CN107760754A - 体外检测免疫细胞杀伤效率的方法 - Google Patents
体外检测免疫细胞杀伤效率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107760754A CN107760754A CN201610688692.2A CN201610688692A CN107760754A CN 107760754 A CN107760754 A CN 107760754A CN 201610688692 A CN201610688692 A CN 201610688692A CN 107760754 A CN107760754 A CN 107760754A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- tumour cell
- immunocyte
- tumour
- killing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 149
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 140
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 12
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 46
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 26
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 15
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 3
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QGZCUOLOTMJILH-UHFFFAOYSA-N 2h-tetrazol-2-ium;bromide Chemical compound [Br-].C1=N[NH+]=NN1 QGZCUOLOTMJILH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 201000011061 large intestine cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005096 hematological system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
- G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种体外检测免疫细胞杀伤效率的方法，具体地，本发明提供了一种检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的方法，包括步骤：(i)提供一培养体系，在适合培养的条件下，在所述培养体系中培养肿瘤细胞，从而获得含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系，其中所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系；(ii)向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞，共培养一段时间，获得含有肿瘤细胞和免疫细胞的混合培养体系；和(iii)在显微镜下观察所述肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，从而测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。本发明借助显微镜可直观的观察到肿瘤细胞的形态和存活的肿瘤细胞的数量，还可准确的计算出免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体地，涉及体外检测免疫细胞杀伤效率的方法。
背景技术
治疗肿瘤是人类的最大挑战，通常需要采用综合治疗方法，包括手术切除肿瘤、放疗、化疗，但这些方法存在肿瘤迁移与复发的危险，而且具有严重损伤正常组织和免疫功能的副作用。半个世纪生命科学积累表明肿瘤实际上是机体免疫系统不能监护和清除时时刻刻在突变细胞的积聚，从而蚕食正常机体机能，最终危机患者的生命。而提高机体免疫力治疗肿瘤则成为现代生物学对肿瘤治疗最大贡献，细胞免疫治疗通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和杀伤功能，清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞，达到预防复发及转移，达到根治肿瘤的目的，具有特异性强、毒副作用小等特点。从而成为肿瘤综合治疗的一个必不可少的组成部分，其中肿瘤细胞免疫治疗是一种崭新的、最具有显著疗效的肿瘤治疗方式之一。
根据免疫细胞治疗的特点及抗肿瘤的机制细胞免疫治疗可分为主动性免疫治疗和过继性细胞免疫治疗，或特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗。目前肿瘤细胞免疫治疗研究主要集中在过继性免疫治疗，利用体外扩增的免疫细胞，如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、DC细胞、NK细胞、基因修饰的T细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL细胞)等进行肿瘤的治疗。通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的，是继传统疗法(手术、化疗和放疗)、靶向疗法后肿瘤治疗领域又一项突出有效的治疗方式。
肿瘤细胞免疫治疗是现在科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法。具体涉及的是通过一定手段采集或分离得到人体自身免疫细胞，经过体外诱导、培养后，得到数量增多、靶向杀伤性增强的各种免疫细胞(如CIK细胞、NK细胞、TIL细胞、DC细胞等)，这些细胞可释放穿孔素/颗粒酶，穿孔素在癌细胞表面穿孔，使颗粒酶进入细胞内诱导癌细胞凋亡；或者分泌大量细胞因子，直接作用癌细胞或激活其他免疫细胞杀伤癌细胞，把这些免疫细胞回输到人体，达到杀灭血液和组织中的癌细胞。这种方法打破免疫耐受，激活和增强机体自身的免疫能力，达到治疗和保健的双重功效。
淋巴细胞作为免疫细胞中最重要的一类，是现今肿瘤免疫细胞治疗研究中的焦点。当淋巴细胞在体外与靶细胞接触时，可表现出破坏和溶解靶细胞的特性，称为淋巴细胞毒作用(cytotoxicity)。靶细胞可以是肿瘤细胞或其它组织细胞。淋巴细胞杀伤靶细胞的方式可通过直接杀伤或产生淋巴因子破坏靶细胞。淋巴细胞毒性实验是评价体外培养淋巴细胞对靶细胞杀伤效率的重要方法。常规采用的操作方法是把淋巴细胞与人白血病细胞系K562进行共培养，检测经过淋巴细胞杀伤后残余K562细胞的活性来反映淋巴细胞的杀伤效率。其中存在的问题是K562细胞是血液系统肿瘤细胞系，呈悬浮状态，并且在细胞大小上，与淋巴细胞差别不是很明显，这就造成我们只能通过检测残余K562细胞的活力来反映淋巴细胞的杀伤效率。这就造成实验结果不太稳定，操作不简便易行。
因此，本领域迫切需要开发一种可直观准确的检测免疫细胞对靶细胞杀伤效率以及可从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断免疫细胞杀伤靶细胞的能力的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可直观准确的检测免疫细胞对靶细胞杀伤效率以及可从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断免疫细胞杀伤靶细胞的能力的方法。
本发明的第一方面提供了一种非治疗性和非诊断性的检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的方法，包括步骤：
(i)提供一培养体系，在适合培养的条件下，在所述培养体系中培养肿瘤细胞，从而获得含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系，其中所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系；
(ii)向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞，共培养一段时间，获得含有肿瘤细胞和免疫细胞的混合培养体系；和
(iii)在显微镜下观察所述肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，从而测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
在另一优选例中，在步骤(iii)之前,还包括用洗脱法处理免疫细胞的步骤。
在另一优选例中，在向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞之前，对所述肿瘤细胞进行计数。
在另一优选例中，设立对照组，所述对照组中仅含有肿瘤细胞，不含有所述免疫细胞，计算对照组中肿瘤细胞的数量。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)，用其他检测方法进一步测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
在另一优选例中，用洗脱法处理免疫细胞后，用以下公式测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率：杀伤效率＝1-共培养组细胞活力/肿瘤细胞对照组细胞活力；
其中，共培养组细胞活力指免疫细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独肿瘤细胞培养组的细胞活力。
在另一优选例中，不经洗脱法处理免疫细胞，用以下公式测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率：杀伤效率＝1-(共培养组细胞活力-免疫细胞对照组细胞活力)/肿瘤细胞对照组细胞活力；
其中，共培养组细胞活力指免疫细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组的单独的肿瘤细胞的细胞活力；免疫细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独免疫细胞培养组的细胞活力。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：肺癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、其他类型肿瘤细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自下组：肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系HepG2、其他类型肿瘤细胞系、或其组合。
在另一优选例中，步骤(i)中，所述的培养体系中，所述肿瘤细胞的培养密度为1000-10000个细胞/0.1ml，较佳地，2000-8000个细胞/0.1ml，更佳地，3000-6000个细胞/0.1ml。
在另一优选例中，步骤(i)中，所述的培养体系为96孔板。
在另一优选例中，步骤(i)中，所述的培养体系的体积为30-250μl，较佳地40-200μl，更佳地50-150μl。
在另一优选例中，步骤(i)中，所述肿瘤细胞的培养时间为0-48h，较佳地，2-24h。
在另一优选例中，步骤(i)中，所述肿瘤细胞的培养温度为35-39℃，较佳地，36-38℃。
在另一优选例中，步骤(i i)中，所述免疫细胞选自下组：淋巴细胞。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述免疫细胞与肿瘤细胞的效靶比为1-100：1，较佳地，10-50：1，更佳地，20-50：1。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述共培养的时间为0.5-96h，较佳地，1-48h，更佳地，2-24h。
在另一优选例中，步骤(iv)中，所述其他检测方法选自下组：MTT法、LDH释放法、CellTiter检测方法、或其组合。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述免疫细胞的密度为0.2×104－1×106个细胞/0.1ml，较佳地，0.5×104－8×105个细胞/0.1ml，更佳地，1×104－3×105个细胞/0.1ml。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述共培养的温度为35-39℃，较佳地，36-38℃。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了倒置荧光显微镜10倍物镜下观察的拍照结果，可以看到淋巴细胞与肿瘤细胞共培养组中，淋巴细胞把肿瘤细胞都包围覆盖了，大部分地方看不到肿瘤细胞，极少数地方可以看到有变形的肿瘤细胞，这说明淋巴细胞识别并攻击肿瘤细胞。
图2显示了倒置荧光显微镜20倍物镜下观察的拍照结果，为图1实验结果高倍镜下的观察结果，更明显地反映出靶向肿瘤细胞被杀伤的效果。
图3显示了倒置荧光显微镜4倍物镜下观察的拍照结果。
图4显示了倒置荧光显微镜4倍物镜下观察的拍照结果。
图5显示了倒置荧光显微镜4倍物镜下观察的拍照结果。
在图3-图5中，正常情况下，贴壁生长好的肿瘤细胞很难被移液枪吹洗下来，在加入淋巴细胞共培养后，经过淋巴细胞杀伤过的肿瘤细胞，因为细胞死亡或者将要死亡，细胞没有贴壁性或贴壁性很差，则很容易被吹洗下来，图片结果为淋巴细胞与肿瘤细胞共培养处理后，用PBS缓冲液进行吹洗前后的拍照结果，对照组和实验组平行操作。可以看出单独的肿瘤细胞在吹洗前后基本没有变化，而共培养组的细胞在吹洗后，基本都掉落，这说明肿瘤细胞基本被淋巴细胞全部杀伤或杀死。
具体实施方式
本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次意外地发现，将肿瘤细胞(如实体肿瘤细胞系)和免疫细胞(如淋巴细胞)进行共培养一段时间，借助显微镜可直观的观察到肿瘤细胞的形态和存活的肿瘤细胞的数量，还可准确的计算出免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。在此基础上，本发明人完成了本发明。
如本文所用，术语“其他类型肿瘤细胞或细胞系”指不局限于肺癌、肝癌和乳腺癌，还可以是胃癌、鼻咽癌、食管癌、大肠癌、宫颈癌等类型的肿瘤细胞或细胞系。
检测方法
对于杀伤试验中的靶细胞，针对不同的癌症种类，选择相应的人肿瘤细胞系，主要采用的是贴壁生长的细胞系。提前一定时间，可以是2小时到24小时，或更长时间铺设一定数量的肿瘤细胞，具体数量可采用96孔板每孔103-104个细胞，提前让肿瘤细胞能很好地贴壁生长，之后按照一定的效靶比，例如5:1、10:1、20:1、50:1、100:1等等，加入分离得到或体外诱导培养得到的免疫细胞，进行共培养，结果观察和检测的时间可根据实际情况调整，可以是2小时到24小时，或者共培养更长的时间。结果判断，可选择以下方法：形态检查法、洗脱法等。
形态检查法是指共培养结束后，直接在显微镜下观察免疫细胞分布的变化以及肿瘤细胞数量和形态的改变。绝大部分肿瘤细胞的体积比淋巴细胞大，且成贴壁生长，贴壁生长的肿瘤细胞如果在非常规消化的情况下脱落，则基本判断为即将死亡或死亡细胞。具体来说，如果杀伤效率很好的免疫细胞与肿瘤细胞进行共培养，可明显观测到免疫细胞包围肿瘤细胞，形成细胞杀伤团，肿瘤细胞数量明显减少或直接没有贴壁的细胞。正是存在这种对比，可以很直观地通过显微观察进行免疫细胞杀伤效率的大致判断。
洗脱法是指针对贴壁的肿瘤细胞，在共培养结束后，采用PBS缓冲液或其他细胞培养相关液体对共培养的体系进行轻柔地洗脱操作，洗去悬浮的免疫细胞和死亡脱落的肿瘤细胞，再直接通过显微镜观察存活的贴壁肿瘤细胞情况，从而判断出免疫细胞的杀伤效率。
在本发明中，通过改变靶细胞的选择种类，采用各种贴壁生长的肿瘤细胞系作为检测的靶细胞，结合不同的检测方法，例如形态检查法、洗脱法和细胞荧光染料追踪法进行检测，从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断淋巴细胞杀伤靶细胞的能力。
本发明可以作为体外测定肿瘤患者细胞免疫的指标，也可以通过测定机体免疫活性细胞杀伤肿瘤细胞的能力，来判断肿瘤患者的治疗效果，还可以鉴定淋巴细胞的功能性亚群。
在一优选实施方式中，所述检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的方法，包括步骤：
(i)提供一培养体系，在适合培养的条件下，在所述培养体系中培养肿瘤细胞，从而获得含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系，其中所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系；
(ii)向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞，共培养一段时间，获得含有肿瘤细胞和免疫细胞的混合培养体系；和
(iii)在显微镜下观察所述肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，从而测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
在一优选实施方式中，本发明还可结合MTT法、LDH释放法、CellTiter检测方法等方法进一步测定免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
本发明的检测方法不仅可直观的观察到肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，还可更精确的计算出免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次通过改变靶细胞的选择种类，采用各种贴壁生长的肿瘤细胞系作为检测的靶细胞，结合不同的检测方法，例如形态检查法、洗脱法和细胞荧光染料追踪法进行检测，从贴壁细胞数目的减少情况和形态的改变情况来判断淋巴细胞杀伤靶细胞的能力。
(2)本发明对淋巴细胞杀伤效率的检测提供了更加灵活的检测方法，可用显微镜直接观察肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，也可在显微镜观察前先用洗脱法处理细胞，再观察肿瘤细胞，直接根据不同的实验室条件(比如实验仪器或者试剂的限制等等)和不同的实验目的，可以灵活选择不同的判断方法。
(3)本发明可以作为体外测定肿瘤患者细胞免疫的指标，也可以通过测定机体免疫活性细胞杀伤肿瘤细胞的能力，来判断肿瘤患者的治疗效果，还可以鉴定淋巴细胞的功能性亚群。
(4)本发明不仅可直接用显微镜观察肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，还可以附加地采用MTT相关试剂和酶标仪进行细胞活力检测，从而获得更精确的杀伤效率(＞90％)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明实施例中所用的材料如无特别说明，均为市售产品。
实施例1用形态检查法检测淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
(1)靶细胞的接种：选用能贴壁生长的肿瘤细胞，本实施例选择三种常见癌症的相应细胞系，分别为人肺癌细胞系A549(购自中科院上海细胞库)、人乳腺癌细胞系MCF-7(购自中科院上海细胞库)和人肝癌细胞系HepG2(购自中科院上海细胞库)。肿瘤细胞经PBS缓冲液洗涤后用2.5g/L胰酶消化2～3min，显微镜下观察，确保细胞消化好之后，用含10％～20％小牛血清的DMEM细胞培养液(购自赛默飞公司)将贴壁细胞冲洗下来，离心去掉上清，再用培养液重悬细胞，计数细胞个数，调整细胞浓度，根据实际情况，96孔板的总体积为50-150μl，每孔可加4000个肿瘤细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃含5％CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)分离培养淋巴细胞：取受检者肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分层液分离得到淋巴细胞后，采用淋巴细胞生长培养液(包含人IL2、人CD137L等因子，购自Invitrogen公司)进行细胞体外培养，根据需要选择用于试验用的效应细胞，用培养基配成细胞悬液待用。
(3)细胞杀伤实验：淋巴细胞和靶细胞按效靶比例20∶1混合，每孔中加入8×104个淋巴细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃5％CO2细胞培养箱中24h。
(4)结果检测：采用倒置显微镜进行观察，可采用不同放大倍数的物镜进行观察。对比单独淋巴细胞组和单独肿瘤细胞组，可以观察到共培养试验组的淋巴细胞和肿瘤细胞的分布和形态都发生变化，贴壁的肿瘤细胞很少或直接没有，淋巴细胞和脱落的肿瘤细胞形成各种杀伤团。低倍物镜可观察到整体的肿瘤细胞存活情况(图1)，高倍物镜可明显观察到杀伤团的具体情况(图2)。
结合MTT细胞活力检测法，可以用下述公式计算淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
公式：杀伤效率＝1-(共培养组细胞活力-淋巴细胞对照组细胞活力)/肿瘤细胞对照组细胞活力。
其中，细胞活力是指通过添加细胞活力检测试剂(类似MTT(噻唑蓝))，继续培养3-24小时(具体根据之后所采用的溶解结晶产物的方法来定)之后，检测外源性MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(死细胞无此功能)，再采用可以溶解甲臢的试剂(例如二甲基亚砜)来溶解结晶，之后采用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量。共培养组细胞活力指淋巴细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独肿瘤细胞培养组的细胞活力。
结果表明，这种方法不仅可直观明了地体现出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，还可准确的计算出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率(大约在90％以上)，肿瘤细胞基本都被淋巴细胞所包围，形成杀伤细胞团。
用上述方法测定淋巴细胞对其他类型的肿瘤细胞(如胃癌、鼻咽癌、食管癌、大肠癌、宫颈癌)的杀伤效率，结果表明，其他类型的肿瘤细胞的杀伤效果与乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞相似。
实施例2用洗脱法检测淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
(1)靶细胞的接种：选用能贴壁生长的肿瘤细胞，本实施例选择三种常见癌症的相应细胞系，分别为人肺癌细胞系A549(购自中科院上海细胞库)、人乳腺癌细胞系MCF-7(购自中科院上海细胞库)和人肝癌细胞系HepG2(购自中科院上海细胞库)。肿瘤细胞经PBS缓冲液洗涤后用2.5g/L胰酶消化2～3min，显微镜下观察，确保细胞消化好之后，用含10％～20％小牛血清的DMEM细胞培养液(购自中科院上海细胞库)将贴壁细胞冲洗下来，离心去掉上清，再用培养液重悬细胞，计数细胞个数，调整细胞浓度，根据实际情况，96孔板每孔可加4000个肿瘤细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃含5％CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)分离培养淋巴细胞：取受检者肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分层液分离得到淋巴细胞后，采用采用淋巴细胞生长培养液(包含人IL2、人CD137L等因子，购自Invitrogen公司)进行细胞体外培养，根据需要选择用于试验用的效应细胞，用培养基配成细胞悬液待用。
(3)细胞杀伤实验：淋巴细胞和靶细胞按效靶比例20∶1比例混合，每孔中加入8×104个淋巴细胞(0.1ml体积中)，置培养板于37℃5％CO2细胞培养箱中24h。
(4)结果检测：共培养结束后，去掉上清，重新加入PBS缓冲液或细胞培养相关液体洗脱漂浮细胞，可重复洗脱一次，之后加入培养基，在倒置显微镜下观察剩余的贴壁肿瘤细胞的情况。
结果如图3至图5所示，通过把悬浮细胞洗脱掉，在低倍镜下观察，可以很清楚地观察到肿瘤细胞的残余情况，间接反映出淋巴细胞的杀伤效率。
结合MTT细胞活力检测法，可以用以下公式计算淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
公式：杀伤率＝1-共培养组细胞活力/肿瘤细胞对照组细胞活力。
其中，细胞活力是指通过添加细胞活力检测试剂(类似MTT(噻唑蓝))，继续培养3-24小时(具体根据之后所采用的溶解结晶产物的方法来定)之后，检测外源性MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(死细胞无此功能)，再采用可以溶解甲臢的试剂，例如二甲基亚砜来溶解结晶，之后采用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量。共培养组细胞活力指淋巴细胞和肿瘤细胞共培养后，存活细胞的细胞活力；肿瘤细胞对照组细胞活力指平行于共培养组的单独的肿瘤细胞的细胞活力；淋巴细胞对照组细胞活力指平行于共培养组设置的单独淋巴细胞培养组的细胞活力。
共培养在洗脱后，没有残余的肿瘤细胞。结果显示，免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率为100％。
结果表明，这种方法不仅可直观明了地体现出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，还可准确的计算出淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
用上述方法测定淋巴细胞对其他类型的肿瘤细胞(如胃癌、鼻咽癌、食管癌、大肠癌、宫颈癌)的杀伤效率，结果表明，其他类型的肿瘤细胞的杀伤效果与乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞相似。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种非治疗性和非诊断性的检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一培养体系，在适合培养的条件下，在所述培养体系中培养肿瘤细胞，从而获得含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系，其中所述肿瘤细胞为实体肿瘤细胞系；
(ii)向所述的含有贴壁的肿瘤细胞的培养体系中加入免疫细胞，共培养一段时间，获得含有肿瘤细胞和免疫细胞的混合培养体系；和
(iii)在显微镜下观察所述肿瘤细胞的形态以及存活的肿瘤细胞的数量，从而测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(iii)之前,还包括用洗脱法处理免疫细胞的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(iv)，用其他检测方法进一步测定所述免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自下组：肺癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、其他类型肿瘤细胞、或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自下组：肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系HepG2、其他类型肿瘤细胞系、或其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述的培养体系中，所述肿瘤细胞的培养密度为1000-10000个细胞/0.1ml，较佳地，2000-8000个细胞/0.1ml，更佳地，3000-6000个细胞/0.1ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述的培养体系的体积为30-250μl，较佳地40-200μl，更佳地50-150μl。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述免疫细胞与肿瘤细胞的效靶比为1-100：1，较佳地，10-50：1，更佳地，20-50：1。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(iv)中，所述其他检测方法选自下组：MTT法、LDH释放法、CellTiter检测方法、或其组合。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述免疫细胞的密度为0.2×104－1×106个细胞/0.1ml，较佳地，0.5×104－8×105个细胞/0.1ml，更佳地，1×104－3×105个细胞/0.1ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610688692.2A CN107760754A (zh) | 2016-08-18 | 2016-08-18 | 体外检测免疫细胞杀伤效率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610688692.2A CN107760754A (zh) | 2016-08-18 | 2016-08-18 | 体外检测免疫细胞杀伤效率的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107760754A true CN107760754A (zh) | 2018-03-06 |
Family
ID=61262432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610688692.2A Pending CN107760754A (zh) | 2016-08-18 | 2016-08-18 | 体外检测免疫细胞杀伤效率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107760754A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109295155A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-02-01 | 庆云堂生物科技（北京）有限公司 | 利用微流控细胞培养检测人免疫细胞抗肿瘤能力的方法 |
| CN110402853A (zh) * | 2018-04-28 | 2019-11-05 | 义慧科技(深圳)有限公司 | 免疫细胞杀伤肿瘤能力的检测模型及其构建方法和应用 |
| CN112285081A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-01-29 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995018866A1 (en) * | 1994-01-11 | 1995-07-13 | Manson Lionel A | Method of determining tumor immunogenicity |
| US20080254480A1 (en) * | 2007-04-11 | 2008-10-16 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Microcytoxicity assay by pre-labeling target cells |
| CN104946589A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-09-30 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 一种肿瘤特异性til细胞的分离培养方法 |
| CN105695406A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-06-22 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 制备具有高效肿瘤杀伤性dc-cik免疫细胞的方法及制得的dc-cik免疫细胞 |
-
2016
- 2016-08-18 CN CN201610688692.2A patent/CN107760754A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995018866A1 (en) * | 1994-01-11 | 1995-07-13 | Manson Lionel A | Method of determining tumor immunogenicity |
| US20080254480A1 (en) * | 2007-04-11 | 2008-10-16 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Microcytoxicity assay by pre-labeling target cells |
| CN104946589A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-09-30 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 一种肿瘤特异性til细胞的分离培养方法 |
| CN105695406A (zh) * | 2016-04-27 | 2016-06-22 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 制备具有高效肿瘤杀伤性dc-cik免疫细胞的方法及制得的dc-cik免疫细胞 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吴军等: "植物血凝素及淋巴因子激活的杀伤细胞体外抗肿瘤作用的MTT比色法分析", 《第一军医大学学报》 * |
| 李新灵等: "CIK细胞体外诱导培养及对不同肿瘤细胞株的细胞毒作用", 《天津医药》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110402853A (zh) * | 2018-04-28 | 2019-11-05 | 义慧科技(深圳)有限公司 | 免疫细胞杀伤肿瘤能力的检测模型及其构建方法和应用 |
| CN109295155A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-02-01 | 庆云堂生物科技（北京）有限公司 | 利用微流控细胞培养检测人免疫细胞抗肿瘤能力的方法 |
| CN112285081A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-01-29 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kaloni et al. | BCL-2 protein family: attractive targets for cancer therapy | |
| Wang et al. | cGAS is essential for the antitumor effect of immune checkpoint blockade | |
| Kratky et al. | Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination | |
| Choi et al. | Signaling by the Epstein–Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4+ and CD8+ T cell responses | |
| CN106148286B (zh) | 一种用于检测热原的细胞模型的构建方法和细胞模型及热原检测试剂盒 | |
| Ichii et al. | Role for Bcl-6 in the generation and maintenance of memory CD8+ T cells | |
| Hayden et al. | NF-κB and the immune response | |
| Liadis et al. | Caspase-3-dependent β-cell apoptosis in the initiation of autoimmune diabetes mellitus | |
| Ito et al. | Autophagic cell death of malignant glioma cells induced by a conditionally replicating adenovirus | |
| Martorelli et al. | Role of CD4+ cytotoxic T lymphocytes in the control of viral diseases and cancer | |
| Cochez et al. | AhR modulates the IL‐22‐producing cell proliferation/recruitment in imiquimod‐induced psoriasis mouse model | |
| CN106591306B (zh) | 靶向干扰肿瘤ptn-ptprz1通路的小干扰rna在肿瘤免疫治疗中的应用 | |
| Kumar | Inflammation research sails through the sea of immunology to reach immunometabolism | |
| CN107750170A (zh) | 转分化的方法和其使用方法 | |
| CN107760754A (zh) | 体外检测免疫细胞杀伤效率的方法 | |
| CN104004712A (zh) | 抗原特异性的细胞毒性t淋巴细胞的制备方法 | |
| CN102936600A (zh) | 稳定表达荧光素酶的a549裸鼠模型及其建立与应用 | |
| Zhang et al. | Long non‐coding RNA AK085865 ablation confers susceptibility to viral myocarditis by regulating macrophage polarization | |
| Ding et al. | Photochemically controlled activation of STING by CAIX-targeting photocaged agonists to suppress tumor cell growth | |
| Yang et al. | TET1 and TET3 are essential in induction of Th2-type immunity partly through regulation of IL-4/13A expression in zebrafish model | |
| Bellier et al. | Turning immunological memory into amnesia by depletion of dividing T cells | |
| CN110423812A (zh) | Skiv2l2（MTR4）基因在肿瘤治疗中的用途 | |
| CN100429316C (zh) | 一种重组腺病毒及其应用 | |
| CN102939934A (zh) | 整体可视化人肺腺癌h1650裸鼠模型及其建立与应用 | |
| Yunis | Interphase deoxyribonucleic acid condensation, late deoxyribonucleic acid replication, and gene inactivation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180306 |