JP6421297B2 - 悪性形質転換細胞の検出方法 - Google Patents
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Description
陽性対照細胞試料においては、コロニーを含む画分数及び混入させた悪性形質転換細胞の濃度から単一悪性形質転換細胞のコロニー形成確率を算出することができる。具体的には、まず、細胞試料の複数ウェルへの分画は偶発的に行われる事象であり、一つのウェルに含まれる細胞数の確率はポアソン分布に従うものと仮定する。陽性対照細胞試料中に混入させた悪性形質転換細胞細胞の希釈率から、1ウェルに含まれる細胞数の割合の理論値、及び、総画分数における期待値に加え、観察されうる総コロニー数の期待値が得られる。この期待値と実際の総コロニー数の観測値から、単一悪性形質転換細胞のコロニー形成確率を算出することが出来る。
1-1.材料及び方法
寒天は低融点アガロースであるSeaPlaqueTM Agarose(Lonza社)を、96ウェルマイクロプレートはGreiner社655892、培地はD-MEM(和光純薬株式会社)を使用した。
軟寒天培地での培養30日目に、顕微鏡下で各ウェルの観察を行ったところ、HeLa細胞を混入させた細胞試料を播種した40ウェル中において、球状の細胞塊(コロニー)(図2(a))を含むウェルが複数確認された。一方、hMSCのみを含む陰性コントロールの40ウェル内及びブランクウェル内ではコロニー形成は観察されなかった。これらの結果から、軟寒天培地中のような三次元環境下においては、hMSCのような正常な細胞は足場が存在しないためほとんど増殖しないのに対し、HeLa細胞は増殖能を損なうことなく生存し続け、コロニーを形成することが示された。
2-1.材料及び方法
実施例1の1-1と同様の操作を行い、0.4%軟寒天を含む10%ウシ胎児血清含有D-MEM培地で1000000個のhMSCと10個のHeLa-GFP細胞(Cell Biolabs社)を含むように調整した細胞試料を、96ウェルプレート上の80ウェルに75マイクロリットルずつ分注及び播種した。この時、1ウェル辺り12500個のhMSCと0.125個(すなわち8ウェル中に1個)のHeLa-GFP細胞を含むように細胞試料の濃度を調整した。更に、陰性コントロールとしてHeLa-GFP細胞を含まない1000000個のhMSCのみからなる同様の細胞試料を、75マイクロリットルずつ80ウェルに分注及び播種した別の96ウェルプレートも用意した。
その結果、HeLa-GFP細胞を含む4枚のプレートそれぞれでコロニーを含むウェルが観察された。一方、MSCのみを含む陰性コントロールプレートのウェル内ではコロニー形成は観察されなかった。各プレートの1つのウェルに含まれたコロニー数を表3に示す。
200:細胞含有培地層
300:栄養層
400:悪性形質転換細胞
401:コロニー
Claims (1)
- 複数のウェルを有するマルチウェルプレートの各ウェルの底部に、アガロースを含有する寒天培地である第1の培地からなる底部培地層を形成し、
細胞集団中に悪性形質転換細胞の存在が疑われる細胞試料につき、前記細胞試料中の前記悪性形質転換細胞の濃度が1つのウェルあたり悪性形質転換細胞が1個以下となるように前記細胞集団を複数に分画し、その分画した細胞集団を足場非依存性細胞増殖用のアガロースを含有する軟寒天培地である第2の培地に播種して細胞含有培地を形成し、該細胞含有培地を前記底部培地層の上に載置して細胞含有培地層を形成し、
前記細胞含有培地層の上に細胞に栄養を供給するための栄養層を載置し、前記ウェル中に前記底部培地層と前記細胞含有培地層と前記栄養層とを積層した状態にて細胞を培養し、
培養後に前記栄養層を除去して、前記悪性形質転換細胞を染色可能な染色試薬を添加し、固定処理を施した後、
前記底部培地層における第1の培地及び、前記細胞含有培地層における第2の培地を溶解させて、前記細胞含有培地層中の細胞をウェル底部に沈降させ、イメージングにより前記悪性形質転換細胞のコロニーの有無を検出することを特徴とする、悪性形質転換細胞の検出方法。
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JP5935141B2 (ja) * | 2011-10-03 | 2016-06-15 | 国立大学法人 鹿児島大学 | 水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムを用いた定量的軟寒天コロニー形成アッセイ |
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