ES2966679T3 - Métodos y composiciones para mejorar la detección de microorganismos - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un método y medios para la detección y cuantificación rápida de microorganismos vivos y recuperados específicos en una muestra, que comprende etapas de poner en contacto la muestra con un cóctel de detección, el cóctel de detección comprende: (i) un medio nutritivo que comprende al menos uno de los huéspedes -fracción derivada o factores de crecimiento de células de origen huésped, para el crecimiento selectivo acelerado y la multiplicación de dicho microorganismo; (ii) al menos una molécula marcadora fluorescente para la detección del metabolismo intracelular mediante un sensor, y (iii) al menos un activador metabólico para aumentar específicamente el metabolismo de dicho microorganismo específico y aumentar la concentración intracelular de dicha molécula marcadora fluorescente en dicho microorganismo específico. La rápida detección y cuantificación de microorganismos vivos y recuperados específicos en una muestra se realiza además: (i) midiendo los niveles de gris de intensidad fluorescente de las moléculas marcadoras mediante el sensor, mientras estos niveles de gris se correlacionan con el nivel de metabolismo de dicho microorganismo específico; (ii) determinar el nivel de gris hasta un umbral predeterminado de metabolismo; y (iii) correlacionar además los niveles de gris por encima del umbral predeterminado con la cantidad de dicho microorganismo de alta actividad metabólica recuperado en la muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para mejorar la detección de microorganismos

Campo de invención

La presente invención se refiere generalmente al uso de X-glucurónido, B-galactosa y D-glucosa para aumentar la concentración intracelular de al menos una molécula marcadora fluorescente seleccionada del grupo que consiste en Fluoresceína, Fluoresceína di(p-D-glucurónido), NileRed y CY5 en bacterias coliformes en un método para la detección y cuantificación rápida de bacterias coliformes vivas y recuperadas en una muestra.

Antecedentes de la invención

La contaminación e infección bacteriana es un problema importante para la salud pública, la alimentación, la industria, la bioseguridad ambiental y muchas otras áreas.

Microorganismos en sangre y fluidos estériles: Frecuentemente se obtienen fluidos biológicos humanos de pacientes que presentan síntomas de infección en la zona corporal correspondiente para aislar e identificar el agente etiológico. Este tipo de muestras también se toman para detectar la presencia de microorganismos en pacientes de riesgo que presentan condiciones patológicas particulares (pacientes sometidos a cirugía abdominal, ascitis en pacientes cirróticos, trastornos hematológicos, etc.).

La recuperación de microorganismos de la sangre es crucial para el diagnóstico y tratamiento adecuados de la infección. Para obtener resultados precisos, es necesario maximizar la cantidad de organismos recolectados de una muestra determinada. Esto supone un reto debido a que las concentraciones de organismos patológicos en la sangre varían enormemente. Un ejemplo de este amplio intervalo de concentraciones es el caso de la bacteriemia, una afección en donde hay bacterias viables presentes en la sangre circulante.

El diagnóstico y tratamiento oportunos de la bacteriemia es de gran interés para los profesionales de la salud. Cuando no se diagnostica, la bacteriemia puede provocar el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) y los pacientes suelen tener un alto riesgo de desarrollar sepsis, la principal causa de muerte en pacientes críticamente enfermos en Europa y Estados Unidos.

La sepsis es una afección potencialmente mortal causada por la respuesta inflamatoria sistémica incontrolada a una infección bacteriana, viral o fúngica. La sepsis representa una carga sustancial para la salud. La incidencia de la sepsis y el número de muertes relacionadas con la sepsis están aumentando, debido a una variedad de razones atribuidas al envejecimiento de la población, la creciente longevidad de los pacientes con enfermedades crónicas, las terapias contra el cáncer cada vez más agresivas y el uso cada vez mayor de dispositivos invasivos, como marcapasos, válvulas y desfibriladores cardíacos, y procedimientos para una variedad de afecciones médicas, así como el uso generalizado de antibióticos de amplio espectro, que ha aumentado las tasas de resistencia a los antibióticos y de infecciones fúngicas nosocomiales.

En consecuencia, es necesario desarrollar diagnósticos rápidos y precisos para detectar bacterias en la sangre, la orina y otros líquidos normalmente estériles. Además, la identificación rápida y precisa de la sepsis y sus organismos causantes es un requisito previo para una terapia exitosa. El reconocimiento tardío de la sepsis y la terapia antibiótica inicial inadecuada se asocian con un aumento de la mortalidad y la morbilidad. El estándar de oro actual para el diagnóstico de la sepsis es el cultivo de sangre y otros fluidos o tejidos corporales. Sin embargo, incluso en la sepsis grave, los hemocultivos dan con el microorganismo causante sólo en el 20 al 40 % de los pacientes. Además, se necesitan al menos 24 horas para obtener información preliminar sobre el organismo potencial.

Detección de microorganismos en preparados farmacéuticos:Los métodos tradicionales para garantizar la calidad y detectar cualquier contaminante microbiano en productos intravenosos tardan al menos dos semanas en completarse. Los productos intravenosos preparados en hospitales suelen ser de alto riesgo y tienen una vida útil corta. Esto a veces significa que los resultados microbiológicos de calidad tradicionales sólo están disponibles después de que el producto ha sido administrado al paciente. Como consecuencia de ello, ha habido algunos incidentes mortales en los que se han usado productos intravenosos contaminados.

Detección de patógenos transmitidos por los alimentos: La detección y enumeración de patógenos en los alimentos y en las superficies que entran en contacto con ellos son un componente importante de cualquier programa integrado para garantizar la inocuidad de los alimentos a lo largo de toda la cadena de suministro alimentario. Tanto las autoridades gubernamentales como las empresas alimentarias usan el análisis microbiológico para controlar en todo momento el estado de la contaminación y analizar sus tendencias para detectar riesgos emergentes. Los métodos de cultivo tradicionales para detectar microorganismos en los alimentos pueden ser laboriosos y pueden requerir varios días antes de conocer los resultados. Los productos que se procesan mínimamente tienen una vida útil inherentemente corta, lo que impide el uso de muchos de estos métodos convencionales.

Patógenos transmitidos por el agua: Las enfermedades transmitidas por el agua son una carga mundial, así la morbilidad y la mortalidad causadas por el agua contaminada son enormes y se deben controlar mejorando la seguridad del agua potable.

Las infecciones transmitidas por el agua son causadas por la ingestión, el contacto con gotitas transportadas por el aire o el contacto con agua contaminada por una variedad de más de 1400 especies de agentes infecciosos que incluyen bacterias, virus, hongos protozoos y helmintos, que pueden provocar diarrea, enfermedades gastrointestinales y enfermedades sistemáticas, e incluso la muerte. Se estima que el 3,2 % de las muertes en todo el mundo son atribuibles al agua contaminada causada por un saneamiento e higiene deficientes.

Los métodos de detección desempeñan un papel importante en el seguimiento de la calidad del agua, la vigilancia y la evaluación cuantitativa del riesgo microbiano; así, tienen una gran influencia en la implementación de mejores prácticas para paliar y prevenir amenazas que permitan alcanzar el objetivo de seguridad híd rica.

La contaminación e infección bacteriana es un problema importante para la salud pública, la alimentación, la industria, la bioseguridad ambiental y muchas otras áreas. Sin embargo, los métodos actuales para detectar bacterias en contextos médicos, veterinarios, agrícolas, de procesamiento de alimentos, industriales y otros son lentos, requieren personal o equipo especializado para su ejecución y, a menudo, son costosos. Existe una gran necesidad insatisfecha de tecnologías que puedan proporcionar una detección rápida, sensible y específica de patógenos para permitir programas de seguridad proactivos, convenientes y rápidos que reduzcan los costos y las amenazas a la salud humana.

El Documento de Patente de los EE.UU. de Número US 2005/202518 describe un método para detectar y contar microorganismos en una muestra marcando fluorescentemente el microorganismo concentrado y detectando y analizando la fluorescencia.

El Documento de Patente de los EE.UU. de Número US 2010/062466 describe un medio para la detección y/o identificación de bacterias que comprende un sustrato para una actividad metabólica específica para un grupo de bacterias Gram-negativas.

El Documento de Patente de los EE.UU. de Número US 2007/281291 describe un método para detectar bacterias E. coli en un material de muestra que comprende exponer el medio de inducción a luz de longitud de onda larga y observar la fluorescencia que indica la presencia de E. coli.

El Documento de Patente de Europa de Número EP 0254 771 describe un medio específico para combinación con una muestra de espécimen para determinar la presencia o ausencia de un microbio objetivo en la muestra de espécimen.

El Documento de Patente de Número WO 89/04372 describe un proceso para analizar, en un breve período de tiempo, una concentración diluida de microorganismos patógenos vivos en una muestra de producto para consumo humano.

El Documento de Patente de Número WO 2016/210436 describe un medio selectivo para Salmonella que comprende fructosa-asparagina como fuente de nutrientes, y un método para seleccionar una cepa bacteriana aislada que puede usar fructosa-asparagina como fuente de nutrientes.

El Documento de Patente de Número WO 2005/012555 describe una disolución de inducción que proporciona una detección rápida de coliformes, capaz de inducir, en ausencia de crecimiento celular, la expresión de las enzimas inducibles p-glucuronidasa y p-galactosidasa.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Concentración intracelular de la molécula marcadora del metabolismo celular como resultado de la influencia de activadores del metabolismo (Esquema)

Las ilustraciones muestran el efecto de la recuperación bacteriana o de los estimuladores/activadores del metabolismo sobre las concentraciones de tintes de moléculas marcadoras en varias células: Los tintes de las moléculas marcadoras aumentan su concentración (óvalos blancos grandes) en células recuperables con metabolismo aumentado (B). La concentración es baja (óvalos blancos pequeños) en células no recuperables (A; B y C): En microorganismos que no crecen y anabióticos que tienen un bajo nivel de metabolismo, los colorantes permanecen confinados en el espacio extracelular. Luego se recuperan las células que están marcadas con marcadores (óvalos patrón) para la identificación de especies mediante tinción fluorescente doble y estudio por imágenes (C).

Figura 2: Morfología de bacteriascoliformesde la prueba.

Figura 3: Se observó la concentración intracelular de los marcadores del metabolismo celular en cultivos deColiformesTotales (A) yPs. aeruginosa(B) recuperados/metabolismo activado. Se observó una concentración de marcadores significativamente baja enColiformes(C) yA. hidrofiliasometidas a shock metabólico tratadas con activadores inespecíficos.

Figura 4: Definición de contaminación inicial de la muestra.

Se trazan los recuentos bacterianos realizados mediante el método de recuento de heterótrofos en placa (normalizado a un volumen de 1 ml, Eje Y) y mediante el nuevo método (recuento bruto, Eje X) paraE. coli(A);Ps. aeruginosa(B) y bacterias heterótrofas totales (C) para obtener las líneas de tendencia y las ecuaciones. Este proceso reveló fórmulas para calcular los recuentos de contaminación inicial.

Figura 5: Correlación de recuentos microbianos entre los métodos de prueba y el convencional.

En la mayoría de los casos, la correlación entre el nuevo método y el convencional se define en aproximadamente el 90 %. Las correlaciones se probaron mediante recuentos deE. coli(rombo), dePs.aeruginosa(cuadrado) y de bacterias heterótrofas totales (triángulo).

Los ejes X e Y representan el número de la serie experimental [h] y la correlación numérica de la correlación [%], respectivamente.

Figura 6: Los medios que contienen activadores del crecimiento permiten comenzar la detección bacteriana entre un 20 y un 80 % antes que los medios de cultivo estándar. La línea horizontal sólida indica los niveles de contaminación bacteriana específica que son suficientes para una detección y enumeración microbiana confiable mediante la nueva tecnología.

Las líneas en el gráfico son las curvas de crecimiento deE. colien el medio de cultivo recién inventado (cuadrado) y en los medios de cultivo de agua peptonada estándar (triángulo) o MacConkey (rombo). El aumento de la tasa de crecimiento (marcado por formas ovaladas) se verifica para concentraciones iniciales de 10 UFC/ml (líneas continuas) y 100 UFC/ml (línea de puntos).

Los ejes X e Y representan el tiempo de incubación [h] y la concentración bacteriana [UFC/ml], respectivamente.Sumario

La presente invención se refiere al uso de X-glucurónido, B-galactosa y D-glucosa para aumentar la concentración intracelular de al menos una molécula marcadora fluorescente seleccionada del grupo que consiste en Fluoresceína, Fluoresceína di(p-D-glucurónido), NileRed y CY5 en bacterias coliformes en un método para la detección y cuantificación rápida de bacterias coliformes vivas y recuperadas en una muestra, que comprende las etapas de: a. proporcionar un cóctel de detección que comprende

i. un medio nutritivo que comprende al menos una de una fracción derivada de un huésped mamífero, para el crecimiento selectivo acelerado y la multiplicación de dicho microorganismo;

ii. al menos una molécula marcadora fluorescente para la detección del metabolismo intracelular mediante un sensor seleccionado del grupo que consiste en Fluoresceína, Fluoresceína di(P-D-glucurónido), NileRed y CY5;

iii. al menos un activador metabólico seleccionado del grupo que consiste en X-glucurónido, B-galactosa y D-Glucosa para aumentar específicamente el metabolismo de dichas bacterias coliformes y aumentar la concentración intracelular de dicha molécula marcadora fluorescente en dichas bacterias coliformes; b. poner en contacto dicha muestra con dicho cóctel de detección;

en donde dicha detección es detección microscópica y dicha cuantificación se realiza mediante las etapas de:

i. medir los niveles de gris de intensidad fluorescente de dichas moléculas marcadoras mediante dicho sensor, dichos niveles de gris se correlacionan con el nivel de metabolismo de dichas bacterias coliformes vivas y recuperadas,

ii. determinar dicho nivel de gris hasta un umbral predeterminado de metabolismo; y además correlacionar dichos niveles de gris por encima de dicho umbral predeterminado con la cantidad de dichas bacterias coliformes de alta actividad metabólica en dicha muestra.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde dicha muestra comprende al menos uno de fluido, agua, alimento, bebida, sangre, una solución, una preparación farmacéutica, un tejido de mamífero, aire, suelo, superficie y cualquier combinación de los mismos. Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde la fracción derivada del huésped comprende tejido del huésped, extracto de tejido del huésped, factor de crecimiento del huésped y cualquier combinación de los mismos.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde el tejido huésped se selecciona de un grupo que comprende tejido somático, tejido neuronal, tejido del tracto digestivo, piel, tejido epitelial, tejido conectivo, tejido muscular, tejido adiposo. tejido areolar, tejido óseo, tejido cartilaginoso, tejido linfático, tejido muscular, tejido fibroso, tejido del tracto urinario, tejido linfático, tejido hepático, suero sanguíneo, suero sanguíneo fetal, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, sudor, leche materna y cualesquiera combinaciones de los mismos.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde el activador metabólico es Beta-galactósido para bacteriascoliformestotales.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde dicho filtrado comprende además una etapa de filtrado a través de un filtro bacteriano con una disposición de poros de 0,2 a 0,6 pm.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde el período de tiempo para dicha detección de un organismo específico en una muestra es inferior a 24 horas.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde dicho método comprende además las etapas de aumentar el número de microorganismos recuperados en dicha muestra.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde el número de dicho microorganismo específico en dicha muestra es igual o mayor que el número de Unidades Formadoras de Colonias de dicho organismo específico detectadas mediante el Recuento de heterótrofos en placa convencional.

Ahora se hace referencia a una realización de la presente invención que describe el uso mencionado anteriormente, en donde dicho medio nutritivo, medio de cultivo BcS-EC, para dicho cultivo selectivo de bacteriascoliformescomprende una mezcla de agua de peptona, medio de cultivo McConkey, DMEM (por sus siglas en inglés), suero fetal de ternero, 4-nitrofenil p-D-glucurónido, galactosa y glucosa.

En la presente invención se describe, pero no se reivindica, una composición para la detección rápida del número de microorganismos específicos vivos y recuperados en una muestra, que comprende un cóctel de detección configurado para entrar en contacto con dicha muestra, dicho cóctel comprende:

a. un medio nutritivo que comprende una fracción derivada del huésped, para el crecimiento y multiplicación selectiva de dicho microorganismo;

b. al menos una molécula marcadora fluorescente, para su detección mediante un sensor; y

c. al menos un activador metabólico para aumentar específicamente el metabolismo de dicho microorganismo específico y aumentar la internalización de dicha molécula marcadora fluorescente en dicho microorganismo específico;

en donde dicho cóctel de detección, cuando entra en contacto con una muestra que contiene microorganismos vivos predeterminados, es una fuente de fluorescencia detectable mediante un sensor suficiente para proporcionar niveles de gris de dichas moléculas marcadoras fluorescentes; dichos niveles de gris por encima del umbral predeterminado se correlacionaban con la cantidad de dicho microorganismo de alta actividad metabólica recuperado en dicha muestra.

En la presente invención se describe, pero no se reivindica, un sistema útil para la detección y cuantificación rápida de microorganismos vivos y recuperados específicos en una muestra, dicho sistema comprende:

a. un módulo de contactoin vitroconfigurado para poner en contacto dicha muestra con un cóctel de detección, dicho cóctel comprende:

i. un medio nutritivo que comprende al menos una de las fracciones derivadas del huésped, para el crecimiento selectivo acelerado y la multiplicación de dicho microorganismo;

ii. al menos una molécula marcadora fluorescente para la detección del metabolismo intracelular mediante un sensor

iii. al menos un activador metabólico para aumentar específicamente el metabolismo de dicho microorganismo específico y aumentar la concentración de dicha molécula marcadora fluorescente en dicho microorganismo específico;

b. un módulo para registrar los datos del resultado de dicho contacto in vitro en donde dicho módulo comprende: i. un sensor para medir niveles de gris de intensidad fluorescente de dichas moléculas marcadoras; y

ii. un módulo para correlacionar dichos niveles de gris detectados con el metabolismo de dicho microorganismo específico, determinando dicho nivel de gris con un umbral predeterminado de metabolismo; y además correlacionar dichos niveles de gris por encima de dicho umbral predeterminado con la cantidad de dicho microorganismo de alta actividad metabólica recuperado en dicha muestra.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

General

La presente invención se refiere a un método para la detección e identificación rápidas de microorganismos recuperables usando la detección microscópica combinada del metabolismo microbiano mejorado mediante la medición de la concentración intracelular de moléculas marcadoras del metabolismo, así como de marcadores específicos no metabólicos marcados, precedidos por un crecimiento mejorado de microorganismos usando tejidos o factores impulsados por el huésped.

Recuperación de microorganismos estresados.

Los microorganismos presentes en los alimentos procesados, el agua o el medio ambiente pueden resultar dañados y, por tanto, ser más exigentes en sus necesidades de crecimiento. Estos organismos pueden ser difíciles de detectar porque no crecen en los medios selectivos que normalmente se usan para su aislamiento. El fallo en el aislamiento de bacterias también es un fenómeno conocido en un número significativo de infecciones en pacientes humanos. En algunas zonas del cuerpo humano son especialmente frecuentes las infecciones sin un agente causal aislado. Además, un número significativo de casos de infección bacteriana no están asociados con el aislamiento del agente causal cuando se aplican métodos microbiológicos estándar, basados en el aislamiento de bacterias en medios de cultivo. Este inadecuado aislamiento bacteriano se podría deber a la implicación de microorganismos de difícil crecimiento o no recuperables en los medios de cultivo.

Por lo tanto, en la detección y enumeración de microbios es importante una apreciación de la naturaleza de las lesiones subletales y su reparación en la recuperación de microorganismos.

Microorganismos recuperables:

Los microorganismos viables incluyen formas de microorganismos recuperables y no recuperables. Los microorganismos recuperables son de mayor interés y los más analizados en las pruebas microbianas convencionales de agua, alimentos, bebidas, medicamentos, etc. Hasta la fecha, el único método certificado de identificación y cuantificación para este tipo de pruebas es el recuento convencional de unidades formadoras de colonias (UFC).

La presente invención se basa en el hallazgo actual de que la tasa de metabolismo es mucho mayor en los microorganismos recuperables cuando se recuperan y que los procesos metabólicos se activan mediante inductores específicos del tipo microbiano. Más específicamente, los colorantes de los compuestos marcadores del metabolismo aumentan su concentración en las células recuperables con el aumento del metabolismo.

El método se puede usar para detectar prácticamente cualquier microorganismo recuperable mediante la detección microscópica del metabolismo específicamente activado, sin necesidad de esperar a que crezca la colonia (método HPC). En base a este hallazgo, la presente invención describe una tecnología innovadora para identificar microorganismos recuperables en poco tiempo. La tecnología combina la identificación del tipo de células microbianas mediante la detección de la tasa de metabolismo, una vez que dicha tasa de metabolismo se ha aumentado por inductores específicos (activadores metabólicos). La tasa de metabolismo y el nivel de concentración intracelular de los compuestos marcadores son función de la actividad celular, que es muy alta en las células recuperadas.

Además, la cuantificación de la concentración intracelular de las moléculas marcadoras se puede usar para diferenciar las recuperadas (muy activas) de las inactivas.

Usando el colorante específico para las moléculas marcadoras es posible detectar y cuantificar la tasa y el nivel de concentración intracelular de dichas moléculas, para definir, especificar y contar los microorganismos recuperados en la muestra analizada como se muestra en la Figura 1.

Bacteriascoliformes

Por bacteriascoliformesse refiere en lo sucesivo a bacterias Gram negativas, no formadoras de esporas y con forma de bastón, móviles o no móviles, que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas cuando se incuban a 35-37°C. Son un indicador comúnmente usado de la calidad sanitaria de los alimentos y el agua. Las bacteriascoliformesse encuentran en el medio acuático, en el suelo y en la vegetación; están universalmente presentes en grandes cantidades en las heces de los animales de sangre caliente. Si bien las baterías coliformes en sí mismas normalmente no son causa de enfermedades graves, su presencia se usa para indicar que pueden estar presentes otros organismos patógenos de origen fecal. Dichos patógenos incluyen bacterias, virus o protozoos que causan enfermedades y muchos parásitos multicelulares.

UFC

Las unidades formadoras de colonias, habitualmente abreviadas como UFC, se refieren en lo sucesivo a colonias individuales de bacterias, levaduras o mohos. Una colonia de bacterias o levaduras se refiere a una masa de células individuales del mismo organismo que crecen juntas. Para los mohos, una colonia es un grupo de hifas (filamentos) del mismo modo que crecen juntas. Las unidades formadoras de colonias se usan como una medida del número de microorganismos presentes en o sobre la superficie de una muestra. Las unidades formadoras de colonias se pueden informar como UFC por unidad de peso, UFC por unidad de área o UFC por unidad de volumen, según el tipo de muestra analizada. Para determinar el número de unidades formadoras de colonias, se prepara una muestra y se extiende o se vierte uniformemente sobre una superficie de una placa de agar y luego se incuba a una temperatura adecuada durante varios días. Se cuentan las colonias que se forman. Las UFC no es una medida para células o esporas individuales, ya que se puede formar una colonia a partir de una sola o de una masa de células o esporas.

HPC- Recuento de heterótrofos en placa

El recuento de heterótrofos en placa (HPC, por sus siglas en inglés), anteriormente conocido como recuento en placa estándar, es un procedimiento para estimar el número de bacterias heterótrofas vivas en el agua. Esta prueba proporciona información útil sobre la calidad del agua y datos de respaldo sobre la importancia de los resultados de la prueba decoliformes.

El HPC es útil, entre otros, para juzgar la eficiencia de diversos procesos de tratamiento de agua potable, piscinas, así como para verificar la calidad del agua terminada en un sistema de distribución. También para aplicaciones donde hay calderas y torres de refrigeración. Heterótrofos se refiere en lo sucesivo a microorganismos que requieren carbono orgánico para crecer. Estos incluyen bacterias, levaduras y mohos. Una variedad de pruebas simples basadas en cultivos que tienen como objetivo recuperar una amplia gama de microorganismos del agua se denominan colectivamente procedimientos de "recuento de heterótrofos en placa" o "prueba HPC".

Niveles de gris

Las mediciones del nivel de gris se realizan para comparar estadísticamente la intensidad de la tinción o de la fluorescencia de un marcador particular entre tratamientos o grupos. Los niveles de gris se usan en lo sucesivo para cuantificar la intensidad de la fluorescencia.

La presente invención se refiere a una metodología para identificar y cuantificar microorganismos recuperables en poco tiempo, basada en la detección microscópica del metabolismo celular dentro de dichos microorganismos.

Más detalladamente, la presente invención se refiere a un método para una detección rápida y de alto rendimiento de un microorganismo específico en una muestra, que comprende mezclar la muestra con un cóctel de detección único y determinar el número de microorganismos específicos en dicha muestra midiendo los niveles de gris de los indicadores intracelulares marcados con fluorescencia del metabolismo microbiano y de las moléculas marcadoras no metabólicas específicas conjugadas con fluorescencia en dicha mezcla; dichos niveles de gris se correlacionan con la cantidad de dicho microorganismo de alta actividad metabólica recuperado en dicha muestra.

Dicho cóctel comprende: (i) un medio nutritivo que comprende una fracción derivada del huésped que contiene activadores del crecimiento celular de dicho organismo huésped, para el crecimiento selectivo acelerado y la multiplicación de dicho microorganismo; (ii) marcadores específicos marcados con fluorescencia del microbio de prueba, específicos para reconocer dicho microorganismo; y (iii) un activador metabólico para aumentar el metabolismo intracelular y al menos un factor marcador detectable mediante fluorescencia que puede ser un indicador de dicho metabolismo.

Ejemplos

Las siguientes muestras describen los métodos y aparatos útiles para poner en práctica la invención y resumen los resultados del trabajo experimental para desarrollar un método de cuantificación de microorganismos recuperables basado en la detección de la tasa del metabolismo celular en microbios específicamente recuperados, en comparación con el metabolismo en microbios no-activados.

Además, el documento describe el proceso de diseño y validación del sistema de prueba.

Ejemplo 1:

Metodología para la rápida identificación y cuantificación de microorganismos recuperables mediante detección microscópica del metabolismo celular.

Los microorganismos viables incluyen formas de microorganismos recuperables y no recuperables. Los microorganismos recuperables son los de mayor interés y los más probados en las pruebas microbianas convencionales de agua, alimentos, bebidas, medicamentos, etc. Hasta la fecha, el único método certificado de identificación y cuantificación para este tipo de pruebas es el recuento convencional de unidades formadoras de colonias (UFC). El fenómeno de recuperación microbiana ocurre en las pruebas de recuento de heterótrofos en placa (HPC), cuando los microbios se reproducen y multiplican usando medios que contienen nutrientes específicos y generales que activan la recuperación/crecimiento.

El fenómeno del aumento del metabolismo es característico únicamente de las células activas y aumenta según el nivel de metabolismo celular. La cuantificación de la concentración intracelular de moléculas marcadoras se usa para diferenciar las recuperadas (muy activas) de las inactivas. Como parte del aumento del metabolismo, partes de la membrana celular, receptores de membrana, efectores específicos y líquidos extracelulares se internalizan y concentran dentro de la célula. El nivel de concentración intracelular de indicadores del metabolismo intracelular es función de la actividad celular, que es muy alta en las células recuperadas.

Usando el tinte específico de moléculas marcadoras es posible detectar y cuantificar la tasa y el nivel de dichos indicadores de concentración intracelular, para definir, especificar y contar los microorganismos recuperados en la muestra analizada como se muestra en el siguiente diagrama (como se presenta en Figura 1).

La Figura 1 representa la concentración intracelular de la molécula marcadora del metabolismo celular como resultado de la influencia de los activadores del metabolismo.

Las ilustraciones muestran el efecto de la recuperación bacteriana o de los estimuladores/activadores del metabolismo sobre las concentraciones de tintes de las moléculas marcadoras en varias células: Los tintes de las moléculas marcadoras aumentan su concentración (óvalos blancos grandes) en células recuperables con metabolismo aumentado (B). La concentración es baja (óvalos blancos pequeños) en células no recuperables (A; B y C): En microorganismos que no crecen y anabióticos que tienen un bajo nivel de metabolismo, los colorantes permanecen confinados en el espacio extracelular. Luego se recuperarán células que adicionalmente están marcadas con los marcadores para la identificación de especies mediante tinción fluorescente doble y estudio por imágenes (C).

Desarrollo de la metodología

La invención propuesta comprende un método basado en la detección de la tasa metabólica celular para determinar el tipo y número de microbios recuperados en un medio. Los resultados de detección de la invención propuesta fueron adicionales a los obtenidos con métodos convencionales de UFC y revelaron además una equivalencia entre esos métodos, lo que permitió que la invención propuesta se usara como un contador de UFC.

El método se desarrolló y validó para su uso en el análisis del recuento microbiano total, de bateríascoliformestotales y dePs. aeruginosaen diferentes medios de prueba. Todas las pruebas se realizaron usando equipos de laboratorio de microbiología convencionales, equipos de obtención de imágenes y equipos microscópicos estándar.

Los principios fundamentales del desarrollo de la metodología son los siguientes:

a. Determinación de la composición del cóctel de nutrientes para la recuperación óptima del tipo microbiano a probar que contiene, entre otras cosas, factores del crecimiento celular del tejido huésped.

b. Determinación de efectores que estimulan específicamente el metabolismo celular en los microbios de prueba.

c. Determinación de moléculas marcadoras fluorescentes para el metabolismo intracelular en dichas células microbianas.

d. Desarrollo de un método para preparar los medios de prueba para el examen microscópico.

e. Determinación de las condiciones de incubación (tiempo y temperatura mínimos de incubación) para los medios de prueba en un cóctel de nutrientes para permitir la recuperación de los microbios y el examen microscópico en la resolución requerida.

f. Determinación de las condiciones (tiempo) para la tinción de muestras celulares con moléculas marcadoras marcadas en presencia de efectores/activadores del metabolismo.

g. Determinación de las condiciones para el examen microscópico.

h. Definición de la imagen de determinación para los microbios de prueba recuperados

i. Trazado de funciones para la correlación entre los recuentos de células microscópicas y los recuentos de HPC con respecto a una aplicación de una prueba específica

Muestras:

Se recogieron muestras de:

a. Lodos procedentes de una plante de tratamiento de aguas residuales municipal

b. Leche pasteurizada (3 % grasa)

c. Jugo de naranja recién exprimido.

El muestreo se realizó en tres días diferentes o en tres lotes de producción por triplicado de cada fuente (un total de 27 muestras para cada medio de prueba). El lodo de aguas residuales se analizó para bacteriascoliformestotales, la leche pasteurizada se analizó paraPs. aeruginosay el jugo de naranja se analizó para la contaminación bacteriana total.

En estas muestras se realizó el recuento específico de bacterias recuperadas. Estas muestras se analizaron en paralelo mediante métodos HPC convencionales relevantes para las bacterias a analizar. Los datos de todos los análisis se usaron para determinar la relación entre los procedimientos de la invención propuestos para la determinación de microbios recuperables basados en el metabolismo celular y el número de microbios recuperados de los métodos HPC en los medios de prueba. El análisis de la correlación reveló un valor de (R2) = 0,95 comparando la invención propuesta con el método convencional.

Preparación de los medios de prueba

Los lodos de aguas residuales se diluyeron con PBS iso-normal en concentraciones de 1:10, 1:100 y 1:1000 p/v. Se añadió un ml de cada disolución a 9 ml de medio de cultivo MacConkey (Mb) estándar y se incubó usando una incubadora con agitación a 35°C durante 1 hora. Durante la incubación, las disoluciones se filtraron mediante membranas de 2,0 gm y se transfirieron 0,1 ml del filtrado a través de membranas de 0,4 gm.

La leche pasteurizada se contaminó con un cultivo calibrado dePs.aeruginosaen concentraciones de 1, 10 y 100 UFC/ml. Luego, se añadieron 10 ml de cada muestra de leche contaminada a 90 ml de cóctel que contenía Medio Selectivo de Pseudomonas (CB) y Tween 40 (2 % v/v) y se incubaron a 25°C durante 7 horas. Durante la incubación, se trataron 10 ml de las disoluciones con HCl (pH 4,0) durante 5 minutos, se filtraron mediante membranas de 2,0 gm y se transfirieron 0,1 ml del filtrado a través membranas de 0,4 gm. Las membranas se lavaron adicionalmente con PBS iso-normal.

El jugo de naranja se contaminó con una mezcla de cultivo bacteriano total calibrada en concentraciones de 1, 10 y 100 UFC/ml. Luego se añadieron 10 ml de cada muestra de jugo contaminado a 90 ml de NB y se incubaron usando una incubadora con agitación a 25°C durante 8 horas. Durante la incubación, las disoluciones se filtraron mediante membranas de 2,0 gm y se transfirieron 0,1 ml del filtrado a través de membranas de 0,4 gm.

Tinción y obtención y estudio de las imágenes de las bacterias recuperadas.

Después de las preparaciones de los medios, se trataron membranas microbianas de 0,4 gm con disoluciones de trabajo de tintes de membrana CY3 en PBS con adiciones de activadores metabólicos celulares:

a. Asparagina paraPs.aeruginosa

b. Beta-galactósido para bacteriasColiformesTotales

c. Medio NB para el recuento de bacterias totales

en concentraciones estándar. Cada membrana se tiñó a temperatura ambiente durante 6 minutos, se lavó con PBS y se obtuvieron y estudiaron las imágenes.

La obtención y estudio de imágenes se hizo usando un microscopio Axioplan 100, objetivo Plan Neofluar X20/0,5 NA (filtro de excitación BP 450-490 (excitación: 450-490 nm; divisor de haz: FT 510 nm; emisión: 515-555 nm; Karl Zeiss). Se obtuvieron imágenes de las preparaciones con una cámara Axiocam 506 mono de 5 megapíxeles con sensor CCD (por sus siglas en inglés). La recopilación de datos, el procesamiento y el análisis de imágenes se realizaron mediante el programa informático ImagePro+.

Hallazgo de las características microscópicas de las bacterias recuperables:

a. Cada tipo de bacteria analizada se preparó mediante dos procedimientos diferentes:

b. Después de la proliferación de la suspensión bacteriana se dividió en dos porciones iguales. La primera parte se hizo proliferar mediante procedimientos de los inventores como los descritos anteriormente. La segunda porción se sometió a choque metabólico mediante incubación en disolución salina iso-normal a 25°C durante 72 horas. Luego se tiñó la primera porción en presencia y la segunda porción en ausencia de activadores metabólicos celulares (ver párrafos anteriores).

c. Los cultivos activados y sometidos a choque recuperados se observaron mediante microscopio y se obtuvieron sus imágenes.

d. Se midieron y analizaron las características morfológicas y la intensidad de luz de los microbios en cada cultivo. Las características morfológicas de las bacterias fueron similares en los cultivos activados y sometidos a choque en comparación al tipo bacteriano específico (Figura 2).

e. Además, se descubrió que la intensidad fluorescente de las bacterias activadas era significativamente mayor. Se realizaron las siguientes observaciones durante la obtención de imágenes mediante la configuración de la obtención imágenes actual:

a. La intensidad de la fluorescencia de las bacterias teñidas estaba en el intervalo de 25 a 225 niveles de gris (en una escala de 0 a 255).

b. Las bacterias sometidas a choque tenían una señal de 25 a 55 niveles de gris.

c. Los microorganismos activados por metabolismo celular tenían una señal de 85 a 225 niveles de gris (Figura 3).

Por lo tanto, se midió una diferencia de aproximadamente 30 niveles de gris entre los microorganismos recuperados (estimulados por el metabolismo celular) y los no recuperados.

La Figura 3 presenta la concentración intracelular de moléculas marcadoras en cultivos decoliformestotales (A) y dePs. aeruginosa(B) recuperadas o activadas por metabolismo. Se observó una concentración significativamente baja de moléculas marcadoras en Coliformes sometidas a choque metabólico (C) y enA. hidrofiliatratadas con activadores inespecíficos (D).

Características usadas para la identificación de células microbianas recuperadas en los medios de prueba.

Correlaciones de la invención propuesta con los recuentos convencionales (HPC):

Las muestras del cultivo de bacteriascoliformestotales aisladas de aguas residuales, del cultivo de la mezcla de bacterias totales obtenida del jugo de naranja y del cultivo estándar dePs.aeruginosase diluyeron con PBS a concentraciones de 1 y 10 UFC/ml. Se añadió un ml de cada muestra diluida a un medio activador de recuperación selectiva de bacterias y se incubó como se describió anteriormente. A continuación, las soluciones se trataron, se tiñeron y se obtuvieron imágenes según la invención propuesta para cada una durante 0,5 h. Se obtuvieron imágenes del veinte por ciento (20 %) de cada preparación. Paralelamente, se probó 1 ml de cada disolución usando la metodología HPC convencional. Todas las pruebas se prepararon por triplicado. Los resultados obtenidos de ambos métodos se promediaron, se normalizaron a 1 ml de suspensiones microbianas iniciales, se compararon (Ver Tabla 1) y se representaron gráficamente. Las ecuaciones de correlación para cada cultivo se muestran en los gráficos (Ver Figura 4).

La Figura 4 presenta la definición de la contaminación inicial de la muestra.

Se trazan las gráficas de los recuentos bacterianos que se realizaron mediante el método de recuento de heterótrofos en placa (normalizado a un volumen de 1 ml, eje Y) y mediante el nuevo método (recuento sin procesar, eje X) paraE. co li(A);Ps. aeruginosa(B) y bacterias heterótrofas totales (C) para obtener las líneas de tendencia y las ecuaciones. Este proceso reveló fórmulas para calcular los recuentos de contaminación iniciales.

Los niveles de contaminación iniciales para los medios de prueba se calcularon de la siguiente manera:

Ni= Fc(x)/2(Ts/Tc)

Donde: Ni - Nivel de contaminación inicial;

Fc - Ecuación de correlación (datos experimentales);

x - Recuento por el nuevo método desarrollado [RMUT - Tiempo de muestreo (incubación) [min]; Tc - Período del ciclo celular (división) [min] (datos experimentales).

Ejemplos:

Bacterias coliformes:

Ps. aeruginosa:

Bacterias totales:

Tabla 1. Recuentos microbianos del nuevo método desarrollado (RMU: recuento microbiano recuperado) correlacionado con el método HPC (unidades formadoras de colonias - UFC). Los resultados de los recuentos de bacterias coliformes (A), Ps. aeruginosa (B) y bacterias totales (C) se presentan sin procesar y normalizados a recuentos de 1 ml.

A. Bacterias coliformes

B. Ps. Aeruginosa

C. Bacterias totales

Comparación de muestras silvestres diluidas con muestras contaminadas.

La mezcla microbiana total procedente del jugo de naranja se cultivó en medio de cultivo durante 72 horas a 25°C. El medio se eliminó mediante centrifugación y se usó un sedimento microbiano para la contaminación del jugo de 1, 10 y 100 UFC/ml. La leche pasteurizada se contaminó conPs.aeruginosaestándar por el mismo procedimiento. El lodo de aguas residuales se tomó tal cual y se diluyó como se describió anteriormente.

Las muestras silvestres diluidas y contaminadas se analizaron de forma simultánea por triplicado mediante el método convencional (HPC) y el nuevo método de la invención propuesta. La prueba se repitió en tres días experimentales diferentes para cada tipo de prueba. Los resultados de las observaciones microscópicas se procesaron para los recuentos de bacterias recuperadas como se describió anteriormente. Los recuentos de ambos tipos de pruebas se promediaron con respecto al día experimental, se normalizaron para 1 ml de muestra inicial y se correlacionaron. En la Tabla 2 se presenta el resumen de los resultados de las pruebas.

Tabla 2. Resultados de pruebas del nuevo método desarrollado (RMU) y del método HPC (UFC).

Se presentan el recuento de bacterias coliformes (A) en lodo activo, recuento de Ps.aeruginosa en leche (B), recuento de bacterias totales en jugo de naranja (C) y los normalizados a 1 ml de muestra. Las correlaciones para cada prueba fueron

Los resultados obtenidos fueron:

Método convencional:

24 horas para bacteriascoliformes

72 horas paraPs. aeruginosa

96 horas para el recuento bacteriano total.

Nuevo método:

1 hora para bacteriascoliforme

7 horas paraPs.aeruginosa

8 horas para el recuento bacteriano total.

El tiempo de prueba necesario para obtener los resultados mediante el nuevo método depende y es inversamente proporcional a la contaminación de partida del medio de prueba y al ciclo celular microbiano (tiempo de división). La Figura 5 representa la correlación de los recuentos microbianos entre los métodos de prueba y convencional. En la mayoría de los casos, la correlación entre el método nuevo y el convencional se define en aproximadamente el 90 % (ver Figura 5). Las correlaciones se probaron mediante recuentos deE. coli(rombo),Ps.aeruginosa(cuadrado) y recuento de bacterias heterótrofas totales (triángulo).

Los ejes X e Y representan el número de la serie experimental [h] y el índice de correlación de la relación numérica [%], respectivamente.

En la mayoría de los casos, la correlación entre el método nuevo y el convencional se define en aproximadamente el 90 % (ver Figura 5) que presenta la correlación de las prueba de los medios. La Figura 5 presenta correlación entre los métodos de prueba y el número de muestra).

Sumario del Ejemplo 1

Los resultados del Ejemplo 1 muestran la validez de la nueva metodología de la invención propuesta y la equivalencia de dicha nueva metodología con el método de recuento de UFC, por ejemplo para muestras de recuento de bacterias recuperables Totales,coliformesyPs.aeruginosaen lodos de aguas residuales, jugos y leche.

Las contaminaciones bacterianas de esos tres tipos son de suma importancia en alimentos, bebidas y microbiología ambiental.

El recuento recuperable que usa la nueva metodología normalmente proporcionará cifras mayores que las UFC analizadas de forma convencional: el recuento de HPC convencional es una prueba indirecta basada en el cultivo de microbios. La capacidad de cultivo de un microorganismo depende de las propiedades del medio de cultivo y de las condiciones de incubación.

Según esto, se espera que el nuevo sistema de prueba directo detecte más células recuperadas.

Comparaciones de la metodología HPC convencional y la nueva metodología para la cuantificación de microorganismos recuperables

A continuación se resumen las características de ambos métodos de prueba.

Tabla 3: Características de comparación del método convencional con la invención actual

La Figura 6 muestra que los medios que contienen activadores del crecimiento permiten comenzar la detección bacteriana entre un 20 y un 80 % antes que los medios de cultivo estándar. La línea horizontal sólida indica niveles de contaminación bacteriana específica que son suficientes para una detección y enumeración microbiana confiable mediante la nueva tecnología.

Las líneas en el gráfico son las curvas de crecimiento deE. co lien los medios de cultivo recién inventados (cuadrado) y en agua peptonada estándar (triángulo) o en el medio de cultivo MacConkey (rombo). El aumento de la tasa de crecimiento (marcado por formas ovaladas) se verifica para concentraciones iniciales de 10 UFC/ml (líneas continuas) y 100 UFC/ml (línea de puntos).

Los ejes X e Y representan el tiempo de incubación [h] y la concentración bacteriana [UFC/ml], respectivamente. Ejemplo 2:

Preparación del cóctel de activación/tinción del metabolismo microbiano.

El cóctel de tinción contiene tres componentes principales. Estos componentes se usan al mismo tiempo o por separado, dependiendo de la bacteria y/o del material analizado.

Activación específica o inespecífica del metabolismo celular:

Este reactivo contiene una sustancia que de manera selectiva o no selectiva aumenta el metabolismo intracelular del microbio de prueba. Las sustancias que se pueden usar son azúcares específicos o no específicos, proteínas, efectores de receptores de membrana y sustratos específicos de reacciones enzimáticas intracelulares.

Este reactivo contiene

Detección de metabolismo alto: Este reactivo contiene una sustancia fluorescente detectable que es absorbida por una célula microbiana y se acumula en ella debido al aumento del metabolismo celular. Son adecuadas las sustancias que participan en reacciones metabólicas intracelulares que tienen propiedades luminosas/fluorescentes.

identificación específica de microbios: Este reactivo contiene una sustancia fluorescente detectable que identifica de manera específica y precisa el tipo de especie microbiana.

Los reactivos se eligen entre:

- anticuerpos fluorescentes conjugados

- carbonatos metabolizados

- secuencias específicas de ADN/ARN

- productos fluorescentes de reacciones intracelulares específicas

Nota- En algunos casos, el uso de una misma sustancia cumple ambos propósitos.

Usando tintes específicos, es posible detectar y cuantificar la tasa y el nivel de internalización de los compuestos seleccionados para contar e identificar microorganismos recuperables en una muestra de prueba.

Los siguientes son ejemplos no limitantes de preparaciones de cócteles.

1. Un coctel para realizar pruebas dePs.aeruginosa:

a. Medios de Bactosense para mejorar el cultivo Pseudomonas.

b. Cetrimida (10 mg/l) - un activador del metabolismo.

c. Fucidina (10 mg/l) - un activador del metabolismo.

d. Fluoresceína, un marcador selectivo del metabolismo producido naturalmente en células dePs.

aeruginosametabólicamente activas.

e. Anticuerpo monoclonal anti-Pseudomonas aeruginosa (por ejemplo ab35835) (1:50), un marcador de identificación.

2. Un cóctel para realizar pruebas de E. coli:

a. Medios de Bactosense para mejorar el crecimiento de bacteriascoliformes

b. X-glucurónido (0,075 g/1), un activador del metabolismo.

c. B-galactosa (1,0 g/1), un activador del metabolismo.

d. Fluoresceína di(p-D-glucurónido) (5 mg/), marcador selectivo del metabolismo.

e. Anti-E.coli FITC - (por ejemplo AB30522) (1:50), un marcador de identificación.

3. Un coctel para realizar pruebas de bacteriascoliformes:

a. Medios de Bactosense para mejorar el crecimiento de bacterias coliformes

b. D-Glucosa (2 g/1), un activador del metabolismo.

c. B-galactosa (1,0 g/1), un activador del metabolismo.

d. NileRed (5 mg/l), un marcador general del metabolismo; o

e. CY5 (1 mg/l), un marcador general del metabolismo.

Ejemplo 3:

Medios especiales para mejorar el crecimiento de diferentes microorganismos.

1. Funciones de los medios de cultivo:

a. Simula el entorno fluido/tejido del huésped.

b. Incluye varios factores/estimuladores/desencadenantes del crecimiento.

c. Parámetros ambientales controlados.

d. Apoya tasas de crecimiento mejoradas de microorganismos.

e. Simula el entorno fluido/tejido del huésped

La presente invención enseña que el crecimiento de bacterias patógenas se estimula por factores del crecimiento encontrados en el organismo/tejido huésped en lugar de aquellos encontrados en fuentes alternativas. Esta es una suposición lógica ya que un microbio patógeno determinado proliferará intensamente en un tipo específico de organismo/tejido huésped, pero será inofensivo y/o no proliferará en otros.

Por lo tanto, es posible acelerar el cultivo de patógenos microbianos mediante la adición de aceleradores del crecimiento celular individuales o mixtos, que simulan el entorno fluido/tejido del huésped, en los medios de cultivo estándar.

Esta suposición se probó experimentalmente. De hecho, los resultados muestran una aceleración de la tasa de crecimiento bacteriano en intervalos del 20-75 %.

a. Incluye varios factores/estimuladores/desencadenantes del crecimiento.

El activador se elige entre:

i. Activadores mixtos/complicados:

Tejidos y/o extractos de tejido procedentes del huésped del patógeno: suero sanguíneo libre de anticuerpos, suero sanguíneo fetal, extractos de tejido somático/neuronal, LCR, orina y/o extractos de tejido del tracto urinario, saliva libre de lisozima, etc.

Mezcla de factores del crecimiento celular (citocinas) de los organismos huéspedes.

ii. Citocinas aisladas del organismo/tejidos del huésped.

Para diseñar la formulación del medio de cultivo, se deben probar los tipos y concentraciones de las adiciones según su influencia en la tasa de cultivo del patógeno específico.

b. Diseño de la formulación de los medios de cultivo:

i. Seleccionar el medio de selección estándar óptimo (generalmente líquido) para el crecimiento del patógeno específico.

ii. Seleccionar el activador del crecimiento que se sepa que está fuertemente asociado con el microorganismo en el huésped.

iii. Seleccionar el entorno que apoye eficazmente el crecimiento de las células/tejidos del huésped (mezcla estándar).

iv. Definir la concentración del/los activador/es en el medio ambiente (mezcla activadora).

v. Definir proporciones entre el estándar y las mezclas de activación en la formulación final del medio.

vi. Llevar el contenido de la selección de factores desde los medios estándar a los niveles óptimos.

c. Prueba de calidad de los medios:

i. Comparar las tasas de crecimiento microbiano usando medios diseñados por Standard y Novell mediante métodos HPC o de cinco tubos.

ii. Definir las condiciones de almacenamiento y la vida útil de los medios determinando la tasa de crecimiento microbiano en ellos.

2. Ejemplos de medios de cultivo

a. Medio de cultivo BcS-EC

BcS-EC es un medio de cultivo de bacterias especial para el crecimiento específico acelerado de bacteriascoliformes.Reactivos:

En la Tabla 4 se describen los siguientes reactivos necesarios para preparar 1 l y/o 0,5 l del medio BcS-EC: Tabla 4: Composición del medio BcS-EC

Procedimiento:

i. Preparar agua peptona, medio McConkey y DMEM según las instrucciones del fabricante:

ii. Disolver 13,38 g de DMEM con alto contenido de glucosa (4,5 g/l) en 1 litro de DDW con la adición de 3,7 g/l de bicarbonato de sodio (sin calentar);

iii. Suspender 40,01 g del medio MacConkey en 1 litro de DDW con un agitador magnético y calentamiento; iv. Disolver 15 g de agua peptona en 1 litro de DDW con un agitador magnético y calentamiento;

v. Mezclar las disoluciones agua peptona, MacConkey y DMEM.

vi. Añadir FCS, galactosa y glucosa a esta disolución y mezclar bien con un agitador magnético.

vii. Esterilizar la disolución mediante filtración a través de una membrana de 0,22 gm.

viii. Dividir asépticamente en alícuotas de 10 y/o 50 ml en tubos de plástico estériles.

ix. Conservar en frigorífico a 4°C.

b. Medio de cultivo BcS-LM

BcS-LM es un medio de cultivo de bacterias especial para el crecimiento específico acelerado deListeria.

Reactivos:

En la Tabla 5 se describen los siguientes reactivos necesarios para preparar 1 l y/o 0,5 l del medio DGD-LM Tabla 5: Composición de los medios BcS-LM

2.2 Procedimiento

i. Preparar el cultivo de Listeria según las instrucciones del fabricante:

ii. Disolver 15 g en 1 litro de DDW con un agitador magnético;

iii. Añadir los suplementos para el cultivo de Listeria y mezclar bien con un agitador.

iv. Añadir DMEM, FCS, galactosa y glucosa. Mezclar bien con un agitador magnético.

v. Esterilizar la disolución mediante filtración a través de una membrana de 0,22 gm.

vi. Dividir asépticamente en alícuotas de 10 a 50 ml en tubos de plástico estériles.

vii. Conservar en frigorífico a 4°C.

Tabla 6: Composición de FCS (Suero fetal de ternero)

De Lindl, T. (2002): “Zell- und Gewebekultur”, 5a Ed. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Según los datos de Thermo, en el FBS (por sus siglas en inglés) están presentes 111 ng/ml de IGF, 12,6 ng/ml de TGF-beta, 37,3 ng/ml de FGF-2. (Sin embargo, existen variaciones de un lote a otro).

Composición del FBS

Ejemplo 4:

Ahora se hace referencia a la Figura 7, que ilustra un sistema (100) útil para la detección y cuantificación rápida de microorganismos vivos y recuperados específicos en una muestra (120). El sistema comprende

a. un módulo de contacto in vitro (110) configurado para poner en contacto la muestra (120) con un cóctel de detección (150), el cóctel (150) comprende:

i. un medio nutritivo que comprende al menos uno de una fracción derivada del huésped o factores del crecimiento de células de origen huésped, para el crecimiento selectivo acelerado y la multiplicación del microorganismo;

ii. al menos una molécula marcadora fluorescente para la detección del metabolismo intracelular mediante un sensor

iii. al menos un activador metabólico para aumentar específicamente el metabolismo de dicho microorganismo específico y aumentar la concentración de la molécula marcadora fluorescente en dicho microorganismo específico;

b. un módulo para registrar datos (130) sobre el resultado de dicho contacto in vitro en donde el módulo comprende:

i. un sensor (140) para medir niveles de gris de intensidad fluorescente de las moléculas marcadoras; y

ii. un módulo para correlacionar (160) dichos niveles de gris detectados con el metabolismo del microorganismo específico, determinando el nivel de gris a un umbral predeterminado de metabolismo; y correlacionar además los niveles de gris que están por encima del umbral predeterminado con la cantidad de microorganismos de alta actividad metabólica recuperados en la muestra.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Uso de X-glucurónido, B-galactosa y D-Glucosa para aumentar la concentración intracelular de al menos una molécula marcadora fluorescente seleccionada del grupo que consiste en Fluoresceína, Fluoresceína di(p-D-glucurónido), NileRed y CY5 en bacterias coliformes en un método para la detección y cuantificación rápida de bacterias coliformes vivas y recuperadas en una muestra, que comprende las etapas de:

a. proporcionar un cóctel de detección que comprende

i. un medio nutritivo que comprende al menos una de una fracción derivada de un huésped mamífero, para el crecimiento selectivo acelerado y la multiplicación de dicho microorganismo;

ii. al menos una molécula marcadora fluorescente para la detección del metabolismo intracelular mediante un sensor seleccionado del grupo que consiste en Fluoresceína, Fluoresceína di(p-D-glucurónido), NileRed y CY5; iii. al menos un activador metabólico seleccionado del grupo que consiste en X-glucurónido, B-galactosa y D-glucosa para aumentar específicamente el metabolismo de dichas bacterias coliformes y aumentar la concentración intracelular de dicha molécula marcadora fluorescente en dichas bacterias coliformes;

b. poner en contacto dicha muestra con dicho cóctel de detección;

en donde dicha detección es detección microscópica y dicha cuantificación se realiza mediante las etapas de: i. medir los niveles de gris de intensidad fluorescente de dichas moléculas marcadoras mediante dicho sensor, estando dichos niveles de gris correlacionados con el nivel de metabolismo de dichas bacterias coliformes vivas y recuperadas,

ii. determinar dicho nivel de gris hasta un umbral predeterminado de metabolismo;

correlacionar además dichos niveles de gris por encima de dicho umbral predeterminado con la cantidad de dichas bacterias coliformes de alta actividad metabólica en dicha muestra.

2. El uso de la reivindicación 1, que comprende además una etapa de filtrar dicha muestra mediante un filtro bacteriano con un intervalo de poro de 0,2 a 0,6 gm.

3. El uso de la reivindicación 1, en donde un período de tiempo para dicha detección de dichas bacterias coliformes en una muestra es inferior a 24 horas.

4. El uso de la reivindicación 1, en donde:

(a) cuando dicho cóctel de detección comprende agua de peptona, medio McConkey, DMEM, suero fetal de ternero, p-D-glucurónido de 4-nitrofenilo, B-galactosa y D-Glucosa.