CN109758486A - 灵芝提取物在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及灵芝提取物在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用，属于药学技术领域。本发明的灵芝提取物具有抗肿瘤多药耐药作用；在同等剂量下，本发明灵芝提取物的作用强度远强于其它灵芝三萜单体和灵芝多糖等灵芝成分，灵芝提取物中的特征活性成分具有协同作用，且灵芝提取物不增加肝脏毒性，具有良好的安全性，表明本发明所获得的灵芝提取物取得了增效减毒的有益效果；本发明的灵芝提取物无细胞毒性，可以显著增加多药耐药细胞中罗丹明123的积累，其作用强于其它灵芝单体成分；且能逆转HepG2/ADM细胞对紫杉醇、长春新碱、多柔比星的耐药，能逆转MCF‑7/ADR细胞对紫杉醇、多柔比星的耐药，对P‑糖蛋白功能具有抑制作用。

Description

灵芝提取物在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用
技术领域
本发明涉及灵芝提取物在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用，属于药学技术领域。
背景技术
癌症是引起全球死亡的主要原因之一。在中国，不论城市还是农村，肿瘤都是居民的主要死亡原因之一。肿瘤多药耐药(Multidrug Resistance，MDR)指癌细胞对于许多结构不相关的化疗药物表现出的交叉抵抗现象，是肿瘤难治疗、易复发的主要原因之一，已成为肿瘤成功化疗的重要障碍。据美国癌症协会估计，90％以上肿瘤患者的死亡受到不同程度耐药影响，因此，克服MDR是肿瘤成功化疗的当务之急，寻找具有抗耐药活性的药物已成为肿瘤MDR的研发热点。
尽管MDR产生机制复杂，但是由mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-glyco-protein，P-gp)的过表达是产生MDR的主要原因。寻找低毒有效的MDR逆转剂是提高化疗疗效的一个重要方法，是化疗领域亟需解决的问题。
由P-糖蛋白(P-gp)介导的多药耐药(MDR)是癌症治疗失败的主要原因之一。多年来已经发现了许多合成P-gp抑制剂，并发现其在体内外都明显抵抗P-gp的功能。然而，由于药物毒性和狭窄的治疗窗口，这些药物的III期试验没有得到预期效果。因此，寻找具有高效低毒的新型MDR调节剂尤为重要，在中药中寻找毒副作用小、药理作用独特的抗肿瘤耐药药物是解决肿瘤耐药性问题的途径之一。
灵芝是祖国中医药宝库中的珍品，素有“仙草”之誉。古今药理与临床研究均证明，灵芝确有防病治病、扶正固本、延年益寿之功效，用于许多慢性病的治疗，如癌症、肝炎、II型糖尿病、高血压等。灵芝中含有三萜、多糖、甾体、生物碱、核苷、氨基酸、蛋白质等多种成分，其中，以三萜和多糖的生物活性最为显著。
目前有关灵芝抗肿瘤耐药性的报道有：(1)扶正消瘤颗粒抗MCF_7耐药细胞体外增殖及机理研究(张瑞清，南方医科大学硕士论文，2011年5月20日)：扶正消瘤颗粒为含灵芝的复方中药，可通过下调MCF-7耐药细胞的MDR1的转录及P-gp蛋白的表达，发挥对乳腺癌耐药细胞MCF/ADM的抗耐药作用；(2)灵芝多糖逆转顺铂耐药卵巢癌细胞作用及其机制研究(曲红光，吉林大学博士论文，2012年6月)：灵芝多糖对DDP耐药卵巢癌细胞SKOV-3/DDP具有逆转作用，其作用机制，可能通过降低耐药基因和抗氧化基因的表达，降低氧自由基清除和诱发脂质过氧化，促进细胞凋亡来实现；(3)灵芝三萜类成分的提取分离及其抗肿瘤活性研究(沈翠娥，2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议)：提示灵芝三萜类化学成分具有提高多药耐药性肿瘤细胞K562/A02(白血病多药耐药细胞)、KBv200(口腔上皮癌多药耐药细胞)对阿霉素敏感性的潜在活性；(4)灵芝烯酸B逆转ABCB1介导的肿瘤多药耐药活性评价及作用机制研究(刘道路，暨南大学硕士论文，2015年5月31日)：从灵芝中分离得到的羊毛甾烷型三萜化合物灵芝烯酸B逆转ABCB1(P-gp，即P-糖蛋白)介导的肿瘤多药耐药活性评价及作用机制研究。
目前关于灵芝抗肿瘤多药耐药的研究均为灵芝提取单体的研究，而对于灵芝提取物对耐药肿瘤的逆转作用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供灵芝提取物在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用，本发明的灵芝提取物无毒副作用，对多药耐药肿瘤细胞P-gp功能具有明显抑制作用，能显著逆转肿瘤细胞的多药耐药，恢复抗肿瘤化疗药物的药效作用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：灵芝提取物在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述灵芝提取物通过醇进行提取得到。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述灵芝提取物的制备方法为：将灵芝子实体干燥粉碎成粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并提取液，得乙醇提取液，浓缩，干燥，得灵芝子实体醇提物，即灵芝提取物。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述步骤中，乙醇的体积分数为5～99％，提取次数为1～3次，每次提取的时间为3h。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述灵芝提取物含有灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝烯酸C、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸LM2、灵芝烯酸B、灵芝酸H、灵芝酸D、灵芝酸F、赤芝酸、灵芝烯酸D、麦角甾醇和灵芝多糖。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述灵芝提取物中，麦角甾醇的质量百分含量为0.1～0.25％，灵芝多糖的质量百分含量为0.5～20％，灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸LM2、灵芝酸H、灵芝酸F和赤芝酸的质量百分含量之和为0.1～11％。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述抗肿瘤多药耐药药物为逆转HepG2/ADM细胞对紫杉醇、长春新碱、多柔比星耐药的药物，所述抗肿瘤多药耐药药物为逆转MCF-7/ADR细胞对紫杉醇、多柔比星耐药的药物，所述抗肿瘤多药耐药药物为对P-糖蛋白功能具有抑制作用的药物。
本发明还提供一种抗肿瘤多药耐药药物，所述药物包含灵芝提取物。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物还含有药学上可接受的载体。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的灵芝提取物具有抗肿瘤多药耐药作用；在同等剂量下，本发明灵芝提取物的作用强度远强于其它灵芝三萜单体和灵芝多糖等灵芝成分，灵芝提取物中的特征活性成分具有协同作用，且灵芝提取物不增加肝脏毒性，具有良好的安全性，表明本发明所获得的灵芝提取物取得了增效减毒的有益效果；
(2)本发明的灵芝提取物无细胞毒性，可以显著增加多药耐药细胞中罗丹明123(Rh123)的积累，其作用强于其它灵芝单体成分，说明对P-gp功能具有抑制作用；且能逆转HepG2/ADM(人肝癌耐药肿瘤细胞)细胞对紫杉醇、长春新碱、多柔比星的耐药，能逆转MCF-7/ADR(人乳腺癌耐药肿瘤细胞)细胞对紫杉醇、多柔比星的耐药，对P-糖蛋白功能具有抑制作用；
(3)在本发明灵芝提取物的作用下，移植瘤恢复了其对紫杉醇、长春新碱的敏感性，没有增强紫杉醇的体内副作用。
附图说明
图1为实施例2中灵芝提取物的高效液相色谱图；
图2为实施例4中细胞毒性试验的结果统计图；
图3为实施例5中灵芝提取物对HepG-2/ADM细胞Rh-123积累的影响结果统计图；其中，A为对照组，B为样品组；
图4为实施例6中灵芝提取物对HepG-2/ADM异种移植瘤模型的MDR逆转作用的结果统计图；其中，A为处理后的第16天，各组小鼠切除HepG-2/ADM肿瘤大小的代表性图，B为在P-gp过表达HepG-2/ADM移植瘤模型中，随着实验时间肿瘤体积变化的统计图，C为各组小鼠切除HepG-2/ADM肿瘤的肿瘤重量的平均值统计图，D为在P-gp过表达HepG-2/ADM移植瘤模型中，体重平均值随实验时间的变化统计图；
图5为实施例7中灵芝提取物对不同组的异种移植肿瘤组织中P-gp蛋白表达水平的影响统计图；其中，A为样品6(灵芝提取物)及其与紫杉醇合用对P-gp表达的效果，左边是三个肿瘤样本的电泳图，右边是另三个肿瘤样本的电泳图，B为样品6及其与紫杉醇合用对P-gp表达的定量效果(对左边三个肿瘤样本的电泳图的定量)，C为样品6及其与紫杉醇合用对P-gp表达的定量效果(对右边三个肿瘤样本的电泳图的定量)；
图6为实施例8中各组的代表性病理组织切片图；
图7为实施例9中灵芝提取物对小鼠ALT和AST水平的影响统计图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 灵芝提取物的制备
灵芝子实体干燥粉碎成粗粉后，用5％乙醇10倍量加热回流提取3次，每次3h，过滤，合并3次提取液，得乙醇提取液，浓缩，干燥，得灵芝子实体醇提物，即灵芝提取物。
实施例2 灵芝提取物的制备
灵芝子实体干燥粉碎成粗粉后，用95％乙醇5倍量加热回流提取3次，每次3h，过滤，合并3次提取液，得乙醇提取液，浓缩，干燥，得灵芝子实体醇提物，即灵芝提取物。
对本实施例制备的灵芝提取物的成分进行高效液相色谱分析，其中8种三萜(灵芝酸A，灵芝酸B，灵芝酸C2，灵芝酸G，灵芝酸LM2，灵芝酸H，灵芝酸F，赤芝酸)的含量总合为9.45％，麦角甾醇含量为0.21％，灵芝多糖含量为2.8％。高效液相色谱图如图1所示，8种三萜的各含量如表1所示。本发明下述实施例中药理实验的所用试验药物均为本实施例所得的灵芝提取物。
表1
实施例3 灵芝提取物的成分范围
发明人采用本发明的制备方法，在不同的提取参数下制备得到灵芝提取物，并对制备的灵芝提取物的成分范围进行总结。本含量比例的灵芝提取物的制备方法见实施例2。
采用本发明制备方法所得的灵芝提取物的成分范围如表2-1和表2-2所示。
表2-1
表2-2
组分名称 本实施例含量比例 含量比例范围
麦角甾醇 0.21％ 0.1～0.25％
灵芝多糖 2.8％ 0.5～20％
实施例4 肿瘤细胞增殖实验
本实施例的肿瘤细胞增殖实验所用试验药物为实施例2中所得的灵芝乙醇(95％)提取物，其中，8种三萜(灵芝酸A，灵芝酸B，灵芝酸C2，灵芝酸G，灵芝酸LM2，灵芝酸H，灵芝酸F，赤芝酸)含量总合为9.45％，麦角甾醇含量为0.21％，多糖含量为2.8％。
用MTT法评估细胞增殖，就是将人肝癌细胞株(HepG-2)或人乳腺癌细胞株(MCF-7)以每孔4×103个细胞接种于96孔板中并培养过夜，再用不同浓度(31.25～1000.00μg/mL)的样品处理细胞48h。然后，在每孔中加入20μl MTT，并将细胞孵育4h。最后，所形成的紫色甲瓒晶体用150μl DMSO溶解，并用多模酶标仪(Bio-Rad laboratories,USA)在490nm波长处检测其光吸收值。用Graph Pad Prism 5.0计算IC50值。
通过MTT试验测试了样品对人肝癌耐药细胞HepG-2/ADM的毒性效应，结果如图2所示，横坐标为样品浓度，纵坐标为细胞活力。在HepG-2/ADM细胞中评估MTT细胞毒性试验。用不同浓度的样品处理细胞48小时，测定细胞活力。根据样品和对照品之间的吸光度比来计算样品对细胞增殖的抑制。计算结果值代表三次独立试验的平均数±标准差(n＝6)。由图2可知，用0～1000.00μg/mL之间浓度递增的样品处理48小时，没有抑制这些细胞的增殖。当用1000.00μg/mL的样品处理时，90％以上的细胞是活的。结果表明，本发明的灵芝提取物对人肝癌耐药细胞没有细胞毒性，将其进一步研究灵芝提取物的多药耐药逆转作用。
实施例5 肿瘤耐药逆转实验
本实施例的肿瘤耐药逆转实验所用试验药物为实施例2中所得的灵芝乙醇(95％)提取物，其中，8种三萜(灵芝酸A，灵芝酸B，灵芝酸C2，灵芝酸G，灵芝酸LM2，灵芝酸H，灵芝酸F，赤芝酸)含量总合为9.45％，麦角甾醇含量为0.21％，多糖含量为2.8％。
1.体外抗耐药活性试验
选择2对肿瘤耐药/敏感细胞株：人肝癌敏感细胞株HepG-2和耐药细胞株HepG-2/ADM，人乳腺癌敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/ADR。
阳性对照药为维拉帕米，抗肿瘤阳性药为紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(VCR)、多柔比星(Doxorubicin，DOX)。
试验药物中，Sample 1(样品1)为灵芝酸A，Sample 2(样品2)为灵芝酸B，Sample 3(样品3)为灵芝烯酸B，Sample 4(样品4)为灵芝醇F，Sample 5(样品5)为灵芝多糖，Sample6(样品6)为本发明实施例2的灵芝提取物。
因耐药逆转剂需在非毒剂量下进行活性评价，采用MTT法测定细胞毒性。在无毒剂量或相当于IC10的剂量下设三个剂量，并设立相应的阳性和阴性对照组，阳性对照药为维拉帕米。
取对数生长期的细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁，弃原来培养基，加入同时含有试验药物和不同浓度的抗肿瘤药物的培养基，以维拉帕米(VRP)为阳性对照。孵育72h后，每孔加入30μL的5mg/mL的MTT溶液处理4h。弃废液，加入100μL DMSO溶解生成的甲瓒，酶标仪检测其OD值，并通过Prism 4.0软件计算IC50，通过IC50计算逆转剂的逆转倍数，评价逆转效果用逆转倍数(fold reversal,FR)表示：逆转倍数＝单独用药IC50/联合用药IC50。灵芝提取物对耐药人肝癌细胞株HepG-2/ADM细胞的逆转作用结果如表3所示，灵芝提取物对耐药人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR细胞的逆转作用结果表4所示。
表3
表4
由表3和表4可知，本发明的灵芝提取物可以显著逆转HepG2/ADM细胞对紫杉醇、长春新碱、多柔比星的耐药性，可以显著逆转MCF-7/ADR细胞对紫杉醇、多柔比星的耐药性，增强对化疗药物的敏感性。
本发明灵芝提取物具有显著的逆转肿瘤耐药作用，能逆转多种肿瘤细胞对多种抗肿瘤药的耐药性，且强于其它灵芝成分。在同等剂量下，本发明灵芝提取物的作用强度远强于其它灵芝三萜单体和灵芝多糖等灵芝成分，提示本灵芝提取物中的特征活性成分具有协同作用。
2.灵芝提取物对HepG-2/ADM细胞Rh-123积累的影响
罗丹明123(Rh-123)是糖蛋白的特定荧光探针底物，用来检测糖蛋白的功能。
(1)Rh-123积累试验
细胞按每孔1×105个细胞接种于6孔板中并孵育过夜。细胞浓度为0.5mg/mL的样品溶液在37℃下处理48h，然后用10.0μM Rh-123染液恒温避光培养4h。经过上述操作，收集细胞并用冷的PBS溶液洗涤3次。最后，在PBS缓冲液中将细胞重悬，用流式细胞仪检测细胞中Rh-123的荧光强度，将所得到的数据在FlowJo 7.6.1软件中分析。
(2)灵芝提取物增加了HepG-2/ADM细胞的Rh-123积累
在本研究中检测到样品对Rh-123积累影响P-糖蛋白过表达HepG-2/ADM细胞。用500μg/mL样品处理细胞4小时，然后通过流式细胞术分析。实验结果如图3所示，没有表达P-蛋白的人肝癌敏感细胞(Rh-123 accumulation in HepG-2)比人肝癌耐药细胞(Rh-123accumulation in HepG-2/ADM)积累了更高的Rh-123水平，表明这种人肝癌细胞系对大多数P-蛋白底物抗癌药物具有极强的抗性；流式细胞术分析对照组和样品组HepG-2/ADM细胞中Rh-123(10.0μM)的积累，通过流式细胞术检测细胞内的荧光强度，以反映细胞中Rh-123的含量，其中，灵芝提取物(Sample 6)的作用最强，0.5mg/mL以下的灵芝提取物可以显著增加多药耐药细胞中Rh-123的积累。这两个结果都表明灵芝提取物对P-gp功能具有抑制作用，其作用最强。
实施例6 灵芝提取物对HepG-2/ADM和MCF-7/ADR异种移植瘤模型的MDR逆转作用试验
1.构建人癌裸鼠异种移植瘤模型
在P-gp介导的多药耐药的研究中，HepG-2/ADM和MCF-7/ADR是一个适合研究的靶细胞。本试验使用HepG-2/ADM和MCF-7/ADR的人癌裸鼠异种移植瘤模型，发现其维持体内多药耐药表型，并对紫杉醇和长春新碱耐药。
在整体实验中，抗肿瘤阳性药物为紫杉醇和长春新碱。HepG-2/ADM和MCF-7/ADR细胞分别在体外培养和收集，然后在裸鼠的侧翼一次性皮下注射HepG2/ADM或MCF-7/ADR细胞(含有25％基质胶的200μl磷酸盐缓冲液中的1×107个细胞)。当肿瘤可见时，测量肿瘤长度和宽度来计算体积。一旦肿瘤的大小约为100mm3，裸鼠将被随机分成4组(5个裸鼠一组)，然后用不同的治疗方案处理：(a)control：生理盐水(0.9％，i.p.，q2d×8)；(b)仅紫杉醇(18mg/kg，i.p.，q2d×8)或长春新碱(5mg/kg，i.p.，q2d×8)；(c)样品(400mg/kg，i.g.，q1d×16)；(d)紫杉醇(18mg/kg，i.p.,，q2d×8)或长春新碱(5mg/kg，i.p.，q2d×8)和样品(400mg/kg，i.g.，q1d×16)。每两天记录小鼠的体重和长宽度，根据以下公式计算肿瘤的体积：
根据肿瘤体积和处理时间绘制肿瘤生长曲线。当对照组肿瘤平均体积达到1300mm3(由于小鼠个体差异)，小鼠通过接触CO2被立即处予安乐死。肿瘤组织从小鼠中切除并测量该重量。根据以下公式计算生长抑制率(IR)：IR＝1-(实验组肿瘤重量平均值/对照组肿瘤重量平均值)×100％。
在每组试验的最后，将动物安乐死，记录小鼠体重和肿瘤重量。收集异种移植瘤组织，每组3个肿瘤在液氮中冷冻，用于蛋白质印迹分析，收集其他肿瘤并固定在福尔马林中进行HE染色研究。
2.灵芝提取物对耐药癌细胞的总体抗癌效果
(1)裸鼠HepG-2/ADM细胞异种移植模型用于评价灵芝样品在体内逆转紫杉醇耐药性的效果
用样品与紫杉醇的组合同样处理裸鼠，对HepG-2/ADM异种移植瘤模型的MDR逆转作用的结果如图4所示。图4中，A为处理后的第16天，各组小鼠切除HepG-2/ADM肿瘤大小的代表性图片；B为在P-gp过表达HepG-2/ADM移植瘤模型中随着实验时间肿瘤体积的变化，处理过程如下：(a)control：生理盐水(i.p.，q2d×8)；(b)paclitaxel：仅紫杉醇(18mg/kg，i.p.，q2d×8)；(c)Sample 6：仅灵芝提取物(400mg/kg，i.g.,q1d×16)；(d)Sample 6+paclitaxel：紫杉醇(18mg/kg，i.p.，q2d×8)和灵芝提取物(400mg/kg，i.g.,q1d×16)，线图上的每个点代表植入后特定日的肿瘤体积(mm3)的平均值(n＝5)，并且每个条代表SD/100；与对照组和紫杉醇单独组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；C为各组小鼠的切除HepG-2/ADM肿瘤的肿瘤重量的平均值(小鼠，n＝5)，每列表示测定的均值，条表示SD；与未处理的对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；D为在P-gp过表达HepG-2/ADM移植瘤模型中，体重平均值随实验时间的变化。
由图4可知，与生理盐水组相比，剂量为18mg/kg的紫杉醇只能轻微地抑制裸鼠的肿瘤生长，表明该移植瘤维持MDR表型并对紫杉醇治疗有抗性。此外，用盐水(阴性对照)、紫杉醇(阳性对照)、灵芝提取物处理的动物之间的肿瘤尺寸没有显着差异。纯紫杉醇处理小鼠，肿瘤生长抑制率18.56％，灵芝提取物和紫杉醇的组合与单独紫杉醇组、单独灵芝提取物治疗组相比显著抑制肿瘤生长。灵芝提取物与紫杉醇组合组的抑制肿瘤生长率为68.18％，高于单独紫杉醇组的18.56％。该结果显示，灵芝提取物在体内对P-gp介导的MDR具有显着的逆转作用。此外，剂量测试中，观察到灵芝提取物与紫杉醇组合组没有死亡或体重明显下降，表明组合方案没有增加毒副作用的发生。
(2)人癌裸鼠MCF-7/ADR细胞异种移植模型用于评价灵芝样品在体内逆转长春新碱耐药性的效果
在人癌裸鼠MCF-7/ADR细胞异种移植模型中，灵芝提取物与长春新碱组合组的抑制肿瘤生长率为76.52％，高于单独长春新碱组24.31％，表明灵芝提取物逆转了人乳腺癌MCF-7/ADR细胞对长春新碱的耐药性。
因此，在人癌裸鼠异种移植模型中，灵芝提取物逆转了糖蛋白(P-gp)介导的肿瘤多药耐药(MDR)。
实施例7 灵芝提取物对P-gp蛋白水平的影响
1.Western blot分析
将肿瘤组织放进溶解缓冲液中(20mMTris-HCl pH 7.4，2mM EDTA，500mM钒酸钠，1％Triton X-100，0.1％SDS，10mM NaF，10mg/mL亮抑肽酶，和1mM PMSF)，在CoolBoxTM XT系统(Sigma)下同质化。采用Bradford法对蛋白浓度进行量化。40mg蛋白溶液用4～12％SDS-PAGE法分离，然后转移至PVDF膜上，于脱色摇床上用5％的脱脂奶粉摇动封闭2h，弃去封闭液，于一抗(1:1000)中4℃孵育过夜，用PBST洗涤后，以1:2000的比例加入二抗并在37℃孵育1小时，用增强型化学发光检测系统分析(Thermo Fisher公司)。
2.灵芝提取物没有改变P-gp的蛋白水平
P-gp介导的MDR的逆转作用可以通过抑制其功能或通过降低其表达来实现。本研究对每组的三个肿瘤进行蛋白质表达水平分析。通过蛋白质印迹法来分析P-gp表达水平。GAPDH被用于加样控制。在蛋白印迹图像下显示三个独立实验的结果。
灵芝提取物对不同组的异种移植肿瘤组织中P-gp蛋白表达水平的影响结果如图5所示，其中，A为样品6(灵芝提取物)及其与紫杉醇合用对P-gp表达的效果，左边是三个肿瘤样本的电泳图，右边是另三个肿瘤样本的电泳图，B为样品6及其与紫杉醇合用对P-gp表达的定量效果(对左边三个肿瘤样本的电泳图的定量)，C为样品6及其与紫杉醇合用对P-gp表达的定量效果(对右边三个肿瘤样本的电泳图的定量)，从图5可以看出，400mg/kg的灵芝提取物并没有太大改变移植瘤组织中的P-pg表达。此外，在该研究中，紫杉醇治疗组可轻微增强肿瘤组织中的P-pg表达。说明MDR的逆转很可能是通过直接抑制P-gp的外排功能，而不是其mRNA或蛋白质水平的下调获得的。
实施例8 肿瘤组织的病理检查-HE染色实验
将异种移植组织固定在4％的聚甲醛中，按标准操作包埋在石蜡中，用旋转切片机切除5μm切片并用苏木精和伊红染色，使用附带的数码相机(Leica ICC50)在Leica DM750显微镜下检查载玻片。各组的代表性病理组织切片图如图6所示，其中，control为对照组，paclitaxel为紫杉醇组，Sample 6为灵芝提取物组，Sample 6+paclitaxel为灵芝提取物和紫杉醇组。
由图6可知，在灵芝提取物和紫杉醇联合作用下，移植瘤组织出现大面积的细胞核固缩、肿瘤细胞胞浆呈空泡化以及坏死的肿瘤细胞，同时伴有淋巴细胞和浆细胞浸润的肿瘤组织充血，提示了在灵芝提取物的作用之下，HepG-2/ADM移植瘤恢复了其对紫杉醇的敏感性。
实施例9 灵芝提取物体内副作用的研究
1.血液化学分析
使用Drew Trilogy Analyzer(Diamond Diagnostics,Holliston,MA,USA)测量血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平。
2.灵芝提取物没有增强紫杉醇的体内副作用
肝毒性和心肌病是紫杉醇的两个危险的副作用，导致充血性心力衰竭和肝功能衰竭。灵芝提取物对小鼠ALT和AST水平的影响统计图如图7所示，与生理盐水组相比，紫杉醇能轻微增强血液中的AST浓度。紫杉醇和灵芝提取物联合治疗裸鼠并不能提高这些动物的ALT或AST浓度，这表明联合方案并没有增加毒副作用的发生率。
综上，本发明的灵芝提取物对MDR肿瘤细胞均无细胞毒性，可显著增加多药耐药肿瘤细胞对染料罗丹明Rh123的累积，其作用强于其它灵芝单体成分；在体外和体内实验中，本发明的灵芝提取物均显著逆转多种肿瘤对紫杉醇、长春新碱和多柔比星的多药耐药性，恢复紫杉醇、长春新碱和多柔比星的抗肿瘤作用；在同等剂量下，本发明灵芝提取物的作用强度远强于其它灵芝三萜单体和灵芝多糖，提示本灵芝提取物中的特征活性成分具有协同作用；本发明灵芝提取物组合组的动物没有死亡或体重明显下降、没有增强紫杉醇的体内肝毒性副作用、不改变实验动物肝脏ALT或AST水平，提示灵芝提取物不增加肝脏毒性，具有良好的安全性；本发明的灵芝提取物不改变肿瘤耐药蛋白P-gp的表达，其逆转耐药机制可能是直接抑制耐药蛋白的外排功能，而不是下调其mRNA或蛋白质水平而获得的；本发明的灵芝提取物取得了增效减毒的有益效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.灵芝提取物在制备抗肿瘤多药耐药药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灵芝提取物通过醇进行提取得到。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述灵芝提取物的制备方法为：
将灵芝子实体干燥粉碎成粗粉，用乙醇加热回流提取，过滤，合并提取液，得乙醇提取液，浓缩，干燥，得灵芝子实体醇提物，即灵芝提取物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乙醇的体积分数为5～99％，提取次数为1～3次，每次提取的时间为3h。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灵芝提取物含有灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝烯酸C、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸LM2、灵芝烯酸B、灵芝酸H、灵芝酸D、灵芝酸F、赤芝酸、灵芝烯酸D、麦角甾醇和灵芝多糖。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述灵芝提取物中，麦角甾醇的质量百分含量为0.1～0.25％，灵芝多糖的质量百分含量为0.5～20％，灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸LM2、灵芝酸H、灵芝酸F和赤芝酸的质量百分含量之和为0.1～11％。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤多药耐药药物为逆转HepG2/ADM细胞对紫杉醇、长春新碱、多柔比星耐药的药物，所述抗肿瘤多药耐药药物为逆转MCF-7/ADR细胞对紫杉醇、多柔比星耐药的药物，所述抗肿瘤多药耐药药物为对P-糖蛋白功能具有抑制作用的药物。
8.一种抗肿瘤多药耐药药物，其特征在于，所述药物包含灵芝提取物。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。
10.如权利要求8或9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
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