CN114767669B - 一种P-gp抑制剂及其提取方法和应用 - Google Patents

一种P-gp抑制剂及其提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种吲哚萜类的P‑gp抑制剂，及其提取方法和应用。本发明提供的P‑gp抑制剂可选择性抑制癌细胞P‑gp的活性和表达，而抑制癌细胞转运多西他赛到细胞外，所述P‑gp抑制剂可明显降低癌细胞对多西他赛的耐药性，从而提高多西他赛对癌细胞有丝分裂的抑制。本发明提供的P‑gp抑制剂的提取方法简单，所述方法可有效的从臭牡丹中提取所述P‑gp抑制剂，联合多西他赛增加化疗敏感性降低耐药性，具有临床价值。

Description

一种P-gp抑制剂及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及治疗癌症的药物领域，尤其涉及一种辅助治疗癌症的药物及其提取方法和应用。
背景技术
多西他赛(Docetaxel)是一种抗癌药物，其作用与紫杉醇(PTX)相同，为M期周期特异性药物，其可以促进小管聚合成稳定的微管并抑制其聚解，从而使小管的数量显著减少，并可破坏微管网状结构。体外实验表明，对多种小鼠及人体肿瘤细胞株有细胞毒作用，抗瘤谱较PTX广。但是长期使用多西他赛这类药物会导致人体产生耐药性。耐药是癌症化疗失败的主要原因之一。P-糖蛋白(P-gp)是一类典型的耐药转运蛋白，具有广泛特异性。许多常用的微管药物包括长春碱类、紫杉烷类等均是P-gp底物。多西他赛作为紫杉烷类会通过癌细胞膜上P-gp介导的主动转运，被转运到细胞外，从而导致药物在细胞内的积累减少，导致药物疗效的降低并产生药物抵抗，最终发生耐药。在多种实体瘤中均发现了P-gp的表达，并且经过化疗后，P-gp的表达会升高，引起药物耐药，并与患者的不良预后相关。因此，如何抑制细胞对多西他赛的耐药性成为一个亟待解决的问题。
发明内容
基于上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种多药耐药相关蛋白-1(P-gp)的抑制剂。本发明的第二个目的在于提供一种所述P-gp抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。本发明的第三个目的在于提供一种所述P-gp抑制剂的提取方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术手段：
一种P-gp抑制剂，所述P-gp抑制剂的结构式如下：
Figure GDA0003697211280000021
一种所述的P-gp抑制剂的应用，应用于制备治疗癌症的药物。
所述治疗癌症的药物包括多西他赛和所述的P-gp抑制剂。
所述P-gp抑制剂用于减少癌细胞对多西他赛的排出。
所述P-gp抑制剂通过降低癌细胞P-gp活性和蛋白表达水平减少癌细胞对多西他赛的排出。
所述P-gp抑制剂通过降低癌细胞P-gp活性和P-gp的表达水平来降低癌细胞对多西他赛耐药性，并增强癌细胞对多西他赛的敏感性。
一种所述的P-gp抑制剂的提取方法，包括如下步骤：
取臭牡丹干燥全草粉碎后用，乙醇回流得到提取液，对提取液进行减压浓缩后，采用乙酸乙酯进行萃取得到萃取液；最后用水和乙醇进行清洗，得到浸膏；
采用色谱法从所述浸膏从提取所述P-gp抑制剂。
所述色谱法采用的色谱柱为C18。
所述色谱法采用流动相为乙腈甲酸水溶液。
所述色谱法采用的柱温为25℃。
所述色谱法采用的体积流量为1.0mL·min-1。
相比于现有技术，本发明带来以下技术效果：
1.本发明提供的P-gp抑制剂可选择性抑制癌细胞膜的转运蛋白，从而抑制癌细胞对多西他赛的转运。
2.本发明提供的P-gp抑制剂通过抑制癌细胞对多西他赛的转运，可明显降低癌细胞对多西他赛的耐药性，从而提高多西他赛对癌细胞有丝分裂的抑制。
3.本发明提供的P-gp抑制剂的提取方法简单，所述方法可有效的从臭牡丹中提取所述P-gp抑制剂。
附图说明
图1示出了本发明提供的P-gp抑制剂的的色谱图；
图2示出了本发明提供的P-gp抑制剂的1H NMR谱图；
图3示出了本发明提供的P-gp抑制剂的13CNMR谱图；
图4示出了本发明提供的P-gp抑制剂的质谱图；
图5示出了本发明提供的P-gp抑制剂与P-gp的分子对接图；
图6示出了本发明提供的P-gp抑制剂对P-gp蛋白的转运活性实验中，对P-gp底物检测进行荧光检测后得到的对照组和P-gp抑制剂的组底物检测荧光强度分析图；
图7示出了多西他赛、本发明提供的P-gp抑制剂联合多西他赛对A549/DTX细胞的增殖的影响的曲线图；
图8示出了对照品、多西他赛、本发明提供的P-gp抑制剂联合多西他赛对A549/DTX细胞周期分布的影响图；
图9示出了多西他赛、本发明提供的P-gp抑制剂联合多西他赛对A549/DTX细胞微管分布的影响的荧光照片；
图10示出了对照品、多西他赛、本发明提供的P-gp抑制剂、本发明提供的P-gp抑制剂联合多西他赛的对P-gp蛋白表达影响的印迹图；
图11示出了对照品、多西他赛、本发明提供的P-gp抑制剂、本发明提供的P-gp抑制剂联合多西他赛的对P-gp蛋白表达影响分析图。
图12示出了本发明提供的P-gp抑制剂对P-gp的作用原理图。
具体实施方式
臭牡丹是一种常见的中草药，其分布广泛，药物资源丰富。臭牡丹性平，味辛、苦，功能活血散瘀、祛风解毒、消肿止痛。在治疗癌症的中药中经常加入臭牡丹，所以对臭牡丹中的有机物的研究对治疗癌症非常有帮助。臭牡丹的化学成分包括有机酸类化合物、醇类化合物、过氧化物、甾醇类化合物、萜类化合物、糖类等，上述成分通常具有抗炎、抗肿瘤等药理作用，特别是抗肿瘤作用。臭牡丹的化学成分中，苯乙醇苷类化合物是臭牡丹的特征性化合物，其结构由3部分组成，即苯乙醇苷元、咖啡酸、糖。发明人通过研究发现从臭牡丹中提取乙酸乙酯部位抗肿瘤效果显著。发明人在研究臭牡丹乙酸乙酯提取物时，发现一种包含吲哚萜的化合物，其具有对P-gp的抑制作用，而其本身并没有明显细胞毒性作用；其与多西他赛联用，可降低癌细胞P-gp对多西他赛的外排转运作用，从而提高癌细胞中的多西他赛的积累量，进而降低癌细胞对多西他赛的耐药性，提高化疗敏感性。
以下结合具体实验，对本发明进行进一步说明。
为研究臭牡丹中的化合物中各物质对肿瘤细胞的作用原理，发明人首先从臭牡丹中提取出了糖苷类化合物，并对提取出的糖苷类化合物进行了鉴定。具体提取过程如下：
取一定量的臭牡丹全草，干燥后粉碎，用然后用95％的乙醇回流提取3次，每次2小时；合并提取液，并将提取液减压浓缩至无醇味，再用乙酸乙酯进行萃取，以除去提取液中的脂溶性成分，萃余液用大孔树脂D101进行分离纯化；最后用纯水、10％乙醇洗脱萃余液以除去杂质，并收集50％乙醇的洗脱液减压浓缩即得浸膏。
发明人采用凝胶柱和制备型高效液相色谱将上述臭牡丹中提取出的化合物进行分离得到各化合物。采用的制备型高效液相色谱的具体参数如下：
色谱柱：Inert Sustain-C18(4.6×250μM,5μm)，流动相乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)。使用前超声脱气，用0.22μm微孔滤膜滤过；梯度洗脱程序：0～5min，5％A；5～24min，5％～24％A；24～27min，24％A；27～40min，24％～37％A；40～45min，37％～55％A；45～48min，55％～65％A；48～58min，65％～95％A；58～70min，95％A；柱温为25℃，体积流量1.0mL·min-1，进样量5μL。
检测波长254nm；质谱检测条件：采用电喷雾离子化(ESI)进行离子化，采用负离子模式采集；干燥气温度为325℃；干燥气体积流量为6.8L·min-1；鞘气温度为350℃；毛细管电压为4.0kV；碎片电压为110V，质量数范围为m/z50～1000。使用制造商提供的调谐液m/z70-3200范围校准质量轴。
从臭牡丹中提取得到的所述P-gp抑制剂的质谱图见图1。
发明人采用凝胶柱和制备型高效液相色谱将上述臭牡丹中提取出的化合物进行分离得到各化合物。
采用的制备型高效液相色谱的具体参数如下：
色谱柱：Inert Sustain-C18(4.6×250μM,5μm)，流动相乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)。使用前超声脱气，用0.22μm微孔滤膜滤过；梯度洗脱程序：0～5min，5％A；5～24min，5％～24％A；24～27min，24％A；27～40min，24％～37％A；40～45min，37％～55％A；45～48min，55％～65％A；48～58min，65％～95％A；58～70min，95％A；柱温为25℃，体积流量1.0mL·min-1，进样量5μL。收集保留时间为23-25min的物质。
通过上述制备型高效液相色谱对浸膏进行分离后，发明人得到了所述P-gp抑制剂。所述P-gp抑制剂的波普数据归纳如下：
1H NMR(300MHz，CD3CN，δ，ppm):11.67(1H,-NH-in indole),9.48(2H,-OH inphenol),7.35-6.91(4H,aromatic proton in indole),6.61-6.52(3H,aromatic protonin phenol),6.08(1H,-OCH(OH)-),5.52(1H,alcohol proton),5.39(1H,-CH＝CH2),4.94(1H,alcohol proton),4.09(3H,alcohol proton),3.70(2H,-OCH 2-),3.57-3.51(2H,-CH 2-OH),3.24(1H,>CH-O-in cyclohexane),3.15(1H,>CH-O-),2.72(2H,-CH 2-phenol),2.62and 2.38(2H in-CH 2-indole),2.53(1H,>CH-NH2),1.82-1.70(11H,＝C(CH 3)2,-NH 2,and-CH 2-in cyclohexane),1.78-1.73(3H,),1.71(1H,proton in ethene),1.70(2H,-HN2in),1.64-1.39(5H,-CH 2-in cyclohexane),1.19(1H,>CH-).
13C NMR(300MHz，CD3CN)δ，ppm):145.6,144.5,143.0,138.1,136,131.5 127.1,124.1,122.8,121.7,119.8,118.8,116.4,115.9,111.12,105.9,101.8,95.8,90.7,86,81.9,77.9,76.6,65.3,62.5,45.3,36.2,32.2,31.9,29.9,29.6,27.8,27.7,23.6,22.8.
m/z:655,656,657.32,656.31.
根据上述波谱数据，发明人确定了所述臭牡丹提取物的结构如下：
Figure GDA0003697211280000061
为评价所述P-gp抑制剂是否对癌细胞P-gp有抑制作用，发明人进行了如下实验：
1、细胞培养
用含10％FBS的DMEM培养基，于CO2恒温培养箱中对细胞进行培养。当细胞密度达到80～90％后开始传代。弃掉旧的培养基，并加入2mL PBS缓冲溶液清洗细胞，弃掉后再加入1mL的胰酶消化，加入2mL的培养基收集细胞并转移到15mL离心管后将其离心(1000rpm，3min)，弃掉上清液后加入2mL的培养基吹打重悬细胞，将适量的细胞加入新的培养皿，然后放回培育箱继续培养，取对数生长期细胞用于实验。
2、活性测定
采用CCK8方法进行：取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度3×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，置于5％CO2，37℃培养箱中培养24h后，至细胞单层铺满孔底。将孔随机分成给药组和空白对照组，每组设6个复孔。药物组加入含不同浓度P-gp抑制剂(1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50μg/mL)的培养基100μL。空白对照组加入100μL不含药培养基。将96孔板置5％CO2培养箱(37℃)培养48h，每孔加入10μLCCK8，继续培养2h后，用酶标仪于450nm处测定OD值，计算药物对细胞生长的抑制率(％)。按计算公式：抑制率(％)＝[1-(给药组平均OD值)/对照组平均OD值)]×100％。按寇氏改良法公式计算IC50值。
表1所述P-gp抑制剂对6种癌细胞的抑制活性(IC50：μg/mL)
Figure GDA0003697211280000071
由表1可知，所述P-gp抑制剂对上述癌细胞毒性作用较低(IC50＜30μg/mL)。
3、P-gp抑制剂与p糖蛋白亲和力
为研究所述P-gp抑制剂对P-gp的抑制效果，发明人先进行P-gp抑制剂与P-gp分子对接，使用ChemDraw软件构建吲哚萜类化学结构式，转换成sdf格式文件，导入ChemBio3D软件进行优化修饰，将吲哚萜类的小分子配体文件在Discovery Studio软件中删除水分子；在PDB网页(http://www.rcsb.org/)获取p糖蛋白(p-plycoprotein)受体文件，将受体文件导入AutoDockTools软件进行加氢，输出为PDBQT文件；将吲哚萜类的小分子配体及p糖蛋白(p-plycoprotein)受体导入Auto Vina软件进行分子对接，对接情况如图5所示。由图5可知，吲哚萜类与p糖蛋白的结合位点具有3个氢键，吲哚萜类可以通过与p糖蛋白的第367位赖氨酸(LYS A：367)、第364位谷氨酸(GLU A:364)、第241位天冬氨酸(ASP A:241)有效结合，从而靶向p糖蛋白。
结合能可以判断受体与配体对接的亲和力，结合能为负值则说明受体与配体具有亲和力，结合能小于-5.0kcal·mol-1说明亲和力较好。吲哚萜类与p糖蛋白对接的结合能值如表2。由表2可知，吲哚萜类与p糖蛋白的中心结合点位置的自由能为-8.0kcal/mol，说明两者亲和力较好，具有良好的对接关系。
表2吲哚萜类与p糖蛋白对接的结合能值
Figure GDA0003697211280000081
Figure GDA0003697211280000091
为研究P-gp抑制剂对P-gp蛋白的转运活性，对P-gp底物检测进行荧光检测。罗丹明6g是耐药蛋白P-gp的经典底物，其荧光强度可以通过流式细胞仪检测，以此来而衡量P-gp蛋白的转运活性。本研究通过设立罗丹明6g对照组和P-gp抑制剂组分别处理A549/DTX细胞，通过实验结果分析(图6)可以看到罗丹明6g对照组荧光强度值为65±8，加入P-gp抑制剂后，荧光强度值在胞内积累量明显增加，荧光强度值增加到457±12，因此加入P-gp抑制剂后的P-gp转运活性受到明显抑制。
4、P-gp抑制剂联合多西他赛的作用
为研究P-gp抑制剂联合多西他赛对肺癌多西他赛耐药株A549/DTX细胞增殖的影响，发明人为排除MRP1的干扰，研究所述P-gp抑制剂对A549/DTX细胞转运多西他赛的影响时，加入MRPl抑制剂MK571与所述P-gp抑制剂共孵育。A549/DTX细胞接种于六孔板中，分两组，于对数生长期时一组加入MK571(50μmol·L-1)作为对照，另一组加入所述P-gp抑制剂选择毒性较低浓度(20μg·mL-1)与MK571(50μmol·L-1)，两组分别加入不同浓度的多西他赛(0.01、0.5、1、5、10、50、100μmol/L)。细胞经药物处理两天后，每孔加入10μL CCK8，继续培养2h后，用酶标仪于450nm处测定OD值，计算IC50值。结果如图7，显示多西他赛对A549/DTX细胞的IC50为71.2μmol·L，20μg·mL-1P-gp抑制剂联合多西他赛作用于A549/DTX细胞后，IC50为17.8μmol·L，表现出较多西他赛单药更为显著的抑制效果(P<0.05)。
发明人进一步检测P-gp抑制剂对细胞内多西他赛浓度的影响。A549/DTX细胞接种于六孔板中，分两组，于对数生长期时一组加入MK571(50μmol·L-1)作为对照，另一组加入所述P-gp抑制剂选择毒性较低浓度(20μg·mL-1)与MK571(50μmol·L-1)。移除培养液，进行PBS清洗1次，然后加入多西他赛(50μmol·L-1)与细胞共孵育60min后收集细胞，PBS清洗3次，加入超纯水重悬细胞，-80℃冻融裂解然后于15000g离心15min，移取上洁，保存于零下80摄氏度。上述培养采用的培养为DMEM高糖培养基。然后吸取样品175μL，再加入三倍量的甲醇混合，15000rpm离心15min，然后取上清液进样于高效液相色谱仪进行定量分析。色谱条件为：Diamonsil C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为乙醇-水(55:45)，流速为lmL/min，柱温为25℃，检测波长为353nm，进样量为25μL。结果显示每毫克P蛋白摄取的多西他赛的量为0.1736毫克，而对照组为每毫克P蛋白摄取的多西他赛的量为0.4203毫克。由此可见，所述P-gp抑制剂对P-gp的抑制效果明显。
发明人进一步研究了所述P-gp抑制剂与多西他赛之间的协同作用。具体的，发明人采用Chou-Talalay方法来评价所述P-gp抑制剂和多西他赛的协同治疗效果。通过此方法计算“组合指数”(CI)，定量描述协同作用(CI<1)，加和作用(CI＝1)或拮抗作用(CI>1)。即，将耐药的A549/DTX细胞在系列稀释的所述P-gp抑制剂和多西他赛混合物溶液中暴露48小时。在高于和低于IC50两倍系列浓度的数个浓度点，用上述描述的方法来评价联合应用的细胞毒性。通过使用CalcuSyn软件v.2.1(Bio-soft)，协同作用被进一步细化为协同作用(CI＝0.3-0.7)，强协同作用(CI＝0.1-0.3)和非常强的协同作用(CI<0.1)。细胞死亡的程度达到50％(ED50)和90％(ED90)时，所述P-gp抑制剂与多西他赛的组合指数(CI)值是0.23和0.05。这表明在过表达P蛋白的A549/DTX细胞中，所述P-gp抑制剂-多西他赛组合表现出强协同的细胞毒性作用(CI<0.3)。
5、P-gp抑制剂联合多西他赛作用机制
为研究P-gp抑制剂联合多西他赛对A549/DTX细胞周期分布的影响，将A549/DTX细胞分为空白对照组、多西他赛组(10μmol·L-1)、P-gp抑制剂(20μg·mL-1)联合多西他赛(10μmol·L-1)组，收集各组细胞进行流式细胞术周期检测，结果如图8，A549/DTX细胞周期分布图统计结果如表3所示，可以看出，与对照组比较，多西他赛组、P-gp抑制剂联合多西他赛组中分布于G1期的细胞数减少(P<0.05，P＜0.01)；与对照组比较，多西他赛组S期细胞数变化无统计学意义，P-gp抑制剂联合多西他赛组分布于S期细胞数减少(P<0.05)；与对照组比较，多西他赛组、P-gp抑制剂联合多西他赛组分布于G2/M期细胞数显著增加(P＜0.05或P＜0.01)。因此P-gp抑制剂联合多西他赛能够阻滞A549/DTX细胞于G2/M期。
表3各组A549/DTX细胞周期分布的影响(
Figure GDA0003697211280000111
n＝3)
Figure GDA0003697211280000112
为研究P-gp抑制剂联合多西他赛对A549/DTX细胞微管分布的影响，基于多西他赛作用于β-tubulin，促进微管聚合抑制微管解聚而抑制有丝分裂的原理，发明人荧光标记β-tubulin，设立多西他赛组(10μmol·L-1)、P-gp抑制剂(20μg·mL-1)联合多西他赛(10μmol·L-1)组，激光共聚焦分析A549/DTX细胞微管β-tubulin分布情况，结果如图9，A多西他赛组，B为P-gp抑制剂联合多西他赛组，发现β-tubulin主要定位在细胞核内，在胞浆中呈弥散状分布。相比多西他赛组，联合组β-tubulin在胞核中增加、胞浆中有减少趋势，由此可见，P-gp抑制剂联合多西他赛可以抑制微管解聚。
为研究P-gp抑制剂对P-gp蛋白表达水平的影响，发明人通过Westernblot方法进一步测试了所述P-gp抑制剂对P-gp的表达印迹。实验分为A549/DTX细胞空白对照组、多西他赛组(10μmol·L-1)、P-gp抑制剂组(20μg·mL-1)、P-gp抑制剂(20μg·mL-1)联合多西他赛(10μmol·L-1)组，分组处理后，提取膜蛋白分析，结果如图10和图11，显示的P-gp蛋白表达印迹图，与对照组比，多西他赛组P-gp蛋白表达水平无显著差异，P-gp抑制剂组、P-gp抑制剂联合多西他赛组中A549/DTX细胞P-gp蛋白表达降低，具有统计学意义(**P＜0.01)；与多西他赛组比，P-gp抑制剂联合多西他赛组P-gp蛋白表达显著降低，具有统计学意义(##P＜0.01)。因此，P-gp抑制剂可以降低P-gp蛋白表达。
由此可见，吲哚萜类的P-gp抑制剂与多西他赛组联用，P-gp抑制剂通过结合P-gp蛋白降低转运活性，通过降低P-gp蛋白表达，致使多西他赛外排量减少，细胞内多西他赛含量积累增加，促进多西他赛微管聚合抑制微管解聚作用，抑制有丝分裂进程，同时相比于单独使用多西他赛，联合组明显能够发挥化疗增敏的协同作用，抑制耐药性(图12)。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种P-gp抑制剂，其特征在于：
所述P-gp抑制剂的结构式如下：
Figure QLYQS_1
2.一种如权利要求1所述的P-gp抑制剂的应用，其特征在于：应用于制备治疗癌症的药物。
3.如权利要求2所述的P-gp抑制剂的应用，其特征在于：
所述治疗癌症的药物包括多西他赛和所述的P-gp抑制剂，
所述P-gp抑制剂用于减少癌细胞对多西他赛的排出。
4.如权利要求3所述的P-gp抑制剂的应用，其特征在于：
所述P-gp抑制剂通过降低癌细胞P-gp活性和P-gp的蛋白表达水平来减少癌细胞对多西他赛的排出。
5.如权利要求3所述的P-gp抑制剂的应用，其特征在于：
所述P-gp抑制剂通过降低癌细胞P-gp活性和P-gp的表达水平来降低癌细胞对多西他赛耐药性，并增强癌细胞对多西他赛的敏感性。
6.一种如权利要求1所述的P-gp抑制剂的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
取臭牡丹干燥全草粉碎后用，乙醇回流得到提取液，对提取液进行减压浓缩后，采用乙酸乙酯进行萃取得到萃取液；最后用水和乙醇进行清洗，得到浸膏；
采用色谱法从所述浸膏从提取所述P-gp抑制剂。
7.如权利要求6所述的P-gp抑制剂的提取方法，其特征在于：
所述色谱法采用的色谱柱为C18。
8.如权利要求6所述的P-gp抑制剂的提取方法，其特征在于：
所述色谱法采用流动相为乙腈甲酸水溶液。
9.如权利要求6所述的P-gp抑制剂的提取方法，其特征在于：
所述色谱法采用的柱温为25℃。
10.如权利要求6所述的P-gp抑制剂的提取方法，其特征在于：
所述色谱法采用的体积流量为1.0mL·min-1。
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