CN101788480B - 基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于荧光标记细胞状态的肝毒性物质筛选和评价方法，是一套结合硬件/软件系统的筛选和评价方法，通过荧光倒置显微镜及电脑实时获取图像，经过处理，将生物信息可视化，结合FDA染色测量活细胞的线性动态范围宽，提供用于肝毒性物质评价的相关参数。本发明方法快速、灵敏并且经济，在保持细胞结构和功能完整性的前提下，快速检测被筛样品对细胞数量、形态、迁移、凋亡等各个环节的影响，准确对荧光特异性标记的细胞活性进行定量分析，检测细胞在毒性物质作用下的活性改变，方法设计合理，提供的筛选和评价系统结构完善，可用于筛选有肝毒性物质的筛选和评价。

Description

基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法

技术领域

本发明属于物质毒理学筛选与评价方法领域，涉及应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取技术、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取肝毒性物质相关指标并用于外源物的肝毒性筛选和评价，同时该方法可以扩展应用于其他细胞毒性物质的筛选与评价(如肾毒性、心肌毒性、抗肿瘤等)。

背景技术

肝脏是药物及外源性物质在体内代谢的最主要场所，很多药物在体内发挥防病治病作用的同时，不可避免地会影响肝脏的结构与功能，导致不同机理的药物性肝损伤。据统计，在已上市应用的药物中，有1100种以上的药物具有潜在的肝毒性，很多药物的赋形剂、中草药以及保健药亦有导致肝损伤的可能。在美国有1％肝炎患者是因药物引起的。在我国，药物性肝炎所占的比例约占急性肝炎住院患者的10％。据统计，有大约30％的候选药物在审批阶段未获通过，是由于其细胞毒性以及临床安全性方面存在问题。而从1961到1992年在法国、德国、英国、美国等国家，因其肝脏毒性而撤出市场的药物占总被撤销药物的18％。多年来，肝毒性是导致药物被从市场撤回、被限用或被拒批的最重要的原因，已经成为阻碍新药候选药物开发的重要因素。

同时，近年来中草药在临床应用的普及，尤其是在慢性肝病等疾病治疗中的应用日益增多，随之所引起的不良反应也逐渐增多，甚至因中草药中毒致死的病例也时有报道。中草药所致的肝损伤占临床药物性肝损伤总病例的4.8％～32.6％。这些因中草药的而导致的不良反应多是由于长期使用以及过量使用导致，中草药中含有的毒性成分如，生物碱、苷类等成分都会引起肝损伤。说明中草药并不是因其天然而无不良反应的，但是需要指出的是，只是某些中草药具有潜在的肝毒性，但其尚不在药物性肝损伤中占主要地位。必须辩证的看待中草药的药理活性与毒性，同时还需规范药材种植的GAP管理以及制剂生产标准化，进一步提高对中草药的安全性的正确认识。因此需要积极研究能够快速筛选并鉴定具有肝毒性的化学物质、以及中草药中导致不良反应的成分的方法，建立快速的筛选和评价模型，将肝毒性检测放在药物研发的早期阶段。

目前，药物开发阶段毒性评价模型(包括肝毒性)是基于临床前的动物模型(如，啮齿类的大鼠，非啮齿类的犬)和临床III期人体试验评价。虽然以动物模型来预测一个候选药物在人体是否有毒性存在不一致的例子，即在动物实验表明安全的候选药物在开展人体试验时候存在毒性的现象，但是有一个共识即使动物模型不能完全预测人类的疾病，动物模型对于药物开发还是有价值的并且是关键的，值得资金的投入。但是，动物模型评价药物安全性存在诸如动物消耗量大，资金投入多，劳动强度高等问题。有必要在动物实验阶段之前开展体外毒性预测，通过毒性筛选提高候选药物的质量。常规的体外毒性筛选方法包括LDH释放、MTT法、SRB法以及细胞内ATP含量测定等，量效以IC₅₀表示，当体外测定的IC₅₀值不超过体内毒性浓度值的5～10倍时则被认为该体外毒性预测模型是合理的。但是这些方法存在速度慢、灵敏度低及自动化程度低等不足，难以满足化合物库以及中草药中多成分高通量筛选的需求。基于细胞的高通量(HTS)、高内涵筛选(HCS)应运而生。尤其是HCS已经应用于药物开发的早期阶段。HCS的优势在于具有自动化，高通量的特点，能够通过荧光标记细胞或亚细胞器实现细胞计数、细胞形态学统计、亚细胞器功能改变，离子浓度变化、受体功能改变及DNA等遗传物质改变的定性与定量分析；具备单次测量，获得多参数的功能。由于是在细胞完整的生理结构及功能网络环境下开展毒性筛选实验，比基于离体的受体、酶等大分子的筛选结果更可信，一些大型的制药企业更是将HCS用于化合物小分子库的细胞活性、毒性以及遗传毒性等方面的筛选。但是往往商业化的HCS设备价格都很昂贵，在国外也只有大型制药企业才有能力使用；目前国内也只有少数几家科研院所单位拥有相关设备。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于荧光标记细胞状态的肝毒性物质筛选和评价方法，是一套结合硬件/软件系统的筛选和评价方法。具体通过以下步骤实现：

1.硬件和软件系统

该筛选和评价硬件系统由一台荧光倒置显微镜及电脑构成，其中荧光倒置显微镜部件包括荧光倒置显微镜主体，高精度可控电动平台，平台控制器，电荷耦合器(CCD)，汞灯；汞灯控制器，手动操纵杆，平台控制器通过接线与显微镜主体相连，电荷耦合器(CCD)通过接口C-mount与显微镜主体相连，其获取的图像信息由IEEE1394连接卡上传至电脑储存(IEEE1394连接卡购自于Leica公司)；汞灯控制器通过接线与显微镜主体相连，用于控制荧光发光调节；手动操纵杆通过接线与显微镜主体相连，可对电动平台移动进行调节。软件系统主要包括：高精度可控电动平台控制与图像采集控制系统，图像拼接系统，图像识别系统。主要由软件系统控制荧光倒置显微镜上的高精度可控电动平台精确走位，由荧光探针相适应的滤光片得到的光激发细胞荧光发生，通过内制冷高分辨率CCD实时获取图像，同步上传至电脑，图像在经过拼接和识别软件处理，将生物信息可视化，提供用于肝毒性物质评价的相关参数。

2.二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)染色特异性标记活细胞

FDA本身没有荧光，是一个非极性酯类化合物，它能够通过完整的细胞膜，在细胞内被酯酶水解而产生极性的荧光物质。该荧光物质不能通过细胞膜，因此能在细胞膜完整的细胞内留存，在细胞膜不完整的细胞内则会散失很快。所以，在一定波长光源激发下，活细胞被FDA染色产生较强绿色荧光，而死细胞不会产生荧光，活细胞量可用绿色荧光的强度来表征。

准确称取适量FDA溶于二甲基亚砜(DMSO，Merck公司)中配成10mg/mL储备液，分装于0.6mL离心管中，置于-20℃避光储存，临用前，用PBS稀释储备液4000倍待用。

(1)FDA最佳染色浓度选择

在96孔板中接种人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-O2，3000个/孔，只种96孔板中间60孔，置于细胞培养箱中过夜使细胞贴壁完全。第二天，在暗室中，弃去每孔中培养液，加入100μL/孔含系列浓度梯度(FDA浓度梯度在0.078～40μg/mL之间，每个浓度6复孔)。FDA的PBS，置于室温(25℃)孵育15min，接着用100μL/孔PBS漂洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片(激发光460-500nm、发射光512-542nm)，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将荧光强度进行统计，选择最佳FDA染色浓度，作为后续所有实验的荧光染色浓度。

(2)FDA荧光染色测量活细胞数法线性动态范围及细胞种板细胞数量选择

HepG2细胞和L-O2细胞按照倍半稀释的方式，种于96孔板内60孔中，每个细胞数量5个复孔，从50000个/孔一直倍半稀释12个数量梯度，即25～50000个细胞每孔。孵育及细胞染色条件同(1)。同时，每个细胞株各做两块板，分别用于FDA荧光染色和MTT法测量。扫描得到的荧光图像经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将荧光强度进行统计，通过绘制FDA法荧光强度～细胞数量对数值、MTT法吸光度值～细胞数量对数值曲线，比较两种细胞活力测定方法线性动态范围、灵敏性以及两个细胞株的选择性。

3.对化合物或中药材中肝毒性成分开展筛选并评价其毒性

(1)采用常用的体外肝毒性细胞模型HepG2和L-O2，HepG2和L-O2细胞的种板数量为3000个/孔，细胞培养过夜让其贴壁充分，次日进行加药操作，以对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪为肝毒性阳性化合物，其中对乙酰氨基酚设定9个浓度梯度为13.65～0.053mmol/L，盐酸氯丙嗪设定9个浓度梯度为163.5～0.639μmol/L，同时设定正常细胞对照组；

(2)取化合物和中药材的不同成分与细胞HepG2、L-O2共孵育48小时，之后弃去每孔中培养液，每孔加入含2.5μg/mL二乙酸荧光素的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，室温避光孵育15分钟，在高精度可控电动平台(B)上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片，激发光460-500nm、发射光512-542nm，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，结果以细胞成活率表示：

成活率％＝加药处理组荧光强度/正常对照组荧光强度×100

对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪以细胞成活率对浓度梯度做量效曲线，计算IC₅₀值，用IC₅₀值来评价毒性的强弱；

在筛选中设定正常细胞组、阳性损伤对照组及溶剂对照组，阳性损伤对照组为：13.65mmol/L的对乙酰氨基酚和163.54μmol/L的盐酸氯丙嗪，溶剂对照组为：0.1％(v/v)二甲基亚砜。

在筛选中设定正常细胞组、阳性损伤对照组及溶剂对照组，阳性损伤对照组为：13.65mmol/L的对乙酰氨基酚和163.54μmol/L的盐酸氯丙嗪，溶剂对照组为：0.1％(v/v)二甲基亚砜。

对于中药材，在与细胞HepG2、L-O2共孵育48小时前，需经过加热回流提取、中压柱分离及制备液相分离制备等前处理手段，将药材分成不同的成分，每个成分用二甲基亚砜(DMSO)溶解成50mg/mL的储备液，药材成分用于肝毒性成分筛选时使用浓度为50μg/mL。

评价毒性的原则为IC₅₀值越小，毒性越大，一般认为IC₅₀值＜10μg/mL或IC₅₀值＜10μM时具有很强的毒性。对于中药材则通过成活率来筛选有毒性成分，成活率越小表示毒性越大，成活率＜80％则表示有一定毒性，其中成活率＜50％的表示毒性较强；对于那些细胞存活率＜50％的化合物和中药材毒性成分则开展后续的量效反应实验(IC₅₀计算)，并为进一步分离纯化、结构鉴定工作提供帮助。

因此，本发明可以通过以上步骤对化合物以及中草药中的肝毒性成分进行筛选和毒性强弱的评价。

在本发明中，软件系统主要包括：高精度可控电动平台控制与图像采集控制系统，图像拼接系统，图像识别系统。各部分功能分别为：

(1)高精度可控电动平台控制与图像采集控制系统，控制移动平台按照预设参数进行高精度走位，可实现对细胞培养孔板中任何孔内的细胞图像进行获取，并可以调节相关图像拍摄参数，包括自动对焦、曝光时间、放大倍数等。

(2)图像拼接系统，能够对每孔获得的图像经过一定算法进行拼接，进而可以得到整孔细胞图像，反映每孔细胞对于药物处理后的整体变化，结果更可信。

(3)图像识别系统，能够对拼接得到的图像进行识别，统计相关参数，包括荧光强度、细胞数量及面积，负责将所生成的图像与分析结果可视化，输出报表，统计毒性物质的IC₅₀值为毒性强弱评价提供参考。

本发明的另一个目的是提供该方法在化合物或中药材中肝毒性物质的筛选和评价中的应用。还可对化合物或药物中肝毒性物质的筛选和评价中的应用。

本发明对于先导化合物的选择以及中草药中有毒有害成分的筛选提供筛选方法，特别对于筛选出来的中草药中肝毒性成分，可为后续进一步开展分离、纯化有效化合物，结构分析、鉴定等工作提供依据。本发明通过活细胞特异性荧光染料标记和测量肝细胞活力状态而实现对肝毒性物质筛选和评价。

本发明的有益之处是：与传统的细胞毒性物质筛选方法比较，本发明提供的筛选和评价方法，通过活细胞特异性的荧光染料标记细胞，能够将毒性物质作用前后细胞在活力、形态结构、分布等多方面进行统计区分，这些参数可以特异性的表征细胞的生理或病理特性。本发明提供的肝毒性物质筛选方法具有快速、高通量(实现一次筛选18min内筛选96个样品)、灵敏、经济的特点。本发明提供的筛选和评价方法结合FDA染色测量活细胞的线性动态范围宽；线性检测数量范围广，并且最低检测限为单个细胞或亚细胞器。同时基于本筛选和评价系统和FDA标记HepG2细胞筛选肝毒性物质的方法的Z’因子达到0.5以上，是高质量的毒性物质筛选方法。

本发明方法设计合理，提供的筛选和评价系统结构完善，具有很高的应用价值，而且设备简单、经济，适合于国内在早期开展药物的药理和毒性相关方面的研究，具有较大的推广性。

本发明提出一种基于肝细胞的肝毒性物质的快速、灵敏并且经济的筛选方法，即在保持细胞结构和功能完整性的前提下，通过快速同时检测被筛样品对细胞数量、形态、迁移、凋亡等各个环节的影响，准确的对荧光特异性标记的细胞活性进行定量分析，检测细胞在毒性物质作用下的活性改变，可用于筛选和评价肝毒性物质。

附图说明

图1筛选及评价硬件和软件系统。

图2筛选流程。

图3图像识别处理结果。

图4本筛选和评价方法的动态线性范围及灵敏度(与MTT法比较)。

图5对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪对HepG2细胞和L-O2细胞的量效曲线。

图6本方法用于筛选中药材川楝子中肝毒性成分。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例进一步说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

试剂：

RPMI-1640、DMEM基础培养基；

小牛血清(CS)、胎牛血清(FBS)；

硫酸链霉素，青霉素钠；

对乙酰氨基酚，盐酸氯丙嗪；

二乙酸荧光素钠(Fluorescein diacetate，FDA)；

二甲基亚砜(DMSO)；

仪器：

Leica DMI 6000 B荧光倒置显微镜、DFC 310 FX CCD：德国Leica公司；

二氧化碳培养箱：Thermo Forma Series II Water Jacketed CO₂ Incubator；

SB-840-2型单人双面超净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

实施例1筛选系统构建及应用于肝毒性筛选

1.硬件和软件系统

本发明的目的是提供一种基于荧光标记细胞状态的肝毒性物质的筛选和评价方法，是一套结合硬件/软件系统的筛选和评价方法，该筛选和评价硬件系统由一台德国Leica DMI 6000B荧光倒置显微镜1及电脑2构成(见图1)。其中荧光倒置显微镜1包括荧光倒置显微镜主体A、高精度可控电动平台B、平台控制器C、电荷耦合器D(1392×1040像素，型号Leica DFC 310FX，德国Leica公司)、汞灯E、汞灯控制器F、粗调节螺旋G和手动操纵杆H，平台控制器C通过接线与显微镜主体A相连，电荷耦合器D通过接口C-mount(1×HCf.1”，放大倍数1)与显微镜主体A相连，其获取的图像信息由IEEE1394连接卡上传至电脑储存(IEEE1394连接卡购自于Leica公司)，汞灯控制器F通过接线与显微镜主体A相连，用于控制荧光发光调节；粗调节螺旋G用于荧光图像粗调；手动操纵杆H通过接线与显微镜主体A相连，可对电动平台移动进行调节。

另外还配置了用于观察二乙酸荧光素，即Fluorescein diacetate，FDA荧光的滤光片：L5，德国Leica公司，相关参数为：激发波长460-500nm，发射波长512-542nm；用于扫描拍照的物镜为Leica 2.5倍物镜，参数2.5×/0.07NPLAN。软件系统主要包括：高精度可控电动平台控制与图像采集控制系统，图像拼接系统，图像识别系统。

由软件系统控制荧光倒置显微镜上的高精度可控电动平台精确走位，由荧光探针相适应的滤光片得到的光激发细胞荧光发生，通过内制冷高分辨率CCD实时获取图像，同步上传至电脑，图像由拼接和识别软件处理，将生物信息可视化，提供用于肝毒性物质评价的相关参数(细胞成活率及IC₅₀值)。参见图2。2.二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)染色特异性标记活细胞

FDA本身没有荧光，是一个非极性酯类化合物，它能够通过完整的细胞膜，在细胞内被酯酶水解而产生极性的荧光物质。该荧光物质不能通过细胞膜，因此能在细胞膜完整的细胞内留存，在细胞膜不完整的细胞内则会散失很快。所以，在一定波长光源激发下，活细胞被FDA染色产生较强绿色荧光，而死细胞不会产生荧光，活细胞量可用绿色荧光的强度来表征。

准确称取FDA10mg溶于1mL二甲基亚砜(DMSO，Merck公司)中配成10mg/mL储备液，分装于0.6mL离心管中，置于-20℃避光储存，临用前，用PBS稀释储备液4000倍待用。

2.1FDA最佳染色浓度选择

在96孔板中接种人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-O2，3000个/孔，只种96孔板中间60孔，置于细胞培养箱中过夜使细胞贴壁完全。第二天，在暗室中，弃去每孔中培养液，加入100μL/孔含系列浓度梯度FDA的PBS，置于室温(25℃)孵育15min(FDA浓度梯度为：0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5，5，10，20以及40μg/mL，每个浓度6复孔)。接着用100μL/孔PBS漂洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片L5(激发光460-500nm、发射光512-542nm)，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统并将细胞荧光强度结果进行统计，选择最佳FDA染色浓度为2.5μg/mL。

2.2FDA荧光染色测量活细胞数法线性动态范围及最佳种板细胞数量选择

HepG2细胞和L-O2细胞按照倍半稀释的方式，种于96孔板内60孔中，每个细胞数量5个复孔，从50000个/孔一直稀释了12个浓度，即25～50000个细胞每孔。孵育及细胞染色条件同2.1。同时，每个细胞株各做两块板，一块板用于FDA荧光染色，另一块用于传统细胞毒性测定法MTT测量。扫描得到的荧光图像经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将细胞荧光强度结果进行统计，通过绘制FDA法荧光强度-Log(细胞数量)值、MTT法吸光度值-Log(细胞数量)值曲线，比较两种细胞活力测定方法动态线性范围、检测灵敏度，以及两个细胞株的选择性(见图4)。

结果显示基于本硬件和软件系统的FDA染色法比MTT法灵敏度更高，检测下限更低，FDA染色能够达到单细胞检测，而MTT法在细胞数量很少时则无法分辨，灵敏度较差。孵育时间48h，细胞种板每孔数量以3000个比较合适。同时，在线性动态范围上，基于本硬件和软件系统的FDA染色法达到1.8个对数数量级，为MTT法的3倍，即，对于HepG2和L-O2细胞，FDA法线性动态范围从782个细胞～50000个细胞，相信相关系数r＞0.95；对于MTT法，HepG2和L-O2细胞线性动态范围分别是6250～25000和12500～50000，r＞0.97。因此，更宽的线性动态范围以及更低的检测下限表明基于本硬件和软件系统的FDA染色法还可以用于药物协同作用研究，比如可以用于几个抗肿瘤药物对肿瘤的协同杀伤方面的研究等。

3.基于本硬件和软件系统的FDA染色法筛选中药川楝子中肝毒性成分

本发明还被应用于中药材中肝毒性成分的筛选。以具有肝毒性的中药材川楝子为例，川楝子药材购于杭州中药饮片厂，经鉴定为楝科植物川楝Meliatoosendan Sieb.et Zucc.的干燥成熟果实。具体步骤先通过植化手段。

川楝子成分的提取、分离和制备。

提取：药材粉碎，过筛并干燥，再用有机溶剂(乙醇)及水加热回流提取；

分离：将分离得到的浸膏进一步通过中压柱洗脱分离；

制备：最后将得到的各部分浸膏上制备液相色谱进一步分离，收集流分，将其冷冻干燥后得到该药材的不同成分，用于筛选实验。

人肝细胞HepG2和L-O2以3000个/孔种板，过夜让其贴壁。第二天进行加药，即提取、分离、制备的川楝子不同成分与HepG2细胞和L-O2细胞共孵育48h，浓度都为50μg/mL。同时设定正常组、阳性损伤组(13.65mM对乙酰氨基酚和163.5μM盐酸氯丙嗪)以及阴性对照组(0.1％二甲基亚砜，v/v)，以相应的量分别加入空中。与细胞共孵育48h之后，在暗室中，弃去每孔中培养液，加入100μL/孔含2.5μg/mL FDA的PBS，置于室温(25℃)孵育15min。接着用100μL/孔PBS漂洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片L5(激发光460-500nm、发射光512-542nm)，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统并将细胞存活率结果进行统计，绘制柱状图(参见图6)。由图6表明A01及A09作用的细胞成活率＜50％，显示具有较强的肝毒性，为后续开展进一步毒性量效反应，即IC₅₀实验，及其纯化及结构鉴定工作提供基础。

实施例2荧光图像识别处理

荧光图像识别系统主要是对荧光显微镜得到的荧光图片进行处理，使得细胞生物学信息转化成数据，结果可视化。具体处理步骤为荧光图片背景信号扣除、二值化处理、数据统计生成报表。通过这三个步骤的处理，可以将人眼所分辨不出来的荧光信号可视化，识别灵敏度高，检测下限低，自动化的批量处理荧光图片，得出结果更快、更稳定，且为多参数(提供数量、面积以及荧光强度)。识别示意图见图3，其中图A.FDA染色96孔板整孔HepG2细胞；图B.图像处理之后。

实施例3基于本硬件和软件系统的FDA染色标记活细胞用于对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪两个化合物对肝细胞毒性的量效试验

HepG2细胞和L-O2细胞按照3000个每孔的密度接种于96孔板中，第二天换液，选择化合物对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪为阳性损伤对照，施行浓度梯度实验。对乙酰氨基酚从13.65mM开始倍半稀释9个浓度，盐酸氯丙嗪从163.5μM开始倍半稀释9个浓度，每个浓度3复孔平行。化合物与细胞在细胞培养箱中孵育48h，在暗室中，弃去每孔中培养液，加入100μL/孔含2.5μg/mL FDA的PBS，置于室温(25℃)孵育15min，接着用100μL/孔PBS漂洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片L5(激发光460-500nm、发射光512-542nm)，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，即以细胞成活率对化合物浓度梯度做曲线，计算IC₅₀。同时以MTT法为对照进行平行对照实验。结果见图5，表明基于本硬件和软件系统的FDA染色法的灵敏度比MTT法更高，结论与实施例2一致；同时还发现HepG2细胞模型用于检测药物的肝毒性比L-O2模型更灵敏。且HepG2模型得到的对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪的IC₅₀值分别为2.559mM和8.097μM，这个浓度与临床上报道的毒性浓度接近，两个化合物血清浓度分别为1mM(参见参考文献[1])和2.814μM(参见参考文献[2])。而且本发明提供的方法用于筛选肝毒性药物的结果符合体外模型预测体内的要求，目前要求体外测得IC₅₀值不超过体内药物浓度值的5～10倍(参见参考文献[3])，因此，本发明提供的是一个理想的体外模型与体外筛选评价方法。

实施例4基于本硬件和软件系统的FDA染色法的质量评价

接种HepG2和L-O2细胞于96孔板上，3000个/孔，过夜让其贴壁充分，用已知的肝毒性化合物对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪为阳性损伤对照，即13.65mM对乙酰氨基酚和163.5μM盐酸氯丙嗪作为阳性肝细胞毒性对照，0.5％(v/v)DMSO作为阴性对照，每个浓度6复孔，每孔加入200μL培养液，细胞培养箱中孵育48h，接着弃去每孔中培养液，加入100μL/孔含2.5μg/mL FDA的PBS溶液，置于室温(25℃)孵育15min，接着用100μL/孔PBS漂洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片L5(激发光460-500nm、发射光512-542nm)，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统分析每孔细胞成活率，计算Z’因子(参见参考文献[4])，结果参见表1。

Z’因子计算公式按照国际上经典文献提供的公式：

$Z^{\′}=1-\frac{(3{\mathrm{\σ}}_{c+}+3{\mathrm{\σ}}_{c-})}{|{\mathrm{\μ}}_{c+}-{\mathrm{\μ}}_{c-}|}$

其中，μ_c+、μ_c-分别为阳性对照和阴性对照的信号平均值；σ_c+、σ_c-分别为阳性对照和阴性对照的信号SD值(每个数据平行操作6次，即n＝6)。

Z’因子大于0.5即被认为是一个优秀、高质量的筛选方法，因此HepG2细胞系用于本发明所提供的方法用于肝毒性筛选具有很好的实验质量，适合于肝毒性药物的高通量筛选。

表1本发明方法用于肝毒性物质筛选Z’因子

本发明涉及的参考文献：

[1]S.Bridger，K.Henderson，E.Glucksman，A.J.Ellis，J.A.Henry，R.Williams，Deaths from lowdose paracetamol poisoning.British Medical Journal，1998，316：1724-1725.

[2]E.Tanaka，T.Nakamura，M.Terada，T.Shinozuka，C.Hashimoto，K.Kurihara，K.Honda，Simple and simultaneous determination for 12 phenothiazines in human serum by reversed-phasehigh-performance liquid chromatography.Journal of Chromatography B，2007，854：116-120.

[3]F.Ballet.Hepatotoxicity in drug development：detection，significance and solutions.Journal ofHepatology，1997，26：26-36.

[4]J.H.Zhang，T.D.Chung，K.R.Oldenburg，A simple statistical parameter for use in evaluationand validation of highthroughput screening assays.Journal of Biomolecular Screening，1999，4：67-73.

Claims (4)

1.一种基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法，具体通过以下步骤实现：

(1)硬件系统：由一台荧光倒置显微镜(1)及电脑(2)构成，其中荧光倒置显微镜(1)包括荧光倒置显微镜主体(A)，高精度可控电动平台(B)，平台控制器(C)，电荷耦合器(D)，汞灯(E)，汞灯控制器(F)，手动操纵杆(H)，平台控制器(C)通过接线与显微镜主体(A)相连，电荷耦合器(D)通过接口与显微镜主体(A)相连，其获取的图像信息由IEEE1394连接卡上传至电脑(2)储存，汞灯控制器(F)通过接线与显微镜主体(A)相连，手动操纵杆(H)通过接线与显微镜主体(A)相连；软件系统：高精度可控电动平台控制与图像采集控制系统，图像拼接系统，图像识别系统；

(2)二乙酸荧光素染色特异性标记活细胞

准确称取适量二乙酸荧光素溶于二甲基亚砜中配成10mg/mL储备液，分装于0.6mL离心管中，置于-20℃避光储存，临用前，用磷酸盐缓冲液稀释储备液4000倍待用，

(a)二乙酸荧光素最佳染色浓度选择

在96孔板中接种人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-O2，3000个/孔，只种96孔板中间60孔，置于细胞培养箱中过夜使细胞贴壁完全，第二天，弃去每孔中培养液，加入100μL/孔含系列浓度梯度的二乙酸荧光素的磷酸盐缓冲液，二乙酸荧光素浓度梯度在0.078～40μg/mL之间，每个浓度6复孔，置于室温孵育15分钟，接着用100μL/孔磷酸盐缓冲液漂洗，吸干，在高精度可控电动平台(B)上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片，激发光460-500nm、发射光512-542nm，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，选择最佳二乙酸荧光素染色浓度，作为后续所有实验的荧光染色浓度；

(b)二乙酸荧光素荧光染色测量活细胞数法线性动态范围及细胞种板细胞数量选择

HepG2细胞和L-O2细胞按照倍半稀释的方式，细胞种于96孔板内60孔中，每个细胞数量5个孔平行，从50000个/孔一直倍半稀释12个数量梯度，即25～50000个细胞每孔，孵育及细胞染色条件同步骤(a)，同时，每个细胞株各做两块板，分别用于二乙酸荧光素荧光染色和噻唑蓝法测量，扫描得到的荧光图像经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，通过绘制二乙酸荧光素法荧光强度～细胞数量对数值、噻唑蓝法吸光度值～细胞数量对数值曲线，比较两种细胞活力测定方法线性动态范围、灵敏性以及两个细胞株的选择性；

(3)对化合物或中药材中肝毒性成分开展筛选并评价其毒性

(a)采用体外肝毒性细胞模型HepG2和L-O2，细胞的种板数量为3000个/孔，细胞培养过夜让其贴壁充分；次日进行加药操作，以对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪为肝毒性阳性化合物，其中对乙酰氨基酚设定9个浓度梯度为13.65～0.053mmol/L，盐酸氯丙嗪设定9个浓度梯度为163.5～0.639μmol/L，同时设定正常细胞对照组；

(b)取化合物和中药材的不同成分与细胞HepG2、L-O2共孵育48小时，之后弃去每孔中培养液，每孔加入含2.5μg/mL二乙酸荧光素磷酸盐缓冲溶液，室温避光孵育15分钟，在高精度可控电动平台(B)上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：绿色荧光滤光片，激发光460-500nm、发射光512-542nm，曝光时间500ms，物镜放大倍数2.5倍，每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，结果以细胞成活率表示：

成活率％＝加药处理组荧光强度/正常对照组荧光强度×100

对乙酰氨基酚和盐酸氯丙嗪以细胞成活率对浓度梯度做量效曲线，计算IC₅₀值，用IC₅₀值来评价毒性的强弱；

在筛选中设定正常细胞组、阳性损伤对照组及溶剂对照组，阳性损伤对照组为：13.65mmol/L的对乙酰氨基酚和163.54μmol/L的盐酸氯丙嗪，溶剂对照组为：0.1％v/v二甲基亚砜。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法，其特征在于，步骤(3)中，对于中药材，在与细胞HepG2、L-O2共孵育48小时前，需经过加热回流提取、中压柱分离及制备液相分离的前处理，将中药材分成不同的成分，每个成分用二甲基亚砜溶解成50mg/mL的储备液，中药材成分用于肝毒性成分筛选时使用浓度为50μg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法在化合物中肝毒性物质的筛选和评价中的应用。

4.根据权利要求1所述的一种基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法在中药材中肝毒性物质的筛选和评价中的应用。

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