.体外成熟的早期卵母细胞的胚胎制备.生育与不育，1996；65：1151-6

Trounson A，Wood C，Kaunsche A.未经治疗的多囊卵巢患者的卵母细胞的体外成熟、受精以及发育成熟.生育与不育，1994；62：353-62

Cha KY，Chung HM，Han SY，Yoon TK，Oum KB，ChungMK.应用来自未经刺激的多囊卵巢综合征患者的未成熟的卵泡卵母细胞成功地进行体外成熟、受精和怀孕.生育与不育摘要O-044；1996：Sup1.S23

Wynn P，Picton HM，Krapez J，et al.(1998).从未经刺激或经轻微刺激的患者中收集到的卵母细胞成熟的随机研究.人类生殖，13，3132-3138

Groome NP，Illingwowrth PJ and O’Brien M，et al.(1996)人的整个月经期中测定抑制素B二聚体.临床内分泌与代谢杂志，81，1401-1405。

必须清楚下述的附图和实施例是本发明实施方案的举例描述，并且本发明并不仅局限于这些。

实施例

本研究中包括月经周期正常的、因为男方的原因和/或输卵管疾病而称之为IVF/ICSI妇女83位。本研究得到地方伦理委员会的准许。本研究所涉及的所有妇女均同意写入此项研究。

监测激素的曲线(促性腺类激素，抑制素A，抑制素B，雌二醇和孕酮)。上述激素除抑制素A和抑制素B外，均用RIA(放射性免疫法)(Immuno 1，Bayer)测量，该法参见Groome所述(1996)。

在借助超声检测发现卵泡为10毫米后的那天收集未成熟卵。我们所使用的抽吸针购自Carl Wood所述的Cook公司。考虑到未成熟的卵丘或卵对机械损伤可能更易感，将抽吸压降到100mmHg，否则如果强制性地从少量的液体中将卵吸入针的顶端，小卵泡中的针会直接损伤卵细胞。

对卵泡进行穿刺。吸取卵后，用Trounson所述的含有Hepes的Earle平衡盐液和碳酸氢钠缓冲液加肝素(100IU/ml)冲洗针头。

吸出的卵泡转入试管中送至实验室，并在孔径为70微米的胚胎过滤膜上冲洗。红细胞和其他小细胞透过滤膜而被洗掉，将卵母细胞和较大的细胞片段收集在培养皿中。根据是否出现堆积细胞对未成熟的卵母细胞进行鉴别和分级为全部多层的、稀疏的或裸露的。

卵母细胞在含有0.3mM的丙酮酸钠，重组FSH 0.075IU/ml(Gonal-F；Serono)，hCG 0.05IU/ml(Profasi；Seronao)，和白蛋白1％的组织培养基199(TCM199，Sigma)或BBEM(Medicut，丹麦)中成熟。随后再往培养基中添加雌二醇1μg/ml和高浓度的HAS(5％)，或用患者的血清(10％)来替代白蛋白。

用透明质酸酶(IVFScience；Serono)脱去卵母细胞核，并进行机械吹打。用Puresperm^TM(Cryos，丹麦)梯度分离法或泳动法制备有运动能力的精子。为了进行ICSI，将去核的卵母细胞单独放入5微升的精子制备培养基(Medicult，丹麦)的液滴中，并将2微升的精子混悬液放入10微升的PVP(IVF Science，瑞典)滴中。所有MF-II的卵母细胞用ICSI法进行受精，然后将其放入10微升的BBEM液滴中，在37℃，5％CO2，潮湿的空气中进行培养。在大约受精10-20小时后，放大300倍检测卵母细胞是否存在原核，这是成功受精的标志。胚胎培养到2天或3天(0天＝受精日)，此时将合适数量的胚胎(最多为2个)放入妇女体内。合适的胚胎可以进行分裂。

实施例1：IVM周期中抑制素A和雌二醇的分析

来自83位受试者统计数据见表1，可以获得有关的内分泌学参数，这83位受试者治疗周期有10位怀孕。

表1怀孕妇女与未孕妇女的比较

未孕者怀孕者 P值

均值±标准差均值±标准差 T检验^*

第3天时血清抑制素A(pg/ml) 9.0±3.1 7.4±0.7 0.1

第3天时血清雌二醇A(nmol/l) 0.15±0.08 0.14±0.03 0.7

OPU时血清抑制素A(pg/ml) 16.3±9.2 19.6±6 0.28

从第3天抑制素A升高(％) 87±93 164±73 0.01

OPU时血清雌二醇(pg/ml) 0.35±22 0.48±26 0.1

从第3天雌二醇A升高(％) 157±138 246±224 0.08

抑制素A升高×雌二醇升高(％²) 17607±26753 49433±61156 0.005

^*应用非配对检验。数据并不按正态分布。

表1表明怀孕组妇女第3天抑制素水平升高的程度非常高，而雌二醇升高的并不明显，并且抑制素A升高水平与雌二醇升高的乘积，怀孕组非常显著的高。

随后分析血清抑制素A和雌二醇单独能够区分治疗有效者和治疗无效者的能力。为了进行此项研究，使用不同的区别因素，并确定数据和怀孕之间在统计学上的相关性。

表2区别因素：第3天时血清抑制素A低于10(pg/ml)

未孕者受孕者 P值^*

第3天时抑制素A低于10 51 10 0.03

第3天时抑制素A高于或等于10 22 0

^*Fisher Exact检验

表3区别因素：第3天时血清抑制素A低于9(pg/ml)

未孕者受孕者 P值^*

第3天时抑制素A低于9 43 9 0.04

第3天时抑制素A高于或等于9 30 1

^*Fisher Exact检验

表4区别因素：血清中抑制素A从第3天到OPU日至少升高80％

未孕者受孕者 P值^*

抑制素A升高＞80％ 35 10 0.001

抑制素A升高＜80％ 38 0

^*Fisher Exact检验

表5区别因素：血清中抑制素A从第3天到OPU日至少升高100％

未孕者受孕者 P值^*

抑制素A升高＞100％ 30 8 0.02

抑制素A升高＜100％ 43 2

^*Fisher Exact检验

表6区别因素：血清中雌二醇从第3天到OPU日升高超过87％

未孕者受孕者 P值^*

雌二醇升高＞87％ 47 10 0.02

雌二醇升高＜87％ 26 0

^*Fisher Exact检验

表7区别因素：血清中雌二醇从第3天到OPU日升高至少100％

未孕者受孕者 P值^*

雌二醇升高＞100％ 41 9 0.04

雌二醇升高＜100％ 31 1

^*Fisher Exact检验

将抑制素A和雌二醇结合起来分析区分治疗有效和无效的情况。

表8区别因素：抑制素A和雌二醇从第3天到OPU日升高的乘积至少为7500(％×％)

未孕者受孕者 P值^*

＞7500 46 10 0.004

＜7500 37 0

^*Fisher Exact检验

表9区别因素：血清中抑制素A至少升高80％的组中血清中雌二醇从第3天到OPU日升高至少87％

未孕者受孕者 P值^*

抑制素A和雌二醇升高大于85％和87％ 38 10 0.2

抑制素A升高80％和雌二醇升高低于87％ 7 0

^*Fisher Exact检验

表10区别因素：抑制素A从第3天到OPU日未升高组中血清雌二醇从第3天到OPU日升高大于87％

未孕者受孕者 P值^*

雌二醇升高大于87％和抑制素A升高大于80％ 38 10 0.03

雌二醇升高大于87％和抑制素A升高低于80％ 19 0

^*Fisher Exact检验

表11抑制素A未升高的作用

未孕者受孕者

雌二醇升高低于87％和抑制素A未升高 20 0

雌二醇升高低于87％和抑制素A升高大于80％ 7 0

表12雌二醇未升高的作用

未孕者受孕者

抑制素A升高低于80％和雌二醇未升高 20 0

抑制素A升高低于80％和雌二醇升高大于87％ 19 0

上面的数据表明血清中抑制素A的水平为预测IVM成功的一个非常有效的指标。这些数据表明试验中的未受孕者，其体内抑制素A的水平在月经周期的第3天高于10pg/ml(表2)。再者，只有在月经周期的第3天抑制素A高于9pg/ml时才可以受孕(表3)。

不仅第3天抑制素A的绝对水平可以用来预测IVM的成功，而且血清中抑制素A从第3天到取卵(OPU)日的升高也可以。因此，有效周期与第3天到OPU日血清抑制素A升高至少80％呈显著相关(表4和表5)。

有关雌二醇的数据表明有效周期与从第3天到OPU日血清雌二醇升高至少87％相关(表6和表7)。

血清抑制素A与雌二醇伴随性升高似乎是预测IVM成功的一个更好指标。从第3天到OPU日抑制素A和雌二醇升高的乘积是预测有效周期的一个非常好的指标(表8、表9和表10)。另外，如果从第3天到OPU日抑制素A没有达到80％，将预示着受孕失败(表11)，抑制素A升高而雌二醇并不升高，也不会受孕(表12)。

实施例2：用抑制素A和雌二醇参数预测分析IVM周期

用实施例1已经肯定的参数的预测效应，经分析抑制素A和雌二醇来确定哪些周期应可以取卵。

表13删除第3天抑制素升高周期的效应

未孕者受孕者受孕率(％)

所有周期 83 10 12.1

第³天抑制素A低于10(pg/ml)的周期 62 10 16.1

第³天抑制素低于9(pg/ml)的周期 52 9 17.3

表14删除抑制素A在OPU日未升高的周期的效应

未孕者受孕者％

所有周期 83 10 12.1

仅第3天至OPU日抑制素A升高

大于80％的周期 45 10 22.2

表15删除抑制素A在第3天为10(pg/ml)或更高，或者抑制素A并未在OPU日未升高80％以上的周期的效应

未孕者受孕者％

所有周期 83 10 12.1

所选周期 40 10 25.0

表16删除抑制素A在第3天为10(pg/ml)或更高，或者抑制素A和雌二醇从第3天至OPU日的升高乘积低于7500％的周期的效应

未孕者受孕者％

所有周期 83 10 12.1

所选周期 38 10 26.3^*

^*与“所有周期”相比显著不同(p＜0.05，CHI2-检验)

表17删除抑制素A在第3天为10(pg/ml)或更高，或者抑制素A和雌二醇在OPU日未升高的周期的效应

未孕者受孕者％

所有周期 83 10 12.1

所选周期 35 10 28.6^*

^*与“所有周期”相比显著不同(p＜0.05，CHI2-检验)

这些数据提示注定不能受孕的周期可以删除，这要根据在治疗的早期测量抑制素A和治疗晚期测量抑制素A和雌二醇含量(表13、表14、表15、表16、表17)而进行。这些测量结果将极大地提高IVM周期的效率。这些收集的数据提示每位患者可以在早期高抑制素A(未受孕者)水平的周期和早期低抑制素A(受孕者)水平的周期之间进行交替使用。

实施例3：FSH刺激的影响

卵泡的未成熟卵母细胞自发恢复减数分裂最初是由Pincus和Enzman于1935年证实的。来自小卵泡的人类卵母细胞可以恢复并完成体外的减数分裂，但远远低于其他种类的哺乳动物(Edward，1965)。已经有未受刺激的卵母细胞成功进行成熟实例报道(Cha etal，1991；Trounson et al，1994；Barnes et al，1996；Russell et al，1997)，当对这些卵母细胞进行精子胞浆内注射(ICSI)(Russellet al，1997)时，可获得高受精率，但是据报道发育潜能则低(Chaand Chian，1998；Barnes et al 1996)。与常规IVF相比，IVM操作规程相对简单，治疗时间较短，从而降低了治疗成本。另外，尤其还可以避免由过度刺激综合征时卵巢超排卵的负作用。尽管到目前为止人类的受孕率还非常低，但是实验动物的成功结果却非常鼓舞人心。FSH刺激的猴子已经表明，可以提高卵母细胞核和胞质的成熟(Schramm和Bavister，1994)。卵泡中FSH含量的升高与产生一个阳性信号有关，这样可以在人体内完成卵母细胞的成熟(Gomez，et al，1993)，并且FSH短期刺激表明可以提高到达MII期(Wynn et al，1998)的卵母细胞的百分比。

在随机的前瞻性研究中，我们调查研究了体外成熟的未成熟的卵母细胞的发育潜能是否可以在排卵前用FSH刺激加以提高。

材料与方法

本研究中所使用的病例为由于男方因素和/或输卵管疾病而进行IVF/ICSI的夫妇。妇女的年龄至少18岁最大不超过38岁，具有正常的排卵周期，平均为24天-35天，体重指数(BMI)介于18-29kg/m²。剔除所有由内分泌异常而引起不育的患者如高催乳素血症、多囊卵巢综合征和以前受卵巢控制的过度刺激周期，在上述疾病中每次只获得小于3个卵母细胞。再者，还将所有的在月经周期的第3天，FSH值(＞15IU)高的妇女剔除。

该研究还经过地方伦理道德委员会的批准。参与研究的所有夫妇均签合同同意。第一个实验为随机预测研究，包括20名因为男方原因计划接受ICSI治疗的患者。将这些妇女随机分为两组。第一组(n＝10)不接受刺激，第二组(n＝10)用重组-FSH刺激(Gonal-F，Serono)，剂量为150IU/天，从月经周期的第3天开始给药3天。经超声观察前导卵泡达到10mm后进行取卵。所有卵母细胞在进行ICSI前，先在体外成熟36小时。

第二个试验包括连续的12对夫妇。所有妇女在取卵前均用重组FSH(Gonal F，Serono)刺激，从月经周期的第3天开始每天给药150IU。有5位患者接受与第一个实验中的第2组相同的刺激，给药剂量为150IU/天，共3天，经观察前导卵泡达到10mm后取卵。余下的7位患者继续刺激，直到卵泡达到10mm，在72小时后取卵。所有的卵母细胞继续培养48小时，直到用ICSI进行受精。

所有患者在月经周期第3天进行阴道超声，并测定FSH、LH、雌二醇、抑制素A和抑制素B的基础水平。从月经周期的第3天开始直到取卵那天连续观察上述激素水平。终止一个卵巢囊肿的病例观察。第二次超声检查在第6-7天进行，随后每天进行超声检查或间隔2-3天进行一次检查，这取决于卵泡大小。

在这两个实验中，子宫内膜刺激有以下步骤组成：取卵母细胞日开始用17-β-雌二醇，用法为每日3次，每次口服2毫克。子宫内膜的厚度超声观察＜6毫米的那天不能进行取卵。在取卵后的两天，开始使用阴道内黄体酮栓剂治疗，并一直持续到妊娠检测。如果妊娠检测呈阳性，雌激素和黄体酮一直用到妊娠50天为止。

如Trounson等(1994)所述，用已经减压的17-G Cook针经阴道取卵母细胞。将卵泡吸取液转入试管，送至实验室，并在孔径为70微米的胚胎滤膜上进行冲洗。按照Smith等人(1998)所介绍的详细方法进行成熟和受精，简单地说，卵母细胞在组织培养基199(TCM199；Sigma，Roedovre，丹麦)中成熟，培养基中含有丙酮酸钠0.3mM，1500IU/ml青霉素G，50mg/ml硫酸链霉素，雌激素1μg/ml(均购自Sigma)，重组FSH0.075IU/ml(Gonal-F，Seronao)，hCG0.5IU/ml(Profasi，Serono)，和患者的血清(10％)。患者的血清是在取卵那天采集的。卵母细胞在25微升上覆盖矿物油的IVM培养基液滴中于37℃，5％CO₂分别培养。在经历胚泡降解后，当核膜缺失时就可以鉴别出卵母细胞；当第一极体伸出时表明卵母细胞为成熟的MII期卵母细胞。

用所有MII期卵母细胞进行ICSI受精。卵母细胞随后放入10微升的IVF培养基(Medicult，丹麦哥本哈根)，并在Falcon培养皿中在油下培养至受精后的2天。胚胎计数为1-4个，第1型和第2型(＜10％分段)可以进行转移(Deschacht，et al，1988)。最多可以转2个胚胎。胚胎发育率就是所有注射进的卵母细胞中可用于转移的胚胎数。植入率就是在所有的替代胚胎中，经超声检查所见的妊娠囊数。

超声检测

同一个观测者用7.5Mhz经阴道传感器(Bruel & Kjaer)进行阴道超声扫描，检测卵泡直径。卵泡直径可通过在同一个扫描平面中，检测卵泡的赤道轴(最长轴)和与之垂直的轴的方法来计算。

统计方法

用Students T检验进行统计学分析。由于没有任何一种激素变量呈正态分布，所以非参数Mann-Whitney U检验用来分析非配对数据之间在统计学上的显著性差异，以及用Pratts检验来分析配对数据。显著性水准值为p＜0.05。

结果

患者

在实验1中，非FSH刺激组妇女的中位数年龄为31岁(范围在28-36岁)，而接受FSH刺激组妇女的中位数年龄为32岁(范围在28-36岁)。这不同于第二个实验中妇女的中位数年龄，即32岁(范围27-37岁)。其他临床特征包括患不孕症的时间、不孕症的病因和先前IVF周期的次数所有组均相似。

第一个实验：成熟与胚胎发育

在第一个实验中，包括20位患者，77个卵母细胞用于IVM，36小时后62个(81％)成熟为MFII期。用ICSI技术受精后，有49个(79％)见到2PN(两原核)，其中有45个(72％)进行卵裂。胚胎发育率为40/62(65％)，植入率5/33(15％)。每次临床受孕率为5/20(25％)。一名妇女在怀孕8周受孕失败，其余的正常。FSH刺激对卵母细胞成熟、受孕率卵裂率没有表现出任何效应，对发育也同样如此(表18)。共观察到5人受孕。一人生下一位健康男孩，一人在妊娠的第8周失败，其余的均超过32周。

激素分布曲线

在这两组中，妇女体内的雌二醇、FSH、LH、抑制素A和抑制素B的含量在月经周期的第3天和取卵那天时并没有表现出差异(表19)。在非刺激组中，卵泡期血清FSH含量与刺激组相比也没有差异，尽管观察到在个体之间存在很大的变异。非刺激组血清雌二醇的的水平从月经周期第3天到第6-7天时维持在相同的水平。但在取卵时则发现显著的升高。刺激组的雌二醇浓度在取卵前发生较早(第6-7天)的升高平台期。在这两组中均未发现提前出现的LH峰值。

抑制素A的水平与雌二醇表现出相同的模式，即刺激组早期升高，而非刺激组晚期升高。非刺激组中抑制素B的含量升高的比抑制素A早(6-7天)。此时，也发现刺激组升高，而其含量为为非刺激组的3倍，但是从第6-7天到取卵时抑制素B就显著地降低。

第二个实验

第二个实验包括12位妇女，有38个卵母细胞用于IVM，在48小时后，有27个卵母细胞(71％)成熟，并用ICSI受精。受精率和卵裂率分别为61％和53％。这与第一个实验中的受精率和卵裂率没有差别。15个胚胎转入10位患者体内，没有进行冰冻保存。一个怀孕者生下一个健康女孩。本组的胚胎发育为56％，植入率为7％。延长刺激的时间，从3天延长到6天，用量为150IU/天，直到卵泡直径为10mm为止，在取卵时，我们获得增大的卵泡，并且血清雌二醇含量也升高，但是每次取卵时获得的卵母细胞数并不增加(表20)。

安全性

在本研究中未观察到由于妇科感染、出血或腹痛而需要住院治疗的情形。

讨论

据我们所知，这是首次对取卵母细胞经体外成熟、植入率为15％，受孕率达25％的报道。本实验中未成熟的卵母细胞的行为与经过超排卵后取的卵以及体内成熟卵(Meldrum，et al，1998)几乎一样。

非刺激组周期正常的妇女卵母细胞的数量与Barnes等人(1996)的研究中所获得和成熟的卵母细胞没有差异。预先用重组的FSH治疗的患者并不能提高获得的卵母细胞数。以前的研究结果存在争议。Wynn等(1998)报道用FSH刺激的月经周期正常的妇女，与未受FSH刺激的组妇女相比获得卵母细胞数量升高，但Trounsond等并没有发现获得卵母细胞有任何差异。以前的研究提示募集到的卵泡数在先导黄体期(Goμ geon和Testart，1990)就是一定的，以及一个短期的早期的FSH刺激并不改变募集到的非成熟卵母细胞数。这与本实验中的结果相一致。第2个实验中，FSH数量和卵泡大小均增加，我们发现不能提高获取卵母细胞的数量。这与以前发表的文章的结果一致(Templeton等)，从不含有hCG的大卵泡中获得卵母细胞非常低。

本研究中，卵母细胞的成熟、受精和分裂率与以前的研究结果相符合，但是我们获得了更高的受孕率以及更高的植入率，表明提高IVM卵母细胞的胚胎发育。很多因素可以解释这一现象。IVM卵母细胞的胚胎发育可以用预先FSH刺激加以提高。恒河猴中，短期的FSH刺激可以提高成熟和分裂率(Schram和Bavister)。对人而言，将来自刺激周期的未成熟的卵母细胞进行转移，可以怀孕(Nagy等，1996；Liu等，1997；Jaroudi等1997；Edirisinghe等，1997)。

最近，Wynn等(1998)报道预先用FSH进行治疗后，可以提高卵母细胞的成熟率。但是在第一个实验中，在取卵母细胞之前用FSH刺激妇女，并不能提高体外成熟率。有两种可能的解释：(1)使用的培养条件或(2)取卵时间。受精的时间和培养条件是非常重要的因素，有关这些方面的讨论参见Smith等(1999)。在Wynn等人的研究中取卵母细胞是固定的一天(月经周期的第7天)，而在本研究中，取卵的时间根据卵泡大小。刺激组(平均9天)取卵时间比未受刺激组(平均10天)(表19)要早，但是两组取卵的时间均是用同样的方法确定的。卵泡大小可以用超声进行监测，当前导卵泡达到10mm时进行取卵。

Wynn等(1998)还对MII期卵母细胞未受精进行了研究。本研究中，FSH刺激对受精率和分裂率均没有任何影响。这与Trounson等(1998)的研究结果一致。他们报道自然经期的妇女用重组FSH治疗3天并不影响卵母细胞在体外的成熟率和受精率。我们从以前的研究中知道，卵泡期的FSH在第3天的含量存在的广泛的个体之间的差异，并表现为FSH的最大浓度在个体间存在显著变异(Schipper等，1998)。FSH水平在个体间的变异可以反映FSH的阈值不同，以及卵巢对FSH的敏感性不同，这可能是成熟率和受精率没有差异的一个原因，尽管FSH水平不同。

我们发现非刺激组在取卵那天血清雌二醇和抑制素A的浓度升高，并且认为这与优势性卵泡的选择一致(Shipper等，1998)。抑制素B的浓度升高要早于抑制素A，二者的浓度一直维持到取卵那天。这符合以前的研究(Schipper等，1998；Groome等，1996)，并与我们超声图像相符，因为取卵那天就在10mm的优势卵泡出现之后。这提示来自这些患者体内用于IVM的卵母细胞可以从最终要发生闭锁的萎缩卵泡中获得，同时我们发现卵母细胞的发育不受闭锁早期的负性影响。这在以前的牛实验中得到证实(Smith等，1996)。

抑制素A和B的生成均有赖于促性腺激素(Lockwood等，1996)，在本研究的促性腺激素组中，在用FSH刺激时，发现抑制素A和抑制素B的含量均升高了3倍。从月经周期的第6-7天到取卵时血清中抑制素A和抑制素B的含量均显著降低，这种现象与非生长卵泡相符(Price，等，1995)。

获取和挑选用于IVM的卵母细胞的时间要根据其他种属哺乳动物的经验进行(Eppig，等，1992；Edwards等1965)，但是还有人卵母细胞恢复减数分裂并完成成熟的能力，具有卵母细胞体积大小依赖性(Durenzi，等，1995)。Tsuji等(1985)发现来自小卵泡(3-4mm的卵母细胞成熟率与来自大卵泡(9-15mm)的卵母细胞相比下降。Dubey等(1995)还观察到来自体积减小的超排卵卵泡的卵母细胞的受精率下降。直径为10-14mm卵泡中的卵母细胞有58％的受精，直径为22-26mm的卵泡中的卵母细胞有74％的受精。本研究中，在第二个实验中我们发现，用高剂量的促性腺激素刺激后的大卵泡中的卵母细胞可以成熟与分裂(表20)，但是当在超声观察到前导卵泡出现进行取卵时，直径为8-10mm的卵泡中的卵母细胞也具有发育能力。Russell等(1998)研究发现在优势卵泡的直径超过14mm时所获取的未成熟的卵母细胞，其成熟率和受精率显著地降低。这说明可能存在一个关键点，此时选择进程对存在的卵泡有副作用。监测卵泡的直径可能非常有用，因为这是一种挑选可以用于体外成熟的卵母细胞的切实可行的方法。许多因素而不是卵泡大小似乎限制了IVM系统的效应。子宫内膜的刺激为另一因素。在一个未成熟的卵母细胞周期中，来自优势卵泡的合适的内源性雌二醇缺乏。因此需要外源性刺激，并且受试者必须与胚胎发育植入窗口同步(Russell等1997)，发现成熟率和受精率升高，在用雌二醇刺激的中期卵泡开始与早期的子宫内膜刺激相比。我们从接受供体卵母细胞的受者的激素替代中获知，两天大小的胚胎最适合转移到暴露在黄体酮的第3天或第4天的子宫内膜腔中(Rosenwaks，等1987)。我们目的是尽可能接近地模拟正常刺激，并且在取卵时开始使用雌二醇，并在两天后再补充黄体酮。期望在用FSH刺激的患者中雌二醇的浓度从月经周期的第6-7天开始升高，可能比没有刺激的患者的子宫内膜作更好的准备，雌二醇的升高只在取卵之前。我们并未发现两组的植入率有差异，这与以前的研究相符，因为在卵泡期血清中雌二醇浓度与植入率之间没有发现有相关性(Younis等1996；Remohi等，1997)。

这些研究结果需要在更多的患者中进一步证实。从上述结果中可以获得一个非常诱人的替代方法，用于体外受精的可控性卵巢过度刺激。该方法除可以降低副作用获得有益的临床效果外，尤其还可消除过度刺激综合征，这种治疗可以降低IVF的费用。最近用于卵巢刺激的药物广泛的应用已经受到Edwards等人(1997)的质疑。许多尝试在自然月经周期下而不用外源性促性腺激素进行IVF。未成熟的卵母细胞拯救与IVM结合在一起可以提高自然周期下的IVF的成功率。在IVF/ICSI中，由于男方原因大多数妇女能够合成她们自身的FSH，帮助刺激卵巢卵泡，这可以用于IVM。低剂量的FSH刺激与自然周期对胚胎发育相比没有益处。但是还需要用更多研究对这一观点加以阐明。

表18第一个实验中获得的用于IVM的卵母细胞的数量、成熟率、受精率、分裂率和受孕率

患者数 IVM卵母 MFII数 2PN受精数分裂数胚胎周期冰冻临床植入

细胞数 (％MF-II) (％MII) (％MII) 转移数保存数受孕数

无FSH 10 37 28(76) 23(62) 20(54) 16 9 2 3 3

36小时IVM

+FSH 10 40 34(85) 26(65) 25(62) 17 9 5 2 2

36小时IVM

表19第一个实验中的两组在第3天、第6-7天和取卵日时激素水平

第一组第二组

未刺激重组FSH刺激

周期数 10 10

取卵日平均值(范围) 10(8-12) 9(8-11)

血清FSH IU/ml平均值(范围)

第3天 6.6(4.5-12.7) 7.3(5.1-10.9)

第6-7天 4.6(3.7-10.0) 7.3(5.4-15.8)

取卵日 7.3(5.1-10.9) 4.6(3.7-10.0)

血清雌二醇nmol/l平均值(范围)

第3天 0.12(0.07-0.44) 0.15(0.07-0.25)b

第6-7天 0.17(0.11-0.47)^a，b 0.33(0.17-3.7)^a，b

取卵日 0.47(0.12-1.20)^b 0.32(0.13-1.08)

血清LH IU/ml平均值(范围)

第3天 5.6(2.4-11.6) 6.1(3.2-10.9)

第6-7天 8.7(5.0-10.2) 3.1(0.9-8.3)

取卵日 6.9(4.2-11.8) 6.1(3.6-12.2)

血清抑制素A平均值(范围)

第3天 9(8-26) 8(＜7-17)b

第6-7天 17(7-29)^a，b 45(16-89)^a，b，c

取卵日 24(12-52)^b 18(＜7-60)^c

血清抑制素B平均值(范围)

第3天 105(＜20-205)^b 153(82-174)^b

第6-7天 119(66-327)^a，b 449(143-2693)^a，b，c

取卵日 121(81-175) 107(66-365)^c

a.p＜0.05，b.p＜0.05，c.p＜0.05

表20第二个实验中低剂量和高剂量的促性腺激素刺激时获得用于IVM的卵母细胞的数量、成熟率和分裂率

患者数注射次数取卵日卵泡大小取卵日雌二醇卵母 MII数分裂胚胎怀孕

中位数中位数中位数中位数细胞数 (％) 转移数

(范围) (范围) (范围) (范围)

低剂量 5 6 9 10 0.3 21 15(71％) 10(66％) 7 1

重组FSH (8-11) (7-15) (0.05-1.89)

48hIVM

高剂量 7 9 10 14 1.56 17 12(71％) 10(83％) 8

重组FSH (6-12) (9-12) (10-16) (1.53-5.19)

48h IVM

Claims

1、用于检测来自哺乳动物的机体分泌物、痰、血液、血清或尿的标本中抑制素A或雌二醇的存在或量的测定法在预测哺乳动物中何时存在能在体外成熟并继而受精的未受精卵中的应用，所述测定法包括：

a)在月经周期的不同时间从雌性哺乳动物获得标本；

b)测定抑制素A或雌二醇的存在或量；

c)比较抑制素A或雌二醇的相对浓度与基准，以确定是否存在

能在体外成熟并继而受精的未受精卵；以及

d)随后从所述哺乳动物取卵子。

2、根据权利要求1的应用，其中所述预测包括预测哺乳动物中何时存在能在体外成熟并继而受精、裂解、植入和受孕的未受精卵。

3、根据权利要求1或2的应用，其中机体分泌物是子宫分泌物。

4、根据权利要求1的应用，其中标本为血清标本。

5、根据权利要求1或2的应用，其中哺乳动物为灵长类。

6、根据权利要求5的应用，其中灵长类是人。

7、根据权利要求1或2的应用，其中所述激素、小肽激素或肽激素的存在或量由免疫分析法和/或PCR反应测定。

8、确定吸出时机的方法，所述吸出时机即哺乳动物中存在能在体外成熟并继而受精的未受精卵的时机，所述方法包括：

a)在月经周期的不同时间从雌性哺乳动物获得标本；

b)测定抑制素A或雌二醇的存在或量；

c)比较抑制素A或雌二醇的相对浓度与基准，以确定是否存在能在体外成熟并继而受精的未受精卵；以及

d)随后从所述哺乳动物取卵子。

9、根据权利要求8的方法，其中标本选自来自哺乳动物的机体分泌物、痰、血液、血清或尿。

10、根据权利要求8或9的方法，其中标本为血样。

11、根据权利要求8或9的方法，其中哺乳动物为灵长类。

12、根据权利要求11的方法，其中灵长类为人。

13、根据权利要求8或9的方法，其中所述时机通过在月经周期第3天血清标本中抑制素A的量低于10pg/ml，以及血清标本中抑制素A的量从月经周期第3天至取卵日升高大于80％而确定。

14、权利要求8或9的方法，其中所述机体分泌物是子宫分泌物。

15、权利要求8或9的方法，其中所述时机通过血清标本中雌二醇的量从月经周期第3天至取卵日升高大于87％而确定。