CN103969233A - 一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法，包括：取心肌细胞，加入待筛选物质进行预保护；预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；向损伤后的心肌细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记；染色完成后采集、分析细胞荧光图像，分别计算待筛选物质对心肌细胞细胞膜和细胞核的保护率；从待筛选物质中筛选出对心肌细胞的细胞膜和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。采用两种荧光探针同时标记心肌细胞，从不同的作用机制出发考察待筛选物质对心肌细胞的保护效果，不仅筛选和评价方法具有快速、经济、高通量、高内涵的特点，而且筛选和评价结果更为全面严谨。

Description

一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法

技术领域

本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法。

背景技术

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是临床上常用的广谱抗肿瘤药物之一，被广泛地应用于实体瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤治疗。但阿霉素会产生累积性、剂量依赖性的心肌毒性，并进一步发展成不可逆性心肌损伤，最终导致充血性心力衰竭，因此严重地抑制了其临床应用。

阿霉素诱导心肌毒性的机制至今仍未完全阐明，现主要认为阿霉素诱发心肌毒性是多因素共同作用的结果，主要包括自由基损伤、细胞凋亡、线粒体损伤、钙离子超载、能量代谢改变等，这些因素之间相互联系，共同导致心脏毒性的产生和发展。

中医治疗心血管疾病的历史悠久，中药尤其是中药复方具备多层面多靶点的整体治疗优势。然而，虽然现在市场上广泛应用的中成药临床效果显著，但其抗阿霉素诱导的心肌毒性的有效成分以及作用机制还不明确。因此，对这些天然产物进行有效成分的筛选和评价，将有望从传统中药中找出新的具有抗阿霉素心肌毒性的活性物质。

目前，对于心肌保护组分的筛选主要是体外针对抗氧化活性的筛选，如DPPH法，MTT法、SOD以及LDH等酶活测定。但这些方法存在着作用时间久、灵敏度低等缺陷，不足以满足化合物库以及中草药中多组分大量筛选的要求。因此，基于细胞荧光图像的高通量筛选方法成为研究热点，期望能通过荧光标记细胞或者亚细胞器观察细胞形态以及细胞器功能的改变，来定量评价物质的心肌保护效果，从而快速筛选出心血管疾病治疗药物。

公开号为CN101982775B的中国专利文献公开了一种基于细胞荧光图像的药物筛选方法，通过控制荧光导致显微镜上的高精度可控电动平台精确走位，应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取心肌细胞保护作用的相关指标来筛选和评价活性组分。

该方法的不足之处在于，单色荧光标记用于药物筛选研究时，获得的信息单一，不利于全面评价化合物对细胞的作用，存在漏筛现象。

目前还未见相关报道介绍以多种荧光染料同时标记细胞，通过细胞荧光成像判定细胞损伤程度和药物保护效应的高内涵筛选方法。

发明内容

本发明提供了一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法，该方法采用两种荧光探针同时标记细胞，一次性全方位地判定细胞损伤程度和药物保护效应。

一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法，包括：

（1）取心肌细胞，加入待筛选物质进行预保护；

（2）预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；

（3）向损伤后的心肌细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记；

（4）染色完成后采集、分析细胞荧光图像，分别计算待筛选物质对心肌细胞细胞膜和细胞核的保护率；

（5）从待筛选物质中筛选出对心肌细胞的细胞膜和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。

阿霉素引起心肌毒性的损伤机制主要包括破坏细胞膜的完整性而引起的细胞活力下降，改变细胞线粒体膜电位和诱导细胞凋亡等。基于此，本发明选用了两种荧光探针，即细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针，细胞膜完整性荧光探针用于反映细胞膜的完整性，细胞核荧光探针用于反映细胞核双链DNA的损伤程度。并且两种荧光探针的激发和发射波长互不相同，便于分别获取与荧光探针相对应的荧光图像，互不干扰，单独判断待筛选物质对细胞膜、细胞核的保护效果，并与阳性药物进行对比，最终筛选出对心肌细胞的细胞膜和细胞核均具有较强保护效果的活性物质。

两种荧光探针同时染色不仅比分别染色节约了一半工作量，减少了细胞和相关实验耗材的用量，还消除了不同细胞样品之间的差异引起的试验误差，检测结果更为精确可信。同时，通过同时检测药物保护心肌细胞后不同细胞器的损伤程度，可为活性物质对抗阿霉素心肌毒性的作用机制提供有用线索，为后续的验证实验奠定更可靠的基础。

本发明方法可在96孔板上进行，具体包括以下步骤：

（1）取心肌细胞，加入待筛选物质进行预保护；

所述心肌细胞优选为对数生长期细胞，可选用常见的H9c2心肌细胞；细胞密度优选为1～100个/μL（对于96孔板为100～10000个/孔），更优选为20～40个/μL，最优选为40个/μL，适宜的细胞密度有利于染色后检测荧光强度并进行比较。

待筛选物质的终浓度可先进行预实验确定，以不会对心肌细胞产生毒性为宜，预保护时间优选为30～180min，更优选为30min。预保护时间过长可能会影响细胞活力，影响筛选和评价结果。

如未作特殊说明，本发明所述终浓度均是指物质加入到体系中后在总体系中的浓度。

（2）预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；

作为优选，阿霉素的损伤浓度为0.3～0.6μM，损伤时间为6～24h。更优选的损伤浓度为0.3μM，损伤时间为24h，以模拟实际临床应用中阿霉素低剂量致慢性心肌毒性的过程。同时，适宜的损伤浓度和损伤时间可避免心肌细胞过度受损，影响筛选和评价结果。

（3）向损伤后的心肌细胞中同时加入具有不同的细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记；

作为优选，所述细胞膜完整性荧光探针为二乙酸荧光素（FDA），其激发和发射波长分别为488nm和530nm。FDA是一种非极性酯类化合物，其本身并无荧光，但当它通过细胞膜后能被活细胞中的酶水解而产生极性的荧光物质（发绿色荧光）；该荧光物质不能通过细胞膜，因此能在细胞膜完整的细胞内留存，而在细胞膜不完整的细胞内则散失很快，从而可以根据其荧光强度判断心肌细胞的膜完整性。

hoechst33342的最大激发和发射波长分别为346nm和460nm。hoechst33342（发蓝色荧光）能与细胞核双链DNA上的碱基特异性结合，DNA受损时，结合在DNA上的荧光探针就减少，荧光强度也相应减弱。与双链DNA结合后，hoechst33342的最大激发和发射波长分别为350nm和461nm。

FDA和hoechst33342的激发和发射波长互不重叠，保证采集荧光图像时不产生干扰。

由于阿霉素对心肌细胞的毒副作用并非单方面的，而活性物质对心肌细胞的保护到底作用于何种细胞器难以直接获悉，且并非每一种荧光探针都能完美呈现阿霉素对某细胞器损伤程度。虽然阿霉素对心肌细胞的细胞膜、线粒体、DNA都有损伤，但本发明只筛选到能完美呈现阿霉素对心肌细胞的细胞膜、DNA损伤程度的FDA和hoechst33342，而未得到能呈现阿霉素对心肌细胞的线粒体的荧光探针，所以无法筛选和评价待筛选物质是否对心肌细胞线粒体具有保护作用。

作为优选，FDA和hoechst33342的荧光标记浓度为8～12μg/mL，荧光标记时间为10～20min，更优选的荧光标记浓度为8～12μg/mL，荧光标记时间为10min，高浓度和长时间的标记染色会对细胞造成一定的损伤。

（4）染色完成后采集、分析细胞荧光图像，分别计算待筛选物质对心肌细胞细胞膜和细胞核的保护率；

保护率的计算公式为：

其中，f为加药保护组的荧光强度，Fm为损伤组的荧光强度，Fc为正常细胞组的荧光强度。

染色完成后，弃去培养液，用PBS洗一遍后吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像，荧光拍摄参数为：物镜放大倍数2.5倍，曝光时间1000ms，先用绿色荧光滤光片（激发光440-520nm，发射光505nm）拍摄，再用蓝色荧光滤光片（激发光320-400nm，发射光400nm）拍摄；每孔拍摄6幅图像，所得荧光图像经过FluoinsightCell工作站图像拼接、图像识别以及数据数据输出系统进行统计，计算得到保护率。

所述FluoinsightCell工作站图像拼接、图像识别以及数据数据输出系统已在公开号为CN101788480的中国专利文献公开。

（5）从待筛选物质中筛选出对心肌细胞的细胞膜和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。

本发明的一个实施例中，利用上述方法对有心肌保护作用的贞芪扶正颗粒（购于修正药业）中的活性成分进行了筛选，包括：

（i）将贞芪扶正颗粒用纯水溶解，离心取上清液；

（ii）用大孔树脂将所述上清液依次用水、40%乙醇、95%乙醇洗脱，分别收集各洗脱组分，减压浓缩至干；

（iii）将浓缩后的洗脱组分通过制备液相色谱进行分离，收集各馏分，干燥后作为待筛选物质，用本发明的筛选方法对其活性进行评价，并筛选出其中含有的活性物质。

贞芪扶正颗粒是一种中成药，以中药材为原料做成的制剂，本领域技术人员对其发挥药效的主要化合物并不清楚。若能获得其中发挥药效的主要化合物，则有利于制备获得治疗效果更好的药物。本发明从该中成药中发现了羟基酪醇和新女贞子苷具有较强的抗阿霉素心肌毒性活性，与Dox损伤的心肌细胞相比，羟基酪醇和新女贞子苷对心肌细胞的细胞膜和细胞核的保护率均大于15%，具有明显的抗阿霉素心肌毒性活性，这在国际上尚属首次。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针同时标记心肌细胞，从不同的作用机制出发考察待筛选物质对心肌细胞的保护效果，不仅筛选和评价方法具有快速、经济、高通量、高内涵的特点，适合于国内在早期开展对于治疗阿霉素引起的心肌毒性的药物（包括化学药以及中草药）的筛选和先导化合物的发现，为中药现代化奠定基础；而且筛选和评价结果更为全面严谨，为进一步的分离纯化有效化合物以及结构鉴定提供依据，为先导化合物的发现奠定基础。

附图说明

图1为FDA标记细胞的荧光强度随细胞密度的变化曲线；

图2为Hoechst标记细胞的荧光强度随细胞密度的变化曲线；

图1、图2中，Fluorescence intensity表示荧光强度，Log Cell number表示细胞数量的对数值；

图3为Hoechst标记细胞的存活率随DOX浓度的变化曲线；

图4为FDA标记细胞的存活率随DOX浓度的变化曲线；

图3、图4中，Cell Survival（%）表示细胞存活率（%），Log DOX（μM）表示阿霉素浓度（μM）的对数值，Cell number表示细胞数量（/孔）；

图5为单色荧光标记与双色荧光标记对细胞存活率的影响；

其中，Cell Survival（%）表示细胞存活率（%），Log DOX（μM）表示阿霉素浓度（μM）的对数值，mono fluorescence Hoechst表示Hoechst单色荧光标记，mono fluorescence FDA表示FDA单色荧光标记，dualfluorescence Hoechst表示双色荧光标记中的Hoechst荧光标记，dualfluorescence FDA表示双色荧光标记中的FDA荧光标记；

图6为双色荧光标记下芦丁对心肌细胞的保护效果图（10倍镜下观察）；

其中，control表示正常细胞，DOX表示加0.3μM阿霉素处理24h后的细胞，DOX+rutin表示加100μM rutin预保护30min后加0.3μM阿霉素处理24h后的细胞；merge表示将FDA与Hoechst的荧光显微图片合并获得的双色荧光显微图片，通过双色荧光显微图片融合可清晰见到心肌细胞整体形态和细胞核位置；

图7为芦丁对心肌细胞保护作用的量效图；

其中，Rutin表示芦丁，Protective Percent（%）表示保护率（%），Log Concentration（μM）表示浓度（μM）的对数值；

图8a为40%乙醇提取物的制备组分中心肌保护活性成分筛选结果及LC-MS分析负离子模式下总离子流图；

图8b为95%乙醇提取物的制备组分中心肌保护活性成分筛选结果及LC-MS分析负离子模式下总离子流图；

图8a、8b中，Protective Percent（%）表示保护率（%），relative abundance表示相对丰度，Time（min）表示出峰时间（分钟）；

图9a为羟基酪醇对心肌细胞保护作用的量效图；

其中，Hydroxytyrosol表示羟基酪醇，Protective Percent（%）表示保护率（%），Log Concentration（μM）表示浓度（μM）的对数值；

图9b为新女贞子苷对心肌细胞保护作用的量效图；

其中，Neonuezhenide表示新女贞子苷，Protective Percent（%）表示保护率（%），Log Concentration（μM）表示浓度（μM）的对数值。

具体实施方式

（1）FDA和Hoechst标记细胞密度线性考察

取对数生长期的H9c2细胞，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后，以不同的细胞密度（0，10，100，500，1000，2000，4000，6000，8000，10000个/孔）种于96孔板中间60孔中，周边用PBS代替以避免边缘效应，置于细胞培养箱中分别培养24h，48h，72h；弃去每孔中的培养液，避光，分别用浓度为10μg/mL的FDA和10μg/mL的Hoechst对不同培养时间的细胞进行单色荧光标记，在细胞培养箱中孵育10min，弃去培养液，PBS洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。

荧光拍摄参数为：物镜放大倍数2.5倍，曝光时间1000ms，绿色荧光滤光片（激发光440-520nm、发射光505nm），蓝色荧光滤光片（激发光320-400nm，发射光400nm）。每孔拍摄6幅图像，并经过FluoinsightCell工作站荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，统计结果如图1、2所示。

由图1、2可见，细胞密度为0到10000个/孔时，FDA和Hoechst标记细胞的荧光强度随细胞密度的增大而增大，而且荧光强度随细胞培养时间的增加而增加，且呈良好的线性关系（R²>0.9）。说明这两种荧光染料的荧光强度在常规细胞实验所需细胞数范围内均能够较好地反映96孔板中细胞的实际数目，可用于准确评价阿霉素损伤程度和药物保护效果。

（2）FDA和Hoechst标记不同细胞密度的阿霉素浓度损伤线性考察

取对数生长期的H9c2细胞，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后，种于96孔板中间60孔中，周边用PBS代替以避免边缘效应，各板的细胞密度分别为100，500，1000，2000，4000，6000，8000，10000个/孔，置于细胞培养箱中培养24h，弃去培养液；每板加不同浓度的阿霉素（浓度梯度为0.001，0.01，0.1，0.5，1，2，6，10，100μM）进行损伤，损伤时间为24h；每板设置正常细胞组即不加阿霉素组；损伤完成后弃去每孔中的培养液，避光，分别加入100μL浓度为10μg/mL的FDA和10μg/mL的Hoechst对不同培养时间的细胞进行单色荧光标记，在细胞培养箱中孵育10min，弃去培养液，PBS洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。

荧光拍摄参数以及处理分析方法同（1），统计结果如图3、4所示。

由图3可见，DOX浓度为0到2μM时，Hoechst标记细胞的存活率随DOX浓度增加而降低，2μM时细胞存活率接近为1%。

由图4可见，DOX为0.001到0.5μM时，FDA标记细胞的存活率随DOX浓度增加而降低，DOX为0.5到10μM时，出现了存活率平台期，当DOX为更高浓度100μM时，细胞存活率才降低。

由此推断，Hoechst能够较为敏感地呈现阿霉素对某细胞器损伤程度，从而反映心肌细胞的细胞核受损情况。

（3）单色荧光与双色荧光标记H9c2细胞下阿霉素毒性的量效关系比较

取对数生长期的H9c2细胞，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后，以4000个/孔的密度种于96孔板中间60孔中，周边用PBS代替以避免边缘效应，置于细胞培养箱中分别培养24h；弃去培养液，加入不同浓度的盐酸阿霉素（DOX）（0.01，0.1，0.3，0.5，1，2μM）损伤24h；设置正常细胞组即不加阿霉素组；一板用FDA标记，一板用Hoechst标记。染色条件及细胞荧光图像获取和处理方法同（1）。

一板同时用FDA和Hoechst标记，在培养液中同时加入FDA和Hoechst，使两者的终浓度均为10μg/mL，每孔加入100μL，在细胞培养箱中孵育细胞10min，弃去培养液，PBS漂洗一遍，先用绿色荧光滤光片（激发光440-520nm、发射光505nm），拍摄一遍，再用蓝色荧光滤光片（激发光320-400nm、发射光400nm）拍一遍。荧光图像获取及处理方法同（1）。

比较单色荧光标记与双色荧光标记下，H9c2细胞存活率与阿霉素浓度的量效关系，比较结果见图5。

由图5可见，当阿霉素浓度为0.01-2μM时，单色荧光标记和双色荧光标记所得的细胞存活率没有明显的差异，表明双色荧光标记时两个荧光探针不会影响彼此。由于Hoechst标记更为敏感，所以选择Hoechst标记细胞存活率约为50%时阿霉素的浓度（0.3μM）为损伤浓度。

（4）用于评价阳性化合物芦丁的抗阿霉素心肌毒性

取对数生长期的H9c2细胞，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后，以4000个/孔的密度接种于96孔板中间60孔，周边用PBS代替以避免边缘效应，置于细胞培养箱中37℃孵育24h；分别加入浓度为10、20、40、60、80、100μmol/L的已知心肌保护化合物芦丁，预保护30min，不弃培养液，加入阿霉素，使其终浓度为0.3μM，设置正常细胞组（只加培养液不做其他处理）和模型组（只加阿霉素，不加芦丁），细胞培养箱中孵育24h；弃去每孔中的培养液，并用PBS洗涤一遍，避光加入100μL含10μg/mL FDA和10μg/mL Hoechst的培养液，细胞培养箱中孵育10min；弃去培养液，PBS洗一遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像；双色荧光图像的获取和处理方法同（3）（图6）。通过公式计算保护率并绘制保护率对浓度的量效曲线（图7）并计算芦丁的EC50值。保护率的计算公式为：

其中f为加药保护组的荧光强度，Fm为模型组即损伤组的荧光强度，Fc为正常细胞组的荧光强度。

由图6可见，在高倍镜下观察，FDA标记细胞，当细胞处于正常状态时（control，正常细胞组），形态呈梭形，细胞形态完整，绿色荧光比较亮；阿霉素损伤后（模型组），细胞形态变得不规则，有的细胞有空泡出现，同时绿色荧光强度降低；芦丁预保护后（加药保护组），细胞形态比模型组规则许多，有的甚至呈梭形，空泡减少，绿色荧光强度比模型组增加。Hoechst标记细胞，可以明显的看到模型组被标记的细胞核比正常细胞组的减少，加药保护组被标记的细胞核比模型组增加。证实了本发明的方法可较好的用于评价药物的心肌保护作用。

同时，如图7所示，芦丁对心肌细胞具有很好的保护作用，根据FDA和Hoechst荧光强度计算得到，在10-100μM范内，芦丁对心肌细胞的保护作用呈浓度依赖性，浓度为100μM时保护率分别约为53.6%（FDA染色）和38.9%（Hoechst染色）。

（5）本发明方法用于筛选贞芪扶正中的心肌保护成分

利用本发明方法对有心肌保护作用的贞芪扶正颗粒（购于修正药业）中的活性成分进行筛选，具体如下：

1）将贞芪扶正颗粒用纯水溶解，离心取上清液；

2）用大孔树脂将所述上清液依次用水、40%乙醇、95%乙醇洗脱，分别收集各洗脱组分，减压浓缩至干；

3）将浓缩后的洗脱组分通过制备液相色谱进行分离，收集各馏分，冷冻干燥后作为待筛选组分，用于筛选实验；

4）接种H9c2细胞于96孔板上，细胞密度为4000个/孔，培养24h后，加入含有50μg/mL待筛选组分的培养液（50μg/mL时有细胞毒作用的组分浓度降为25μg/mL或10μg/mL），预保护30min后，加入0.3μM的DOX损伤24h，并设置正常对照组（不加DOX)和模型对照组(0.3μM的DOX)，依照第（4）部分中所建立的心肌保护物质的方法，使用FDA和Hoechst进行荧光标记，荧光标记完成后经FluoinsightCell工作站拍摄并处理，计算各待筛选组分对心肌细胞的保护率。

图8a、8b分别为40%、95%乙醇提取物的制备组分中心肌保护活性成分筛选结果及LC-MS分析负离子模式下总离子流图。筛选得到B5，B6，B19，B20，B22五个活性组分。FDA标记时，这五个活性组分的EC₅₀分别为136.3,166.4,267.6,176.5，233.6μg/ml；Hoechst标记时，其EC₅₀分别为299.0,285.8,310.4,342.1,415.3μg/ml。

进一步对组分B6中的主要成分羟基酪醇和组分B20中的主要成分新女贞子苷进行抗阿霉素心肌毒性活性评价。取10、20、40、60、80、100μM的羟基酪醇和新女贞子苷按照上述步骤4)进行实验，结果如图9a、9b所示。

由图9a、9b可见，两个化合物对心肌细胞的保护活性均与浓度呈正相关。其中，FDA标记时，100μM羟基酪醇的保护率为18.7%，100μM新女贞子苷的保护率为29.5%；Hoechst标记时，100μM羟基酪醇的保护率为24.8%，100μM新女贞子苷的保护率为20.4%。结果表明新女贞子苷可能有更好的抗氧化作用，羟基酪醇可能有更好的抗凋亡作用。

Claims (8)

1.一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法，包括：

（1）取心肌细胞，加入待筛选物质进行预保护；

（2）预保护完成后，加入阿霉素进行损伤；

（3）向损伤后的心肌细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针，进行荧光标记；

（4）染色完成后采集、分析细胞荧光图像，分别计算待筛选物质对心肌细胞细胞膜和细胞核的保护率；

（5）从待筛选物质中筛选出对心肌细胞的细胞膜和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述心肌细胞为对数生长期细胞，细胞密度为20～40个/μL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，预保护时间为30～180min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，阿霉素的损伤浓度为0.3～0.6μM，损伤时间为6～24h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述细胞膜完整性荧光探针为二乙酸荧光素。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述细胞核荧光探针为hoechst33342。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针的荧光标记浓度为8～12μg/mL，荧光标记时间为10～20min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，保护率的计算公式为：

其中，f为加药保护组的荧光强度，Fm为损伤组的荧光强度，Fc为正常细胞组的荧光强度。