JP5935141B2 - 水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムを用いた定量的軟寒天コロニー形成アッセイ - Google Patents
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Description
1-1.材料及び方法
寒天はAgarose typeVII(シグマ社(A9045))、96ウエルマイクロタイタープレートはNUNC社163371、培地はRPMI-1640(日水製薬株式会社)を使用し、発色には1-methoxy PMS及びWST-1(同仁化学研究所)を用いた。
結果を図1に示す。図1において、(A)のグラフはDU145細胞の細胞数に対する吸光度(OD405)の関係を示すグラフである。(B)のグラフはPanc1細胞の細胞数に対する吸光度(OD405)の関係を示すグラフである。
2-1.材料及び方法
実施例1の第1-1節と同様に操作し、DU145細胞を1ウエルあたり10000個の条件で播種し、培地のみをコントロールとして、抗癌剤Paclitaxelをそれぞれ図2において表示した濃度で100マイクロリットルずつ重層し、上記と同様に1週間培養の後に測定を行った。
結果を図2に示す。図2において縦軸は、生存率(%)を示す。
3-1.材料及び方法
実施例1の第1-1節と同様に操作し、DU145細胞を1ウエルあたり10000個の条件で播種し、培地のみをコントロールとして、新規の化学物質A、B及びCをそれぞれ図3において表示した濃度で100マイクロリットルずつ重層し、上記と同様に1週間培養の後にアッセイを行った。その後、実施例2の第2-1節と同様に実験・測定を行った。
結果を図3に示す。図3において縦軸は、生存率(%)を示す。
本実施例では、実施例3に記載の化学物質による癌細胞のコロニー形成抑制効果の評価と同様の手順により、11種類の類似低分子による癌細胞のコロニー形成抑制効果の評価を行った。使用した低分子はPCA-1阻害効果を有し、副作用(細胞毒性)がより少なく、腫瘍縮小効果が高い理想的な抗腫瘍薬剤となる可能性があるものである。
本実施例では、実施例3に記載の化学物質による癌細胞のコロニー形成抑制効果の評価と同様の手順により、既に悪性新生物の治療に用いられ、且つ効果が確認されている分子標的薬剤であるイマチニブについて、その治療標的分子であるBCR-Ablを発現しており、治療効果を示す細胞であるK562細胞を用いて癌細胞のコロニー形成抑制効果の評価を行った。ただし、K562細胞は浮遊細胞であるので、軟寒天内での増殖の不利は上皮性細胞よりも少ないものと予想された。
Claims (13)
- 容器底面の寒天上に細胞を含む寒天を重層し、細胞を含む寒天の上部に培地を重層し、細胞を培養する工程と、
培地を除去し、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと電子キャリアーとを添加し、細胞を培養する工程と、
水溶性ホルマザンの発色を指標として細胞の生存を評価する工程と、
を含み、寒天可溶化バッファー添加による寒天の可溶化及び界面活性剤添加による生成したホルマザンの溶解を行わない、細胞の生存を評価する方法。 - 水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムが2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム・モノナトリウム塩である、請求項1記載の方法。
- 電子キャリアーが1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェートである、請求項1又は2記載の方法。
- 容器底面の寒天の濃度が0.55〜0.65%である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 細胞を含む寒天の濃度が0.35〜0.45%である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 容器底面の寒天上に癌細胞を含む寒天を重層し、癌細胞を含む寒天の上部に培地を重層し、癌細胞を培養する工程であって、癌細胞を含む寒天又は培地が候補抗癌剤を含有する、前記工程と、
培地を除去し、水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと電子キャリアーとを添加し、癌細胞を培養する工程と、
水溶性ホルマザンの発色を指標として癌細胞の増殖を評価する工程と、
を含み、寒天可溶化バッファー添加による寒天の可溶化及び界面活性剤添加による生成したホルマザンの溶解を行わない、抗癌剤のスクリーニング方法。 - 水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムが2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム・モノナトリウム塩である、請求項6記載の方法。
- 電子キャリアーが1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェートである、請求項6又は7記載の方法。
- 容器底面の寒天の濃度が0.55〜0.65%である、請求項6〜8のいずれか1項記載の方法。
- 癌細胞を含む寒天の濃度が0.35〜0.45%である、請求項6〜9のいずれか1項記載の方法。
- 水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムと、電子キャリアーと、寒天とを含み、寒天可溶化バッファー及び界面活性剤を含まない、細胞生存又は細胞増殖評価キット。
- 水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウムが2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム・モノナトリウム塩である、請求項11記載のキット。
- 電子キャリアーが1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェートである、請求項11又は12記載のキット。
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