CN114075591A - 中药引经药药性以及引经成分的评价和筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药引经药药性以及引经成分的评价和筛选方法。本发明结合给药后细胞活力、内质网‑高尔基体激活、内质网应激、相关蛋白表达、物质转运等方面构建一种内质网‑高尔基体转运系统中药引经药药性以及引经成分的评价方法。采用所构建的内质网‑高尔基体转运系统中药引经药性评价方法，对中药桔梗的引经药性拆分组分进行综合分析，确定了桔梗上清组分为其引经药性活性组分。本发明将中药引经作用与细胞内质网‑高尔基体转运系统联系在一起，评价方法简明、快速、有效，具有普适性，可应用于其它具有引经作用中药或其成分的筛选与研究。
Description
技术领域
本发明涉及中药引经药药性以及引经成分的评价和筛选方法，属于中药药性评价和筛选领域。
背景技术
引经是中药药性理论的重要组成部分，对临床合理用药具有重要指导作用。然而因传统中医对引经概念的多歧义性、复方中引经作用的难辨识性以及研究思路的局限性，导致中医药领域对引经药性缺乏科学认识。阐明中药引经药性理论的科学内涵，对于促进中医药学发展、丰富中医药理论内容，创新中医药学术思想，指导方剂配伍、合理用药、创新药物研制和提高临床疗效等均具有重大的意义。
内质网是细胞内除核酸以外的一系列重要的物质，如蛋白质、脂类(如甘油三酯)和糖类合成的基地。高尔基体的主要功能将内质网合成的蛋白质进行加工、分拣、与运输，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。高尔基体是完成细胞分泌物(如蛋白)最后加工和包装的场所。内质网出芽形成的外分泌囊泡与高尔基体膜融合，将内含物送入高尔基体腔中，在那里新合成的蛋白质肽链继续完成修饰和包装。蛋白质、脂类和糖类是物质转运的媒介和基础，内质网-高尔基体转运系统在细胞脂质转运和代谢过程中发挥重要作用，同时影响细胞对物质的摄取。
当前对引经中药的研究仍然存在缺乏科学合理的药效和评价体系等问题，建立规范性的评估引经药药性以及筛选引经成分的方法成为中医药现代化的当务之急。
发明内容
本发明的主要目的是提供中药引经药药性以及引经成分的评价和筛选方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种中药引经药药性以及引经成分的评价和筛选方法，包括：
(1)将待评价的中药提取其有效成分得到总提取物，将总提取物进行拆分处理得到含有不同有效成分的各拆分部位；
(2)用不同浓度的总提取物以及各拆分部位作为评价药物分别向靶标组织或者器官的成熟细胞系给药，测定给药后的细胞活力并确定显著增加细胞活力的最佳给药浓度和给药时间；
(3)将各评价药物采用最佳给药浓度和给药时间分别向靶标组织或者器官的成熟细胞系给药，检测给药后的细胞内质网-高尔基体是被否激活并从分子水平上验证内质网-高尔基体被激活后相关蛋白的表达水平；
(4)将各评价药物采用最佳给药浓度和给药时间分别向靶标组织或者器官的成熟细胞系给药，向给药后的细胞加入能够进入该细胞的标记物质，测定细胞对该标记物质的摄取能力；如果该细胞对标记物质的摄取能力增强以及内质网-高尔基体同时被激活，说明所给予的评价药物是中药起到引经作用的有效部位；
(5)测定细胞内质网应激相关蛋白的表达，确定给药后细胞不会产生明显的内质网应激，排除内质网应激造成的内质网-高尔基体转运激活的假阳性。作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述测定细胞活力的方法包括：采用MTT法或CCK8法测定细胞活力；更优选的，所述的采用MTT法或CCK8法测定细胞活力的方法包括：在细胞中加入不同浓度的待筛选药物，12h后洗去药物，加入MTT或CCK8试剂孵育，使用紫外分光光度计检测450nm处的OD值后计算细胞活力。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(3)中所述的检测给药后细胞内质网是否被激活的方法包括：通过内质网荧光探针标记内质网后，进行荧光成像或荧光定量，通过内质网-高尔基体荧光强度的差异，确定内质网的激活情况；更优选的，使用ER-Tracker荧光染料标记内质网，使用荧光显微镜进行荧光成像，观察所标记内质网是否被激活。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(3)中所述的从分子水平上验证内质网-高尔基体被激活后相关蛋白的表达水平的方法包括实时荧光定量PCR(Q-PCR)、Western Blot或ELISA等方法。
作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(4)中所述的关于测定细胞对该标记物质的摄取能力的方法包括但不限于：HPLC、LC-MS、GC-MS或流式细胞术(针对带有荧光物质)等。
作为本发明一种优选的实施方案，步骤(5)中所述的测定细胞内质网应激相关蛋白的表达是通过Western Blot、Q-PCR等方法验证参与内质网应激发生的关键蛋白或mRNA表达水平；其中，所述内质网激活后内质网应激相关蛋白包括但不限于内质网核心信号1(Ern1)、活化转录因子6(Atf6)或双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)。
作为本发明的一种优选的实施方式，所述的待评价的中药包括但不限桔梗、川牛膝、怀牛膝、川芎、柴胡、吴茱萸、冰片、升麻、菊花、蔓荆子、苍耳子、辛夷花、藁本、白芷、苍耳子、辛夷花、桑枝、桂枝、葛根、姜黄、防风、杜仲、川断、木香、砂仁、小茴香、艾叶、木瓜、鸡血藤、防己、狗脊、蝉蜕、半夏、桑白皮、当归、丹参、黄连、菖蒲、苍术、白术、威灵仙、油松节、代赭石或旋覆花等具有引经性质的中药。
作为本发明的一种优选的实施方式，根据中医脏腑经络构建的体外细胞筛选体系，包括但不限于H9C2、HepG2、A549、SK、293T、4T1、PC-12、8305C、AGS、Caco-2、HT-29、FaDu、HFLS-RA、MH7A、Hela、SW579、MCF-7、TM3、TE-1、U-2、PANC-1、TCCSUP、PC-3等体外细胞系；作为本发明的一种最优选的具体实施方案，本发明所述的待评价的中药是引药入肺的引经药，优选是桔梗；相应的，所述引经药作用的靶标组织或者器官的成熟细胞系优选为A549细胞(人肺泡腺癌基底上皮细胞)。
本发明将桔梗用水提取得到水总提取物，将桔梗水总提取物经大孔树脂D101分离得到95醇组分、50醇组分、上清组分以及醇沉组分即为评价药物；将各评价药物采用不同浓度向A549细胞给药，结果发现桔梗拆分后的上清组分与其它给药组相比可显著增加A549细胞活力，并确定25μg/ml为各个组分的最佳给药浓度，最佳给药时间均为12h；将各评价药物采用确定的最佳给药浓度以及最佳给药时间向体外培养的A549细胞给药，通过细胞水平检测给药后的细胞内质网-高尔基体是否被激活并通过分子水平进行内质网-高尔基体相关蛋白表达水平的验证，通过分析荧光成像结果发现，给药桔梗水提物及其拆分后的上清组分，A549细胞的内质网被显著激活，通过Q-PCR实验结果表明在给药上清组分后A549细胞内质网被激活，参与内质网转运系统的相关蛋白表达量有明显的升高；将各评价药物采用最佳给药浓度和给药时间分别向A549细胞给药，给药12h后加入浓度为50μg/ml FTSC，37℃孵育箱中孵育3h，通过流式细胞仪计数分析10000个细胞，考察给药后A549细胞对FTSC摄取能力，通过流式细胞术结果分析，给药桔梗水提物后和其拆分后的上清组分可显著增加细胞对FTSC的摄取能力，同时激活内质网，表明桔梗作为引经药时，其起到引经作用的成分为其拆分后的上清组分；并且将桔梗上清组分采用最佳给药浓度和给药时间分别向A549细胞、HepG2细胞以及HT-29细胞给药，提取细胞总RNA，Q-PCR实验结果表明桔梗上清能够特异性激活肺A549细胞内的内质网转运蛋白，而对其他经络部位的细胞系无明显作用。最后通过测定A549细胞内质网应激相关蛋白的表达，排除桔梗作为引经药及其拆分后的上清组分在给药后不会产生明显的内质网应激；其中，所述的细胞内质网应激相关蛋白但不限于内质网核心信号1(Ern1)、活化转录因子6(Atf6)或双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)。
本发明阐述了内质网-高尔基体运输与引经药的药理特点相结合，建立一套规范、有效且操作简单的引经药评估和筛选系统。本发明从给药后细胞活力、内质网-高尔基体激活、内质网应激、相关蛋白表达、物质转运等几个方面，构建中药引经药性评价方法。采用所构建的内质网-高尔基体转运系统中药引经药性评价方法，对中药桔梗的引经药性进行综合分析，确定桔梗上清组分为其引经药性活性组分。本发明将中药引经作用与细胞内质网-高尔基体转运系统联系在一起，该方法简明、快速、有效，且具有普适性，可广泛用于中药中引经成分的筛选和引经药性评价。
附图说明
图1CCK8法检测细胞活力分析结果。
图2荧光成像检测内质网-高尔基体激活结果。
图3内质网-高尔基体相关蛋白Q-PCR扩增曲线。
图4内质网-高尔基体相关蛋白Q-PCR溶解曲线。
图5内质网-高尔基体相关蛋白表达水平分析。
图6三种不同脏腑经络细胞系内质网-高尔基体相关蛋白表达水平分析。
图7细胞摄取被引物质的流式细胞术象限图。
图8细胞摄取被引物质的流式细胞术分析图。
图9内质网应激相关蛋白Q-PCR扩增曲线。
图10内质网应激相关蛋白Q-PCR溶解曲线。
图11内质网应激相关蛋白Q-PCR表达水平分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1中药引经入肺药药性以及引经成分的评价和筛选试验
通过文献资料报道中药桔梗为一种归肺经的引经药，在中医临床方剂配伍中常被用来作为引经药，而起到引药入肺的作用；在现代医学研究中也表明中药桔梗能够增加其它药物在肺脏中的浓度，这与中医理论下的引药入肺有很大相似之处。
本实施例以桔梗为例，评估其拆分组分是否具有通过激活内质网-高尔基体转运系统，增加内质网-高尔基体转运系统对物质的转运效率，进而增加细胞对其它药物的摄取能力，从而更有效的发挥治疗疾病的作用。
(1)给药后细胞活力评价：采用CCK8法，给药不同浓度的桔梗水总提取物和桔梗水总提取物的经大孔树脂D101分离得到的95醇组分、50醇组分、上清组分以及醇沉组分，完成细胞活性测定。
体外培养A549细胞(人肺泡腺癌基底上皮细胞)，取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，接种在96孔板中，每孔100μl，连续进行24h培养，然后向每孔中加入100μl基础培养基溶解的不同浓度的桔梗水提物及其拆分组分，培养12h后，加入CCK8 10μl，孵育箱中连续进行2h培养，450nm酶标仪(Bio-Tek Epoch2)下完成吸光度值测定。采用SPSS26.0统计分析数据，两独立样本t检验，***P<0.001为差异有统计学意义(n＝3)；在较低浓度下(6.25μg/ml-25μg/ml)，桔梗拆分后的上清组分与其它给药组相比可显著增加A549细胞活力(图1)；后续实验以此为基础，选取25μg/ml为各个组分给药浓度，给药时间为均为12h。
(2)内质网-高尔基体激活的细胞水平验证：体外培养A549细胞，取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，接种在共聚焦培养皿中，每皿100μl，连续进行24h培养后，给药12h后，使用ER-Tracker(碧云天生物技术有限公司)0.5μmol，37℃孵育箱中染色20min，通过ER-Tracker特异性标记内质网，使用荧光显微镜(OLYMPUS DP47)×400倍下进行荧光成像，结果如图2，通过分析荧光成像结果，给药桔梗水提物及其拆分后的上清组分，A549细胞的内质网被显著激活(图中蓝色箭头所指)。
(3)内质网-高尔基体相关蛋白的验证：此步骤通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询人的Rcn3、Rer1、SPA、Traccp1和YIPF5参与内质网-高尔基体转运的关键蛋白的mRNA基因序列，用Oligo 7.0引物设计软件设计Q-PCR引物，β-actin作为内参基因。体外培养A549人肺泡基底上皮细胞、HepG2肝上皮样细胞以及HT-29小肠上皮细胞，给药后，使用总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，使用PCR仪(BIO-RAD S1000 ThermalCycler)进行逆转录，荧光定量PCR试剂盒使用实时荧光定量PCR仪(Quant Studio 3ThermoFisher公司)进行基因扩增，获取扩增曲线和溶解曲线，分别为图3和图4所示；试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。扩增结束后，以2-△△CT计算基因的相对表达量，采用SPSS 26.0统计分析数据，两独立样本t检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001为差异有统计学意义，分析差异是否具有统计学意义(n＝3)(图5)。通过Q-PCR实验结果表明，在给药上清组分后肺部A549细胞的内质网被特异性激活，参与内质网转运系统的相关蛋白表达量有明显的升高(图6)。
(4)给药后细胞摄取能力的研究：体外培养A549细胞，取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，接种在12孔板中，每孔250μl，连续进行24h培养后给药，给药12h后加入FTSC(5-氨基硫脲，一种小分子水溶性的非特异性荧光染料，Sigma)浓度为50μg/ml，37℃孵育箱中孵育3h，通过流式细胞仪(FASC Calibur BD公司)计数分析10000个细胞，考察给药后A549细胞对FTSC摄取能力；以及通过ER-Tracker标记内质网(同上述步骤(2)中的有关方法)，进一步考察引经药对内质网的作用，结果如图7，采用SPSS 26.0统计分析数据，两独立样本t检验，*P<0.05，***P<0.001为差异有统计学意义(n＝3)(图8)。通过流式细胞术结果分析，给药桔梗水提物后和其拆分后的上清组分可显著增加细胞对FTSC的摄取能力，同时激活内质网，该结果表明桔梗作为引经药时，其起到引经作用的成分为其拆分后的上清组分,其为分子量小于3000Da的系列己糖聚合物，其主要由果糖、半乳糖和葡萄糖组成，其中，果糖:半乳糖：葡萄糖≈7:2：1。
(5)内质网应激的排除：此步骤通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询人的Atf6、Ern1和PERK三个参与内质网应激的三条通路的关键蛋白的mRNA基因序列，用Oligo 7.0引物设计软件设计Q-PCR引物，β-actin作为内参基因。体外培养A549肺癌细胞，通过Q-PCR检测，方法步骤同(3)结果如图9-11，在对比空白组和上清组分，三条参与内质网应激通路的主要蛋白基因的mRNA水平均未发生明显升高，该结果表明桔梗作为引经药及其拆分后的上清组分在给药后不会产生明显的内质网应激。
本实施例以桔梗为例，通过现代科学的研究方法，详细阐述了基于内质网-高尔基体转运系统的中药引经药性成分评价及筛选方法，通过该方法成功筛选出桔梗中引经作用的成分为其拆分后的上清组分；该方法简明、快速、有效，且具有普适性，同样可应用于其它具有引经作用中药或其成分的筛选与研究。
Claims (10)
1.一种中药引经药药性以及引经成分的评价和筛选方法，其特征在于，包括：
(1)将待评价的中药提取其有效成分得到总提取物，将总提取物进行拆分处理得到含有不同有效成分的各拆分部位；
(2)用不同浓度的总提取物以及各拆分部位作为待评价药物，分别向靶标组织或者器官的成熟细胞系给药，测定给药后的细胞活力并确定显著影响细胞活力的最佳给药浓度和给药时间；
(3)将各待评价药物，采用最佳给药浓度和给药时间，分别向靶标组织或者器官的成熟细胞系给药，检测给药后的细胞内质网-高尔基体是否被激活，并从分子水平上验证内质网-高尔基体被激活后相关蛋白的表达水平；
(4)将各评价药物采用最佳给药浓度和给药时间，分别向靶标组织或者器官的成熟细胞系给药，向给药后的细胞加入能够进入该细胞的被引物质，测定细胞对该被引物质的摄取能力；如果该细胞对被引物质的摄取能力增强，并且内质网-高尔基体同时被激活，说明所给予的评价药物是该中药起到引经作用的有效部位；
(5)测定细胞内质网应激相关蛋白的表达，排除该中药中起到引经作用的有效部位给药后，细胞不会产生明显的内质网应激。
2.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，步骤(2)中所述测定细胞活力的方法包括：采用MTT法或CCK8法测定细胞活力；优选的，所述的采用MTT法或CCK8法测定细胞活力的方法包括：在细胞中加入不同浓度的待评价药物，12h后洗去药物，加入MTT或CCK8试剂孵育，使用紫外分光光度计检测450nm处的OD值后计算细胞活力。
3.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述的检测给药后细胞内质网-高尔基体是否被激活的方法包括：通过荧光探针标记内质网-高尔基体后进行荧光成像或荧光定量，通过内质网-高尔基体荧光强度的差异，确定内质网-高尔基体的激活情况；优选的，步骤(3)中所述的检测给药后细胞内质网-高尔基体是否被激活的方法包括：使用荧光染色法标记内质网-高尔基体，使用荧光显微镜进行荧光成像观察所标记内质网-高尔基体是否被激活。
4.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述的从分子水平上验证内质网-高尔基体被激活后相关蛋白的表达水平的方法包括括但不限于：实时荧光定量PCR、Western Blot或ELISA。
5.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述的从分子水平上验证内质网-高尔基体被激活后相关蛋白的表达水平，其中相关蛋白包括括但不限于：Rcn3、SPA、Traccp1、YIPF5、Protein Rer1或Ergic1。
6.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，步骤(4)中所述的关于测定细胞对被引物质的摄取能力的方法包括但不限于：流式细胞术、荧光显微镜、HPLC、LC-MS或GC-MS。
7.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，步骤(5)中所述的测定细胞内质网应激相关蛋白的表达通过Western Blot或Q-PCR验证参与内质网应激发生的关键蛋白或mRNA表达水平；其中，所述内质网应激相关蛋白包括但不限于内质网核心信号1、活化转录因子6或双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶。
8.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，所述的待评价的中药包括但不限于桔梗、川牛膝、怀牛膝、川芎、柴胡、吴茱萸、冰片、升麻、菊花、蔓荆子、苍耳子、辛夷花、藁本、白芷、苍耳子、辛夷花、桑枝、桂枝、葛根、姜黄、防风、杜仲、川断、木香、砂仁、小茴香、艾叶、木瓜、鸡血藤、防己、狗脊、蝉蜕、半夏、桑白皮、当归、丹参、黄连、菖蒲、苍术、白术、威灵仙、油松节、代赭石或旋覆花中的任何一种。
9.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，所述的中药引经药包括引肺经、引心经、引肝经、引脾经、引肺经、引肾经、引大肠经、引小肠经、引膀胱经、引胆经或引胃经；所述的靶标组织或者器官的成熟细胞系包括H9C2、HepG2、A549、SK、293T、4T1、PC-12、8305C、AGS、Caco-2、HT-29、FaDu、HFLS-RA、MH7A、Hela、SW579、MCF-7、TM3、TE-1、U-2、PANC-1、TCCSUP或PC-3；
优选的，所述待评价的中药是引药入肺的桔梗；所述的靶标组织或者器官的成熟细胞系为A549细胞。
10.根据权利要求1所述的评价和筛选方法，其特征在于，所述待评价的中药是引药入肺的桔梗；所产生的桔梗引经药性组分为桔梗上清，其为分子量小于3000Da的系列己糖聚合物。
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