CN101149327B - 基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，是运用一套筛选和评价硬件系统，通过不同荧光染料标记和测量细胞内多细胞参数变化实现对抗肿瘤药物评价和筛选。该筛选和评价硬件系统由高精度电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站组成。通过二乙酸荧光素染色测量活细胞数法；Hoechst 33342和碘化丙啶双染法评价药物诱导细胞凋亡；FDA、Hoechst 33342和PI三染法分析药物诱导凋亡作用模式。本发明可对表达不同靶标细胞器的至少两种单细胞或两种细胞亚群进行测量，方法设计合理，既能用于药物作用机理的研究，也能用于高内涵药物筛选和毒性分析，可在筛选药物和评价药物毒性中应用。
Description
技术领域
本发明属药物筛选方法领域，涉及应用细胞显微图像信息的自动化技术和光学标记、光学测量技术来记录多孔板内的细胞图像，通过分析图像信息来获取抗肿瘤化合物筛选评价的指标。
背景技术
癌症严重地威胁着人们的健康，其中肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病是几种发病率较高的癌症。肺癌已成为我国第一大癌症，且发病率及死亡率增长最为迅速。肝癌发病率则仅次于肺癌，某些地区肝癌发病率呈逐年增高的趋势，全世界每年死于肝癌的患者约26万人，我国近10万人。统计资料显示，几乎所有人群的乳腺癌发病率都在上升，平均每年约升高1％，估计全球每年发病患者超过100万人。尽管对乳腺癌的治疗已经取得了很大的进步，但仍然有25％的患者死于该病。而白血病则是20岁以下青年死亡的主要病因之一。白血病的化学治疗一直是医学和药学研究的重点领域，早期开发的白血病化疗药物特异性不强，既能有效的杀灭肿瘤细胞，又对正常人体细胞有杀伤作用，毒副反应较大，病人很难坚持长期用药。
肿瘤细胞对于药物或化合物的敏感性通常通过细胞毒试验得到。细胞毒试验有很多方法，较为常见的是通过染色手段将细胞的活性信息转化为光学信号，经检测光学信号推导出活细胞的数量，从而判断用药物产生的细胞毒性。目前，MTT、SRB法是最普遍、最常用的细胞毒实验方法，已有很多研究者采用该方法进行药物筛选，但是，这些方法存在速度慢、灵敏度差、自动化程度低等缺陷，难以满足高通量药物筛选的需要。其它用于细胞毒性检测的方法包括HPLC检测法、同位素标记检测法和流式细胞仪法等，这些方法存在分别存在手段繁琐、具有放射性污染和适用细胞类型有限等不足之处。因此，寻找快速、准确、稳定的药物筛选方法成为目前肿瘤化疗领域中亟待解决的关键技术问题。
高内涵筛选(high content screening，HCS)是通过显微成像和扫描的方法来记录孔板内的细胞图像，并分析图像中的空间分辨信息的技术。高内涵筛选通过分析和统计图像中各个细胞的形态、结构等参数来表征细胞的生理或病理特征，其优点在于它能够很快区分出具有所需生物学效应的化合物和非特异性作用的化合物。例如，凋亡的过程伴随着很多胞内的代谢途径的变化，也包含众多药物作用的靶标，高内涵筛选应用于药物诱导细胞凋亡过程的研究，可观察和区分细胞凋亡过程中的形态学变化标志，如细胞缩小、染色质浓缩、核膜和核的破裂、凋亡小体形成等。HCS系统可以快速、准确地对各种规格的孔板内经由荧光标记细胞的活性进行定量分析，动态监控细胞在药物作用下的活性改变，因此本发明中的多维方法可通过测量化合物对多细胞参数的影响来筛选抗肿瘤化合物。
发明内容
本发明的目的是提供基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，是运用一套筛选和评价硬件系统，通过不同荧光染料标记和测量细胞内多细胞参数变化实现对抗肿瘤药物评价和筛选。该筛选和评价硬件系统由高精度电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站组成，具体通过以下步骤实现：
(1)二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)染色测量活细胞数法
FDA本身没有荧光，它能通过完整细胞膜，在细胞内被酯酶酶切而产生荧光物质。该荧光物质不能通过细胞膜，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。因此活细胞量等于发射绿色荧光的细胞数量。
准确称取FDA 1mg溶于0.1ml二甲亚砜(DMSO)中配成FDA储备液，分装于0.5ml离心管中，置于-20℃储存。临用前，用PBS稀释FDA储备液1000倍待用。
A)FDA染色测量活细胞数法线性范围
取对数生长期的人口腔鳞状细胞(KB)细胞，用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶混合溶液消化后，以5×104、1×104、5×103、1×103、2×102、4×101细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，每个细胞密度设6个复孔，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h。测试前弃去孔内培养液，每孔加入FDA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液50μL，4℃培养30min后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，拍摄参数为：绿色通道(激发光450～490nm、发射光＞510nm)，物镜放大倍数5倍，每孔摄取1幅图像，然后使用筛选和评价系统的工作站分析所得图像，计算孔内细胞数。
B)FDA染色测量活细胞数法实验质量控制
取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以3×103细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h。用1×10-7M长春新碱(VCR)作为阳性对照，0.1％DMSO作为阴性对照，设4个平行孔，每孔加入200μL培养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入FDA的PBS溶液50μL，4℃培养30min后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后后使用工作站分析所得图像，计算孔内细胞数和Z′因子。
(2)Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染法评价药物诱导细胞凋亡
细胞发生凋亡时，染色质会固缩。Hoechst 33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI则不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后，使用荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光+强蓝色荧光。
取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以2×103细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h后，弃去培养液。分别将不同浓度的长春新碱(2×10-7、2×10-6M)加入孔内，每一药物浓度设4个平行孔，每孔加入200μL培养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入细胞凋亡与坏死检测试剂50μL，4℃培养30min后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、红色荧光强度。
(3)FDA、Hoechst 33342和PI三染法分析药物诱导凋亡作用模式
虽然Hoechst 33342、PI双染法可以区分药物作用后细胞凋亡发生的情况，但是由于Hoechst 33342、PI两种都是核染料，因此在蓝红两个通道下都无法得到细胞的形态学信息，然而区别细胞凋亡最重要的标志是细胞形态学特征的变化，如细胞缩小、染色质浓缩、核膜和核的破裂、凋亡小体形成等。为了获得更多细胞形态学特征，还需要另一种荧光染料对整个细胞进行标记。FDA的酯酶酶切产物能在活细胞内聚集，因此整个细胞可见绿色荧光。根据表1可知FDA的激发和发射波长与PI和Hoechst都没有重叠，因此能够通过不同的滤光片对三种荧光加以区分。
表1Hoechst 33342、FDA、PI荧光激发和发射波长参数
| 荧光染料 | 激发波长(nm) | 发射波长(nm) |
| Propidium iodide(PI)Fluorescein diacetate(FDA)Hoechst 33342 | 530495355 | 615520465 |
取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以2×103细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h后，弃去培养液。分别将各种中药组分和长春新碱(阳性对照)加入孔内。每一药物浓度设3个平行孔，每孔加入200μL培养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入含FDA的细胞凋亡与坏死检测试剂50μL，4℃培养30min后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、绿色、红色荧光强度。
本发明的筛选和评价硬件系统主要包括：高精度电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站，其各部分的主要功能分别为：
(1)高精度电动水云平台用来装载试验所需的多个由不同药物处理过的细胞样本对象，该平台由步进电机实现控制，能在X-Y两个方向内以指定步长精确移动，可实现程序控制，将指定孔中的观测样本送至显微镜观测处。
(2)荧光视觉系统主要部分为具有自动对焦功能的倒置荧光相差显微镜。通过显微镜将荧光染色过的细胞放大，达到观测和成像所需要的要求。
(3)图像采集与处理系统主要部分为电耦合图像传感器(charge coupleddevice，CCD)及相应的图像采集卡(1394卡)，它能够将显微镜的观测成像，并将简单处理后的图像通过所提供的应用程序接口传送给上位机。
(4)工作站包括：数据存储、分析与可视化系统和控制系统。主要用于将取得的原始图像数据预处理，并存入数据库，通过图像处理算法测量细胞统计状况，得出表征药物疗效的相关参数指标，并将所成图像与分析结果可视化，含生成实验结果报表。控制系统以设计友善的图形用户界面的形式体现，为用户对系统所提的各种具体需求提供接口。
在本发明的方法中，表达至少一种靶标或具有靶细胞器的细胞或细胞亚群的至少一种细胞参数在化合物存在或不存在时得以通过光学测量结果的差异来表征。这些方法可以使用细胞系、稳定或瞬时转染的细胞或原代细胞，它们表达一种或多种靶标受体或具有靶细胞器。优选地，至少两种细胞参数得以测量。更优选的，至少三种细胞参数得以测量。
本发明的另一个目的是提供基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法在筛选药物和评价药物毒性中应用。
本发明的有益之处是：与传统的药物筛选方法相比，本发明提供的基于细胞显微图像信息的药物筛选和评价系统和基于该系统设计的不同荧光染料标记及测量细胞内多细胞参数变化的抗肿瘤药物筛选和评价方法可使用单个细胞的形态、结构等多方面的信息来表征细胞的生理或病理特性。因此能够快速区分出具有所需生物学效应的化合物和非特异性作用的化合物。利用本发明提供的筛选和评价系统及方法能开展亚细胞群的观察，例如某个分裂周期的细胞、成熟与非成熟细胞，活细胞与死细胞，细胞与细胞碎片等。从原理上来说，只要显微镜能够观察到的细胞或亚细胞级的形态变化和运动，并可以通过算法加以识别，就可以用本发明提供的筛选和评价系统来进行研究。
肿瘤细胞对于药物或化合物的敏感性通常通过细胞毒试验得到。然而目前使用较多的MTT、SRB法存在速度慢、灵敏度差、自动化程度低等缺陷，本发明提供的基于细胞显微图像信息的药物筛选和评价系统和FDA染色测量活细胞数法具的线性范围达到了4个数量级(4×101～5×104细胞/孔)大大超过了MTT、SRB法的动态范围。且该方法为均相方法，无需分离染料和背染色细胞，因此能够实现快捷的自动化分析。该方法的线性限低达101细胞/孔数量级，因此不但可以用于96孔板的筛选，还可以用于通量更高的384孔板、1536孔板的筛选。在优化实验和拍摄方法后，基于本筛选和评价系统和FDA标记活细胞筛选药物的方法的Z′因子达到了0.820，是高质量的药物筛选方法。
细胞凋亡指的是细胞程序性死亡的过程，区别细胞凋亡最重要的标志是细胞形态学特征的变化，如细胞缩小、染色质浓缩、核膜和核的破裂、凋亡小体形成等[9]。诱导细胞凋亡是广泛关注的抗肿瘤药物作用的机理之一。所以，快速检测化合物是否能诱导细胞凋亡是判断该化合物是否具有进一步抗肿瘤药物开发价值的重要判断标准之一。本发明提供的筛选和评价系统及Hoechst33342、PI双染法能够有效的分析药物作用对核染色体产生的影响，因此可作为药物诱导细胞凋亡的评价方法。而FDA、Hoechst 33342、PI三染法则可作为高内涵药物作用模式分析评价方法。应用此方法对初级筛选出的有效中药组分进行研究可以为这药物组分所含化合物与阳性模型药的抑制肿瘤生长的机制异同提供了线索，也为进一步分离、纯化有效化合物提供了依据。
本发明提供的筛选和评价系统和各种荧光标记染法还应用于药物毒性的筛选和评价。FDA染色测量活细胞数法可用于评价化合物对于细胞的毒性；Hoechst 33342、PI双染法和FDA、Hoechst 33342、PI三染法能够用于分析化合物产生毒性的机理。
本发明设计合理，提供的筛选和评价系统结构完整、具有很高的应用价值，填补了国内同类设备的技术空白。在本发明的系统基础上设计的荧光标记方法既能够用于进行药物作用机理的研究，也能够用于高内涵药物筛选和毒性分析。
附图说明
图1基于细胞显微图像信息的药物筛选和评价系统整体系统构架示意图。
图2工作站界面。
图3 FDA标记的不同细胞密度图像。
图4计算细胞数与初始细胞数关系。
图5 Hoechst 33342、PI双染法观察药物诱导细胞凋亡。
图6 Hoechst 33342、PI双染法分辨不同亚群细胞。
图7 FDA、Hoechst 33342、PI三染法细胞荧光图像。
图8 FDA、Hoechst 33342、PI三染法分辨不同药物作用模式。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例进一步详细说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
试剂：
RPMI-1640、DMEM培养基：GIBCORL公司；
小牛血清：GIBCORL公司；
硫酸链霉素：华北制药有限公司；
青霉素钠：江西东风药业股份有限公司；
长春新碱(vincristine，VCR)：Hanye Pharmaceutical公司；
二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)：Sigma-Aldrich，Inc.；
细胞凋亡与坏死检测试剂盒：碧云天公司；
其它试剂均为国产分析纯。
仪器：
Leika DM6000型倒置相差荧光显微镜、DFC 300 CCD：德国Leika公司；
二氧化碳培养箱：Thermo Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator；
SB-840-2型单人双面净化工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
XW-80A型旋涡混合器：上海精科实业有限公司。
实施例1细胞显微图像信息的药物筛选和评价系统设计
参见图1，是本发明筛选和评价系统的构架，主要包括：高精度电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站。
参见图1、图2，基于细胞显微图像信息的药物筛选和评价系统的各部分的主要功能和性能指标分别为：
(1)高精度电动水云平台用来装载试验所需的多个由不同药物处理过的细胞样本对象，该平台由步进电机实现控制，能在X-Y两个方向内以指定步长精确移动，可实现程序控制，将指定孔中的观测样本送至显微镜观测处。平台最小步长20nm、重复精度1μm。
(2)荧光视觉系统主要部分为具有自动对焦功能的倒置荧光相差显微镜。通过显微镜将荧光染色过的细胞放大，达到观测和成像所需要的要求。显微镜放大倍数×4、×10、×20、×40、×60，配置电动物镜转盘、电动聚光镜。
(3)图像采集与处理系统主要部分为CCD图像传感器及相应的图像采集卡(1394卡)，它能够将显微镜的观测成像，并将简单处理后的图像通过所提供的应用程序接口传送给上位机。CCD性能参数为：1392×1040像素、16位色深、低于环境温度20℃。
(4)工作站包括：数据存储、分析与可视化系统和控制系统。主要用于将取得的原始图像数据预处理，并存入数据库，通过图像处理算法测量细胞统计状况，得出表征药物疗效的相关参数指标，并将所成图像与分析结果可视化，含生成实验结果报表。控制系统以设计友善的图形用户界面的形式体现，为用户对系统所提的各种具体需求提供接口。
实施例2 FDA染色测量活细胞数法
1.实验方法
准确称取FDA 1mg溶于0.1ml DMSO中配成FDA储备液，分装于0.5ml离心管中，置于-20℃储存。临用前，用PBS稀释FDA储备液1000倍待用。
a)FDA染色测量活细胞数法线性范围
取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以5×104、1×104、5×103、1×103、2×102、4×101细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，每个细胞密度设6个复孔，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h。测试前弃去孔内培养液，每孔加入FDA的PBS溶液50μL，4℃培养30min后用筛选和评价系统采集孔内细胞图像，拍摄参数为：绿色通道(激发光450～490nm、发射光＞510nm)，物镜放大倍数5倍，每孔摄取1幅图像。然后使用筛选和评价系统的工作站分析所得图像，计算孔内细胞数。
b)FDA染色测量活细胞数法实验质量控制
取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以3×103细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h。用1×10-7M长春新碱作为阳性对照，0.1％DMSO作为阴性对照，设4个平行孔，每孔加入200μL培养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入FDA的PBS溶液50μL，4℃培养30min后用筛选和评价系统采集孔内细胞图像，拍摄参数为：绿色通道(激发光450～490nm、发射光＞510nm)，物镜放大倍数5倍，每孔摄取1幅图像。然后后使用工作站分析所得图像，计算孔内细胞数和Z′因子。
2.结果
在荧光显微镜下的用CCD摄取不同细胞密度的孔的图像如图3A～F所示。
使用工作站对图像进行预处理，然后识别每幅图像中的细胞量(Nfig)，再根据图像面积和孔面积比例，换算出每孔内细胞量(Nwell)，用计算细胞数与孔内初始细胞数(Ni)作图，可得图4。
参见图5，可以看出在细胞密度4×101～5×104细胞/孔时每幅图像中的细胞数与初始细胞数都具有良好的线性关系：Nfig＝0.2776Ni(R2＝0.9887)。根据放大倍数计算，孔面积为照片面积的4.91倍，由此可换算出的每孔细胞数(Nwell)＝1.36×孔内初始细胞数(Ni)。KB细胞的倍增时间约为42 h，因此24 h后细胞增殖为初始细胞量的约1.4倍与Nwell＝1.36×Ni相符合。可见孔中随机选取位置拍摄到的单幅图像对于孔内细胞分布具有的代表性。
表2显示了FDA染色法测量细胞存活率的结果。FDA染色法测量活细胞数的相对标准差(RSD)在5％以下。按照Z′因子的计算方法[1]：
可得，以长春新碱为阳性对照FDA染色测量活细胞数法的Z′为0.820(＞0.5)，说明FDA染色法测量活细胞数的方法具有有很好的实验质量，适合进行高通量筛选。
表2 FDA染色法测量细胞存活率
| 活细胞数 | 细胞存活率 | |||
| 均值 | 标准差 | 相对标准差 | ||
| 阴性对照组(DMSO)阳性对照组(长春新碱) | 6478.31445.7 | 277.724.8 | 4.3％1.7％ | 100％22.3％ |
本筛选和评价系统进行细胞或亚细胞水平形态分析的基础就是细胞或细胞结构的自动化分割、识别。本发明以FDA染色法标记活细胞为实例测试了本发明的筛选和评价系统的软件预处理图像和分割、识别单个细胞的能力。虽然实验结果表明细胞分割、识别仍存在一些误差，但是本筛选和评价系统已经能够满足细胞分割和识别的需求。细胞分割、识别误差主要来源为实验方法和软件两方面：
(1)接种细胞时细胞密度是由血球计数板进行计数，所以在细胞密度低于1000细胞/孔时，“初始细胞密度”只是是一个近似值，并不能十分准确的反映孔内的细胞密度，而且孔与孔之间细胞密度的差异也会比较大。因此在细胞密度比较低的情况识别细胞密度的方差较大，而且与“初始细胞密度”存在的偏差也比较大。
(2)本发明的工作站识别细胞的误差。主要的识别误差为漏识别。这种情况在图片边缘的区域里比较明显，主要原因是显微镜的荧光激发光光源强度不均匀，造成边缘区域较暗使荧光发射强度较低，细胞与背景之间差异太小。同时CCD曝光参数设置不当也造成在高细胞密度时，照片中央部分曝光过度活边缘部分曝光不足，也会增加识别的误差。
因此降低识别的误差的主要需要在实验和拍摄方法上进行优化：
(1)实验方法的优化主要表现在选择适当细胞密度和荧光染色方法上。实验表明细胞密度在1×103～1×104细胞/孔时，细胞间隙较大，易于识别，且孔间初始细胞密度差异小，实验质量高。FDA染色后按照常规的37℃培养30min，由于荧光物质产生过快，渗透到胞外溶液中的荧光物质多，背景荧光较强，降低了信噪比；而在4℃培养30min后胞内绿色荧光明显，且渗透到胞外溶液中的荧光物质少，细胞-背景差异大，具有很好的信噪比。
(2)拍摄方法的优化主要是在改进汞灯照明均一度和CCD曝光参数选择两个方面。选取放大倍数较小的C接口(C mount)或者截取图像中间部分进行分析，可以避免照明均一度的影响，但分析等量细胞数所需的图像数要增加。而通过使用Leika提供的SDK中自动选择CCD曝光参数的模块能够进一步优选出好的曝光参数进行拍摄。
通过优化实验和拍摄方法，我们建立了基于本发明的筛选和评价系统和FDA标记活细胞的药物筛选方法，该方法Z′因子达到了0.820，是高质量的药物筛选方法。
实施例3 Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染法测量药物诱导细胞凋亡
1.实验方法
取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以2×103细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h后，弃去培养液。分别将不同浓度的长春新碱(2×10-7、2×10-6M)加入孔内，每一药物浓度设4个平行孔，每孔加入200μL培养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入细胞凋亡与坏死检测试剂50μL(C1056-1细胞染色缓冲液50μL，C1056-2 Hoechst 33342染色液0.25μL，C1056-3 PI染色液0.25μL)，4℃培养30min后用Di-HCS采集孔内细胞图像，拍摄参数为：蓝色通道(激发光340～380nm、发射光＞400nm)，红色通道(激发光515～560、发射光＞590nm)，物镜放大倍数5倍，每孔同一视野下各通道摄取1幅图像。然后使用Di-HCS工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、红色荧光强度。
2.结果
用CCD摄取蓝色和红色两个通道下，不同浓度药物处理后细胞的图像如图5A、B所示。
参见图6，表明经Hoechst 33342、PI双染后，在荧光显微镜下可以区分药物诱导细胞凋亡发生的情况。传统的流式细胞仪法在凋亡细胞的分析中具有广泛应用，运用细胞仪对Hoechst 33342、PI双染的细胞进行凋亡分析的优点在于：可对单个细胞进行分析；可同时对凋亡细胞、活细胞和死细胞进行分析；可用来分析凋亡细胞的百分比；检测灵敏度高[2]。但是流式细胞仪所需样品量较大，操作过程繁琐，特别是对于贴壁细胞需要使用酶消化、悬浮后才能进行检测，破坏了细胞原有生长状态，并且无法进行大规模自动化分析。基于本筛选和评价系统的Hoechst 33342、PI双染法不但保留了流式细胞仪进行凋亡分析的优点，而且克服了其分析贴壁细胞操作繁琐的缺点，直接对孔板内原位生长的细胞凋亡情况进行了分析。
使用筛选和评价系统的工作站对两通道荧光图像进一步分析可得细胞荧光强度的二元分布图(参见图7)，可同时分辨3种不同亚群细胞：弱红色荧光+弱蓝色荧光为正常细胞(左下)；弱红色荧光+强蓝色荧光为早期凋亡细胞(右下)；强红色荧光+强蓝色荧光为晚期凋亡和坏死细胞(右上)。用2×10-7、2×10-6M长春新碱处理KB细胞48 h后，早期凋亡细胞的百分比分别增加了3.49％和6.92％，晚期凋亡和坏死细胞的百分比分别增加了14.37％和15.18％，而正常细胞的百分比分别下降了9.23％和17.83％，说明长春新碱诱导KB细胞产生了凋亡和坏死。
实验结果表明基于本筛选和评价系统的Hoechst 33342、PI双染法可以有效分析药物作用后多孔板上贴壁细胞的凋亡发生的情况，并可同时分析凋亡细胞、活细胞和死细胞，其分析的灵敏度达到了单细胞水平。
实施例4 FDA、Hoechst 33342和PI三染法分析药物诱导凋亡作用模式
1.实验方法
取对数生长期的KB细胞，用EDTA-胰酶混合溶液消化后，以2×103细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24h后，弃去培养液。分别将中药组分65-15(2μg/mL)，62-15(2μg/mL)，14B05(2μg/mL)和长春新碱(1×10-7M，阳性对照)加入孔内。每一药物浓度设3个平行孔，每孔加入200μL培养液。孵育48h后，弃去培养液，每孔加入含FDA的细胞凋亡与坏死检测试剂50μL(C1056-1细胞染色缓冲液50μL，C1056-2 Hoechst 33342染色液0.25μL，C1056-3 PI染色液0.25μL，FDA储备液0.05μL)，4℃培养30min后用Di-HCS采集孔内细胞图像，拍摄参数为：蓝色通道(激发光340～380nm、发射光＞400nm)，绿色通道(激发光450～490nm、发射光＞510nm)、红色通道(激发光515～560、发射光＞590nm)，物镜放大倍数5倍，每孔同一视野下各通道摄取1幅图像。然后使用Di-HCS工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、绿色、红色荧光强度。
2.结果
通过筛选和评价系统摄取蓝色、绿色和红色三个通道下细胞的原始图像参见图8A、B、C所示。因为筛选和评价系统使用的发射光滤光片为低通滤光片，所以在蓝色通道中绿色和红色荧光对蓝色荧光有较大干扰；而由于FDA的荧光强度大于PI的荧光强度，绿色通道中红色荧光对绿色荧光只有较弱干扰。因此需要通过图像处理算法进行校正，以消除荧光交叉干扰。使用筛选和评价系统的工作站消除荧光交叉干扰后的图像参见图8D、E、F所示，在蓝色、和绿色通道中其他荧光的影响已经基本除去。
消除荧光交叉干扰后，可使用工作站对三通道荧光图像进行综合分析得到的细胞荧光强度的三元分布图(参见图9)。它作为区分药物诱导细胞凋亡模式的依据：从图9A可以看出阴性对照组的细胞多分布在高细胞活性区域(强绿色荧光)，而早期凋亡细胞(强蓝色荧光+弱红色荧光)较少，死细胞或晚期凋亡细胞(强红色荧光+强红色荧光)较早期凋亡细胞多。1×10-7M作用后(参见图9B)，细胞在低细胞活性区域(弱绿色荧光)分布明显增加，且早期凋亡细胞(强蓝色荧光+弱红色荧光)比例高。
通过比较三元分布图可以对不同剂量中药组分诱导细胞凋亡的模式进行分析：
(1)组分65-15的作用后早期凋亡细胞、死细胞或晚期凋亡细胞比例无明显提高，但高活性细胞比例有所下降。
(2)组分14B05使早期凋亡细胞和死细胞或晚期凋亡细胞比例增加，高活性细胞比例有所下降。
(3)组分62-15显著增加早期凋亡细胞比例，细胞基本分布在低活性区域。
以上分析可知组分65-15的诱导细胞凋亡模式与长春新碱有较大相似性，而组分14B05和组分62-15的作用模式与长春新碱差异较大，提示了它们所含化合物抑制肿瘤生长的机制可能与长春新碱有较大区别。
实验结果表明基于本筛选和评价系统的FDA、Hoechst 33342、PI三染法能够在细胞水平分析药物抑制细胞生长的作用模式，为药物作用机制的研究提供线索。
本发明涉及的参考文献：
[1]Zhang JH，Chung TDY，Oldenburg KR.A simple statistical parameter for use in evaluationand validation of high throughput screening assays.Journal of Biomolecular Screening1999；4：67-73.
[2]慈云祥，张春阳，冯军.细胞凋亡分析测试方法的研究进展.化学进展1998；10：451-9.
Claims (5)
1.一种基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，其特征是包括由高精度电动水云平台，荧光视觉系统，图像采集与处理系统，工作站组成的筛选和评价硬件系统，通过不同荧光染料标记和测量细胞内多细胞参数变化实现，具体通过以下步骤实现：
(1)二乙酸荧光素染色测量活细胞数法
准确称取二乙酸荧光素1mg溶于0.1ml二甲亚砜(DMSO)中配成储备液，分装于0.5ml离心管中，置于-20℃储存，临用前，用磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)稀释储备液1000倍待用，
A)二乙酸荧光素染色测量活细胞数法线性范围
取对数生长期的人口腔鳞状细胞(KB细胞)，用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶混合溶液消化后，以5×104、1×104、5×103、1×103、2×102、4×101细胞/孔的密度接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，每个细胞密度设6个复孔，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24小时，测试前弃去孔内培养液，每孔加入二乙酸荧光素的磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)50μL，4℃培养30分钟后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用筛选和评价硬件系统工作站分析所得图像，计算孔内细胞数，
B)二乙酸荧光素染色测量活细胞数法实验质量控制
取对数生长期的人口腔鳞状细胞(KB细胞)，用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶混合溶液消化后，接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24小时，用1×10-7M长春新碱作为阳性对照，0.1％二甲亚砜作为阴性对照，设4个平行孔，每孔加入200μL培养液，孵育，弃去培养液，每孔加入二乙酸荧光素的磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)，培养30分钟后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用筛选和评价硬件系统工作站分析所得图像，按照Z′因子的计算方法，计算孔内细胞数和Z′因子：
其中μc+、σc+分别表示阳性对照组细胞数的平均值和方差，μc-、σc-分别表示阴性对照组细胞数的平均值和方差；
(2)Hoechst 33342和碘化丙啶双染法评价药物诱导细胞凋亡
取对数生长期的人口腔鳞状细胞(KB细胞)，用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶混合溶液消化后，接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24小时后，弃去培养液，分别将2×10-7、2×10-6M不同浓度的长春新碱加入孔内，每一药物浓度设4个平行孔，每孔加入200μL培养液，孵育48小时后，弃去培养液，每孔加入细胞凋亡与坏死检测试剂50μL，培养30分钟后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用筛选和评价硬件系统工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、红色荧光强度；
(3)二乙酸荧光素、Hoechst 33342和碘化丙啶三染法分析药物诱导凋亡作用模式
取对数生长期的人口腔鳞状细胞(KB细胞)，用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶混合溶液消化后，接种于96孔培养板上，每孔含100μL培养液，在37℃、100％湿度、含5％CO2和95％空气的条件下培养24小时后，弃去培养液，分别将各种中药组分和作为阳性对照的长春新碱加入孔内，每一药物浓度设3个平行孔，每孔加入200μL培养液，孵育48小时后，弃去培养液，每孔加入含二乙酸荧光素的细胞凋亡与坏死检测试剂50μL，培养30分钟后用筛选和评价硬件系统采集孔内细胞图像，然后使用筛选和评价硬件系统工作站分析所得图像，并统计每个细胞的蓝色、绿色、红色荧光强度。
2.根据权利要求1所述的基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，其特征是：筛选和评价硬件系统中荧光视觉系统主要部分为具有自动对焦功能的倒置荧光相差显微镜。
3.根据权利要求1所述的基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，其特征是：筛选和评价硬件系统中图像采集与处理系统主要部分为电耦合图像传感器及相应的图像采集卡。
4.根据权利要求1所述的基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法，其特征是筛选和评价硬件系统工作站包括：数据存储、分析与可视化系统和控制系统，控制系统以设计友善的图形用户界面的形式体现，为用户各种具体需求提供接口。
5.根据权利要求1所述的基于细胞显微图像信息的抗肿瘤药物评价和筛选方法在筛选药物和评价药物毒性中应用。
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