CN103969232A - 一种三色荧光标记筛选抗阿霉素肾毒性活性物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三色荧光标记筛选抗阿霉素肾毒性活性物质的方法，包括：取肾细胞，加入待筛选物质进行预保护；预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；向损伤后的肾细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针、线粒体膜电位荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记；染色完成后采集、分析细胞荧光图像，计算待筛选物质对细胞膜、线粒体和细胞核的保护率；从待筛选物质中筛选出对肾细胞的细胞膜、线粒体和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。采用三种荧光探针同时标记肾细胞，从不同的作用机制出发考察待筛选物质对肾细胞的保护效果，不仅筛选方法具有快速、经济、高通量、高内涵的特点，而且筛选结果更为全面严谨。

Description

一种三色荧光标记筛选抗阿霉素肾毒性活性物质的方法

技术领域

本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种三色荧光标记筛选抗阿霉素肾毒性活性物质的方法。

背景技术

慢性肾病是一种常见的复杂性疾病，在我国成人中的发病率为10.8%，已成为影响我国公众健康的主要疾病之一。肾小管上皮细胞损伤是慢性肾病持续进展的重要因素，因此，筛选对肾小管上皮细胞具有保护作用的物质对慢性肾病治疗药物的发现具有重要意义。

肾小管上皮细胞损伤的引发原因是多样的，药物毒副作用是诱导因素之一。如阿霉素（Doxorubicin，DOX）是临床上常用的广谱抗肿瘤药物，被广泛地应用于实体瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤治疗。但阿霉素在使用过程中会产生较强的肾毒性，如何降低其毒副作用，一直是科研工作者的关注焦点。

近年来，基于荧光染色技术的检测分析方法是应用于药物高通量、高内涵筛选的重要方法之一。荧光显微系统的应用解决了普通显微镜对细胞、细胞器的形态和活力方面相对微弱的改变难以观察的问题，被应用于药物研究的多个方面，如药物细胞毒测定和药物相互作用研究等。

如公开号为CN 101788480 B的中国专利文献公开了一套荧光显微系统，包含一个硬件系统好一个软件系统，其中硬件系统由一台荧光倒置显微镜及电脑构成，其中荧光导致显微镜包括荧光倒置显微镜主体，高精度可控电动平台，平台控制器，电荷耦合器，汞灯，汞灯控制器，手动操作杆，平台控制器通过接线与荧光倒置显微镜主体相连，电荷耦合器通过接口与荧光倒置显微镜主体相连，其获取的图像信息由IEEE1394连接卡上传至电脑储存，汞灯控制器通过接线与荧光倒置显微镜主体相连，手动操作杆通过接线与荧光倒置显微镜主体相连；软件系统包括：高精度可控平台控制与图像采集控制系统，图像拼接系统，图像识别系统。

荧光标记技术具有简便、灵敏的特点，已经成为体外药物筛选的重要技术之一。如公开号为CN 101982775 B的中国专利文献公开了一种基于细胞荧光图像的药物筛选方法，通过控制荧光导致显微镜上的高精度可控电动平台精确走位，应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取心肌细胞保护作用的相关指标来筛选和评价活性组分。

该方法的不足之处在于，单色荧光标记用于药物筛选研究时，获得的信息单一，不利于全面评价化合物对细胞的作用，存在漏筛现象。

但目前还未见相关报道介绍以多种荧光染料同时标记肾脏细胞，通过细胞荧光成像判定肾细胞损伤程度和药物保护效应的高内涵筛选方法。

发明内容

本发明公开了一种三色荧光标记筛选抗阿霉素肾毒性活性物质的方法，该方法利用三种荧光探针同时对肾细胞进行标记，一次性全方位地判定肾细胞损伤程度和药物保护效应。

一种三色荧光标记筛选抗阿霉素肾毒性活性物质的方法，包括：

（1）取肾细胞，加入待筛选物质进行预保护；

（2）预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；

（3）向损伤后的肾细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针、线粒体膜电位荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记。

（4）染色完成后采集、分析细胞荧光图像，分别计算待筛选物质对肾细胞细胞膜、线粒体和细胞核的保护率；

（5）从待筛选物质中筛选出对肾细胞的细胞膜、线粒体和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。

阿霉素引起肾毒性的损伤机制主要包括破坏细胞膜的完整性而引起的细胞活力下降，改变细胞线粒体膜电位和诱导细胞凋亡等。基于此，本发明选用了三种荧光探针，其中，胞膜完整性荧光探针用于反映细胞膜的完整性，线粒体膜电位荧光探针用于反映线粒体的损伤程度，细胞核荧光探针，用于反映细胞核双链DNA的损伤程度。并且这三种荧光探针的激发和发射波长互不相同，便于分别获取与荧光探针相对应的荧光图像，互不干扰，单独判断待筛选物质对细胞膜、线粒体、细胞核的保护效果，并与阳性药物进行对比，最终筛选出对肾细胞的细胞膜、线粒体和细胞核均具有较强保护效果的活性物质。

三种荧光探针同时染色不仅比分别染色节约了三分之二的工作量，减少了细胞和相关实验耗材的用量，还消除了不同细胞样品之间的差异引起的试验误差，检测结果更为精确可信。同时，通过同时检测药物保护肾细胞后不同细胞器的损伤程度，可为活性物质对抗阿霉素肾毒性的作用机制提供有用线索，为后续的验证实验奠定更可靠的基础。

本发明方法可在96孔板上进行，具体包括以下步骤：

（1）取肾细胞，加入待筛选物质进行预保护；

所述肾细胞可选用肾小管上皮细胞，优选为对数生长期细胞，细胞密度为1～100个/μL（对于96孔板为100～10000个/孔），更优选为20～60个/μL，最优选为50个/μL，适宜的细胞密度有利于细胞被标记后检测到适宜的荧光强度，便于进行比较。

待筛选物质的终浓度可先进行预实验确定，以不会对肾细胞产生毒性为宜，预保护时间优选为15～120min，更优选为15min，预保护时间过长可能会影响细胞活力，影响筛选和评价结果。

如未作特殊说明，本发明所述终浓度均是指物质加入到体系中后在总体系中的浓度。

（2）预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；

作为优选，阿霉素的损伤浓度为0.78～100μM，损伤时间为12～48h。更优选的损伤浓度为5μM，损伤时间为24h，以模拟实际临床应用中阿霉素低剂量致慢性肾毒性的过程。同时，适宜的损伤浓度和损伤时间可避免肾细胞过度受损，影响筛选和评价结果。

（3）向损伤后的肾细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针、线粒体膜电位荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记；

作为优选，所述细胞膜完整性荧光探针为二乙酸荧光素（FDA），其激发和发射波长分别为488nm和530nm。FDA是一种非极性酯类化合物，其本身并无荧光，但当它通过细胞膜后能被活细胞中的酶水解而产生极性的荧光物质（发绿色荧光）；该荧光物质不能通过细胞膜，因此能在细胞膜完整的细胞内留存，而在细胞膜不完整的细胞内则散失很快，从而可以根据其荧光强度判断肾细胞的膜完整性。

作为优选，所述线粒体膜电位荧光探针为MitoTracker Red CMXRos（MTR）。该探针为一种红色荧光染料，其最大激发和发射波长分别为579nm和599nm，用于对活细胞线粒体进行染色，并且该染料的积累取决于膜电位。线粒体受损后膜电位降低，MTR累积减少，荧光强度减弱。

作为优选，所述细胞核荧光探针为hoechst33342，hoechst33342的最大激发和发射波长分别为346nm和460nm。hoechst33342（发蓝色荧光）能与细胞核双链DNA上的碱基特异性结合，DNA受损时，结合在DNA上的荧光探针就减少，荧光强度也相应减弱。与双链DNA结合后，hoechst33342的最大激发和发射波长分别为350nm和461nm。

FDA、MTR以及hoechst33342的激发和发射波长互不重叠，保证采集荧光图像时不产生干扰。

由于阿霉素对肾细胞的毒副作用并非单方面的，而活性物质对肾细胞的保护到底作用于何种细胞器难以直接获悉，且并非每一种荧光探针都能完美呈现阿霉素对某细胞器损伤程度。本发明发现FDA、MTR以及hoechst33342分别能完美呈现阿霉素对肾细胞的细胞膜、线粒体、DNA损伤程度，因此能用于筛选和评价待筛选物质是否对肾细胞的个细胞器具有保护作用。

作为优选，FDA的荧光标记浓度为1.5mg/L，MTR的荧光标记浓度为1mg/L，hoechst33342的荧光标记浓度为5mg/L；荧光标记时间为10～20min，更优选为15min，高浓度和长时间的标记染色会对细胞造成一定的损伤。

（4）染色完成后采集、分析细胞荧光图像，分别计算待筛选物质对肾细胞细胞膜、线粒体和细胞核的保护率；

保护率的计算公式为：

其中，f为加药保护组的荧光强度，Fm为损伤组的荧光强度，Fc为正常细胞组的荧光强度。

染色完成后，弃去培养液，用PBS洗一遍后吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：物镜放大倍数2.5倍，曝光时间1000ms，先用绿色荧光滤光片（激发光440-520nm，发射光505nm）拍摄，再用蓝色荧光滤光片（激发光320-400nm，发射光400nm）拍摄，最后用红色荧光滤光片（激发光515-565nm，发射光580nm）；每孔拍摄6幅图像，所得荧光图像经过FluoinsightCell工作站图像拼接、图像识别以及数据数据输出系统进行统计，计算得到保护率。

所述FluoinsightCell工作站图像拼接、图像识别以及数据数据输出系统已在公开号为CN 101788480的中国专利文献公开。

（5）从待筛选物质中筛选出对肾细胞的细胞膜、线粒体和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。

本发明的一个实施例中，利用上述方法对中药红花中的抗阿霉素肾毒性活性物质进行了筛选，包括：

（Ⅰ）取红花药材，用50%乙醇进行回流提取，提取液经过滤、浓缩获得A01组分；

（Ⅱ）用大孔树脂对A01组分进行分离，洗脱剂依次为水、20%乙醇、40%乙醇、95%乙醇，分别收集各洗脱液，浓缩获得B01、B02、B03、B04组分；

（Ⅲ）将B02、B03、B04组分通过制备液相色谱进行分离，分别获得C01～C20、D01～D20、E01～E20组分；

（Ⅳ）以步骤（Ⅲ）中获得的各组分作为待筛选物质，用本发明的筛选方法对其肾细胞保护活性进行评价，并筛选出其中含有的活性物质。

通过计算保护率，发现与其他组分相比，C17、C18、C19组分对肾细胞具有较强的保护作用。在此基础上，对C17、C18、C19组分中含有的化合物进行分析，从中选取了异槲皮素、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷及羟基红花黄色素A这四个化合物，再次以这四种化合物作为待筛选物质，利用本发明方法进行活性评价。

筛选结果发现，这四个化合物对肾细胞均具有一定程度的保护作用，，而此前对这四个化合物的肾保护作用均未有文献报道。其中，异槲皮素的保护作用最强，在FDA、MTR以及hoechst33342标记下，100μM的异槲皮素对HK-2的保护率分别为（66.22±5.75）%、（77.31±5.15）%、（63.55±5.78）%。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用细胞膜完整性荧光探针、线粒体膜电位探针与细胞核荧光探针同时标记肾细胞，从不同的作用机制出发考察待筛选物质对肾细胞的保护效果，不仅筛选和评价方法具有快速、经济、高通量、高内涵的特点，适合于国内在早期开展对于治疗阿霉素引起的心肌毒性的药物（包括化学药以及中草药）的筛选和先导化合物的发现，为中药现代化奠定基础；而且筛选和评价结果更为全面严谨，为进一步的分离纯化有效化合物以及结构鉴定提供依据，为先导化合物的发现奠定基础。

附图说明

图1为三种荧光探针标记下荧光强度值与盐酸阿霉素浓度的量效关系图；

图2为异槲皮素对盐酸阿霉素损伤HK-2细胞的保护效果图；

图3为芦丁对盐酸阿霉素损伤HK-2细胞的保护效果图；

图4为羟基红花黄色素A对盐酸阿霉素损伤HK-2细胞的保护效果图；

图5为山奈酚-3-O-芸香糖苷对盐酸阿霉素损伤HK-2细胞的保护效果图；

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明方法作进一步详细说明。

本具体实施方式中，所用的设备和试剂包括：

（1）仪器：细胞荧光显微成像平台（浙江大学药学院药物信息学研究所自主研发）；Bio-Tek ELX800酶标仪（Bio-Tek公司，美国）；CO₂细胞培养箱（Thermo公司，美国）；1300系列Ⅱ级A2型生物安全柜（Thermo公司，美国）；Anke LXJ-IIB低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）。

（2）细胞及试剂：人肾近端小管上皮细胞系（human kidney proximaltubular epithelial cell line，HK-2，上海复祥生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，Merck公司）；二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO，百灵威科技有限公司）；甲酸（色谱纯，Tedia公司）；二乙酸荧光素（fluoresceindiacetate，FDA）、Hoechst33342（Sigma公司，美国）；RedCMXRos（MTR，Invitrogen公司，美国）；Pen Strep（Gibco公司，美国）；高糖DMEM基础培养基、Fetal Bovine Serum、Trypsin EDTA（Corning公司，美国）；盐酸阿霉素、芦丁、羟基红花黄色素A（中国药品生物制品检定所）；盐酸川芎嗪（阿拉丁试剂有限公司）；山奈酚-3-O-芸香糖苷、异槲皮素（上海融禾医药科技有限公司）；红花组分样品由浙江大学药物信息学研究所数字中药组分库提供。

实施例1三色荧光探针标记肾脏细胞评价盐酸阿霉素的损伤效果

用三种荧光探针FDA、MTR、Hoechst33342对HK-2细胞进行标记，通过荧光强度的变化反映盐酸阿霉素对HK-2细胞的损伤程度。

HK-2细胞以5000个/孔接种于96孔板，置于细胞培养箱中孵育24h使细胞贴壁；吸去旧培养液，每孔加入90μL培养液（即高糖DMEM基础培养基），再依次加入10μL含7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500及1000μmol/L盐酸阿霉素的培养液；实验另设溶剂对照组（含0.1%DMSO），每组3复孔，孵育24h；吸去旧培养液，每孔加入100μL含1.5mg/L FDA、1mg/L MTR及5mg/L Hoechst33342的高糖DMEM基础培养基，37℃避光孵育15min；染色完成后，弃去培养液，用PBS洗一遍后吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：物镜放大倍数2.5倍，曝光时间1000ms，先用绿色荧光滤光片（激发光440-520nm，发射光505nm）拍摄，再用蓝色荧光滤光片（激发光320-400nm，发射光400nm）拍摄，最后用红色荧光滤光片（激发光515-565nm，发射光580nm）；每孔拍摄6幅图像，所得荧光图像经过FluoinsightCell工作站图像拼接、图像识别以及数据数据输出系统进行统计，获取每孔的荧光信息，以相对荧光强度反映细胞活力状态。

按下式计算相对荧光强度：

相对荧光强度（%）=（损伤组荧光强度值/溶剂对照组荧光强度值）×100%；计算结果见图1。

由图1可见，随着盐酸阿霉素浓度的升高，FDA、MTR和Hoechst33342荧光强度值逐渐下降，表明HK-2细胞损伤程度随着盐酸阿霉素损伤剂量的升高而增强，表明上述方法能够较为准确地反映盐酸阿霉素致肾脏细胞损伤程度。

实施例2从红花提取物中筛选具有抗盐酸阿霉素损伤肾细胞作用的活性组分

称取红花药材200g，用50%的乙醇加热回流提取2次，每次1h，合并提取液，过滤，浓缩干燥后得A01组分。A01组分通过大孔树脂进行分离，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、95%乙醇洗脱，收集各洗脱液后分别浓缩，得B01、B02、B03及B04组分。用制备液相色谱进一步分离B02、B03和B04组分，分别制备得到C01～C20、D01～D20及E01～E20组分。对53个红花组分（D15、D17、D19、D20、E05、E07、E11、E13、E16、E17、E19、E20组分制备量过少，不能满足筛选需要）进行肾细胞保护活性评价。具体流程为：

称取适量的组分，用DMSO溶解获得质量浓度为50g/L的储备液。细胞毒实验表明，0.05g/L的E15、E18有细胞毒作用，因此将其实验浓度降为0.01g/L，其它组分的实验浓度仍为0.05g/L。

HK-2细胞以5000个/孔接种于96孔细胞板，置于细胞培养箱中孵育24h使细胞贴壁。吸去旧培养液，加入80μL培养液和10μL含0.5g/L（E15、E18组分浓度为0.1g/L）待筛选组分的培养液，预保护15min后加入10μL含50μmol/L盐酸阿霉素的培养液，实验另设溶剂对照组（含0.1%DMSO），模型组（含5μmol/L盐酸阿霉素），阳性对照组（含5μmol/L盐酸阿霉素和500μmol/L的盐酸川芎嗪），每组3复孔，孵育24h。弃去旧培养液，同时加入100μL含1.5mg/L FDA、1mg/L MTR及5mg/LHoechst33342的培养液，37℃避光孵育15min，获取每孔的荧光信息，以相对荧光强度反映细胞损伤程度。

实验数据用（）表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理，结果发现，C17、C18及C19组分与细胞作用后，三种探针的相对荧光强度值与模型组相比均升高，具有显著差异（p<0.05）。C17、C18及C19组分中主要化合物的色谱和质谱信息见表1。

按下式计算C17、C18及C19组分对HK-2细胞的保护率：

保护率（%）=（药物处理组荧光强度值－模型组荧光强度值）/（溶剂对照组荧光强度值－模型组荧光强度值）×100%。计算结果见表2。

表1红花C17、C18及C19组分中化合物的色谱和质谱信息

表2红花活性组分C17、C18及C19对HK-2细胞的保护作用

通过单因素方差分析得到表2中3个活性组分，且活性组分在每种荧光探针标记下均有较强的保护活性，提示可能通过抗氧化、抗凋亡和保护线粒体三个方面共同发挥保护作用。

实施例3红花中四个活性成分抗盐酸阿霉素损伤肾细胞的活性研究

从表1中选取四个活性成分：异槲皮素、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷及羟基红花黄色素A，分别稀释成5个浓度（100、50、25、12.5及6.25μmol/L），采用本发明公开的方法（实施例2）评价各化合物对盐酸阿霉素损伤的HK-2细胞的保护作用，评价结果见图2、图3、图4、图5。

实验结果表明，四个化合物对盐酸阿霉素损伤的HK-2细胞均具有一定程度的保护作用。其中，羟基红花黄色素A的保护作用相对较弱，山奈酚-3-O-芸香糖苷及芦丁保护作用较强，异槲皮素保护作用最强。且异槲皮素在6.25μmol/L～100μmol/L浓度范围内对HK-2细胞的保护作用具有良好的量效关系，在FDA、MTR及Hoechst33342三种荧光探针标记下，100μmol/L时对HK-2保护率分别为（66.22±5.75）%、（77.31±5.15）%、（63.55±5.78）%。

Claims (8)

1.一种三色荧光标记筛选抗阿霉素肾毒性活性物质的方法，包括：

（1）取肾细胞，加入待筛选物质进行预保护；

（2）预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；

（3）向损伤后的肾细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针、线粒体膜电位荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记；

（4）染色完成后采集、分析细胞荧光图像，分别计算待筛选物质对肾细胞细胞膜、线粒体和细胞核的保护率；

（5）从待筛选物质中筛选出对肾细胞的细胞膜、线粒体和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肾细胞为对数生长期细胞，细胞密度为1～100个/μL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，预保护时间为15～120min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，阿霉素的损伤浓度为0.78～100μM，损伤时间为12～48h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述细胞膜完整性荧光探针为二乙酸荧光素。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述线粒体膜电位荧光探针为MitoTracker Red。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述细胞核荧光探针为hoechst33342。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，保护率的计算公式为：

其中，f为加药保护组的荧光强度，Fm为损伤组的荧光强度，Fc为正常细胞组的荧光强度。