CN102346107B

CN102346107B - 一种北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法

Info

Publication number: CN102346107B
Application number: CN201010241418.3A
Authority: CN
Inventors: 章桂明; 代京莎; 王颖; 程颖慧; 向才玉
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: CN102346107A

Abstract

本发明公开了一种北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法，该方法采用碘化丙啶染色，利用激光扫描共聚焦显微镜检测，能够快速、准确、灵敏的区分北美大豆猝死综合症病菌孢子的死活，可以替代传统的孢子萌发方法，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

Description

一种北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法

技术领域

本发明涉及一种微生物活性检测方法，特别是涉及一种北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme O’Donnell et T.Aoki)的活性检测方法。

背景技术

北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme O’Donnell etT.Aoki)是引起大豆猝死综合症(Sudden Death Syndrome，简称SDS)的病原菌之一，主要分布在美国、加拿大、阿根廷等国家，在我国还未有该病菌发生危害的报道(吴品珊等，2003)。其病害分布广，危害大，2003年～2005年，该病害对美国大豆产量造成的损失累计达到189万吨(Wrather et al.，2006)。

目前对北美大豆猝死综合症病菌的检测主要是分子生物学方法，如PCR等，这类方法能准确、灵敏、快速的检测出北美大豆猝死综合症病菌，但是不能检测其活性。最新发布的国际标准(ISPM.27)指出，在鉴定进境产品是否携带检疫性有害生物的同时，要对病原菌活性要进行描述。但目前对北美大豆猝死综合症病菌的活性检测分析研究较少，主要采用传统的孢子萌发Colony Forming Units(CFU)计数法，该方法虽然对活性的检测准确、可靠，但检测时间较长。另外，还有基于北美大豆猝死综合症病菌分离培养的分子检测方法，该方法对孢子进行分子检测，可替代对孢子萌发法检测孢子活性，缩短了检测时间，且针对单个孢子即可进行活性检测。其它活性检测方法，如单细胞分析系统活性检测法，虽然检测时间短，最短检测时间仅需20分钟，但对样品中孢子浓度要求较高，至少需菌量1000～2000个孢子，使得该方法在样品稀少时无法进行活性检测。

发明内容

本发明的目的是针对目前北美大豆猝死综合症病菌活性检测中存在的检测时间长或需要孢子量大等问题，提供一种新的检测时间短、所需孢子量极少，甚至1个孢子即可进行的北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种检测北美大豆猝死综合症病菌活性的方法，所述方法采用碘化丙啶为染料对北美大豆猝死综合症病菌孢子进行染色检测。

所述染色方法中染色孢子采用激光扫描共聚焦显微镜观察，活孢子染色后孢子内部没有荧光，而死孢子内部显示红色荧光。

所述激光扫描共聚焦显微镜参数设置包括：荧光信号激发波长为480-500nm，荧光信号发射波长为555-565nm。

所述碘化丙啶的染色浓度为0.000025mmol/L-0.0025mmol/L，优选为0.000025mmol/L-0.0000625mmol/L。

所述碘化丙啶的染色时间为15min-30min，优选为15min。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明的活性检测方法用于北美大豆猝死综合症病菌的活性检测，能够有效的区分孢子的死活，从制样到检测完成仅需要30分钟，可以直接对单个孢子的染色情况进行死活判断。本发明具有快速、准确、灵敏、重复性好等特点，有望替代传统的孢子萌发方法，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

附图说明

图1为本发明一种实施例的北美大豆猝死综合症病菌单个孢子活性检测图，图中A和B为活孢子的扫描结果图，A为激光扫描通道下的扫描结果，B为明场通道下的扫描结果，C和D为死孢子的扫描结果图，C为激光扫描通道下的扫描结果，D为明场通道下的扫描结果；

图2为本发明另一种实验例中北美大豆猝死综合症病菌2个孢子活性检测中染色条件筛选结果图，图中A和B为活孢子的扫描结果图，A为激光扫描通道下的扫描结果，B为明场通道下的扫描结果，C和D为死孢子的扫描结果图，C为激光扫描通道下的扫描结果，D为明场通道下的扫描结果。

具体实施方式

本发明公开了一种北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法，包括如下步骤：

(1)孢子悬浮液配制；用灭菌去离子水配置北美大豆猝死综合症病菌孢子悬浮液，收集于1.5mL离心管中，振荡混匀，10000rpm离心1min，弃上清收集孢子；再加入1mL灭菌去离子水洗涤孢子，10000rpm离心1min，弃上清，最后加入1mL灭菌去离子水重悬，获得孢子悬浮液，浓度约为10⁵-10⁶个/mL。

(3)孢子染色处理；采用碘化丙啶对孢子悬浮液进行染色，室温下避光染色15min-30min，优选15min，离心移弃含有染料的上清液，终止染色，灭菌蒸馏水洗涤两次，重悬孢子，制片。所用染料碘化丙啶与孢子悬浮液混合后，碘化丙啶在混合液中的适合染色终浓度应在0.000025mmol/L-0.0025mmol/L 浓度范围内，优选0.000025mmol/L-0.0000625mmol/L。

(4)激光扫描共聚焦显微镜观察；采用激光扫描共聚焦显微镜观察对染色制片的孢子进行观察，为确保扫描的准确性，观察明场通道下所得孢子图像是否清晰。显微镜参数设置如下：

物镜Objective为63倍油镜，激光管为氩离子激光器，荧光信号激发波长为480-500nm，荧光信号发射波长为555-565nm，设置一个明场通道作为对照，探测针孔Pinhole为1AU即1Airy Units＝0.8μm，光电倍增管增益Gain为560，激光扫描强度Scan Str为5％，扫描模式为line，重复扫描次数Average为2，扫描速度Scan speed为6，精确扫描方式xy为2048×2048。

(5)结果判定；根据激光扫描共聚焦显微镜对单个孢子的染色情况扫描结果进行判断，活孢子染色后孢子内部没有荧光，而死孢子内部显示红色荧光(图1)。为确保检测的准确性，每个样品随机观察30个孢子。

其中，碘化丙啶染色法通常应用于植物和动物的细胞染色，由于真菌的孢子外壁及膜成分组成与动植物的细胞不同，研究对象的不同，会造成结果的差异，适合植物或动物细胞活性染色的染料不一定适合真菌孢子染色，因此需要进行详细的实验论证才能筛选出适合真菌活性染色检测的染料和染色条件。

下面通过具体实施例和实验例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例和实验例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例：北美大豆猝死综合症病菌活性检测

一、材料和仪器

北美大豆猝死综合症病菌菌株ARG1.1，碘化丙啶，LSM5EXCITER激光扫描共聚焦显微镜(ZEISS)，DK-S28电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

二、实验方法

以北美大豆猝死综合症病菌ARG1.1作为实验材料，新鲜配制的孢子悬浮液1mL，分装为两组：一组为未经水浴处理的活孢子(unkilled，UK)，另一组为经50℃水浴处理3min的死孢子，表示为killed(K)。取初始浓度0.5mmol/L的碘化丙啶(溶解于DMSO)1μL加入200μL孢子悬浮液，混匀，碘化丙啶染色终浓度为0.0025mmol/L，室温避光染色15min，13000rpm离心1min去上清液，加入灭菌去离子水200μL洗涤一次，离心去上清，加灭菌去离子水50μL重悬，制片，采用激光扫描共聚焦显微镜观察对染色制片的孢子进行观察，显微镜参数设置如下：

物镜Objective为63倍油镜，激光管为氩离子激光器，荧光信号激发波长为488nm，荧光信号发射波长为560nm，设置一个明场通道作为对照，探测针孔Pinhole为1AU即1Airy Units＝0.8μm，光电倍增管增益Gain为560，激光扫描强度Scan Str为5％，扫描模式为line，重复扫描次数Average为2，扫描速度Scan speed为6，精确扫描方式xy为2048×2048。

三、实验结果

根据激光扫描共聚焦显微镜扫描结果，活孢子经过碘化丙啶染色后孢子内部没有荧光，而死孢子显示红色荧光(图1)。

实验例1：碘化丙啶染色浓度和时间筛选

一、材料和仪器

北美大豆猝死综合症病菌菌株ARG1.1，碘化丙啶，LSM5EXCITER激光扫描共聚焦显微镜(ZEISS)，DK-S28电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，MLR-350HT生化培养箱(SANYO)。

二、实验方法

以北美大豆猝死综合症病菌ARG1.1作为材料，对碘化丙啶的染料浓度和染色时间进行筛选。新鲜配制孢子悬浮液，共分成三组；一组为不经处理的用于萌发实验的活孢子作为萌发试验对照；一组为不经处理的用于染色实验的活孢子(UK组)；一组为经50℃水浴处理3min的死孢子(K组)。设计4种不同染料浓度的浓度梯度实验：原液0.5mmol/L、10倍稀释液0.05mmol/L、40倍稀释液0.0125mmol/L、100倍稀释液0.005mmol/L，4个不同的染色时间的时间梯度实验：染色15min、20min、25min、30min。染色方法为：取1μL染料分别与200μL孢子悬浮液混匀，在室温下避光染色，13000rpm离心1min去上清液，灭菌去离子水洗涤一次，重悬，制片，然后采用激光扫描共聚焦显微镜扫描，观察分析结果。其中染色后的UK组样品分两部分，一部分进行LSCM扫描分析，一部分用于萌发实验，与未经处理的孢子萌发试验作对比，用以检测染色对孢子活性的影响，从而筛选出对孢子活性影响最小且染色效果最佳的染料浓度和染色时间。

三、实验结果

1、萌发实验结果

表1不同的染料浓度-染色时间处理后的萌发率(％)

表1显示染料浓度和染色时间筛选的萌发实验对照。其中，空白对照中不经染色处理的孢子萌发率为100％。经碘化丙啶原液或10倍稀释液染色，染料浓度越高，孢子萌发率越低；同一浓度下，染色时间越长，孢子萌发率越低。经碘化丙啶40倍稀释液(对应染料终浓度0.0000625mmol/L)和100倍稀释液(0.000025mmol/L)染色后萌发率均为100％。

2、最佳染色条件

结合染色对孢子活性的影响，以及染色后激光扫描共聚焦显微镜扫描对死活孢子的区分效果，筛选出不影响孢子活性且染色效果最佳的染色条件为：碘化丙啶染料40倍稀释液，对应染料终浓度0.0000625mmol/L，染色时间为15min。染色效果参见图2。

实验例2：北美大豆猝死综合症病菌活性检测定量分析

一、材料与仪器

来自于美国、阿根廷等国的北美大豆猝死综合症病菌菌株8株，碘化丙啶，LSM5EXCITER激光扫描共聚焦显微镜(ZEIS S)，DK-S28电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，MLR-350HT生化培养箱(SANYO)。

二、实验方法

以北美大豆猝死综合症病菌8个菌株作为实验材料。新鲜配制的孢子悬浮液，分别在5种水浴温度42℃、44℃、46℃、48℃、50℃下均进行5种时间处理即1min、2min、3min、4min、5min，将所有样品分为两组，一组用碘化丙啶40倍稀释液(染色终浓度0.0000625mmol/L)染色15min后，制片，LSCM扫描，分析病菌孢子活性，测量单个孢子的荧光强度值，对每个样品随机测量30个孢子，计算平均值；另一组进行萌发试验，运用SPSS软件，对各处理条件与荧光强度值、孢子萌发率以及荧光强度值与孢子萌发率的关系进行统计分析。

三、实验结果

根据表2中的数据，应用SPSS 13.0统计分析软件，采用多元线性回归分析，使用的线性回归模型为：y＝b0+b1x1+b2x2，统计分析结果见表3，表4，表5。

表3荧光强度值与处理温度-处理时间之间的回归分析

回归方程：y＝b₀+b₁x₁+b₂x₂y：荧光强度值x₁：处理温度(℃)x₂：处理时间(min)P值：显著性概率

表4萌发率与处理温度-处理时间之间的回归分析

回归方程：y＝b₀+b₁x₁+b₂x₂y：萌发率(％)x₁：处理温度(℃)x₂：处理时间(min)P值：显著性概率

表5荧光强度值与萌发率之间的回归分析

回归方程：y＝b₀+b₁x y：荧光强度值x：萌发率(％)P值：显著性概率

由表3得出：方差分析(F检验)的显著性概率P＝0.000＜0.01，说明本组数据具有统计学意义，荧光强度值y与处理温度x1、处理时间x2的综合线性影响极显著。再对偏回归系数b1(处理温度)、b2(处理时间)进行t检验，结果表明处理温度对菌株ARG1.1的荧光强度值影响显著，对其它7个菌株的荧光强度值影响为极显著；处理时间对菌株171的荧光强度值影响显著，对其它7个菌株的荧光强度值影响均为极显著。t检验的结果显示该分析所建立的回归方程是最优方程，同时显示出荧光强度值与处理温度、处理时间是正相关性的，随着处理温度、处理时间的增加而增高。

由表4可知，萌发率y与处理温度x1、处理时间x2的综合线性影响极显著，接着对偏回归系数b1(处理温度)、b2(处理时间)进行t检验，其显著性概率P＝0.000＜0.01，说明处理温度和处理时间对萌发率的影响极显著。t检验的结果显示该分析所建立的回归方程是最优方程，也显示出萌发率与处理温度、处理时间具负相关性，随着处理温度、处理时间的增加而减少。

表5的方差分析结果显示P＝0.000＜0.01，表明该组数据具有统计学意义，荧光强度值y与萌发率x的线性关系极显著，且对偏回归系数b1(萌发率)进行t检验，其显著性概率P＜0.01，说明萌发率与荧光强度值之间具有极显著相关性。t检验的结果显示该分析所建立的回归方程是最优方程，表明荧光强度值与萌发率呈负相关，荧光强度值随着萌发率的降低而增加。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种北美大豆猝死综合症病菌活性检测方法，其特征在于：采用碘化丙啶作为染料对北美大豆猝死综合症病菌孢子进行染色;碘化丙啶的染色浓度为0.000025mmol/L-0.0025mmol/L；碘化丙啶的染色时间为15min-30min，且染色过程于室温避光条件下进行；所述检测方法具体包括：

（1）孢子悬浮液配制：用灭菌去离子水配置北美大豆猝死综合症病菌孢子悬浮液，收集于1.5mL离心管中，振荡混匀，10000rpm离心1min，弃上清收集孢子；再加入1mL灭菌去离子水洗涤孢子，10000rpm离心1min，弃上清，最后加入1mL灭菌去离子水重悬，获得孢子悬浮液，浓度约为10⁵-10⁶个/mL；

（2）孢子染色处理：采用碘化丙啶对孢子悬浮液进行染色，室温下避光染色15min-30min，离心移弃含有染料的上清液，终止染色，灭菌蒸馏水洗涤两次，重悬孢子，制片；所用染料碘化丙啶与孢子悬浮液混合后，碘化丙啶在混合液中的适合染色终浓度应在0.000025mmol/L-0.0025mmol/L浓度范围内；

（3）激光扫描共聚焦显微镜观察：采用激光扫描共聚焦显微镜观察对染色制片的孢子进行观察，显微镜参数设置如下：物镜Objective为63倍油镜，激光管为氩离子激光器，设置一个明场通道作为对照，探测针孔Pinhole为1AiryUnits=0.8μm，光电倍增管增益Gain为560，激光扫描强度Scan Str为5%，扫描模式为line，重复扫描次数Average为2，扫描速度Scan speed为6，精确扫描方式xy为2048×2048；

（4）结果判定：根据激光扫描共聚焦显微镜对单个孢子的染色情况扫描结果进行判断，活孢子染色后孢子内部没有荧光，而死孢子内部显示红色荧光；每个样品随机观察30个孢子。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于：孢子染色后采用激光扫描共聚焦显微镜观察，活孢子内部没有荧光，死孢子内部显示红色荧光。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于：激光扫描共聚焦显微镜参数包括如下设置：

荧光信号激发波长为480-500nm，荧光信号发射波长为555-565nm。

4.如权利要求1-3任一项所述方法，其特征在于：碘化丙啶的染色浓度为0.000025mmol/L-0.0000625mmol/L。

5.如权利要求1-3任一项所述方法，其特征在于：碘化丙啶的染色时间为15min。