CN112285081B - 一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用 - Google Patents

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用。所述检测方法包括如下步骤：将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞混合共培养，而后加入荧光标记B对靶细胞和效应细胞进行标记，加入荧光标记C对所述共培养后产生的死细胞进行染色标记；而后分别使用不同的荧光通道对细胞进行显微成像，结合图像合成分析方法对显微图像中同一区域的细胞进行识别并分析，根据分析结果得到效应细胞的细胞杀伤效力。因此，所述检测方法可以有效排除杂质和细胞碎片的干扰，能够由图像直接得到细胞死亡率、细胞自伤率以及细胞特异杀伤率等多项数据，检测结果直观可视，准确度和灵敏度都较高。

Description

一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞杀伤活性检测技术领域，涉及一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用。
背景技术
杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的效应细胞，如自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T细胞(CTL)、具有吞噬作用的单核细胞、巨噬细胞等。
目前，细胞杀伤效力的检测方法主要包括：51Cr释放试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放法和Calcein释放实验等。其中，经典的方法是51Cr释放实验，该方法可重复性好，被视为细胞杀伤效力检测方法的“金标准”。但是因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其它替代方法进行生物学效力检测。
乳酸脱氢酶(LDH)释放法利用乳酸脱氢酶在胞质内含量丰富、正常状态下无法通过细胞膜，但是在细胞损伤或者死亡的状态下即可释放到胞外的特点，来检测效应细胞的杀伤效力。Calcein释放实验中，Calcein acetoxymethy1酯(Calcein-AM)是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共育，再加Fluoro-Quench试剂，淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔比较，计算效应细胞杀伤靶细胞百分比。
然而，不论是LDH释放法还是Calcein释放实验，都属于间接法，需要通过测定释放物质的量来进行定量，在实验过程中，反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。
流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种先进的细胞定量分析技术，其工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。但是，在检测细胞杀伤的过程中，流式分析的方法在实验阶段需要根据经验调节电压，数据分析阶段需要根据经验进行圈门，这样的过程引入了操作人和分析人的主观误差。且流式细胞仪属于液流系统，无法采集到细胞图像，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察进行佐证，这导致在需要标准化可重复验证的医疗诊断和生物医药产业化领域中，流式细胞术难以广泛使用。
因此，提供一种基于显微图像识别、直观可视并且准确的评估方法来评价细胞的杀伤活性，对于免疫细胞杀伤效力的检测以及免疫治疗相关技术的发展具有重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用。所述方法结合荧光显微成像和图像合成分析方法，快速、直观、准确地统计靶细胞和效应细胞的数量，并给出效应细胞杀伤效力的评价结果。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞混合共培养，而后加入荧光标记B对靶细胞和效应细胞进行标记，加入荧光标记C对所述共培养后产生的死细胞进行染色标记；
其中，荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C对应的激发光波长不同；
(2)分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道、荧光标记B匹配的荧光通道以及荧光标记C匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像；
(3)通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果得到所述效应细胞的细胞杀伤效力检测结果。
本发明中提供一种在体外分析细胞杀伤能力的方法，通过荧光标记A对肿瘤细胞进行标记，作为靶细胞，再用荧光标记B对靶细胞和效应细胞同时标记，设定适当的效靶比，将靶细胞和效应细胞共同孵育一定时间；再用荧光标记C对死细胞进行标记，将混合的样本放入计数板，放置到显微荧光成像系统下摄像，对同一视场的显微图像进行叠加合成分析计数，即可计算效应细胞的杀伤率。
用三种不同激发光波段的荧光试剂A、荧光标记B和荧光标记C分别对靶细胞、所有细胞和死细胞进行染色标记，而后通过荧光显微成像和图像合成分析，在同一位置或同一视野分别用明场和适合3种荧光标记的显微荧光通道进行显微成像，然后将同一视场的显微图像进行叠加合成分析，得到检测结果，即本发明中采用的是由图像直接得到检测结果的“直读法”，对比镉51释放实验以及流式细胞术采用的间接法，本发明的检测结果更加准确和直观。
所述叠加合成分析过程中，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为活的靶细胞，同时显示荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C的细胞为死的靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为活的效应细胞，同时显示荧光标记B和荧光标记C的细胞为死的效应细胞。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述识别结果包括细胞的位置信息、尺寸信息或荧光强度中的任意一种或至少两种的组合。
所述分析结果包括：靶细胞和效应细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活效应细胞数、死效应细胞数、靶细胞死亡率或效应细胞死亡率中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，通过荧光图像识别方法对荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C的图像中的荧光目标进行识别，获得检测目标的位置信息、尺寸信息等；而后对所得到的荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C的显微图像识别结果进行叠加合成分析。
其中，能够在荧光标记B的显微图像中获取到所有细胞的位置信息和尺寸信息；活的靶细胞的位置信息和尺寸信息能同时在荧光标记A的显微图像中获取；死的靶细胞的位置信息和尺寸信息能同时在荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C的显微图像中获取；活的效应细胞的位置信息和尺寸信息仅能在荧光标记B的显微图像中获取；死的效应细胞的位置信息和尺寸信息能同时在荧光标记B和荧光标记C的显微图像中获取。
具体信息如表1所示：
表1
Figure BDA0002748035620000041
Figure BDA0002748035620000051
其中，所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：
靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；
所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：
效应细胞死亡率＝死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％。
同样的，若为了计算靶细胞活率和效应细胞活率，可以采用如下公式进行计算：
靶细胞活率＝活靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；
效应细胞活率＝活效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％。
由此可知，靶细胞死亡率和靶细胞活率之和为100％，效应细胞死亡率和效应细胞活率之和也为100％，说明本发明中，各种细胞类型在统计过程中较为准确。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中将靶细胞与效应细胞共培养时，还分别单独培养靶细胞和效应细胞作为对照组。
优选地，所述检测方法还包括如下步骤：对所述对照组分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道、荧光标记B匹配的荧光通道以及荧光标记C匹配的荧光通道进行显微成像，得到显微图像；对所述对照组的显微图像进行图像识别，并将识别结果进行叠加合成分析，得到对照组的靶细胞死亡率和/或对照组的效应细胞死亡率。
优选地，步骤(3)所述分析结果还包括：细胞特异杀伤率和/或效应细胞自伤率。
其中，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：
细胞特异杀伤率＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；
所述效应细胞自伤率采用如下公式进行计算：
效应细胞自伤率＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。
优选地，步骤(1)中所述荧光标记A包括荧光蛋白或细胞染料。
所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或荧光素酶(Luc)中的任意一种。
本发明中，所述靶细胞可以是免疫细胞相对应的各种肿瘤细胞或病毒感染的靶细胞。靶细胞可以载有GFP、RFP或Luc等标签用于识别，也可以用CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)或钙黄绿素AM(Calcein-AM)等活性染料进行标记。
优选地，步骤(1)中使用荧光标记A对靶细胞进行染色标记后，还包括洗涤的操作。
优选地，步骤(1)中所述靶细胞包括病毒感染的细胞或肿瘤细胞。例如可以是无荧光蛋白标记的或有荧光蛋白标记的K562细胞、Daudi细胞、Jurkat细胞、MCF-7细胞、A549细胞或HepG2细胞等；也可以是其他与前述细胞具有相同作用机理的细胞。
优选地，步骤(1)中所述效应细胞包括免疫细胞或工程化细胞，例如可以是PBMC细胞、NK细胞、T细胞、CTL细胞、LAK细胞、CIK细胞、TIL细胞、DC细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、NK92MI-CD16a细胞等。
优选地，步骤(1)中所述荧光标记B为活细胞染料。本发明中，靶细胞和效应细胞共同染色时，所选用的染料或者标记物优选为核染料，也可以是区别于靶细胞染料和死细胞染料的试剂。
优选地，步骤(1)中所述荧光标记C为死细胞染料。死细胞染色标记可以是任意死细胞标记染料，可以是例如Annexin-V(膜联蛋白-V)、SYTOX Green(绿菁SYTOX)、PI(溴化丙啶)和7-AAD(7-氨基放线菌素D)等中的任意一种或至少两种的组合。
或者，荧光标记C也可以是区别于靶细胞染料的试剂。
需要说明的是，本发明中所述“活细胞染料”和“死细胞染料”，分别指的是能够对活的细胞、死的细胞进行染色的染料。
作为本发明优选的技术方案，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞混合共培养，同时单独培养靶细胞和效应细胞作为对照组细胞；
所述荧光标记A可以是荧光蛋白或细胞染料；荧光蛋白标签通过基因编辑转入靶细胞当中，使其在生长的过程中同时表达荧光蛋白，常用的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或荧光素酶中的任意一种；
所述荧光标记A也可以是细胞染料，如果所选细胞染料容易产生背景荧光，需进行洗涤，如果所选试剂没有背景荧光或背景荧光不影响分析，可免除此步骤；
(2)共培养结束后，加入荧光标记B对靶细胞和效应细胞进行标记；所述荧光标记B为活细胞染料，能够对所有的细胞进行染色。其中，荧光标记B的激发光波长与荧光标记A不同；
(3)再使用荧光标记C对所述共培养后产生的死细胞进行染色标记；
所述荧光标记C为死细胞染料，其中荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C对应的激发光波长不同；选用三种不同激发光的荧光标记对不同的细胞进行区分，方便后续进行统计分析；
(4)将所述染色后得到的细胞转移至加入血球计数板或与血球计数板有类似固定距离微缝结构的细胞计数板；
(5)将步骤(4)制备的已经加样的计数板放置到显微荧光成像系统下摄像，对同一位置或同一视野分别摄取明场通道、荧光标记A匹配的荧光通道、荧光标记B匹配的荧光通道以及荧光标记C匹配的荧光通道下的显微图像，得到4张显微成像图片；
(6)图像合成分析计数：以明场通道和/或荧光标记B通道下获得的图像进行细胞计数，得到总细胞数；而后所述叠加分析所得到的4张显微成像图片中，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为活的靶细胞，同时显示荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C的细胞为死的靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为活的效应细胞，同时显示荧光标记B和荧光标记C的细胞为死的效应细胞。
最后，计算靶细胞死亡率、效应细胞死亡率、对照组靶细胞和效应细胞的死亡率、细胞特异杀伤率和效应细胞自伤率，得到细胞杀伤效力的检测结果；
所使用的计算公式如下：
靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；
效应细胞死亡率＝死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％；
细胞特异杀伤率(％)＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；
效应细胞自伤率(％)＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。
第二方面，本发明还提供一种如第一方面所述的检测方法在检测细胞杀伤力、制备免疫细胞制剂或研究免疫细胞疗法中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的方法先通过三种不同波长的荧光标记对靶细胞、活细胞和死细胞进行分别染色，能够在不同的波长下得到不同的显微图像，通过对显微图像的叠加合成分析，区分活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞，进而得到靶细胞和效应细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活效应细胞数和死效应细胞数，根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率等结果；
(2)本发明提供的方法通过三种荧光标记判定全部靶细胞和效应细胞，和明场下识别的双染法(两种染色标记)相比，更容易排除明场下的杂质，有效排除杂质和细胞碎片的干扰，使结果更准确；
(3)本发明提供的方法结合荧光显微成像和图像合成分析技术，能够同时得到待测细胞的图像信息和数据处理结果，相比流式细胞仪提供的检测结果而言，根据荧光标记即可统计各种细胞的数量，所得结果更加直观，能在一台仪器上得到细胞死亡率、细胞自伤率以及细胞特异杀伤率等多项数据，减少了检测步骤，提高了检测效率。
附图说明
图1为实施例1中FL1荧光通道下得到的荧光显微图像。
图2为实施例1中FL2荧光通道下得到的荧光显微图像。
图3为实施例1中FL3荧光通道下得到的荧光显微图像。
图4为实施例1中不同荧光通道叠加后得到的荧光显微图像。
图5为实施例3中在不同效靶比下、不同荧光通道图像叠加后得到的显微图像。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，所使用的试剂均可购自常规厂商；同时，若无特殊说明，所采用的实验方法均为本领域技术人员知晓的常规方法。
实施例1
本实施例提供一种细胞杀伤效力的检测方法，具体步骤如下：
(1)靶细胞标记：
培养并收集靶细胞，向靶细胞中加入荧光染料CFSE(购买自Biolegend，USA)进行孵育，标记，将标记后的靶细胞制备为细胞溶液；
(2)准备效应细胞：
将效应细胞制备为细胞溶液；
(3)进行效靶细胞共培养：
在培养皿中同时加入靶细胞和效应细胞，效靶比设置为1:1，孵育共培养结束后取样，加入Hoechst33342(购买自Thermofisher，USA)和PI染料(购买自Sigma，USA)，染色；
(4)将步骤(3)得到的细胞加入血球计数板；
(5)将加样的血球计数板放置到检测仪器的样品台上，分别摄取明场通道、FL1通道(匹配荧光染料Hoechst33342)、FL2通道(匹配荧光染料CFSE)、FL3通道(匹配荧光染料PI)；
其中，三个荧光通道信息及顺序分别如下：
FL1：Ex 375nm，Em 460nm；FL2：Ex 480nm，Em 535nm；FL3：Ex 525nm，Em 600LP；
FL1通道激发与采集Hoechst33342荧光，FL2通道激发与采集CFSE荧光，FL3通道激发与采集PI荧光。
(6)然后在同一位置分别用明场和适合3种荧光试标记的显微荧光通道进行显微成像，得到4张显微成像图片；
(7)图像合成分析：图像识别软件会将明场、FL1通道、FL2通道以及FL3通道下的荧光图片进行识别：
其中，同时显示Hoechst33342荧光和CFSE荧光的细胞为活的靶细胞，同时显示Hoechst33342荧光、CFSE荧光和PI荧光的细胞为死的靶细胞，仅显示Hoechst33342荧光的细胞为活的效应细胞，同时显示Hoechst33342荧光和PI荧光的细胞为死的效应细胞；
所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：
靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；
所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：
效应细胞死亡率＝死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％。
具体对应为：
FL1通道下拍摄图片识别的目标为总细胞(包含靶细胞与效应细胞)；
FL2通道下拍摄图片识别的目标为靶细胞(包含活的靶细胞与死的靶细胞)；
FL3通道下拍摄图片识别的目标为总的死细胞(包含死的靶细胞和死的效应细胞)；
图片叠加后，所得结果如图1～图4所示，并对细胞所在的同一位置进行标示。其中，图1为FL1通道下的显微图像，图2为FL2通道下的显微图像，图3为FL3通道下的显微图像，图4为三种通道叠加后获得的显微图像。
若此处只有FL1的信号，标示并统计数目为a；此处同时有FL1和FL2信号，标示并统计数目为b；此处同时有FL1和FL3信号，标示并统计数目为c；此处同时有FL1，FL2和FL3信号，标示并统计数目为d。
并自定义编辑公式如下：
活的靶标细胞个数＝b；死的靶标细胞个数＝d；
靶细胞死亡率(％)＝d/(b+d)×100；
活的效应细胞个数＝a；死的效应细胞个数＝c；
效应细胞死亡率(％)＝c/(a+c)×100。
实施例2
本实施例提供一种细胞杀伤效力的检测方法，具体步骤如下：
(1)靶细胞标记：
培养并收集靶细胞，向靶细胞中加入荧光染料CFSE(购买自Biolegend，USA)进行孵育，标记，将标记后的靶细胞制备为细胞溶液；
(2)准备效应细胞：
将效应细胞制备为细胞溶液；
(3)进行细胞共培养：
在培养皿中同时加入靶细胞和效应细胞(作为实验组)，效靶比设置为1:1，孵育共培养结束后取样，加入Hoechst33342(购买自Thermofisher，USA)和PI染料(购买自Sigma，USA)，染色；
同时制备对照组细胞：在培养皿中仅加入靶细胞和培养基作为靶细胞对照组，在另外的培养皿中仅加入效应细胞和培养基作为效应细胞对照组；
对上述对照组和实验组放在培养环境下培养；
(4)将步骤(3)得到的细胞加入血球计数板；
(5)将加样的血球计数板放置到检测仪器的样品台上，分别摄取明场通道、FL1通道(匹配荧光染料Hoechst33342)、FL2通道(匹配荧光染料CFSE)、FL3通道(匹配荧光染料PI)；
其中，三个荧光通道信息及顺序分别如下：
FL1：Ex 375nm，Em 460nm；FL2：Ex 480nm，Em 535nm；FL3：Ex 525nm，Em 600LP；
FL1通道激发与采集Hoechst33342荧光，FL2通道激发与采集CFSE荧光，FL3通道激发与采集PI荧光。
(6)然后在同一位置分别用明场和适合3种荧光试标记的显微荧光通道进行显微成像，得到4张显微成像图片；
(7)图像合成分析：图像识别软件会将明场、FL1通道、FL2通道以及FL3通道下的荧光图片进行识别：
图片叠加后，软件对细胞所在的同一位置进行标示。
若此处只有FL1的信号，标示并统计数目为a；此处同时有FL1和FL2信号，标示并统计数目为b；此处同时有FL1和FL3信号，标示并统计数目为c；此处同时有FL1，FL2和FL3信号，标示并统计数目为d。
并自定义编辑公式如下：
活的靶标细胞个数＝b；死的靶标细胞个数＝d；
靶标细胞死亡率(％)＝d/(b+d)×100；
活的效应细胞个数＝a；死的效应细胞个数＝c；
效应细胞死亡率(％)＝c/(a+c)×100。
除了获取实验组的靶细胞死亡率以及效应细胞死亡率之外，本实施例中还能够获得对照组中的靶细胞死亡率以及效应细胞死亡率，从而计算细胞特异杀伤率和效应细胞自伤率；
其中，细胞特异杀伤率(％)＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；效应细胞自伤率(％)＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。
在设置对照的情况下，排除细胞自然死亡等情况对细胞杀伤效力检测结果的影响，提高检测精确度。
实施例3
相比于实施例2，本实施例中还设置了不同的效靶比(E:T)作为实验组，以测定不同效靶比下细胞的杀伤效力。
将效应细胞的工作浓度设置为1×106/mL，3×106/mL，6×106/mL的不同浓度，对应的效靶比为1:1、3:1和6:1。
所得到的叠加图像如图5所示，图中不同的细胞显示出不同的颜色，在效靶比较低时，活的靶细胞数量较多；在效靶比较高时，死的靶细胞占大多数。该结果也进一步说明了，在效靶比较高时，效应细胞的杀伤效力较好。
综上所述，本发明提供的方法较为直观，能够直接获得可视化的细胞荧光图像，基于显微图像获得细胞的不同状态进而分析免疫细胞的杀伤效力。该方法步骤简单，提高了检测的效率和准确度。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种细胞杀伤效力的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
（1）将携带荧光标记A的靶细胞与效应细胞混合共培养，并加入荧光标记B对靶细胞和效应细胞进行标记，加入荧光标记C对所述共培养后产生的死细胞进行染色标记作为实验组；
其中，荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C对应的激发光波长不同；
步骤（1）中将靶细胞与效应细胞共培养时，还分别单独培养靶细胞和效应细胞作为对照组；
（2）对实验组和对照组分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道、荧光标记B匹配的荧光通道以及荧光标记C匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像；
（3）通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果得到所述效应细胞的细胞杀伤效力检测结果；
步骤（3）所述识别结果包括细胞的位置信息、尺寸信息或荧光强度中的任意一种或至少两种的组合；
所述叠加合成分析过程中，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为活的靶细胞，同时显示荧光标记A、荧光标记B和荧光标记C的细胞为死的靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为活的效应细胞，同时显示荧光标记B和荧光标记C的细胞为死的效应细胞；
所述分析结果包括：靶细胞和效应细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活效应细胞数、死效应细胞数、靶细胞死亡率或效应细胞死亡率中的任意一种或至少两种的组合；
其中，对所述对照组的显微图像进行图像识别，并将识别结果进行叠加合成分析，得到对照组的靶细胞死亡率和/或对照组的效应细胞死亡率；
其中，所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：
靶细胞死亡率=死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100%；
所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：
效应细胞死亡率=死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100%；
步骤（3）所述分析结果还包括：细胞特异杀伤率和/或效应细胞自伤率；
其中，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：
细胞特异杀伤率=靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；
所述效应细胞自伤率采用如下公式进行计算：
效应细胞自伤率=效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述荧光标记A包括荧光蛋白或细胞染料；
所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或荧光素酶中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中使用荧光标记A对靶细胞进行染色标记后，还包括洗涤的操作。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述靶细胞包括病毒感染的细胞或肿瘤细胞；
步骤（1）中所述靶细胞包括免疫细胞靶向的肿瘤细胞和/或病毒感染的细胞；
步骤（1）中所述靶细胞包括无荧光蛋白标记的和/或有荧光蛋白标记的K562细胞、Daudi细胞、Jurkat细胞、MCF-7细胞、A549细胞或HepG2细胞中的任意一种或至少两种的组合；
步骤（1）中所述效应细胞包括免疫细胞或工程化细胞；
步骤（1）中所述效应细胞包括PBMC细胞、NK细胞、T细胞、CTL细胞、LAK细胞、CIK细胞、TIL细胞、DC细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞或NK92MI-CD16a细胞中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述荧光标记B为活细胞染料；
步骤（1）中所述荧光标记C为死细胞染料。
6.如权利要求1~5任一项所述的检测方法在检测细胞杀伤力、制备免疫细胞制剂中的应用。
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