JP6170103B2 - オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動のための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本願は、35U.S.C.§119(e)に従い、2011年4月14日に出願された米国仮特許出願第61/475,561号明細書及び2012年2月17日に出願された米国仮特許出願第61/600,505号明細書の利益を請求する。尚、これらの文献の全開示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
この研究は、国立老化研究所助成金(National Institutes on Aging Grant)第NIHR37−AG012279号及び国立衛生研究所研究サービス賞(National Institutes on Health Research Service Award)(F32−AG034809)によって一部資金援助を受けた。政府は、本発明に所定の権利を有する。
本発明は、EFS−WebによりASCII形式で提出された配列表を含み、その全内容を参照として本明細書に組み込むものとする。2012年6月25日に作成された前記ASCIIのコピーは、88511WO5.txtと称し、サイズは15,448バイトである。
(1) i)卵原幹細胞(OSC)ミトコンドリア、又は
ii)OSCの子孫から単離されるミトコンドリア
を含み、そして卵母細胞へ移入される、体外受精(IVF)又は人工授精のための卵母細胞を調製するための組成物であって、ここで、該OSCは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりStage-Specific Embryonic Antigen(SSEA)を発現する、
組成物。
(2) 卵母細胞が、受精卵を形成するために卵母細胞をインビトロで受精させることを含む体外受精方法で用いられる、前記(1)に記載の組成物。
(3) 組成物の自己卵母細胞への移入と卵母細胞の受精が実質的に同時に行われる、前記(2)に記載の組成物。
(4) 卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から得られる自己ミトコンドリアを含み、そして卵母細胞へ移入される、卵母細胞のATP生産能を増大させるための組成物であって、ここで、該OSCは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離される非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現する、
組成物。
(5) 少なくとも1つのOSC又は少なくとも1つのOSCの子孫から単離されたミトコンドリアを含み、そして卵母細胞へ注入される、卵母細胞のATP生産能を増大させるための組成物であって、ここで、該OSCは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離される非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現する、
組成物。
(6) 卵母細胞の体外受精方法で用いるための組成物であって、該組成物は卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から取得された単離されたミトコンドリアを含み、該組成物は体外受精用の卵母細胞を調製するために卵母細胞へ移入されるものであり、ここで、該OSCは該卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離される非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現する、
組成物。
(7) 卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から取得された単離された機能的なミトコンドリアを含む、卵母細胞へ移入するための組成物であって、ここで、該OSCは単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現する、
組成物。
(8) ミトコンドリアが遠心分離によって単離される、前記(1)〜(7)のいずれか一項に記載の組成物。
(9) ミトコンドリアが、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって単離される、前記(1)〜(7)のいずれか一項に記載の組成物。
(10) 組成物が、1×103〜5×104個のミトコンドリアを含む、前記(1)〜(9)のいずれか一項に記載の組成物。
(11) OSC又はOSCの子孫が、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、mtDNA fg当り少なくとも5倍多いATPを生産する、前記(1)〜(9)のいずれか一項に記載の組成物。
(12) 卵巣体細胞又は間葉系幹細胞が自己である、前記(11)に記載の組成物。
(13) 組成物が、
(a)OSC又はOSCの子孫に由来するミトコンドリア精製調製物である、又は
(b)OSC又はOSCの子孫の核を含まない細胞質である、
前記(1)〜(12)のいずれか一項に記載の組成物。
(14) 組成物が、注入によって卵母細胞へ移入される、前記(1)、(4)又は(6)のいずれか一項に記載の組成物。
(15) 卵母細胞が体外受精に用いられる、前記(4)又は(5)に記載の組成物。
(16) 組成物が、卵細胞質内精子注入と実質的に同時に該卵母細胞へ移入される、前記(1)、(2)、(3)、(6)又は(14)のいずれか一項に記載の組成物。
(17) OSCが卵巣組織から単離される、前記(7)に記載の組成物。
(18) OSCが、母体年齢の高いヒト女性から単離される、前記(1)〜(17)のいずれか一項に記載の組成物。
(19) ミトコンドリアの2%超、5%超、10%超、又は20%超が機能的なミトコンドリアである、前記(1)〜(17)のいずれか一項に記載の組成物。
(20) 組成物中の機能的なミトコンドリアの少なくとも75%、85%又は90%が高ATP生産能ミトコンドリアである、前記(1)〜(19)のいずれか一項に記載の組成物。
(21) OSC又はOSCの子孫が、卵巣体細胞よりmtDNA fg当り少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、又は少なくとも10倍多いATPを生産する、前記(1)〜(10)又は(13)〜(19)のいずれか一項に記載の組成物。
(22) 卵巣体細胞が、OSC又はOSCの子孫に対して自己である、前記(21)に記載の組成物。
(23) OSC又はOSCの子孫が、間葉系幹細胞よりmtDNA fg当り少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、又は少なくとも10倍多いATPを生産する、前記(1)〜(10)又は(13)〜(20)のいずれか一項に記載の組成物。
(24) 間葉系幹細胞が、OSC又はOSCの子孫に対して自己である、前記(23)に記載の組成物。
(25) ミトコンドリアの2%、5%、10%、又は20%超が機能的なミトコンドリアであることを、工程:
(a)蛍光ミトコンドリア追跡用プローブを組成物中のミトコンドリアと結合させること、ここで、当該追跡用プローブは、非酸化依存性プローブ、蓄積依存性プローブ、又は還元型酸化状態プローブよりなる群から選ばれるものである;
(b)追跡用プローブの結合に基づいてミトコンドリアを選別すること;及び
(c)追跡用プローブに結合したミトコンドリアの割合に基づいて機能的なミトコンドリアの割合を決定すること、
によって確認する、前記(19)に記載の組成物。
(26) 自己卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から単離された外来性の機能的なミトコンドリアを含む、卵母細胞であって、ここで、該OSC又はOSCの子孫は卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現する、
卵母細胞。
(27) 工程:
(a)卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から得られた1つ又はそれ以上の自己ミトコンドリアを含む組成物を得ること、ここで、OSCは卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現するものである;及び
(b)組成物を卵母細胞へ移入すること
を含む方法で調製された、卵母細胞。
(28) 組成物が、注入によって卵母細胞へ移入される、前記(27)に記載の卵母細胞。
(29) 該OSC又はOSCの子孫は該卵母細胞に対して自己である、前記(7)に記載の組成物。
別途定義されていない限り、本明細書で用いる技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。不一致が生じる場合には、定義を含む本願が優先されるものとする。
OSCの単離
小さな(例えば、3×3×1mm)卵巣皮質生検を採取するための、当分野では公知の小規模な腹腔鏡手術を用いて、成体卵巣皮質組織を得ることができ、次に、これをOSC単離のために処理する。Gook et al.,Human Reproduction,2004 20(1):72−78を参照。
ミトコンドリアの作製及び移入方法は、当分野では公知であり、当分野で既述されているように、又は同等の技術を用いて、実施することができる。例えば、Perez et al.,Cell Death and Differentiation 2007 3:524−33.Epub 2006 Oct 13、及びPerez et al.,Nature 2000,403:500−1(これらの各内容は、参照として本明細書に組み込む)を参照されたい。手短には、前述したように、OSCを単離した後、培養することができる。一方法では、OSC培養物が、80%培養飽和密度に達したら、2mlのミトコンドリア溶解バッファー(0.3Mショ糖、1mM EDTA、5mM MOPS、5mM KH2PO4、0.1%BSA)を各プレートに添加し、セルスクレーパーを用いて、細胞を回収する。細胞懸濁液を小ガラス製組織ダウンサーに移して、滑らかになるまで均質化(約10往復行程)した後、溶解物を4℃にて30分間600gで遠心分離する。上澄みを回収し、4℃にて12分間10,000gでスピンした後、得られた粗ミトコンドリアペレットを0.2mlの0.25Mショ糖中に再懸濁させる。次に、このサンプルを0.25Mショ糖で希釈した25〜60%パーコール(Percoll)密度勾配で積層する。界面バンドを勾配から抽出して、2容量の0.25Mショ糖で洗浄した後、4℃にて10分間14,000gでの最終遠心分離にかけることにより、ミトコンドリアペレットを得る。
免疫磁気分離によってマウスOSCを単離するために、Zou et al.,Nat Cell Biol 2009 11:631−636によって用いられるVASA抗体は、ヒトVASAのCOOH−末端の最後の25アミノ酸に対するウサギポリクローナルである(DDX4)(ab13840;Abcam,Cambridge,MA)。この領域は、マウスVASA(MVH)の対応領域と96%の全体相同性を共有する。比較研究のために、ヒトVASAのNH2−末端の最初の145アミノ酸に対するヤギポリクローナル抗体(AF2030;R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いたが、これは、マウスVASAの対応領域と91%の全体相同性を共有する。
書面でのインフォームドコンセントと共に、埼玉医療センター(Saitama Medical Center)で、性同一性障害を持つ年齢22〜33(28.5±4.0)歳の6人の女性患者から卵巣を外科手術で摘出した。外側の皮質層を注意深く取り出し、ガラス化した後、低温保存した(Kagawa et al.,Reprod.Biomed.2009 Online 18:568−577;図12)。手短には、厚さ1mmの皮質断片を100mm2(10×10mm)の切片に切断し、7.5%エチレングリコール(EG)及び7.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む平衡溶液中、26℃で25分間インキュベートし、20%EG、20%DMSO及び0.5Mショ糖を含むガラス化溶液中で、26℃で15分間インキュベートした後、液体窒素に浸漬した。実験分析のために、低温保存した卵巣組織を、Cryotissue Thawing Kit(Kitazato Biopharma、静岡県富士市、日本国)を用いて解凍してから、組織学、異種移植又はOSC単離のために直ちに処理した。COOH抗体を用いて、年齢が22〜33歳の全患者のヒト卵巣皮質組織生検から、直径5〜8μmの生存VASA陽性細胞もFACSにより一貫して単離したが、その収率(%)(選別した全生存細胞に対して1.7%±0.6%VASA陽性;平均±SEM、n=6)は、並行して処理した若い成体マウス卵巣からのOSCの収率(選別した全生存細胞に対して1.5%±0.2%VASA陽性;平均±SEM、n=15)と同等であった。この収率(%)は、FACSによって選別した生存単細胞の最終プール中のこれら細胞の出現率であり、これは、処理前の卵巣中に存在する細胞の総数の小部分を表している。卵巣当たりのOSCの出現率を推定するために、生後1.5〜2ヶ月のマウスの卵巣当たりのゲノムDNA量を決定し(1,7744.44±426.15μg;平均±SEM、n=10)、卵巣毎に選別した生存細胞の画分当たりのゲノムDNA量に分割した(16.41±4.01μg;平均±SEM、n=10)。細胞当たりのゲノムDNA量が同等であると想定して、全卵巣細胞プールのどれくらいが、処理後に得られた全生存選別細胞画分によって表されるかを決定した。この相関係数を用いて、卵巣当たりのOSCの出現率を0.014%±0.002%[0.00926X(1.5%±0.2%)]であると推定した。OSC収率に関して、この数は、複製によって変動したが、4つの卵巣のプールから最初に調製した分散質のFACS後に、成体卵巣当たり250〜わずかに1,000を超える生存VASA陽性細胞が、一貫して得られた。
レトロウイルス形質導入によりGFPを発現するように操作されたFACS精製マウスOSC(in vitroで活発に分裂する生殖細胞だけの培養物として樹立後)が、成体雌マウスの卵巣への移植後に卵母細胞を産生する能力を評価した。得られる結果が、卵巣への移植細胞の安定な組込みを表すものであり、また、移植前に誘導された生殖腺への損傷によって複雑化しないことを確実にするために、1×104GFP発現マウスOSCを、月齢2ヶ月の非化学療法条件付け野生型レシピエントの卵巣に注射し、分析まで5〜6ヵ月間マウスを維持した。月齢7〜8ヶ月の、移植マウスを、外性ゴナドトロピン(PMSG(10IU)の単回腹腔内注射、その46〜48時間後hCG(10IU))で排卵を誘導した後、それらの卵巣と、卵管に放出された全ての卵母細胞を採取した。排卵された卵丘−卵母細胞複合体を、0.4%BSA添加HTFに移して、GFP発現について直接蛍光顕微鏡検査によって評価した。最初にFACSにより精製したGFP発現マウスOSCを受けた雌の卵巣において、GFP陰性卵母細胞を含む卵胞と一緒に、GFP陽性卵母細胞を含む発生中の卵胞が容易に検出可能であった(図4a)。
マウスOSCのin vitro増殖のために以前記載された(Zou et al.,Nat Cell Biol 2009 11:631−636)パラメータを用いて、支持細胞として有糸分裂不活性マウス胎児性線維芽細胞(MEF)を含む規定培地に、成体マウス及びヒト卵巣由来VASA陽性細胞を導入した。手短には、以下:10%FBS(Hyclone,ThermoFisher Scientific,Inc.,Waltham,MA)、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸、1X濃縮ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(Invitrogen,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)、0.1m Mβ−メルカプトエタノール(Sigma,St.Louis,MO)、1X濃縮N−2補充物(R&D Systems,Minneapolis,MN)、白血病阻害因子(LIF;103単位/ml;EMD Millipore,Inc.,Billerica,MA)、10ng/ml組換えヒト上皮増殖因子(rhEGF;Invitrogen,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)、1ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF;Invitrogen,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)、及び40ng/ml神経膠細胞由来の神経栄養因子 (GDNF;R&D Systems,Minneapolis,MN)を添加したMEMα(Invitrogen,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)において細胞を培養した。培養物は、隔日40〜80μlの新しい培地を添加することにより新しくし、2週間毎に細胞を新鮮なMEFSに移しかえた。増殖を評価するために、MEFを含まないOSC培養物を10μM BrdU(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)で48時間処理した後、記載されている(Zou et al.,Nat Cell Biol 2009 11:631−636)ように、BrdU組込み(有糸分裂活性細胞)及びVASA発現(生殖細胞)の二重免疫蛍光による検出のために、2%PFA中に固定した。一次抗体が省かれるか、又は正常ウサギ血清の同等希釈物で置換された場合、シグナルは全く検出されなかった(示していない)。
他者(Pacchiarotti et al.,Differentiation 2010 79:159−170)の結果と一致して、in vitroで培養したマウスOSCは、大きな(直径35〜50μm)球形の細胞を自然に産生したが、これは、形態学(図7a)及び遺伝子発現分析(図7b、c)によって、卵母細胞に類似していた。マウスOSCからのin vitro卵形成のピークレベルは、各継代から24〜48時間以内に観察され(図7d)、その後、次第に減少して、OSCが培養飽和密度に達する毎に、ほぼ検出不能レベルまで降下する。成体ヒト卵巣から単離して、in vitroで維持したVASA陽性細胞の並行分析から、これらの細胞は、マウスOSCと同様に、形態学(図7f)及び遺伝子発現(図7c、g)分析の両方から推定されるように、卵母細胞を自然に産生したことが明らかになった。ヒトOSCからのin vitro卵形成の動態は、卵母細胞形成のピークレベルが各継代から72時間後に観察された点で、マウスOSCとはやや異なっていた(図7e)。広く認められている多数の卵母細胞マーカ(Vasa、c−Kit、Nobox、Lhx8、Gdf9、Zp1、Zp2、Zp3;(Suzumori et al.,Mech.Dev.2002 111:137−141;Rajkovic et al.,Science 2004 305:1157−1159;Pangas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006 103:8090−8095;Elvin et al.,Mol.Endocrinol.1999 13:1035−1048;Zheng et al.,Semin.Reprod.Med.2007 25:243−251)の検出に加えて、マウス及びヒトOSC由来の卵母細胞は、複糸期特異的マーカMsy2も発現した(図7c)。MSY2は、アフリカツメガエル(Xenopus)FRGY2の哺乳動物相同体であり、これは、両性において減数分裂進行及び配偶子形成に必須の生殖細胞特異的核酸結合Yボックスタンパク質である(Gu et al.,Biol.Reprod.1998 59:1266−1274;Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2005 102:5755−5760)。正の対照として成体ヒト卵巣皮質組織を用いた、市販の抗体の実証試験から、成体ヒト卵巣に存在する未熟の卵母細胞と特異的に反応する卵母細胞マーカ(VASA、c−KIT、MSY2、LHX8;図8)に対する4つの抗体をみいだしたが;これらのタンパク質の4つ全ても、ヒトOSCによってin vitroで産生される卵母細胞に検出された(図7g)。
候補ヒトOSCからの推定卵形成のin vitro観察を確認し、拡張するために、2つの最終実験において、成体ヒト卵巣から単離したVASA陽性細胞に、GFP発現ベクター(GFP−hOSC)で安定に形質導入することにより、細胞追跡を容易にした。細胞追跡実験のために、レトロウイルスを用いて、ヒトOSCに形質導入して、GFP(GFP−hOSC)の安定な発現を有する細胞を取得した。手短には、1μgのpBabe−GfpベクターDNA(Addgeneプラスミドリポジトリ#10668)を、製造業者のプロトコル(Lipofectamine、Invitrogen,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)に従い、Platinum−Aレトロウイルスパッケージング細胞系(Cell Biolabs,Inc.,San Diego,CA)にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後にウイルス上澄みを回収した。ヒトOSCの形質導入は、新鮮なウイルス上澄みを用いて実施したが、これは、ポリブレン(5μg/ml;Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)の存在によって促進した。48時間後、ウイルスを除去し、新鮮なOSC培地と交換した。最初の1週間の増殖後、GFPの発現を有するヒトOSCを精製又は単離し、精製又は単離した細胞をさらに2週間増殖させた後、2回目のFACS精製又は選別を行うことにより、ヒト卵巣組織再凝集又は異種移植実験のためのGFP−hOSCを取得した。
図13は、体外受精(IVF)前又は体外受精中の同じ被検者から得た卵母細胞に移入することができる卵形成細胞質又はミトコンドリア画分の誘導化のための雌性生殖細胞のオートロガス供給源としてのOSCの使用の概観を表す。その結果起こったAUGMENT後の卵におけるミトコンドリアDNAコピー数及びATP生産能力の増大によって、卵母細胞が、受精及び胚発生の成功に必要なエネルギー駆動イベントのためのATPの十分な蓄積を有することが確実になる。AUGMENTにより卵母細胞に供給される追加のミトコンドリアは、卵母細胞を産生するために身体によって用いられる天然の前駆細胞に由来する。さらに、追加ミトコンドリアは、胚発生に必要なミトコンドリアの最小閾値数がほぼ4倍増大した場合でも、健全な胚形成が進行することを示すデータ(Wai et al.,Biology of Reproduction 2010 83:52−62、図6参照)によれば、卵母細胞に有害な影響をもたらすことはない。異種卵細胞質移入の有益な作用については、Cohen et al.,Mol Hum Reprod 1998 4:269−80(その方法は、胚/子孫に、生殖細胞系遺伝子操作及びミトコンドリアのヘテロプラスミーをもたらすために、ヒトには適していない)によって早期に報告されており、このことは、卵母細胞が、追加のミトコンドリアによって利益を被ることを示している。
同じ患者から得られた培養ヒト卵巣体細胞及び培養ヒトOSCに、ミトコンドリア染色を実施した。ミトコンドリア塊を示す非酸化依存性Mito Tracker Green FM(Invitrogen,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA;M7514))ミトコンドリア追跡用プローブと一緒に、細胞を37℃で45分間インキュベートして、新鮮な培地で2回洗浄した後、生存細胞蛍光画像化を行った。両細胞型を並行して処理した。図14では、分布パターンがヒトOSCにおける核周辺局在化を示しており、これは、他のヒト幹細胞型と一致している。
本実施例に記載するように、FACSによる方法は、組織内の全ミトコンドリア集団を単離するのに用いることができる。さらに、ミトコンドリア単離のためのFACSによる方法は、機能性(例えば、活発に呼吸する)ミトコンドリア集団だけを単離するために、又は組織、細胞、溶解細胞若しくはそれらから得た画分における全ミトコンドリアに対する機能性ミトコンドリアの比率を定量するために、2つの異なる蛍光色素(ミトコンドリア膜電位(MMP)依存性及びMMP非依存性)を用いて、二重標識を用いることもできる。
本実施例に記載するように、組織中に存在するミトコンドリアを単離及び/又は分画するために、分画遠心分離法を用いることができる。任意の組織又は細胞からミトコンドリアを単離する場合の基本的ステップは、以下の通りである:(i)機械及び/又は化学的手段により細胞を破砕するステップ、(ii)低速で分画遠心分離を実施することにより、残屑及び極めて大きな細胞小器官(SPIN1)を除去するステップ、並びに(iii)より高速で分画遠心分離を実施することにより、ミトコンドリア(SPIN2)を単離して、回収するステップ。
このプロトコルは、市販されている以下の試薬:n−ドデシル−β−D−マルトピラノシド(ラウリルマルトシド;MS910;MitoSciences,Abcam,plc,Cambridge,UK)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、ショ糖溶液15、20、25、27.5、30及び35%、再蒸留水、プロテアーゼ阻害剤カクテル(MitoSciences,Abcam,plc,Cambridge,UK)、及び13×51mmポリアロマー遠心分離管(Beckman 326819;Beckman−Coulter,Inc.,Brea,CA)を使用する。
低ミトコンドリア活性は、精原細胞、初期胚、内部細胞塊細胞及び胚性幹細胞にみとめられていることから、「幹細胞性」の特徴であると報告されている。Ramalho−Santos et al.,Hum Reprod Update.2009 (5):553−72を参照されたい。OSCは、本質的に雄性精原幹細胞(精原細胞)の雌性同等物であるが、OSCは、多産のミトコンドリア活性を有することがわかっている。
以上の説明から、本発明を様々な用途及び条件に合わせるために、本明細書に記載した本発明に、改変及び変更を実施しうることは明らかであろう。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲に含まれる。
Claims (47)
- i)卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から単離された機能的なミトコンドリア、ここで該OSCは非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりStage-Specific Embryonic Antigen(SSEA)を発現する、及び、
ii)該機能的なミトコンドリアに結合された蛍光ミトコンドリア追跡用プローブ、
を含む組成物。 - 機能的なミトコンドリアを含み細胞核を含まない細胞質画分を有するものである、請求項1に記載の組成物。
- 機能的なミトコンドリアが卵巣のOSC又は卵巣のOSCの子孫から単離されたものである、請求項1に記載の組成物。
- 機能的なミトコンドリアであることを、工程:
(a)追跡用プローブの結合に基づいてミトコンドリアを選別すること;及び
(b)追跡用プローブに結合したミトコンドリアの割合に基づいて機能的なミトコンドリアの割合を決定すること、
によって確認する、請求項1に記載の組成物。 - 追跡用プローブは、非酸化依存性プローブ、蓄積依存性プローブ、又は還元型酸化状態プローブである、請求項1に記載の組成物。
- 組成物が、
(a)OSC又はOSCの子孫に由来するミトコンドリア精製調製物である、又は
(b)OSC又はOSCの子孫の細胞核を含まない細胞質である、
請求項1に記載の組成物。 - ミトコンドリアが遠心分離によって得られるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- ミトコンドリアが、ミトコンドリア膜電位差依存性細胞選別によって得られるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- ATP生成能の上昇した卵母細胞であって、
外来の機能的なミトコンドリアを含む組成物を含み、ここで外来の機能的なミトコンドリアは自己の卵巣の卵原幹細胞(OSC)又は自己の卵巣のOSCの子孫から得られるものであり、該OSC又はOSCの子孫は該卵母細胞に対して自己であり、該OSCは非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりStage-Specific Embryonic Antigen(SSEA)を発現し、
ここで外来の機能的なミトコンドリアは、外来の機能的なミトコンドリアを含まない自己卵母細胞と比較して卵母細胞のATP生成能を上昇させるものである、
卵母細胞。 - ATP生成能の上昇した卵母細胞であって、
自己の卵巣の卵原幹細胞(OSC)又は自己の卵巣のOSCの子孫から得られた機能的な外来ミトコンドリアである細胞核を含まない細胞質画分を有する組成物を有し、ここで該OSC又はOSCの子孫は該卵母細胞に対して自己であり、該OSCは非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりStage-Specific Embryonic Antigen(SSEA)を発現し、
ここで外来の機能的なミトコンドリアは、外来の機能的なミトコンドリアを含まない自己卵母細胞と比較して卵母細胞のATP生成能を上昇させるものである、
卵母細胞。 - 卵母細胞へ該組成物を移入する工程を含む方法によって調製されたものである、請求項9又は10に記載の卵母細胞。
- 該組成物が注入によって卵母細胞へ移入される、請求項11に記載の卵母細胞。
- 該組成物が細胞質内精子注入法によって卵母細胞へ移入される、請求項11に記載の卵母細胞。
- 該組成物が細胞質内精子注入と実質的に同時に卵母細胞へ移入される、請求項11に記載のATP生成能の上昇した卵母細胞。
- 自己卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から単離された外来性の機能的なミトコンドリアを含む卵母細胞であって、ここで、該OSCは卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現する、
卵母細胞。 - 体外受精(IVF)に使用するための請求項9〜15のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- OSC又はOSCの子孫が哺乳動物から得られるものである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- OSC又はOSCの子孫がヒトから得られるものである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- ヒトが、母体年齢の高い女性、卵母細胞関連の不妊症を患う女性、及び卵巣予備能の低い女性からなる群から選択される女性である、請求項18に記載の組成物。
- 組成物が、1×103〜5×104個のミトコンドリアを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- OSC又はOSCの子孫が、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、mtDNA fg当り少なくとも5倍多いATPを生産する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 該卵巣体細胞が該OSC又はOSCの子孫に対して自己である、請求項21に記載の組成物。
- ミトコンドリアの2%超、5%超、10%超、又は20%超が機能的なミトコンドリアである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 組成物中の機能的なミトコンドリアの少なくとも75%、85%又は90%が高ATP生産能ミトコンドリアである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- OSC又はOSCの子孫が、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞よりmtDNA fg当り少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、又は少なくとも10倍多いATPを生産する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 該卵巣体細胞が、該OSC又はOSCの子孫に対して自己である、請求項25に記載の組成物。
- OSC又はOSCの子孫が哺乳動物から得られるものである、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- OSC又はOSCの子孫がヒトから得られるものである、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- ヒトが、母体年齢の高い女性、卵母細胞関連の不妊症を患う女性、及び卵巣予備能の低い女性からなる群から選択される女性である、請求項28に記載の卵母細胞。
- 組成物が、1×10 3 〜5×10 4 個のミトコンドリアを含む、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- OSC又はOSCの子孫が、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞と比較して、mtDNA fg当り少なくとも5倍多いATPを生産する、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- 該卵巣体細胞が該OSC又はOSCの子孫に対して自己である、請求項31に記載の卵母細胞。
- ミトコンドリアの2%超、5%超、10%超、又は20%超が機能的なミトコンドリアである、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- 組成物中の機能的なミトコンドリアの少なくとも75%、85%又は90%が高ATP生産能ミトコンドリアである、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- OSC又はOSCの子孫が、卵巣体細胞又は間葉系幹細胞よりmtDNA fg当り少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、又は少なくとも10倍多いATPを生産する、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- 該卵巣体細胞が、該OSC又はOSCの子孫に対して自己である、請求項35に記載の卵母細胞。
- 外来の機能的なミトコンドリアを含まない自己卵母細胞よりも、1×103〜5×104個多い機能的なミトコンドリアを含む、請求項9〜16のいずれか一項に記載のATP生成能の上昇した卵母細胞。
- 卵母細胞中の少なくとも75%の外来の機能的なミトコンドリアが、外来の機能的なミトコンドリアを含まない自己卵母細胞と比較して高ATP生産能ミトコンドリアである、請求項9〜16のいずれか一項に記載のATP生成能の上昇した卵母細胞。
- 組成物中の外来の機能的なミトコンドリアにおける約5%未満〜約25%のmtDNAが、ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド8470-13447内に欠失変異を含むものである、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- 卵母細胞の外来の機能的なミトコンドリアにおける約5%未満〜約25%のmtDNAが、外来の機能的なミトコンドリアを含まない自己卵母細胞と比較して、ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド8470-13447内に欠失変異を含むものである、請求項9〜16のいずれか一項に記載の卵母細胞。
- OSC又はOSCの子孫が、卵巣体細胞と比較して、約100分の1量のミトコンドリアで細胞当たり同等量又はそれ以上の量のATPを生産するものである、請求項9〜16のいずれか一項に記載のATP生成能の上昇した卵母細胞。
- 該卵巣体細胞が、該OSC又はOSCの子孫に対して自己である、請求項41に記載の卵母細胞。
- 不妊症の治療用の組成物の製造における機能的なミトコンドリアの使用であって、
ここで該ミトコンドリアは卵巣の卵原幹細胞(OSC)又は卵巣のOSCの子孫から得られるものであり、OSCは非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりStage-Specific Embryonic Antigen(SSEA)を発現するものであり、
ここで該ミトコンドリアは自己卵母細胞へ移入されるものであり、該治療は体外受精(IVF)及び人工授精からなる群から選択される方法を含むものである、
使用。 - 該組成物が細胞質内精子注入法によって卵母細胞へ移入されるものである、請求項43に記載の使用。
- 該組成物が細胞質内精子注入と実質的に同時に移入されるものである、請求項43に記載の使用。
- 卵母細胞の調製方法であって、
工程:
(a)単離された卵原幹細胞(OSC)又はOSCの子孫から得られた1つ又はそれ以上の自己ミトコンドリアを含む組成物を得ること、ここで、該OSCは卵母細胞に対して自己であり、卵巣組織から単離された非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、Vasa、Oct−4、Dazl、Stella、及び場合によりSSEAを発現するものである;及び
(b)該組成物を単離された卵母細胞へ移入すること
を含む、方法。 - 組成物が、注入によって卵母細胞へ移入される、請求項46に記載の方法。
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