CN117825130A - 结核杆菌抗酸染色标准片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种结核杆菌抗酸染色标准片及其制备方法和应用。所述标准片包括玻片和涂覆于所述玻片上的检测层，所述检测层包括灭活鸟分支杆菌、细胞模拟成分和人工痰液。该标准片的制备方法包括以下步骤：S1、配置梯度灭活鸟分支杆菌液；S2、取动物白细胞和支气管细胞，配置细胞悬浊液；S3、配置人工痰液；S4、将灭活鸟分支杆菌和细胞悬浊液滴至玻片中央，再将人工痰液涂抹至玻片上，并通过人工痰液将灭活鸟分支杆菌和细胞悬浊液均匀抹开，烘干后，得到所述结核杆菌抗酸染色标准片。本发明制备的标准片可以在玻片的表面形成类似人体肺部组织和肺部菌落的形态，与实际较为贴合，且结核杆菌分散均匀，有助于提升质量控制的效果。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种结核杆菌抗酸染色标准片及其制备方法和应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引发的慢性传染病，以肺结核最为常见。肺结核的诊断依赖于病原学、流行病学、临床表现、胸部影像、免疫学等相关辅助检查及鉴别诊断。其中，病原学检测结果，特别是痰涂片镜检，是确诊结核病的关键依据，抗酸染色是检测结核病病原学证据的主要手段。
然而，抗酸染色检检测过程中涉及多个复杂步骤，包括石碳酸复红染液染色、流水冲洗、脱色剂处理、亚甲蓝液复染等，此检测过程容易受到温湿度、浓度、批间差和人员操作等原因的影响，从而导致结果出现偏差。为确保检测结果的准确性，使用标准片进行质量控制和监测是不可或缺的。
目前，大部分医院的检测科常选用肺结核病人体内提取的痰液来支撑标准对照片，但是，这种来源于患者的痰液成分复杂且结果不稳定。此外，作为标准片，其存在一定的个体差异，且来源不稳定。另外，使用患者的痰液用于制作标准片还存在理论以及法律归属权的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种结核杆菌抗酸染色标准片及其制备方法和应用，以灭活鸟分支杆菌、细胞模拟成分以及人工痰液为对象，制备成结核杆菌抗酸染色标准片，解决了上述背景技术中提出的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
根据本发明的第一方面，提供了一种结核杆菌抗酸染色标准片，包括玻片和涂覆于所述玻片上的检测层，所述检测层包括灭活鸟分支杆菌、细胞模拟成分和人工痰液。
本发明提供的结核杆菌抗酸染色标准片，通过灭活鸟分支杆菌和细胞模拟成分，可以在玻片上形成类似人体肺部组织和肺部正常菌群的形态，与直接从人体内提取的样本较为类似，因此在实际质量检测过程中，本发明的标准片为检验室/实验室提供模拟度高，检测层视野清晰、各等级标准片结果稳定的标准片，保证实验结果的可靠性。同时，灭活鸟分支杆菌的形态一致性好，能够长久的保存，可明显降低因标准片问题而导致实验结果的偏差问题。
此外，本发明选择灭活鸟分支杆菌可进行大批量的培养，在制备前进行灭活预处理，不会造成生物危害，形态大小易于观察和判别，菌之间不会出现聚集的情况。然而环境分枝杆菌虽然易获取，但较难提取和分离，而卡介苗是由减毒的牛型结核分枝杆菌悬浮液制成的活菌，作为一种疫苗难于获取，且卡介苗中的活菌易聚集，影响操作者的判读阅片，对结果的影响较大。
优选的，所述细胞模拟成分包括含有动物白细胞和支气管细胞的细胞悬浊液。
本发明采用动物白细胞和支气管细胞，不会有人来源，也不会有伦理风险，易于商业化。来源成本低，可大规模生产。
根据本发明的第二方面，提供了一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，包括以下步骤：
S1、培养标定浓度的鸟分支杆菌，灭活后按等级要求进行梯度稀释，得到灭活鸟分支杆菌；
S2、取动物白细胞和支气管细胞，离心得到细胞悬浊液；
S3、将鸭蛋清加入含有淀粉基质的水溶液中混合均匀，得到人工痰液；
S4、将灭活鸟分支杆菌和细胞悬浊液滴至玻片中央，再将人工痰液涂抹至玻片上，并通过人工痰液将灭活鸟分支杆菌和细胞悬浊液均匀抹开，烘干后，得到所述结核杆菌抗酸染色标准片。
优选的，步骤S1中，所述鸟分支杆菌的标定浓度为3.0×108细菌数/mL。
优选的，步骤S2中，所述动物白细胞与所述支气管细胞的体积比为1:1。
优选的，步骤S3中，所述淀粉基质包括嫩肉淀粉和玉米淀粉。
优选的，步骤S3中，所述嫩肉淀粉与玉米淀粉的质量比为1:0.6～1。
优选的，步骤S3中，所述鸭蛋清与所述含有淀粉基质的水溶液的质量比为1:15～25；
所述含有淀粉基质的水溶液的质量浓度为3.0wt％～3.6wt％。
优选的，步骤S4中，所述烘干的温度为75～95℃。
根据本发明的第三方面，提供了一种结核杆菌抗酸染色标准片或根据上述制备方法得到的结核杆菌抗酸染色标准片在室间质控或室内质控中的应用。
(三)有益效果
本发明提供了一种结核杆菌抗酸染色标准片及其制备方法和应用。具备以下有益效果：
1、本方案提供的结核杆菌抗酸染色标准片，采用灭活鸟分枝杆菌和细胞模拟成分，来源稳定，可为检验室/实验室提供模拟度高，检测层视野清晰、各等级标准片结果稳定的标准片，保证实验结果的可靠性。同时，灭活鸟分支杆菌的形态一致性好，能够长久的保存，可明显降低因标准片问题而导致实验结果的偏差问题。
2、本方案提供的结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，能够得到(0、1+、2+、3+、4+)等级结果以及(阴性、阳性)对照结果，制备的标准片质量稳定，一致性好。
3、本方案提供的结核杆菌抗酸染色标准片在应用于室间质控或室内质控的过程中，可保证报告准确，并且有利于实验室尽快找到和分析出现结果差异的原因，开展有效的整改活动。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的结核杆菌抗酸染色标准片的结构示意图；
图2为本发明实施例1制备的0等级的室间质控结核杆菌抗酸染色标准片的镜检示意图；
图3为本发明实施例1制备的1+等级的室间质控结核杆菌抗酸染色标准片的镜检示意图；
图4为本发明实施例1制备的2+等级的室间质控结核杆菌抗酸染色标准片的镜检示意图；
图5为本发明实施例1制备的3+等级的室间质控结核杆菌抗酸染色标准片的镜检示意图；
图6为本发明实施例1制备的4+等级的室间质控结核杆菌抗酸染色标准片的镜检示意图；
图7为本发明实施例1制备的阴性室内质控结核杆菌抗酸染色标准片的镜检示意图；
图8为本发明实施例1制备的阳性质室内控结核杆菌抗酸染色标准片的镜检示意图。
具体实施方式
为了更好的说明阐述本发明的内容，下面结合具体实施例进行展开说明。
实施例1
本实施例的结核杆菌抗酸染色标准片的制备，包括以下步骤：
步骤一、培养鸟分支杆菌菌株；
将鸟分支杆菌种到Middlebrook 7H9/OADC液体培养基中，在37℃下培养15天至对数生长期，使用麦氏比浊仪测定菌液的浊度，以确菌株的生长情况，将鸟分支杆菌培养物离心、去上清，用PBS洗涤两次，以去除培养基中的杂质，再用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液重悬并稀释鸟分支杆菌培养物，调整菌液浓度为1×108CFU/mL。使用自动化分枝杆菌的培养系统，通过仪器检测鸟分支杆菌生产过程中产生的化学信号变化，自动检测结果。接种后，先于固体培养基中培养4周得阳性报告，再于液体培养基内培养2周出阳性报告，最后将鸟分支杆菌的浓度控制在3.0×108细菌数/mL，灭活后待用。
步骤二、进行菌分级梯度的稀释和确定；
取200μL标定浓度为3.0×108细菌数/mL的菌悬液，用1800μL的纯水进行稀释，得到稀释10倍的菌悬液A；
(1)室内质控结核杆菌抗酸染色标准片的等级所对应的菌稀释梯度；
阴性：10mL蒸馏水；
阳性：取0.5mL的菌悬液A与9.5mL的蒸馏水混合，得到稀释200倍的菌悬液B；
(2)室间质控结核杆菌抗酸染色标准片的等级所对应的菌稀释梯度；
(4+)取1mL的菌悬液A与9mL的蒸馏水混合，得到稀释100倍的菌悬液C；
(3+)取2mL的菌悬液B与8mL的蒸馏水混合，得到稀释500倍的菌悬液D；
(2+)取1mL的菌悬液B与9mL的蒸馏水混合，得到稀释1000倍的菌悬液E；
(1+)取1mL的菌悬液E与9mL的蒸馏水混合，得到稀释10000倍的菌悬液F；
(0)10mL蒸馏水。
步骤三、提取相关细胞系；
取动物血液提取的白细胞和羊支气管上皮细胞在3000转/min的条件下进行离心，去上清液，再加入水打散再次离心，去上清液，然后再加入5mL的水打散，得到细胞悬浊液，其中动物包细胞与羊支气管上皮细胞的臂力为1:1。
步骤四、配置人工痰液；
取1.8g的嫩肉淀粉和1.2g的玉米淀粉加入100mL的蒸馏水中加热至90℃搅拌30min，冷却后再加入5mL的鸭蛋清，用涡旋仪摇匀，得到人工痰液。
步骤五、标准片的制备；
取10μL的细胞悬浊液滴至玻片中央，再取10μL的灭火鸟分支杆菌滴至玻片的中央，最后取30μL的人工痰液进行滴加，使用竹签的茬端按照从内到外，再从外到内的顺序匀速的涂覆30s。将制备好的标准片平放于热平板上50℃烘干1h，得到所述结核杆菌抗酸染色标准片，如图1所示。
将实施例制备的室内质控结核杆菌抗酸染色标准片和室间质控结核杆菌抗菌染色标准片分别进行抗酸染色，包括以下步骤：
1、初染：将石碳酸复红染液盖满痰膜，室温保持染色25min，或者在60℃下染色5min；
2、水洗：通过流水冲洗玻片上的染色液，并沥去标准片上剩余的水；
3、脱色：在痰膜上端外缘滴加3％的盐酸乙醇分化液，直至盖满玻片，脱色1min，至痰膜上无可视红色；
4、水洗：通过流水冲洗玻片上的盐酸乙醇分化液，，并沥去标准片上剩余的水；
5、复染：滴加亚甲蓝复染液，染色1min；
6、水洗：通过流水冲洗玻片上的亚甲蓝复染液，然后沥去标准片上剩余的水，待玻片干燥后镜检；
7、镜检：在玻片的痰膜上滴1～2滴镜油，使用100×油镜进行细致观察，应避免油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈紫红色，其他细菌和细胞呈蓝色。
不同阳性等级的室间质控结核杆菌抗酸染色标准片的抗酸染色结果如表1所示：
表1
阴性/阳性的室内质控结核杆菌抗酸染色标准片的抗酸染色结果，如表2所示：
表2
根据表1和表2可知，本发明制备的结核杆菌抗酸染色标准片染色结果明确且性质稳定，抗酸杆菌的梳理在室内质控/室间质控的判读标准范围内，符合《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》要求的程序，能与临床待检测的样本进行平行前处理，对整个检测过程、试剂、设备、交叉污染等环节能进行更好的质量控制，从而保证检验报告的准确发出，能对不合格的实验室开展有效的整改活动。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种结核杆菌抗酸染色标准片，其特征在于：包括玻片和涂覆于所述玻片上的检测层，所述检测层包括灭活鸟分支杆菌、细胞模拟成分和人工痰液。
2.根据权利要求1所述的一种结核杆菌抗酸染色标准片，其特征在于：所述细胞模拟成分包括含有动物白细胞和支气管细胞的细胞悬浊液。
3.一种如权利要求1或2所述的一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、培养标定浓度的鸟分支杆菌，灭活后按等级要求进行梯度稀释，得到灭活鸟分支杆菌；
S2、取动物白细胞和支气管细胞，离心得到细胞悬浊液；
S3、将鸭蛋清加入含有淀粉基质的水溶液中混合均匀，得到人工痰液；
S4、将灭活鸟分支杆菌和细胞悬浊液滴至玻片中央，再将人工痰液涂抹至玻片上，并通过人工痰液将灭活鸟分支杆菌和细胞悬浊液均匀抹开，烘干后，得到所述结核杆菌抗酸染色标准片。
4.根据权利要求3所述的一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述鸟分支杆菌的标定浓度为3.0×108细菌数/mL。
5.根据权利要求3所述的一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述动物白细胞与所述支气管细胞的体积比为1:1。
6.根据权利要求3所述的一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述淀粉基质包括嫩肉淀粉和玉米淀粉。
7.根据权利要求6述的一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述嫩肉淀粉与玉米淀粉的质量比为1:0.6～1。
8.根据权利要求3所述的一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述鸭蛋清与所述含有淀粉基质的水溶液的质量比为1:15～25；
所述含有淀粉基质的水溶液的质量浓度为3.0wt％～3.6wt％。
9.根据权利要求3所述的一种结核杆菌抗酸染色标准片的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述烘干的温度为75～95℃。
10.一种权利要求1或2所述的结核杆菌抗酸染色标准片或根据权利要去3至9任意一项所述的制备方法得到的结核杆菌抗酸染色标准片在室间质控或室内质控中的应用。
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