WO2016175626A1 - 미생물 검출, 동정 또는 계수 방법 및 이를 이용한 시스템 - Google Patents

미생물 검출, 동정 또는 계수 방법 및 이를 이용한 시스템 Download PDF

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WO2016175626A1
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chamber
counting
metering chamber
fluorescent
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정연철
조근창
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(주)로고스바이오시스템스
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    • G01N2035/0449—Combinations of the above using centrifugal transport of liquid

Definitions

  • the present invention relates to a method capable of detecting, identifying or counting microorganisms and a system using the same.
  • microorganisms The detection, identification and counting of microorganisms is a very important and widely used technique in biological and medical research, clinical microbiology, diagnosis and treatment of cancer, environmental science, food industry, toxicology and related studies and industries.
  • Dilution typically includes colony counting. After diluting the precultured samples to various dilution folds, they are plated in a plurality of solid plate media and incubated at an appropriate temperature, and the number of microbial colonies formed is counted to estimate the presence and concentration of microorganisms in the precultured sample. That's how.
  • this method cannot be used if the culture conditions are not known because it is necessary to know in advance information on a suitable medium to support the growth of a particular microorganism.
  • the result obtained from the microorganisms in the sample is different from the number of microbial individuals in the actual sample. Will result.
  • there is a limit that only an individual that can form a colony is counted.
  • the process of smearing a number of reputation badges is a labor-intensive and time-consuming process, and there are many disadvantages of human error.
  • Indirect methods include turbidity measure and electronic cell counting.
  • Turbidity measurement has the advantage that can be easily performed by measuring the turbidity of the solution in which the microorganisms are suspended using a photometer.
  • accurate counting should be performed in parallel with colony counting, and the total number of microorganisms suspended in solution can be counted, and there is no way to distinguish between viable and non-viable microorganisms.
  • organic or inorganic particles other than microorganisms are contaminated, their accuracy is significantly lowered.
  • concentration of microorganisms suspended in solution should be high.
  • Another form of indirect method is the use of current flow to measure microbial concentrations, which requires special equipment and has similar drawbacks to turbidity measurements.
  • the direct method is a method of directly counting the number of microorganisms using a microscope.
  • the traditional method is to count microorganisms directly with a bright field microscope using a specially designed hemocytometer.
  • This method has the advantage of being very simple, inexpensive and quick to perform.
  • microscopic observation of microorganisms most of which are several micrometers or less, requires observation of multiple fields of view using high magnification (eg 100 x) objectives, which requires labor-intensive and time-consuming work.
  • high magnification eg 100 x
  • the hemocytometer designed for counting microorganisms after inoculating a slide in which the microorganisms are structurally suspended onto a slide, covers the cover glass and prepares a sample. many.
  • Another form of direct counting is smear counting.
  • the solution in which the microorganisms are suspended is plated on a slide glass, dried, and then observed under a microscope without staining or stained by a specific method, followed by a microscope to count the microorganisms.
  • this method does not accurately control the volume of the solution in which the microorganisms are suspended, and has the same limitations as the aforementioned microscopic method.
  • a microbial suspension solution is applied to a filter having a hole smaller than the size of the microorganism to filter the microorganisms on the filter, followed by fluorescence staining and counting using a fluorescence microscope.
  • This method is recognized as a standard method of microbial counting, and because it uses fluorescence staining, it has a high detection sensitivity compared to bright field microscopy and has the advantage of distinguishing viable and non-viable microorganisms.
  • the size and distribution of the filter are not uniform and the distribution of the filtered microorganisms is very uneven, there is a disadvantage in that a very large number of fields must be checked to count the microorganisms (Seo et al., 2010).
  • a microbial solution is placed in a device having a chamber, and then, electricity is transferred to a specific surface, and the cells are cultured or fluorescently stained without being cultured, and then detected by a fluorescence microscope.
  • additional expensive equipment is required, and when cultivating microorganisms in a chamber, appropriate culture conditions must be known in advance, and in a case where a colony is formed in a single individual and in a plurality of individuals There is a disadvantage in that the case where the colony is formed can not be distinguished.
  • the effect of electrical stimulation on the detection of microorganisms has not been studied closely. Therefore, in order to overcome the limitations of the conventional methods and to count microorganisms simply and accurately, the development of a method capable of directly counting the number of microorganisms in a sample is constantly required.
  • the present inventors have tried to find a method for identifying, detecting, or counting microorganisms quickly, accurately, and conveniently, compared to conventional microorganism identification, detection, or counting methods.
  • the present inventors apply a fluorescently labeled microbial sample to a slide containing a quantitative chamber and centrifuge it to adhere the microorganism to the focal plane of the slide, and then analyze the fluorescence image by fluorescence microscopy.
  • the present invention was completed by confirming that microorganisms can be identified, detected, or counted quickly, accurately, and conveniently.
  • Another object of the present invention is to provide a system capable of detecting, identifying or counting microorganisms using the above method.
  • Detecting, identifying or counting microorganisms including detecting, identifying or counting microorganisms contained in the sample solution by analyzing the fluorescent or luminescent image.
  • sample solution containing microorganisms refers to the liquid medium itself cultured microorganisms when the microorganisms are cultured in a liquid medium, and means that the microorganisms are suspended in a solution when the microorganisms are cultured in a solid medium. .
  • the sample solution containing the microorganism may be diluted or concentrated according to the concentration of the microorganism.
  • contact means that the sample solution containing the microorganism and the fluorescent or luminescent material in one container so that the reaction can occur between the microorganism and the fluorescent or luminescent material.
  • the sample solution containing microorganisms may be added to the sample solution containing the microorganisms or the fluorescent or light emitting material.
  • color, fluorescent or luminescent materials may be used.
  • a fluorescent or light emitting material Specifically, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), SYBR gold, acridine orange (AO), BacLight, MycoLight, SYTO dyes, propidium iodide (PI), etc., which can stain the nucleic acid of an organism as a fluorescent dye.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • AO acridine orange
  • BacLight, MycoLight, SYTO dyes propidium iodide
  • PI propidium iodide
  • a thiazole-based dye may be used as a substance that specifically stains viable microorganisms.
  • AO, BacLight, MycoLight, or SYTO dyes may be used to specifically dye viable microorganisms, and may be used to specifically dye non-viable microorganisms, but is not limited
  • the FISH (fluorescence in situ hybridization) method may be used as a method for labeling microorganisms.
  • the FISH method is commonly used to identify microorganisms by contacting species-specific nucleic acid probes with microorganisms. Therefore, the FISH method can be used to detect and count microorganisms as well as to identify microorganisms.
  • species-specific antibodies can be used as a method of labeling microorganisms. Microorganisms can be identified by contacting a species-specific antibody conjugated with a fluorophore with a microorganism to read the presence or absence of a specific antigen.
  • a light emitting material may be used to detect living microorganisms. For example, viable microorganisms can be detected by measuring ATP activity using luciferase, but the present invention is not limited thereto.
  • various microorganisms were stained using MycoLight, a nucleic acid label dye, to detect and count microorganisms.
  • a biological buffer solution such as phosphate buffered saline or tris buffered saline may be used.
  • nonionic surfactants such as Triton X-100, Tween-20, or NP-40 can be used in biological buffers to effectively label luminescent or fluorescent materials.
  • detergent or chelating agents such as EDTA, EGTA and the like may be added.
  • the quantitative chamber of the present invention is for injecting a predetermined volume of sample solution for detecting, identifying or counting microorganisms, and can be manufactured in various forms.
  • it may include a top plate and a bottom plate, it can be manufactured so that the height inside the chamber formed by combining the top plate and the bottom plate is 1 to 200 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the metering chamber may be manufactured to control the volume of the solution contained in the chamber.
  • the centrifugation means of the present invention is for centrifuging slides and is not limited to a particular instrument.
  • a commercially available centrifuge may be used, or a separately produced centrifuge may be used.
  • the centrifugation is characterized in that the centrifugal force acts in a direction perpendicular to the lower plate of the metering chamber into which the mixture is injected to form a focal plane, and the formation of the focal plane is injected into the metering chamber.
  • Microorganisms contained in the mixture is characterized in that formed by forming a single layer on the lower surface of the metering chamber.
  • the "focal plane" means the range in which the lens is in focus. In the focal plane, the image is clearly visible even if the plane perpendicular to the focal point of the optical axis moves along the optical axis.
  • an automatic imaging device as shown in FIG. 6 is used.
  • An automated XY stage was constructed to capture multiple fields of field on a single metering chamber slide, each with an LED, an excitation filter, and an emission filter.
  • Image analysis software may be used for convenience of analysis, but is not limited thereto.
  • image analysis software after labeling the microorganisms with a fluorescent material to count the microorganisms, and then obtain a fluorescent image using an automatic imaging device, after processing with a self-made image analysis software, particles that emit a fluorescent signal The number of microbes was counted to obtain the number of microorganisms per unit volume.
  • the present invention further comprises the step of mixing the sample solution and the loading buffer (loading buffer) in contact with the fluorescent or luminescent material of the step (a) as the next step of the step (a),
  • a mixture of the sample solution and the loading buffer in contact with the fluorescent or luminescent material may be injected into a quantitative chamber installed on the slide surface.
  • the "loading buffer” is a buffer used to prevent phase change due to evaporation of sample or change of external pressure in the process of injecting a sample solution in contact with a fluorescent or luminescent material into a chamber and centrifuging. it means.
  • a separate loading buffer is required to suppress the phase change caused by the evaporation of the sample or the change of external pressure after the sample is injected into the metering chamber.
  • a loading buffer is also needed to ensure that the particular focal plane formed after centrifugation of the metering chamber slide remains undeformed by physical stimulation.
  • a liquid having a higher viscosity and higher boiling point than an aqueous solution may be used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • glycerol polyethylene glycol (PEG) or fructose syrup
  • PEG polyethylene glycol
  • a microbial detection, identification or counting system comprising:
  • centrifugation means capable of centrifuging the slide.
  • the system also includes: (c) a light source for irradiating light on the slide; (d) imaging means for obtaining an image produced by said light source; (e) an image processor for detecting, identifying or counting microorganisms in a volume of said quantitative chamber from images obtained by said imaging means; And (f) display means for displaying a result of detecting, identifying or counting the microorganism.
  • system may further comprise a fluorescent or luminescent material capable of labeling the microorganism.
  • the system may further comprise a loading buffer used to apply the sample solution to the metering chamber.
  • the system of the present invention is a system for implementing the method of the present invention described above, and the details are described in the above method, and the description thereof is omitted to avoid excessive duplication.
  • the present invention provides a method capable of detecting, identifying or counting microorganisms using centrifugation means and imaging means and a system using the same.
  • microorganisms can be detected, identified or counted quickly, accurately and conveniently.
  • 1 is a schematic diagram of the method of the present invention.
  • Figure 2 is a photograph showing the results of fluorescent imaging after dyeing various microorganisms with a nucleic acid labeled fluorescent dye.
  • Figure 3 is a photograph showing the result of checking the degree of evaporation with time of the solution injected into the chamber of the metering chamber slide.
  • Figure 4 is a photograph showing a comparison between the results of imaging the cells without centrifugation and the results of imaging the cells after centrifugation.
  • 5 is a result of diluting and loading E. coli in 1:10, 1:20, and 1: 100, respectively, in a chamber slice of 100 ⁇ m, followed by centrifugation.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of a cell imaging system.
  • FIG. 8 is a photograph showing imaging results obtained with a cell imaging system with multiple fields of view.
  • Figure 9 is a chart comparing the results of counting bacteria and plate counting method by the method of the present invention.
  • Example One Fluorescent material Label of microorganisms used
  • microorganisms such as E. coli
  • the microorganisms were stained using a nucleic acid label dye MycoLight (ATT Bioquest, USA).
  • the microorganisms are suspended in Dulbecco's Posphate-Buffered Saline (DPBS) solution in various ratios, such as 1: 2 to 1: 100, and then suspended.
  • DPBS Dulbecco's Posphate-Buffered Saline
  • the microbial suspension is contacted with MycoLight and reacted for 5 to 30 minutes.
  • Microbial DNA was labeled by MycoLight.
  • 2.5 ⁇ PET 2.5 mM EDTA and 0.025% Tween-20 in 2.5 ⁇ PBS
  • 1 DPBS was used as reaction buffer.
  • Figure 2 shows a fluorescence picture of the various microorganisms fluorescently labeled in contact with MycoLight.
  • a separate loading buffer is required to suppress the phase change caused by the evaporation of the sample or the change of external pressure after the sample is injected into the metering chamber.
  • a loading buffer is also needed to ensure that the particular focal plane formed after centrifugation of the metering chamber slide remains undeformed by physical stimulation.
  • glycerol with higher viscosity and higher boiling point than aqueous solution (Samjeon Pure Chemical Co., Ltd.), DMSO (Sigma, USA) or X-clarity mounting solution (hereinafter M / S, Logos Biosystems Co., Ltd.) was tested for use as a loading buffer.
  • glycerol is injected into the chamber of the quantitative chamber slide having a 100 ⁇ m high chamber, and then left at room temperature to observe the degree of evaporation of the solution over time.
  • the injected solution was added with a bluish trypan blue dye (Life Technologies, USA).
  • DMSO which has a higher boiling point than water, had a similar effect.
  • Figure 4 is stained E. coli cells ( E. coli DH5 ⁇ ) with MycoLight reagent staining nucleic acid, then mixed with a glycerol loading buffer, 2.5 ⁇ l of the mixed solution is injected into the quantitative chamber, the centrifuged slide and not centrifuged The photo is a comparison of the slides by fluorescence imaging. Centrifugation was performed for 30 seconds at 500 RCF.
  • the centrifugal force was to act in a direction perpendicular to the bottom of the metering chamber slide.
  • Imaging and analysis with a digital fluorescence microscope (iRiS TM, logos Biosystems, Inc.) equipped with a 10 X objective lens showed that if the centrifugation was not performed, the cells were not gathered in the same focal plane. In view of this, all cells could not be imaged and many cells were imaged out of focus. However, when centrifugation was performed, almost all the cells were gathered on a single focal plane and almost all the cells could be imaged at a particular focal plane.
  • reaction by adding glycerol in the above was transferred to a chamber slide of 100 ⁇ m height, and centrifuged for 10 minutes at 50, 100, 200 and 400 RCF, respectively, and analyzed. Table 2 below shows the results. Above 100 RCF, the sample settled by more than 90%, and the pulling at the inlet began to appear from 100 RCF.
  • FIGS. 5 and 6 show the results. When centrifuged (Fig. 5) compared to the image without centrifugation (Fig. 6) it can be seen that the focal plane is formed evenly. In addition, the phenomenon that the sample is concentrated after centrifugation was confirmed by varying the centrifugation speed to 200, 400, 600 and 800 RCF. In addition, the precipitation of microorganisms in the sample was analyzed while lowering the centrifugation rate. A 1:10 dilution of E. coli was used, and the chamber slides were centrifuged at 40, 50, and 100 RCF for 10 minutes, and the results were compared. Table 2 below shows the focal plane horseshoe.
  • an auto-imaging device as shown in FIG. 7 was constructed.
  • An automated XY stage was constructed to capture multiple fields of view on one metering chamber slide, and each had an LED, an excitation filter and an emission filter. Images of the slides centrifuged by the method of Example 3 were obtained using the auto-imaging device configured as described above (FIG. 8). Automatically obtained images were processed by image analysis software (Logos Biostems, Korea), and then counting the number of particles emitting fluorescent signals, the number of microorganisms per unit volume was calculated.
  • the present invention can be widely used for detecting, counting, and identifying microorganisms of small size, such as bacteria, microorganisms of various fields can be used.

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Abstract

본 발명은 미생물을 검출, 동정 또는 계수할 수 있는 방법 및 이를 이용한 시스템에 관한 것으로서, 기존의 미생물 동정, 검출 또는 계수 방법에 비해 신속하고 정확하며 편리하게 미생물을 동정, 검출 또는 계수할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 형광표지한 미생물 시료를 원심분리하여 슬라이드 표면에 밀착시킨 다음, 형광이미지를 분석하는 경우, 신속하고 정확하며 편리하게 미생물을 동정, 검출 또는 계수할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 방법 및 시스템은 미생물 검출, 동정 및 계수가 필요한 다양한 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

미생물 검출, 동정 또는 계수 방법 및 이를 이용한 시스템
본 발명은 미생물을 검출, 동정 또는 계수할 수 있는 방법 및 이를 이용한 시스템에 관한 것이다.
미생물의 검출과 동정 및 계수는 생물학 및 의학 연구, 임상 미생물학, 암의 진단과 치료, 환경과학, 식품 산업, 독성학 및 유관 학문과 산업분야에서 매우 중요하고 널리 사용되는 기술이다.
특히, 건강보건 및 환경 미생물학 분야에서 미생물의 신속한 검출과 계수는 매우 중요하다. 극미량의 미생물 오염을 검출하기 위해서 전배양 (pre-cultivation) 단계는 불가피하지만, 전통적인 방법들은 전배양 이후에도 오랜 시간이 걸리거나 부정확한 방법에 의해 미생물을 검출하고 계수한다는 한계가 있다.
미생물을 계수하는 방법은, 희석법 (dilution method), 간접적 방법 (indirect method), 직접 계수법 (direct method) 등 크게 세 가지로 나누어 볼 수 있다. 희석법은 대표적으로 미생물 군락을 계수하는 방법 (colony counting)을 포함한다. 전배양한 시료를 다양한 희석배수로 희석한 후, 이들을 다수의 고체평판 배지에 도말하고 적절한 온도에서 배양한 다음, 형성되는 미생물 군락의 수를 계수하여 전배양한 시료 내의 미생물 존재 여부와 그 농도를 추정하는 방법이다. 그러나 이 방법의 경우, 특정 미생물의 생장을 지원하는 적절한 배지에 대한 정보를 미리 알고 있어야 하므로, 배양조건을 알지 못하는 경우에는 이용할 수 없다. 또한, 서로 생장 조건이 다른 다양한 종류의 미생물이 혼합되어 있는 시료의 경우, 각 미생물의 생장을 지원할 수 있는 배지들이 필요하다. 또한, 배양조건을 잘 알고 있는 경우에도 도말된 미생물이 관찰 가능한 군락으로 자라기까지 수십 시간 내지는 수일이 소요되므로 신속한 검출과 계수가 불가능하다. 또한, 서로 응집되는 성질이 있는 미생물의 경우나 시료 내 이물질로 인하여 미생물이 응집된 경우에는 하나의 미생물 개체로부터 하나의 군락이 형성되지 않고, 다수의 미생물이 응집된 덩어리로부터 하나의 군락이 형성될 수 있기 때문에 이로부터 얻은 결과는 실제 미생물 개체의 수와는 상이한 결과를 나타내게 된다. 또한, 미생물을 고체평판 배지에 도말하는 과정에서 유발될 수 있는 물리화학적 스트레스에 의해 살아있던 미생물이 손상되어 군락을 형성하지 못하는 경우에도 이로부터 얻은 결과는 실제 시료에 있던 미생물 개체의 수와는 상이한 결과로 나타나게 된다. 그리고, 군락을 형성할 수 있는 개체만 계수되는 한계가 있다. 또한, 다수의 평판배지에 도말하는 과정은 노동 집약적이며 많은 시간을 소요하는 과정으로서 오작업 (human error)의 여지가 많은 단점이 있다.
간접적 방법에는 탁도측정 (turbidity measure) 방법과 전기적 세포계수방법 (electronic cell counting)이 있다. 탁도측정법은 미생물이 현탁된 용액의 탁도를 광도계 (photometer)를 이용하여 측정하는 방법으로 손쉽게 수행할 수 있는 장점이 있다. 그러나 정확한 계수를 위해서는 군락계수법 (colony counting)과 병행하여 수행되어야 하며, 용액에 현탁된 미생물의 총수를 계수할 수 있을 뿐 생존 (viable) 미생물과 비생존 (non-viable) 미생물을 구분할 방법이 없고, 미생물 이외의 유기 또는 무기 입자가 오염되어 있는 경우 그 정확도가 현저히 떨어진다는 단점이 있다. 또한, 유의한 수준의 탁도를 측정하기 위해서는 용액에 현탁되어 있는 미생물의 농도가 높아야 한다. 간접적 방법의 다른 형태는 전류의 흐름을 이용하여 미생물 농도를 측정하는 방법으로, 특별한 장치가 필요하고 탁도측정법과 유사한 단점들을 갖는다.
직접 계수법 (direct method)은 현미경을 이용하여 미생물의 수를 직접 계수하는 방법이다. 전통적 방법은 특별히 고안된 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 명시야 현미경으로 직접 미생물을 계수하는 방법이다. 이 방법은 매우 간단하고 저렴하며 신속하게 수행할 수 있는 장점이 있다. 그러나 대부분 수 마이크로미터 이하인 미생물을 명시야 현미경으로 관찰하기 위해서는 고배율 (예. 100 x)의 대물렌즈를 사용하여 다수의 시야를 관찰해야 하므로, 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 작업을 필요로 한다. 또한, 생존 미생물과 비생존 미생물을 구분할 수 없고, 용액에 섞여있는 비생물적 입자를 구분할 수 없다. 또한, 미생물 계수를 위하여 고안된 헤모사이토미터는, 구조적으로 미생물이 현탁된 용액을 슬라이드에 접종한 후, 그 위에 커버글래스를 덮어 시료를 준비하므로 미생물 현탁 용액의 부피가 정확히 제어되지 않아 오류의 소지가 많다. 직접 계수의 또 다른 형태로는 도말 계수법 (smear counting)이다. 미생물이 현탁된 용액을 슬라이드 글래스 위에 도말하여 건조시킨 후, 염색하지 않고 현미경으로 관찰하거나 특정 방법으로 염색한 후 현미경으로 관찰하여 미생물을 계수하는 방법이다. 그러나 이 방법은 미생물이 현탁된 용액의 부피가 정확히 제어되지 않고, 앞서 언급한 현미경적 방법과 마찬가지의 한계를 갖는다. 또 다른 직접 계수법으로 미생물 현탁용액을 미생물의 크기보다 작은 구멍을 갖는 필터에 적용하여 필터 위에 미생물을 걸러준 후, 이를 형광염색하고 형광 현미경을 이용하여 계수하는 방법이 있다. 이 방법은 미생물 계수의 표준방법으로 인정되고 있는 방법으로서 형광염색을 활용하기 때문에 명시야 현미경 관찰법과 비교하여 그 검출 감도가 높고 생존 미생물과 비생존 미생물을 구분해 낼 수 있는 장점이 있다. 그러나 필터의 구멍 크기와 분포가 균일하지 않고 걸러진 미생물의 분포가 매우 불균일하기 때문에 매우 많은 수의 시야를 확인하여 미생물을 계수해야 하는 단점이 있다 (Seo et al., 2010). 최근 개발된 방법 중 미생물 용액을 챔버를 갖고 있는 디바이스에 넣어 준 후, 전기를 흘려 미생물을 특정 면에 이동시키고 이를 배양하거나 배양하지 않은 상태로 형광염색한 후 형광현미경으로 검출 계수하는 방법이 있다. 그러나 전기를 이용하여 미생물을 특정 면에 이동시키기 위해서는 고가의 장비가 추가로 필요하고, 챔버 안에서 미생물을 배양할 경우 적절한 배양 조건을 미리 알고 있어야 하며, 단일 개체에서 군락이 형성되는 경우와 다수 개체에서 군락이 형성되는 경우를 구분할 수 없다는 단점이 있다. 또한, 전기적 자극이 미생물의 검출에 미치는 영향에 대해서도 면밀히 연구된 바가 없다. 따라서 이러한 종래 방법의 한계를 극복하고 간단하고 정확하게 미생물을 계수하기 위해 시료 내에 있는 미생물의 개체수를 직접 계수할 수 있는 방법의 개발이 끊임없이 요구되고 있다.
오늘날 광학 및 전기/전자 공학이 발달함에 따라, 현미경을 통해 육안으로 세포에 대한 정보 (예를 들면, 세포의 개수, 특정 형태)를 관찰하였던 과거와 달리, 셀 카운터 (cell counter) 장비를 이용하여 자동으로 셀에 대한 정보를 얻고 있다. 전통적인 세포계수방법은 노동 집약적이며 많은 시간이 소요되고, 계수를 위한 격자를 갖는 슬라이드 글래스와 그 위에 덮어주는 커버 글래스가 분리된 형태를 갖고 있는 헤모사이토미터를 이용하기 때문에 미생물 용액의 정확한 부피 제어가 어렵다. 따라서 이로부터 많은 오류가 유발되는 단점을 갖는다. 이와 같은 단점을 극복하기 위하여 최근 1회용 정량 챔버 슬라이드에 세포용액을 적용하고 이를 현미경적 방법으로 이미징한 후 자동으로 세포의 수를 결정하고 그 농도를 계산해주는 자동세포계수기 (automated cell counter)가 다수 개발되어 있다. 그러나 이들 세포계수기는 세포의 크기가 대략 5 ㎛ 이상인 효모 세포나 포유동물 세포를 계수할 목적으로 개발되어 낮은 배율 (보통 4 x 이하)의 대물렌즈를 사용하고 광학 효율이 낮아 세포의 크기가 5 ㎛ 이하인 미생물의 세포 계수에는 활용할 수 없는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명자들은 기존의 미생물 동정, 검출 또는 계수방법에 비해 신속하고 정확하며 편리하게 미생물을 동정, 검출 또는 계수할 수 있는 방법을 발굴하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 형광표지한 미생물 시료를 정량 챔버가 포함된 슬라이드에 적용하고 이를 원심분리하여 슬라이드의 초점면 (focal plane)에 미생물을 밀착시킨 다음, 형광 현미경적 방법으로 형광이미지를 분석하는 경우, 신속하고 정확하며 편리하게 미생물을 동정, 검출 또는 계수할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이와 같이, 본 발명의 목적은 형광 또는 발광 표지, 정량 챔버 슬라이드, 원심분리 수단 및 이미징 수단을 이용하여 미생물을 검출, 동정 또는 계수할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 미생물을 검출, 동정 또는 계수할 수 있는 시스템을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면,
(a) 미생물이 포함된 시료용액과 미생물을 표지할 수 있는 형광 또는 발광 물질을 접촉시키고;
(b) 상기 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액을 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버 (chamber) 내에 주입하며;
(c) 원심분리 수단을 이용하여 상기 정량 챔버가 설치된 슬라이드를 원심분리 하고;
(d) 이미징 수단을 이용하여 상기 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버로부터 형광 또는 발광 이미지를 수득하며; 및
(e) 상기 형광 또는 발광 이미지를 분석하여 상기 시료용액에 포함된 미생물을 검출, 동정 또는 계수하는 것을 포함하여, 미생물을 검출, 동정 또는 계수할 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(a) 미생물이 포함된 시료용액과 미생물을 표지할 수 있는 형광 또는 발광 물질을 접촉
본 발명에서 “미생물이 포함된 시료용액”은 미생물을 액체배지에서 배양한 경우, 미생물을 배양한 액체배지 자체를 의미하며, 미생물을 고체배지에서 배양한 경우, 미생물을 용액에 현탁한 것을 의미한다. 이때 미생물이 포함된 시료용액은 미생물의 농도에 따라 희석하거나 농축하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 “접촉시키는”은 미생물이 포함된 시료용액과 형광 또는 발광물질을 하나의 용기에 넣어 미생물과 형광 또는 발광물질 사이에 반응이 일어날 수 있도록 하는 것을 의미한다. 구체적으로, 미생물이 포함된 시료용액에 형광 또는 발광물질을 첨가하거나 형광 또는 발광물질이 포함된 용액에 미생물이 포함된 시료용액을 첨가할 수 있다.
미생물을 표지하는 방법에는, 발색, 형광 또는 발광물질이 이용될 수 있다. 특히 검출 감도를 높이기 위해서는 형광 또는 발광물질을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 구체적으로, 형광염료로서 생물체의 핵산을 염색할 수 있는 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), SYBR gold, acridine orange (AO), BacLight, MycoLight, SYTO dyes, propidium iodide (PI) 등이 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 생존 미생물을 특이적으로 염색하는 물질로서 티아졸 (thiazole)계 염료를 이용할 수 있다. 구체적으로, 생존 미생물을 특이적으로 염색하기 위해 AO, BacLight, MycoLight, 또는 SYTO dyes 등이 이용할 수 있으며, 비생존 미생물을 특이적으로 염색하기 위해를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 미생물을 표지하는 방법으로 FISH (fluorescence in situ hybridization) 방법을 이용할 수 있다. FISH 방법은 종 (species) 특이적인 핵산 탐침 (nucleic acid probe)을 미생물과 접촉시켜 미생물을 동정하는데 보편적으로 사용되고 있으므로, 이를 이용하면 미생물의 검출, 계수뿐만 아니라 미생물의 동정이 가능하다. 또한, 미생물을 표지하는 방법으로 종 (species) 특이적 항체를 이용할 수 있다. 형광물질이 컨쥬게이션 (conjugation)된 종 특이적인 항체를 미생물과 접촉시켜 특정 항원의 존재 유무를 판독함으로써 미생물을 동정할 수 있다. 또한, 생존 미생물을 검출하기 위하여 발광물질을 이용할 수 있다. 예를 들어, ATP 활성을 루시퍼라아제 (luciferase)를 이용하여 측정함으로써 생존 미생물을 검출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서는, 다양한 미생물을 핵산표지염료인 MycoLight를 이용하여 염색하여 미생물을 검출 및 계수하였다.
한편, 미생물의 생존력 (viability)을 유지하면서 성장을 억제하기 위하여 인산완충용액 (phosphate buffered saline)과 같은 생물학적 완충용액 또는 트리스완충용액 (tris buffered saline) 등을 사용할 수도 있다. 또한, 생물학적 완충용액에는 발광 또는 형광물질의 표지가 효과적으로 이루어질 수 있도록 트리톤 X-100 (Triton X-100), 트읜-20 (Tween-20), 또는 NP-40 등과 같은 비이온성 계면활성제 (non ionic detergent), 또는 EDTA, EGTA 등과 같은 킬레이팅제를 첨가할 수도 있다.
(b) 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액을 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버 내에 주입
본 발명의 정량 챔버는 미생물을 검출, 동정 또는 계수하기 위한 일정한 부피의 시료용액을 주입하기 위한 것으로서 다양한 형태로 제작이 가능하다. 예를 들어, 상판과 하판을 포함하며, 상판과 하판이 결합되어 형성되는 챔버 내부의 높이가 1 내지 200 ㎛가 되도록 제작할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 정량 챔버는 챔버 내부에 수용되는 용액의 부피를 제어할 수 있도록 제작할 수도 있다.
(c) 원심분리 수단을 이용하여 상기 정량 챔버가 설치된 슬라이드를 원심분리
본 발명의 원심분리 수단은 슬라이드를 원심분리하기 위한 것으로서 특정한 기기에 제한되는 것은 아니다. 시판 중인 원심분리기를 이용할 수도 있으며, 별도로 제작한 원심분리기 등을 이용할 수도 있다. 또한, 상기 원심분리는 상기 혼합물이 주입된 정량 챔버의 하판에 수직한 방향으로 원심력이 작용하여 초점면 (focal plane)을 형성시키는 것을 특징으로 하며, 상기 초점면의 형성은 상기 정량 챔버에 주입된 혼합물에 포함된 미생물이 상기 정량 챔버의 하부 표면에 단일층을 형성하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 “초점면 (focal plane)”은 렌즈의 초점이 맞는 범위를 의미한다. 초점면에서는 초점에 세운 광축에 수직인 면을 광축에 따라 이동해도 상이 선명하게 보인다.
(d) 이미징 수단을 이용하여 상기 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버로부터 형광 또는 발광 이미지를 수득
본 발명의 이미징 수단으로는 통상적으로 이용되는 다양한 이미징 장치를 이용할 수 있다. 이후 분석단계의 용이성을 위하여 자동이미징 장치를 이용하는 것이 선호될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 도 6에 나타낸 바와 같은 자동이미징 장치를 이용한다. 하나의 정량 챔버 슬라이드에서 여러 위치의 시야 (field)를 촬영하기 위하여 자동화된 XY stage를 구성하였으며, 각각 하나의 LED, 여기필터 (excitation filter) 및 방사필터 (emission filter)가 구비되었다.
(e) 상기 형광 또는 발광 이미지를 분석하여 상기 시료용액에 포함된 미생물을 검출, 동정 또는 계수
형광 또는 발광 이미지를 분석하기 위해서는 통상적으로 이용되는 다양한 분석 방법을 이용할 수 있다. 분석의 편리성을 위해 영상분석 소프트웨어를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 미생물을 계수하기 위하여 형광물질로 미생물을 표지한 다음, 자동이미징 장치를 이용하여 형광이미지를 획득하고, 자체 제작한 영상분석 소프트웨어로 프로세싱한 후, 형광신호를 내는 입자들의 수를 계수하여 단위 부피당 미생물의 수를 얻을 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 단계 (a)의 다음단계로서 상기 단계 (a)의 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액과 로딩버퍼 (loading buffer)를 혼합하는 단계를 추가하고, 상기 단계 (b)의 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액 대신 상기 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액과 로딩버퍼의 혼합물을 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버 (chamber) 내에 주입하는 것으로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 “로딩버퍼”는 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액을 챔버 내에 주입하고 원심분리하는 과정에서 시료의 증발이나 외부 압력의 변화에 따른 상 (phase) 변화를 방지하기 위하여 사용하는 버퍼를 의미한다. 정량 챔버 슬라이드에 주입되는 시료의 양은 수 십 ㎕ 이내의 미량이므로, 정량 챔버에 시료를 주입한 후 시료의 증발이나 외부 압력의 변화에 따른 상 변화를 억제하기 위해서는 별도의 로딩버퍼가 필요하다. 또한, 정량 챔버 슬라이드를 원심분리한 후 형성된 특정 초점면이 물리적인 자극에 의해 변형되지 않고 유지되도록 하기 위해서도 로딩버퍼가 필요하다. 이와 같은 목적을 위하여 수용액보다 점도가 높고 비등점이 높은 액체를 사용할 수 있다. 구체적으로 DMSO (dimethyl sulfoxide), 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 과당 시럽 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 예에 따르면, 로딩버퍼로서 글리세롤 또는 DMSO를 사용하는 경우, 글리세롤 또는 DMSO의 농도가 높아질수록 챔버 내의 용액이 증발되는 정도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 다음을 포함하는 미생물 검출, 동정 또는 계수 시스템을 제공한다:
(a) 미생물이 포함된 시료용액을 수용할 수 있는 정량 챔버가 표면에 설치된 슬라이드; 및
(b) 상기 슬라이드를 원심분리 할 수 있는 원심분리 수단.
또한, 상기 시스템은 (c) 상기 슬라이드에 광을 조사하기 위한 광원; (d) 상기 광원에 의해 생성된 이미지를 수득하기 위한 이미징 수단; (e) 상기 이미징 수단에 의해 얻은 이미지로부터 상기 정량 챔버의 일정 부피 내 미생물을 검출, 동정 또는 계수하는 이미지 프로세서; 및 (f) 상기 미생물을 검출, 동정 또는 계수한 결과를 표시하는 디스플레이 수단을 추가적으로 포함하여 이루어질 수 있다.
또한, 상기 시스템은 상기 미생물을 표지할 수 있는 형광 또는 발광 물질을 추가적으로 포함하여 이루어질 수 있다.
또한, 상기 시스템은 상기 시료용액을 상기 정량 챔버에 적용하는 데 이용되는 로딩버퍼를 추가적으로 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 시스템은 상기 설명한 본 발명의 방법을 구현하기 위한 시스템으로서 구체적인 내용은 상기 방법에서 기술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
이와 같이, 본 발명은 원심분리 수단과 이미징 수단을 이용하여 미생물을 검출, 동정 또는 계수할 수 있는 방법 및 이를 이용한 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면, 신속하고 정확하며 편리하게 미생물을 검출, 동정 또는 계수할 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법에 대한 개요도이다.
도 2는 핵산 표지 형광염료로 다양한 미생물을 염색한 후 형광 이미징한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 정량 챔버 슬라이드의 챔버에 주입된 용액의 시간에 따른 증발 정도를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 원심분리하지 않고 세포를 이미징한 결과와 원심분리한 후 세포를 이미징한 결과를 비교해서 보여주는 사진이다.
도 5는 100 ㎛의 챔버 슬라이에 대장균을 각각 1:10, 1:20, 및 1:100으로 희석하여 로딩한 다음, 원심분리하여 관찰한 결과이다.
도 6은 100 ㎛의 챔버 슬라이에 대장균을 각각 1:10, 1:20, 및 1:100으로 희석하여 로딩한 다음, 원심분리하지 않고 관찰한 결과이다.
도 7는 세포 이미징 시스템의 개요도이다.
도 8은 다수의 시야를 세포 이미징 시스템으로 획득한 이미징 결과를 보여주는 사진이다.
도 9은 본 발명의 방법으로 박테리아를 계수한 결과와 평판도말법으로 계수한 결과를 비교한 도표이다.
이하, 본 발명의 미생물을 동정, 검출 및 계수하기 위한 방법 및 이를 이용한 시스템을 도면을 참고하여 상세히 설명하면 다음과 같으며, 다음에서 설명되는 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 형광물질을 이용한 미생물의 표지
E. coli 등 다양한 미생물을 표지하기 위해 미생물을 핵산표지염료인 MycoLight (ATT Bioquest, 미국)를 이용하여 염색하였다. 미생물을 Dulbecco's 인산완충식염수 (Posphate-Buffered Saline) (DPBS) 용액에 1:2 내지 1:100 등 다양한 비율로 희석하여 현탁시킨 다음, 미생물이 현탁된 용액을 MycoLight와 접촉시키고 5분 내지 30분간 반응시켜 미생물의 DNA가 MycoLight에 의해 표지되도록 하였다. 반응 완충액으로 2.5 X PET (2.5 X PBS중에 2.5 mM EDTA 및 0.025 % Tween-20) 또는 1 X DPBS를 사용하였다. 도 2는 이와 같이 MycoLight와 접촉시켜 형광 표지된 다양한 미생물의 형광 사진을 나타내고 있다.
실시예 2: 로딩버퍼의 조성 결정
정량 챔버 슬라이드에 적용되는 시료의 양은 수 십 마이크로리터 이내로 미량이므로, 정량 챔버에 시료를 주입한 후 시료의 증발이나 외부 압력의 변화에 따른 상 변화를 억제하기 위하여서는 별도의 로딩버퍼가 필요하다. 또한, 정량 챔버 슬라이드를 원심분리한 후 형성된 특정 초점면이 물리적인 자극에 의해 변형되지 않고 유지되도록 하기 위해서도 로딩버퍼가 필요하다. 이와 같은 목적을 위하여 수용액보다 점도가 높고 비등점이 높은 글리세롤 (삼전순약(주), 한국), DMSO (Sigma, 미국) 또는 X-clarity mounting solution (이하, M/S, (주)로고스바이오시스템스) 를 로딩버퍼로 사용하기 위해 시험하였다. 도 3은 다양한 농도의 글리세롤을 포함하는 용액을 100 ㎛ 높이의 챔버를 갖는 정량 챔버 슬라이드의 챔버에 주입한 다음, 상온에 방치하여 시간별로 용액이 증발되는 정도를 관찰한 것이다. 용액의 증발 정도를 쉽게 관찰하기 위하여 주입된 용액에는 글리세롤과 함께 청색을 띄는 트립판 블루 염료 (Life Technologies, 미국)를 첨가하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 글리세롤의 농도가 높아질수록 챔버 내의 용액이 증발되는 정도가 현저히 감소함을 확인하였다. 물보다 비등점이 높은 DMSO 역시 유사한 효과를 보였다. 이와 같이 비등점이 높은 첨가물에 의해 챔버 내의 용액이 증발되는 것이 방지되는 조건은 원심분리 전후의 시료 취급시 또는 원심분리 중에 일어나는 시료의 증발을 현저히 억제하였다. 실험결과 로딩버퍼로서 80 v/v% M/S 및 40 v/v% 글리세롤 (최종 농도)을 사용할 수 있으며, 원심분리는 100 RCF로 10분간 수행하는 것으로 충분하였다.
실시예 3: 슬라이드의 원심분리
슬라이드를 원심분리하여 효과적으로 초점면이 형성되도록 하기 위하여 시료 내에 첨가되는 로딩버퍼의 종류 및 농도, 원심분리시 정량 챔버 슬라이드의 자세 (posture), 원심분리시 회전수와 시간 등을 시험하였다. 도 4는 대장균 세포 (E.coli DH5α)를 핵산을 염색하는 MycoLight 시약으로 염색한 다음, 글리세롤 로딩버퍼와 혼합하고, 혼합액 2.5 ㎕를 정량 챔버에 주입한 후, 원심분리한 슬라이드와 원심분리하지 않은 슬라이드를 형광 이미징하여 비교한 사진이다. 원심분리는 500 RCF로 30초간 수행하였다. 원심력은 정량 챔버 슬라이드의 바닥면에 수직인 방향으로 작용하도록 하였다. 10 X 대물렌즈가 장착된 디지털 형광 현미경 (iRiS (상표명), (주)로고스바이오시스템스)으로 이미징하고 분석한 결과, 원심분리를 수행하지 않은 경우, 세포들이 동일 초점면에 모여 있지 않았기 때문에 특정 초점면에서 모든 세포들을 이미징할 수 없었으며 다수의 세포들이 초점되지 않은 상태로 이미징되었다. 그러나 원심분리를 수행한 경우, 거의 모든 세포들이 단일한 초점면에 모여 있었으며 특정 초점면에서 거의 모든 세포들을 이미징할 수 있었다.
챔버 슬라이드의 높이 (20 ㎛ 및 100 ㎛), 로딩버퍼의 종류 (PBS 및 글리세롤) 및 원심분리속도 (40 RCF 및 900 RCF)를 각각 달리한 후, 세포의 쏠림현상, 초점면 형성 및 초점면 편차, 및 세포 움직임을 관찰하였다. 완충액은 대장균 20 ㎕, MycoLight 4 ㎕, 및 2.5 X PET 16 ㎕를 혼합한 후 80% 글리세롤 40 ㎕를 가하여 반응시킨 것; 및 대장균 20 ㎕, MycoLight 4 ㎕, 및 DPBS 56 ㎕를 반응시킨 것을 제조하여 이용하였다. 슬라이드 높이가 낮은 경우 원심분리 후 샘플 뭉침 현상이 나타났으며, 100 ㎛ 높이의 챔버 슬라이드, 40 RCF, 및 글리세롤 조건에서는 샘플 중 약 80%의 대장균 가라앉고 큰 초점면 편차 (32 ㎛)가 형성되었다. PBS는 경우 20 ㎛ 슬라이드에서 원심분리 전부터 마르기 시작하였다. 아래 표 1은 그 결과를 나타낸다.
또한, 상기에서 글리세롤을 가하여 반응시킨 것을, 100 ㎛ 높이의 챔버 슬라이드에 옮기고, 각각 50, 100, 200 및 400 RCF로 10분간 원심분리한 후 분석하였다. 아래 표 2는 그 결과를 나타낸 것이다. 100 RCF이상에서 샘플이 90% 이상 가라앉았고, 유입구 (inlet)에서의 쏠림현상은 100 RCF부터 나타나기 시작하였다.
Slide depth Centrifuge speed 40 RCF 900 RCF
Loading buffer PBS Glycerol PBS Glycerol
20 μm 쏠림 현상 보통 없음 있음 있음
Focal plane편차 없음 없음 없음 없음
샘플 움직임 보통 없음 보통 없음
100 μm 쏠림 현상 보통 없음 있음 있음
Focal plane편차 없음 있음 없음 없음
샘플 움직임 있음 없음 보통 없음
RCF Focal plane편차(Z-axis) 쏠림 현상(inlet) 쏠림 현상(outlet) 중앙부와 가장자리 분포 편차
0 91.2μm - - -
50 55.13μm 없음 약간 있음 없음
100 18.97μm 약간 있음 있음 약간 있음
200 9.23μm 있음 있음 있음
400 8.35μm 있음 있음 있음
100 ㎛ 높이의 챔버 슬라이드, DMSO에 MycoLight 200 μM이 용해된 염색시약 (AAT Bioquest Cat #24001, Lot # 106137), 2.5 X 반응완충액 (2.5 X PET) (2.5 mM EDTA 및 0.025% 트윈-20을 2.5 X PBS에 용해), 80% 글리세롤, 및 iRiS TC PlanFluor ((주)로고스바이오시스템스)를 사용하였다. DPBS에 대장균을 1:10, 1:20, 및 1:100으로 희석하였다. 미생물 10 ㎛, 염색시약 2 ㎕, 및 2.5 X PET를 ㅂd응시켰다. 30분 반응시킨 후, 반응 혼합물에 로딩버퍼 20 ㎕를 가하였다, 제조된 샘플을 챔버 슬라이드로 옮긴 후, 원심분리 전후를 비교하였다, 도 5 및 도 6은 그 결과를 나타낸 것이다. 원심분리 하지 않은 이미지 (도 6)와 비교하여 원심분리한 경우 (도 5) 초점면이 고르게 형성된 것을 확인 할 수 있다. 또한, 원심분리 후 샘플이 쏠리는 현상을 원심분리속도를 200, 400, 600 및 800 RCF로 달리하면서 확인하였다. 또한, 샘플내 미생물의 침전을 원심분리속도를 낮춰가면서 분석하였다. 상기에서 대장균을 1:10 희석한 것을 사용하였으며, 챔버 슬라이드를 각각 40, 50, 및 100 RCF로 10분간 원심분리하고 그 결과를 비교하였다. 아래 표 2은 초점면 편자를 나타낸 것이다.
RCF 초점면 (focal plane) 편차 (Z-axis)
40 9.18 ㎛
50 7.78 ㎛
100 4.43 ㎛
실시예 4: 형광이미지의 획득 및 분석
형광이미징을 얻기 위해 도 7과 같은 자동이미징 장치를 구성하였다. 하나의 정량 챔버 슬라이드에서 여러 위치의 시야를 촬영하기 위하여 자동화된 XY 스테이지 (stage)를 구성하였으며, 각각 하나의 LED, 여기필터 및 (excitation filter) 및 방사필터 (emission filter)가 구비되도록 하였다. 이와 같이 구성된 자동이미징 장치를 이용하여 상기 실시예 3의 방법으로 원심분리한 슬라이드의 영상을 수득하였다 (도 8). 자동으로 수득한 영상을 영상분석 소프트웨어 ((주)로고스바이오스템스, 대한민국)로 프로세싱한 후, 형광신호를 내는 입자들의 수를 계수하여, 단위 부피당 미생물의 수를 계산하였다. 이와 같이 본 발명의 방법으로 미생물을 계수한 결과와 기존의 미생물 계수방법인 평판도말법으로 미생물을 계수한 결과를 비교하여 분석하였다 (도 9). 도 9에서 DC는 영상분석 소프트웨어를 이용하여 계수한 세포수를 단위 부피 ㎖당 농도로 환산한 결과이고, CFU (colony forming unit)은 평판도말 배양에서 형성된 군락의 수를 단위 부피 mL당 군락을 형성할 수 있는 세포의 농도로 환산한 결과이다. 상관관계 (Corr: correlation)는 DC (D)를 CFU (C)로 나누어준 값이다. 분석결과, 본 발명에 의한 미생물의 계수방법과 평판도말법에 의한 계수방법이 높은 상관관계를 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 로딩버퍼에 따라 차이가 있으나, 챔버 슬라이드의 높이가 낮은 경우 염색구배 (dye gradient)가 형성되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다.
본 발명은 세균과 같은 작은 크기의 미생물을 검출, 계수, 및 동정에 폭넓게 활용될 수 있으므로, 다양한 분야의 미생물 이용될 수 있다.

Claims (24)

  1. 다음의 단계를 포함하는 미생물 검출, 동정 또는 계수방법:
    (a) 미생물이 포함된 시료용액과 미생물을 표지할 수 있는 형광 또는 발광 물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액을 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버 (chamber) 내에 주입하는 단계;
    (c) 원심분리 수단을 이용하여 상기 정량 챔버가 설치된 슬라이드를 원심분리 하는 단계;
    (d) 이미징 수단을 이용하여 상기 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버로부터 형광 또는 발광 이미지를 수득하는 단계; 및
    (e) 상기 형광 또는 발광 이미지를 분석하여 상기 시료용액에 포함된 미생물을 검출, 동정 또는 계수하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 형광 또는 발광 물질은 미생물의 핵산을 표지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 형광 또는 발광 물질은 생존 미생물의 활성을 표지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 형광 또는 발광 물질은 항체에 컨쥬게이션(conjugation)된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 항체는 미생물 특이적 항원을 표지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 정량 챔버는 상판과 하판을 포함하며, 상판과 하판이 결합되어 형성되는 챔버 내부의 높이가 1 내지 200 ㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 정량 챔버는 챔버 내부에 수용되는 용액의 부피를 제어할 수 있는 챔버인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 원심분리는 상기 혼합물이 주입된 정량 챔버의 하판에 수직한 방향으로 원심력이 작용하여 초점면 (focal plane)을 형성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 초점면의 형성은 상기 정량 챔버에 주입된 혼합물에 포함된 미생물이 상기 정량 챔버의 하부 표면에 단일층을 형성하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 다음단계로서 상기 단계 (a)의 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액과 로딩버퍼 (loading buffer)를 혼합하는 단계를 더 포함하고, 상기 단계 (b)의 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액 대신 상기 형광 또는 발광물질과 접촉된 시료용액과 로딩버퍼의 혼합물을 슬라이드 표면에 설치된 정량 챔버 (chamber) 내에 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 로딩버퍼는 물보다 비등점이 높은 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 물질은 글리세롤, DMSO, 과당 시럽, 또는 폴리에틸렌글리콜 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 미생물 검출, 동정 또는 계수는 그 중 두 가지 이상이 동시에 이루어지는 것이 가능한 방법.
  14. 다음을 포함하는 미생물 검출, 동정 또는 계수 시스템:
    (a) 미생물이 포함된 시료용액을 수용할 수 있는 정량 챔버가 표면에 설치된 슬라이드; 및
    (b) 상기 슬라이드를 원심분리 할 수 있는 원심분리 수단.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 시스템은 (c) 상기 슬라이드에 광을 조사하기 위한 광원; (d) 상기 광원에 의해 생성된 이미지를 수득하기 위한 이미징 수단; (e) 상기 이미징 수단에 의해 얻은 이미지로부터 상기 정량 챔버의 일정 부피 내 미생물을 검출, 동정 또는 계수하는 이미지 프로세서; 및 (f) 상기 미생물을 검출, 동정 또는 계수한 결과를 표시하는 디스플레이 수단을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 시스템은 상기 미생물을 표지할 수 있는 형광 또는 발광 물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 시스템은 상기 시료용액을 상기 정량 챔버에 적용하는 데 이용되는 로딩버퍼 (loading buffer)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  18. 제 17항에 있어서, 상기로딩버퍼는 물보다 비등점이 높은 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 물질은 글리세롤, DMSO, 과당 시럽, 또는 폴리에틸렌글리콜 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 14항에 있어서, 상기 정량 챔버는 상판과 하판을 포함하며, 상판과 하판이 결합되어 형성되는 챔버 내부의 높이가 1 내지 200 ㎛인 것을 특징으로 하는 시스템.
  21. 제 14항에 있어서, 상기 정량 챔버는 챔버 내부에 수용되는 용액의 부피를 제어할 수 있는 챔버인 것을 특징으로 하는 시스템.
  22. 제 14 항에 있어서, 상기 원심분리는 상기 혼합물이 주입된 정량 챔버의 하판에 수직한 방향으로 원심력이 작용하여 초점면(focal plane)을 형성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 초점면의 형성은 상기 정량 챔버에 주입된 혼합물에 포함된 미생물이 상기 정량 챔버의 하부 표면에 단일층을 형성하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 시스템.
  24. 제 14항에 있어서, 미생물 검출, 동정 또는 계수는 그 중 두 가지 이상이 동시에 이루어지는 것이 가능한 시스템.
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