CN104140997B - 一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法，包含以下步骤：1)制备饮用水消毒工艺出水的提取物的溶液；2)用步骤1)的提取物溶液暴露处理离体的永生化人胚胎肾细胞；3)步骤2)处理后的细胞依次进行EMA染色和SYTOX Green染料染色；4)流式细胞仪分析。本发明的检测方法可减少假阳性结果，孔板离心排除碎片干扰，可实现饮用水消毒工艺水样的遗传毒性的快速、微量化、高通量分析，提高了检测方法的敏感性，试验结果易于统一，重现性好，准确可靠。

Description

一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法
技术领域
本发明属于水环境研究领域，涉及饮用水的毒性检测分析，特别涉及一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法。
背景技术
环境污染对饮用水水质造成威胁，饮用水消毒工艺有效控制饮用水中致病微生物的介水传染病等，在世界范围内广泛应用。但在消毒的同时，消毒剂不可避免的与水中天然有机物(NOM，naturalorganicmatters)及人为污染物、原水中存在的溴、碘离子等反应生成饮用水消毒副产物(disinfectionby-products，DBPs)(Richardson,S.D.；Plewa,M.J.；Wagner,E.D.；Schoeny,R.；DeMarini,D.M.,Occurrence,genotoxicity,andcarcinogenicityofregulatedandemergingdisinfectionby-productsindrinkingwater:areviewandroadmapforresearch.MutationResearch/ReviewsinMutationResearch[J]2007,636(1-3):178-242)。饮用水安全问题得到广泛关注，针对水质评价开展的方法研究具有重要意义。
目前已报道的DBPs高达600多种，但饮用水消毒过程中产生复杂化合物还无法通过化学分析一一识别。研究表明饮用水消毒过程中产生的部分副产物具有遗传毒性，而DBPs在饮用水中以混合物的形式存在，暴露途径及相互作用尤为复杂，通过对单一DBPs的毒性试验无法准确反映消毒工艺的潜在危害。生物毒性测试以其测定复杂环境样品总体效应的优势彰显，将快速、高通量的生物遗传毒性测试体系应用于饮用水水质应急与预警技术研究显得尤为重要。
体外微核试验是一种检测染色体或有丝分裂器损伤遗传毒性的重要方法(MichaelFenech.Theinvitromicronucleustechnique.MutationResearch-FundamentalandMolecularMechanismsofMutagenesis[J]2000,455(1-2):81-95)。自1959年由Evans等将蚕豆根尖细胞暴露于电离辐射，以微核发生率反映染色体异常评价遗传毒性以来，微核试验检测方法、技术及手段也在不断进步，由传统镜检法像自动化测试方向发展。经济合作与发展组织(OECD)测试导则No.487(2010)及中华人民共和国国家标准GB/T28646-2012对体外哺乳动物细胞微核试验测试方法用于化学品检测进行补充，将流式细胞仪检测方法纳入规范。微核试验以其经济、结果可靠等优点，且所诱发的微核率在一定范围内存在剂量-效应关系，适于定量化评价饮用水遗传毒性。
现有评价技术的缺点：传统微核试验镜检方法试验周期长，易受主观因素影响；微核的产生分为染色体断裂剂及非整倍体毒剂作用两种类型，以往流式细胞仪检测较难区分微核诱发原因，且多应用于标准化合物分析，未对微核诱发因素的贡献率作定量化计算。目前采用污染指数定量评价饮用水水质毒性，毒性反应不够直观，毒性等级划分有一定的主观性。在大量环境样品遗传毒性分析方面，现有微核技术较难满足需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法，包含以下步骤：
1)制备饮用水消毒工艺出水的提取物的溶液；
2)用步骤1)的提取物溶液暴露处理离体的永生化人胚胎肾细胞；
3)步骤2)处理后的细胞依次进行EMA染色和SYTOXGreen染料染色；
4)流式细胞仪分析，根据被SYTOXGreen染料染色但不被EMA染色的颗粒的大小和形态特征，判别微核、细胞核和亚二倍体颗粒，并记录数目，得到微核率和亚二倍体贡献率，进而得出饮用水消毒工艺出水遗传毒性。
具体的，所述微核率和亚二倍体贡献率的计算公式如下：
微核率(％)＝微核数目/细胞核数目×100％
亚二倍体贡献率(％)＝亚二倍体颗粒数目/微核数目×100％
上述方法中，步骤1)中，所述提取物的制备方法为：采集饮用水消毒工艺出水的水样，水样用玻璃纤维滤膜过滤，再用HLB柱进行固相萃取，以二氯甲烷为淋洗剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得。
提取物的制备方法中，所述HLB柱是经正己烷、二氯甲烷、甲醇、超纯水活化的HLB柱。
所述提取物溶液中的溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。上述方法中，在所述步骤1)之后，所述步骤2)之前，包括如下步骤：利用MTT细胞毒性试验确定最高暴露浓度；其中，所述最高暴露浓度是指保证细胞存活率≥50％时细胞暴露处理液中提取物的浓度。在MTT实验中，用细胞暴露处理液来处理离体的永生化人胚胎肾细胞，细胞暴露处理液由提取物溶液和适合于培养永生化人胚胎肾细胞的细胞培养基组成。
上述方法中，所述步骤2)中暴露处理的方法如下：向对数生长期的所述永生化人胚胎肾细胞中加入细胞暴露处理液，置于细胞培养箱中培养24h；其中，所述细胞暴露处理液为适合于培养永生化人胚胎肾细胞的细胞培养基和所述提取物溶液的混合液；
步骤2)中，所述细胞暴露处理液中提取物的浓度小于或等于所述利用MTT细胞毒性试验确定的最高暴露浓度。
上述方法中，所述细胞暴露处理液具体是将所述提取物溶液与所述适合于培养永生化人胚胎肾细胞的细胞培养基按照5:995的体积比混合得到的；所述提取物溶液是将按照上述提取物的制备方法从100mL饮用水消毒工艺出水中提取的提取物溶于1μLDMSO中。
上述方法中，所述适合于培养永生化人胚胎肾细胞的细胞培养基为细胞完全培养基。
再具体的，所述细胞完全培养基由MEM-EBSS培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液组成；其中，MEM-EBSS培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液的体积比为90:10:1；青霉素-链霉素溶液中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/mL。
上述方法中，所述提取物溶液中的溶剂为DMSO。
上述过程中，所述对数生长期细胞为调节细胞密度1×105个/mL，500μL/孔接种于细胞培养板中置于在37℃、体积百分比为5％CO2细胞培养箱中，贴壁生长12h后的细胞。
具体的，所述方法中，所述步骤3)中EMA染色的方法包括如下步骤：
向步骤2)处理后的细胞中加入EMA染色液，浸于碎冰下2cm固定，可见光源离液面10-15cm照射30min；光激活结束后，加入4℃预冷的含体积百分比为2.5％胎牛血清的PBS，吸弃后，PBS洗涤，铝箔纸避光。
具体的，所述方法中，所述步骤3)中所述SYTOXGreen染料染色的方法如下：
向EMA染色洗涤后的细胞加入低渗荧光探针染液，涡旋，37℃避光染色1h；再加入高渗荧光探针染液，涡旋，室温避光放置30min。
具体的，所述EMA染色液由EMA和含体积百分比为2.5％的胎牛血清的PBS缓冲液组成，EMA在EMA染色液中的浓度为0.5-15μg/mL；所述PBS缓冲液pH值为7.2-7.4；再具体的，所述EMA在EMA染液中的浓度1μg/mL；
所述低渗荧光探针为FCM溶液Ⅰ；再具体的，所述FCM溶液Ⅰ由溶质和溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅰ中的浓度为：1-800mg/L氯化钠，500-2000mg/L柠檬酸钠,0.5-2mg/mLRNAseA,0.1-0.5mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0.2-1.0μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水；再具体的，所述溶质及其在FCM溶液Ⅰ中的浓度如下：584mg/L氯化钠，1000mg/L柠檬酸钠,0.5mg/mLRNAseA,0.3mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0.4μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水。
所述高渗荧光探针为FCM溶液Ⅱ；再具体的，所述FCM溶液Ⅱ由溶质和溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅱ中的浓度为：80-160mg/L蔗糖，15-30mg/L柠檬酸及0.2-1.0μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水；再具体的，所述溶质及其在FCM溶液Ⅱ中的浓度为：85.6mg/mL蔗糖，15mg/L柠檬酸及0.4μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水。
具体的，所述方法中，是将细胞放置在24孔板中进行暴露处理的，在所述步骤3)之后，所述步骤4)之前，包括如下步骤：将所述24孔板离心。
具体的，所述永生化的人胚胎肾细胞为永生化的人胚胎肾细胞HEK293。
本发明的另一个目的是提供一种用于体外微核检测饮用水消毒工艺出水遗传毒性的试剂盒，包括以下溶液：
MTT储备液：用pH值为7.2-7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)配制成浓度为5mg/mL的MTT溶液；所述PBS缓冲液pH值为7.2-7.4；
EMA染液：由含体积百分比为2.5％的胎牛血清的PBS缓冲液和EMA组成，EMA在EMA染液中的浓度为0.5-15μg/mL；所述PBS缓冲液pH值为7.2-7.4；再具体的，所述EMA在EMA染液中的浓度1μg/mL；
FCM溶液Ⅰ：由溶质及溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅰ中的浓度如下：1-800mg/L氯化钠，500-2000mg/L柠檬酸钠,0.5-2mg/mLRNAseA,0.1-0.5mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0.2-1.0μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水；再具体的，所述溶质及其在FCM溶液Ⅰ中的浓度如下：584mg/L氯化钠，1000mg/L柠檬酸钠,0.5mg/mLRNAseA,0.3mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0.4μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水。
FCM溶液Ⅱ：由溶质和溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅱ中的浓度为：80-160mg/mL蔗糖，15-30mg/L柠檬酸及0.2-1.0μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水；再具体的，所述溶质及其在FCM溶液Ⅱ中的浓度为：85.6mg/mL蔗糖，15mg/L柠檬酸及0.4μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水。
所述乙基苯基聚乙二醇为NonidetP-40。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1.MTT急性毒性试验在流式细胞仪微核检测前预筛合适浓度，减少以往因细胞死亡造成的假阳性结果。
2.采用24孔板微量化体外细胞培养，减少样品量，孔板离心排除碎片干扰，流式细胞仪检测，高通量获得数据。
3.经流式细胞仪一系列门的设定，在获得细胞微核率的同时可获得细胞周期信息及亚二倍体信息，实现微核诱发因素的定量化分析，方便进一步研究不同消毒工艺的微核产生机理。
因此，本发明实现饮用水消毒工艺水样的遗传毒性的快速、微量化、高通量分析，提高了检测方法的敏感性，试验结果易于统一，重现性好，准确可靠。
附图说明
图1为体外微核测试试验流程图。
图2为前向散射光-侧向散射光(FSCvsSSC)散点图。
图3为SYTOXGreen染细胞核(FL1-H)一维直方图。
图4为SYTOXGreen染细胞核宽度-面积(FL1-WvsFL1-A)散点图。
图5为EMA-SYTOXGreen荧光信号(FL3-HvsFL1-H)散点图。
图6为前向散射光-SYTOXGreen荧光信号(FSCvsFL1-H)散点图。
图7为侧向散射光-SYTOXGreen荧光信号(SSCvsFL1-H)散点图。
图8为圈门设定主核、微核及亚二倍体(FSCvsFL1-H)散点图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
永生化人胚胎肾细胞HEK293购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
实施例1、对南方某饮用水厂臭氧消毒工艺出水进行遗传毒性评价
采用体外微核测试试验对该饮用水厂臭氧消毒工艺出水进行遗传毒性评价，体外微核测试试验流程见图1。
一、南方某饮用水厂饮用水消毒工艺出水提取物的提取
用棕色玻璃瓶原位采集10L水后，立即送回实验室过0.7μm玻璃纤维滤膜过滤，去除悬浮物，过经5mL正己烷、5mL二氯甲烷、5mL甲醇、5mL超纯水活化过的HLB柱进行固相萃取，每根HLB柱富集2L水，过柱流速控制在10mL/min左右；萃取后吹干吸附柱，以10mL二氯甲烷为淋洗剂分三次洗脱富集在吸附柱上的物质；所有有机溶剂均为色谱纯；洗脱液经旋转蒸发仪浓缩至近2mL后，浓缩物过无水硫酸钠柱脱水，氮吹后溶剂置换至100μLDMSO，将该水样提取物的DMSO溶液作为储备液，保存于-20℃冰箱备用，其中，1μLDMSO中含有相当于100ml水样中提取的提取物。
二、细胞培养
取永生化的人胚胎肾细胞HEK293，在37℃、体积百分比为5％CO2培养箱中培养，细胞每两天传代一次，传代后一天换培养基。
在整个体外微核测试试验过程中，均采用细胞完全培养基培养永生化的人胚胎肾细胞HEK293；所述细胞完全培养基由MEM-EBSS培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液组成，其中，MEM-EBSS培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液的体积比为90:10:1；青霉素-链霉素溶液中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/mL。
三、细胞暴露处理
1、MTT急性细胞毒性预筛试验
1)细胞接种
取对数生长期的永生化人胚胎肾细胞HEK293,调节细胞密度为1×105个细胞/mL，100μL/孔接种于96孔板中，在37℃、体积百分比为5％CO2培养箱中培养，贴壁生长12h。设阴性对照组、调零孔(无细胞)和样品暴露组，每组设4个平行试验。
2)细胞暴露
12h后将96孔培养板取出，弃去旧细胞完全培养液，加入下述配制的细胞暴露处理液200μL，细胞在37℃、体积百分比为5％的CO2培养箱中培养暴露24h。
细胞暴露处理液的配制：取新鲜配制的完全培养基995μL，再加5μL样品，混合摇匀，为配置好的细胞暴露处理液，备用，其中5μL样品分别指：
阴性对照组样品：5μL不含饮用水消毒工艺出水提取物的空白溶剂即二甲基亚砜DMSO；
暴露组样品：将水样提取物的DMSO储备液稀释为4个不同的浓度，分别为5μL提取物溶液中含有相当于500mL、250mL、125mL、62.5mL水样中提取的提取物；取该4个不同浓度的提取物溶液各5μL加入995μL的完全培养基中混匀；
调零孔样品：5μLDMSO。
3)MTT应用液处理暴露细胞
MTT(噻唑蓝)应用液的配制：用pH值为7.2-7.4的PBS配制成浓度为5mg/mL的MTT储备溶液；使用时，用pH值为7.2-7.4的PBS稀释成浓度为0.5mg/mL的MTT应用液，现用现配。
暴露结束后，弃去暴露液，加入100μLMTT应用液/孔，将96孔板置于细胞培养箱，在37℃、体积百分比为5％CO2培养箱中避光反应4h后，弃去MTT应用液，加入150μLDMSO/孔,平板摇床振荡5min。波长550nm处测定吸光度，暴露样品、调零孔、阴性对照的吸光度值分别标记为A550(样品)、A550(调零孔)、A550(阴性对照)。
4)MTT预筛试验结果处理
细胞相对存活率的计算公式为：
最后，以保证细胞存活率≥50％为标准，确定HEK293在该饮用水消毒工艺出水物提取物中的最高暴露浓度。
MTT预筛试验结果表明，暴露浓度为500mL水样/mL细胞暴露处理液(从提500mL水样中取出来的提取物/mL细胞暴露处理液，所述1mL细胞暴露处理液含995μL细胞完全培养基和5μL提取物溶液)时，细胞存活率是(89.8±2.8)％，细胞存活率≥50％，不存在急性毒性，选取该浓度为后续流式细胞仪微核检测的浓度，从而减少高急性毒性对微核测试假阳性结果的干扰。
2、微核试验的细胞暴露处理
1)细胞接种
取对数生长期的永生化人胚胎肾细胞HEK293，调节细胞密度1×105个/mL，500μL/孔接种于24孔板中置于在37℃、体积百分比为5％CO2细胞培养箱中，贴壁生长12h后暴露处理。设对照组、调零孔(无细胞)和样品暴露组，每组设3个平行试验。
2)细胞暴露
12h后将24孔培养板取出，弃去旧细胞完全培养液，加入下述配制的细胞暴露处理液200μL，置于细胞培养箱进行暴露处理，细胞培养条件为37℃、体积百分比为5％CO2，暴露培养24h。
细胞暴露处理液的配制：
阴性对照组样品：取新鲜配制的完全培养基995μL，再加5μLDMSO。
实验组样品：取新鲜配制的完全培养基995μL，再加5μL提取物溶液，混合摇匀，为配置好的细胞暴露处理液。1ml细胞暴露处理液中提取物的量为从500mL水样中提取的提取物。
调零孔样品：取新鲜配制的完全培养基995μL，再加5μLDMSO。
四、荧光探针染色
1、染液制备
EMA染液：由EMA和含体积百分比为2.5％的胎牛血清的PBS缓冲液组成，EMA在EMA染色液中的浓度为1μg/mL；所述PBS缓冲液pH值为7.2-7.4；
FCM溶液Ⅰ：由溶质及溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅰ中的浓度如下：584mg/L氯化钠，1000mg/L柠檬酸钠,0.5mg/mLRNAseA,0.3mL/LNonidetP-40以及0.4μMSYTOXGreen核染料，溶剂为超纯水。
FCM溶液Ⅱ：由溶质和溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅱ中的浓度为：85.6mg/mL蔗糖，15mg/L柠檬酸及0.4μMSYTOXGreen核染料，溶剂为超纯水。
2、细胞固定、荧光探针染色及细胞裂解
将暴露处理后的24孔板取出，弃旧培养基。加入300μLEMA染色液/孔，浸于碎冰下2cm固定，可见光源离液面15cm照射30min；光激活结束后，加入200μL含2.5％胎牛血清的PBS(4℃预冷)，吸弃后，PBS洗涤，铝箔纸避光；于室温轻轻加入500μLFCM溶液Ⅰ，涡旋，37℃避光染色1h；用力加入500μLFCM溶液Ⅱ，涡旋，室温避光放置30min后，24孔板离心(600-1200×g，10min)弃上清，沉淀物经PBS重悬，过300目尼龙网，流式细胞仪检测或4℃冰箱避光保存。
五、流式细胞仪分析
1、流式细胞仪参数设置
激发光源为氩离子激光器，激发光：488nm
发射光：SYTOXGreen荧光通道为FL1(515/30band-passfilter)
EMA荧光通道为FL3(>650long-passfilter)
2、流式细胞仪散点图门的设置
采用流式细胞仪检测后根据荧光信号和颗粒大小复杂程度等设置一系列门，筛选出目标细胞的细胞核及产生的微核。
流式细胞仪数据收集后，软件分析时以前向角(FSC-H)和侧向角(SSC-H)为横、纵坐标作散点图2。FSC-H、SSC-H分别反映细胞颗粒度大小及颗粒内容物的精细结构等复杂程度，通过将其设为阈值来排除样品中的各种非特异性碎片的干扰。细胞核颗粒物的FSC-H与SSC-H成一定比例(Lightscatter门设置)，低于该比例则为非目标物质。
以FL1设阈值，SYTOXGreen荧光探针(FL1-H)的荧光强度作一维直方图3，细胞计数为纵坐标，以分析细胞区域内DNA含量的细胞数目，峰处分别代表不同时相的细胞周期(G0/G1、S、G2/M期)以观察细胞暴露处理所处状态，排除碎片干扰(FL1Range门设置)。
以FL1通道荧光信号中颗粒宽度FL1-W为横坐标及颗粒表面积FL1-A为纵坐标作散点图4。荧光信号标记的细胞核中FL1-W与FL1-A成相应比例，设置DoubleDiscrimination门可有效地排除细胞的双粘体及其他非核物质。
以FL3-H通道表征的EMA荧光信号为横坐标与以FL1-H通道表征的SYTOXGreen荧光信号为纵坐标作散点图5。细胞处理时，EMA本身无荧光，在细胞裂解前加入，标记凋亡中后期及坏死细胞的细胞核，经光激活后产生可在FL3通道识别的荧光信号。EMA阳性颗粒标记凋亡小体及坏死细胞。设置EMAnegative门可剔除上述非正常细胞的细胞核颗粒干扰。
经Lightscatter门、FL1-Range门、DoubleDiscrimination门及EMAnegative门一系列交集设门筛选后确定目标颗粒群。以FL1-H通道表征的SYTOXGreen荧光颗粒信号为横坐标分别与FSC-H及SSC-H为纵坐标作散点图(图6，图7)。标记DNA的SYTOXGreen荧光信号与FSC-H及SSC-H呈线性比例，设置FSCvsSYTOX及SSCvsSYTOX门，可进一步除去荧光强度非线性颗粒，保证微核计数准确均一性。
经上述门的设定筛选用于微核计数。以FL1-H通道的SYTOXGreen荧光信号为横坐标与以前向散射光信号(FSC-H)为纵坐标的散点图8，根据被SYTOXGreen染料染色但不被EMA染色的目标颗粒的大小和形态特征，判别微核(Micronuclei)、细胞核(Nuclei)和亚二倍体颗粒(Hypodiploid)，并记录数目，得到微核率和亚二倍体贡献率，进而得出饮用水消毒工艺出水遗传毒性。
3、检测结果处理
饮用水消毒处理工艺样品的计算公式：
微核率(％)＝微核数目/细胞核数目×100％
亚二倍体贡献率(％)＝亚二倍体颗粒数目/微核数目×100％
微核诱发倍率(％)＝微核率(样品)/微核率(对照)
4、南方某饮用水厂臭氧消毒工艺出水体外微核测试结果见表1。
表1
样品 细胞相对存活率(％) 微核率(％) 微核诱发倍率 亚二倍体贡献率(％)
对照 100.0±5.5 1.2±0.1 24.1±1.3
臭氧消毒工艺出水 89.8±2.8 3.2±0.1 2.7 27.9±2.5
实施例2、对北方某饮用水厂氯化消毒工艺出水进行遗传毒性评价
评价方法同实施例1。相同暴露浓度下，即暴露浓度为500mL水样/mL细胞暴露处理液时，北方某饮用水厂氯化消毒工艺出水体外微核测试结果见表2。
表2
样品 细胞相对存活率(％) 微核率(％) 微核诱发倍率 亚二倍体贡献率(％)
对照 100.0±7.8 1.4±0.1 26.4±2.5
氯化消毒工艺出水 90.3±2.4 2.6±0.2 1.8 52.6±4.1

Claims (6)

1.一种饮用水消毒工艺出水遗传毒性的体外微核检测方法，包含以下步骤：
1)制备饮用水消毒工艺出水的提取物的溶液；
2)用步骤1)的提取物溶液暴露处理离体的永生化人胚胎肾细胞；
3)步骤2)处理后的细胞依次进行EMA染色和SYTOXGreen染料染色；
4)流式细胞仪分析，根据被SYTOXGreen染料染色但不被EMA染色的颗粒的大小和形态特征，判别微核、细胞核和亚二倍体颗粒，并记录数目，得到微核率和亚二倍体贡献率，进而得出饮用水消毒工艺出水遗传毒性；所述永生化的人胚胎肾细胞为永生化的人胚胎肾细胞HEK293；
所述方法中，是将细胞放置在24孔板中进行暴露处理的，在所述步骤3)之后，所述步骤4)之前，包括如下步骤：将所述24孔板离心。
2.根据权利要求1所述的体外微核检测方法，其特征在于：所述方法中，在所述步骤1)之后，所述步骤2)之前，包括如下步骤：利用MTT细胞毒性试验确定最高暴露浓度；其中，所述最高暴露浓度是指保证细胞存活率≥50％时细胞暴露处理液中提取物的浓度。
3.根据权利要求2所述的体外微核检测方法，其特征在于：所述暴露处理的方法如下：向对数生长期的所述永生化人胚胎肾细胞中加入细胞暴露处理液，置于细胞培养箱中培养24h；其中，所述细胞暴露处理液为适合于培养永生化人胚胎肾细胞的细胞培养基和所述提取物溶液的混合液；所述细胞暴露处理液中提取物的浓度小于或等于所述利用MTT细胞毒性试验确定的最高暴露浓度。
4.根据权利要求1或2所述的体外微核检测方法，其特征在于：所述EMA染色的方法包括如下步骤：
向步骤2)处理后的细胞中加入EMA染色液，浸于碎冰下2cm固定，可见光源离液面10-15cm照射30min；光激活结束后，加入含体积百分比为2.5％胎牛血清的PBS，4℃预冷，吸弃后，PBS洗涤，铝箔纸避光。
5.根据权利要求4所述的体外微核检测方法，其特征在于：所述SYTOXGreen染料染色的方法如下：
向EMA染色后的细胞加入低渗荧光探针染液，涡旋，37℃避光染色1h；再加入高渗荧光探针染液，涡旋，室温避光放置30min。
6.根据权利要求5所述的体外微核检测方法，其特征在于：所述EMA染色液由EMA和含体积百分比为2.5％胎牛血清的PBS缓冲液组成，EMA在EMA染色液中的浓度为0.5-15μg/mL；
所述低渗荧光探针染液为FCM溶液Ⅰ；所述FCM溶液Ⅰ由溶质和溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅰ中的浓度为：1-800mg/L氯化钠，500-2000mg/L柠檬酸钠,0.5-2mg/mLRNAseA,0.1-0.5mL/L乙基苯基聚乙二醇以及0.2-1.0μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水；
所述高渗荧光探针染液为FCM溶液Ⅱ；所述FCM溶液Ⅱ由溶质和溶剂组成，溶质及其在FCM溶液Ⅱ中的浓度为：80-160mg/mL蔗糖，15-30mg/L柠檬酸及0.2-1.0μMSYTOXGreen染料，溶剂为超纯水。
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