CN112782137B - 10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物的存在或种类的测定技术领域，公开了一种10‑50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，对微小亚历山大藻、三角褐指藻、小球藻、赤潮异弯藻进行培养；并配制CMFDA/FDA染色剂；将培养的进入指数生长期四种藻类进行混合并稀释；利用配制好染色剂对稀释后的藻细胞进行染色；向染色的藻细胞中加入10μm和40荧光标准微球；利用Annexin V与碘化丙啶确定10‑50μm浮游生物生存状态。本发明能够准确的对活体浮游生物细胞进行检测，同时能够得到准确的活体浮游生物细胞的活性情况，能够有效排除凋亡细胞；检测结果精准。
Description
技术领域
本发明属于微生物的存在或种类的测定技术领域，尤其涉及一种10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：显微镜检测、叶绿素a检测、流式细胞仪检测、和Flow-CAM检测。显微镜检测耗费时间、人力，受到检测员专业知识限制；叶绿素a检测仅能检测浮游植物生物量，无法对藻种计数分类；Flow-CAM检测则需要不同浮游生物种类的图谱才能完成。现有浮游生物活细胞的检测方法主要是通过荧光显微镜-红外摄像技术进行检测与计数，然而，这种方法会将细菌以及其他死亡细胞也计数在内，导致检测结果并不准确；同时其并不能准确判断相应细胞的活性。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有检测方法无法快速准确判断活体浮游生物的细胞活性，检测结果不准确，也无法排除要凋亡的细胞。而流式细胞仪检测可直接对样品分类计数，辨别浮游生物生理状态，快速、准确。
解决上述技术问题的难度：需要不同浮游生物种类的光谱，仪器较为昂贵，对仪器操作人员熟练程度有一定的要求，不能带到野外只能在实验室进行分析测定。
解决上述技术问题的意义：在压载水浮游生物检测上有广泛的应用前景，可为海事海关等管理部门船舶压载水业务化检测提供技术支撑。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法。
本发明是这样实现的，一种10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，所述10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法具体包括：
步骤一，对微小亚历山大藻、三角褐指藻、小球藻、赤潮异弯藻进行培养；并配制CMFDA/FDA染色剂；
步骤二，当步骤一中培养的四种藻类进入指数生长期时，将其进行混合；并对混合藻细胞稀释1倍；
步骤三，利用配制好的FDA/CMFDA染色剂对稀释后的藻细胞进行染色；
步骤四，向染色的藻细胞中加入10μm和40荧光标准微球；
步骤五，利用Annexin V与碘化丙啶确定10-50μm浮游生物生存状态。
进一步，步骤一中，所述微小亚历山大藻、三角褐指藻、小球藻、赤潮异弯藻培养条件包括：
采用f/2培养基配方，培养条件：温度分别设定为20±1℃，光照强度100μmol/(m2·s)，光暗周期比12h:12h。
进一步，步骤二中，所述染色剂配制方法具体包括：
CMFDA储备液：取50μgCMFDA溶于430μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为250μM的CMFDA储备液；
FDA储备液：取100mg FDA溶于5mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为50mmol/L的FDA准备液；
取20μLFDA准备液，溶于980μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为1mM的FDA储备液。
进一步，步骤三中，所述染色终浓度为0,5mM和2.5μM。
进一步，步骤五中，所述利用Annexin V与碘化丙啶确定10-50μm浮游生物生存状态具体包括：
利用Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪检测浮游生物细胞是否凋亡；
利用碘化丙啶染红浮游生物凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞核；
通过确定浮游生物细胞凋亡情况确定浮游生物的生存状态。
进一步，所述检测方法还进一步包括：
a)准备好鞘液，开机，应注意更换鞘液过滤器；
b)仪器自较：按照仪器厂商提供的方法检查仪器的灵敏度和准确度；
c)取压载水样品400μL，离心4000rpm，5min，弃上清液，再加入200μL磷酸缓冲液，将样品悬浮，再加入FDA和CMFDA，染色终浓度为0,5mM和2.5μM，染色30min，再离心4000rpm，5min，弃上清液，再加入200μL磷酸缓冲液，重复离心4000rpm，5min，弃上清液，将上述离心管中样品加入200μL磷酸缓冲液，样品制备完成；
d)设定仪器各荧光通道的参数：在红色荧光通道设定阈值，使之适合采集压载水浮游生物样品的测定，并做好参数设定的记录，采集Log信号；
e)选择和校准流速：流速控制在(10～30)cm3/min范围内，采集速度(10～50)个颗粒/s为宜；
f)选择和校准流速：进样，至少稳定15s后开始采集数据，使用列表模式提取数据，采集数量宜大于5000个颗粒；记录样品分析时仪器设置的各项参数；
g)测定样品流速：测量进样前后样品重量或体积，并对进样过程计时，精确计算样品流速；
h)分析计算结果，记录于压载水浮游生物测定结果记录表中。
进一步，所述检测方法包括的仪器与材料为：
流式细胞仪，具有488nm和633nm激光器；
离心机，最高转速10000rpm；
电动振荡器：每分钟振荡次数不小于200次；
其他：流式进样管，移液枪，枪头。
进一步，所述检测方法包括的试剂为：
FDA贮备溶液：取100mg FDA溶于5mL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为50mmol/L的FDA准备液，取20μLFDA准备液，溶于980μL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为1mM的FDA储备液,2-8℃避光保存；
CMFDA(invitrogen)贮备溶液：取50μgCMFDA溶于430μL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为250μM的CMFDA储备液,2-8℃避光保存；
BD鞘液(Ref.342003)；
BD清洗液(Ref.340345)；
内标准：Polysciences荧光微球10μm(Ref)和Polysciences荧光微球40μm(Ref)。
进一步，所述检测方法包括的计算方法为：
压载水中样品中浮游生物的细胞密度可用下式计算：
Cphyto＝N/(R·T)·(Vtotal/Vsample)
式中：
Cphyto——压载水浮游生物细胞密度，单位为个每立方毫米；
N——获取细胞数，单位为个；
R——样品流速，单位为立方毫米每分钟(mm3/min)；
T——样品测定时间，单位为分钟(min)；
Vtotal——样品体积加添加物(荧光微珠等)体积，单位为立方毫米(mm3)；
Vsample——样品体积，单位为立方毫米(mm3)。
质量控制方法为：
标准曲线：利用流式细胞仪自带CST程序，通过运行CS&T质量控制微球建立基线(半年一次)，每日运行CS&T仪器性能状态自动监控，保证仪器运行正常。
每批样品提取的同时，需按同样操作制备全程序空白样品，并平行测定，以考察化学药品、溶剂、环境等因素引入的杂质和污染水平；
重复性试验：准备5份平行样品，按规定的分析流程进行检测。考察色谱峰的相对保留时间和峰面积响应的一致性，其峰面积响应因子的相对标准偏差RSD不得大于15％。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明能够准确的对活体浮游生物细胞进行检测，同时能够得到准确的活体浮游生物细胞的活性情况，能够有效排除凋亡细胞；检测结果精准。
附图说明
图1是本发明实施例提供的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的微小亚历山大藻三对染料双染色浓度梯度实验结果示意图。
图3是本发明实施例提供的三角褐指藻三对染料双染色浓度梯度实验结果示意图。
图4是本发明实施例提供的小球藻三对染料双染色浓度梯度实验结果示意图。
图5是本发明实施例提供的赤潮异弯藻三对染料双染色浓度梯度实验结果示意图。
图6是本发明实施例提供的微小亚历山大藻三对染料双染色染色时间实验结果示意图。
图7是本发明实施例提供的三角褐指三对染料双染色染色时间实验结果示意图。
图8是本发明实施例提供的小球藻三对染料双染色染色时间实验结果示意图。
图9是本发明实施例提供的赤潮异弯藻三对染料双染色染色时间实验结果示意图。
图10是本发明实施例提供的藻类浓度梯度及藻类混合藻浓度梯度FDA/CMFDA染色实验示意图。
图11是本发明实施例提供的藻类浓度梯度及藻类混合藻浓度梯度SYBR green I/PI染色实验示意图。
图12是本发明实施例提供的利用荧光标准微球判定浮游生物大小示意图。
图13是本发明实施例提供的利用Annexin V-FITC/PI双染色研究小球藻细胞凋亡示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明利用FDA/CMDA双染色能将10-50μm浮游生物死活细胞的区分开利用流式细胞仪进行分析计数。荧光素二乙酸酯(FDA本身不发荧光，但该染料可被活细胞中的非特异性酯酶分解产生荧光物质，从而使细胞发荧光。死亡细胞或活性较差的细胞中由于非特异性酯酶活性差，因此无荧光或荧光较暗。该方法可用于鉴定细胞活性，具有价格低廉、操作简单和荧光信号较强等优点。CMFDA是FDA的氯甲基衍生物，同样具细胞膜渗透性，无色，不具有荧光发光性。当通过被动运输穿透细胞膜进入活细胞后，CMFDA中的亲脂性基团可被胞浆内非特异性酯酶水解，生成5-氯甲基荧光素(5-chloromethylfluorescein)；5-氯甲基荧光素可发出绿色荧光，因带电荷而不能自由穿透细胞膜，并利用自身氯甲基与细胞内蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巯基转移酶作用下生成加合物，能完好地保留在胞内。经CMFDA标记的细胞，荧光非常稳定，与FDA相比，具有较长时间的细胞内信号保留特点。
流式细胞仪的操作条件：流式细胞仪运行最佳室温18-22℃，操作人员应熟悉仪器的维护和使用，遵守实验室安全规则。
操作过程
(1)样品采集
采用专用设备采集压载水样品100L，利用专用浓缩设备浓缩至500ml左右，样品保存时应在样品瓶外用铝箔纸包裹避光，以免色素降解；样品应尽快上机分析，也可避光于4℃避光保存并在12h内上样分析。
(2)检测
a)准备好鞘液，开机，应注意更换鞘液过滤器；
b)仪器自较：按照仪器厂商提供的方法检查仪器的灵敏度和准确度(用CV值表示，一般CV值应小于2.0)，确保仪器状态良好；
c)取压载水样品400μL，离心4000rpm，5min，弃上清液，再加入200μL磷酸缓冲液，将样品悬浮，再加入FDA和CMFDA，染色终浓度为0,5mM和2.5μM，染色30min，再离心4000rpm，5min，弃上清液，再加入200μL磷酸缓冲液，重复离心4000rpm，5min，弃上清液，将上述离心管中样品加入200μL磷酸缓冲液，样品制备完成。
d)设定仪器各荧光通道的参数：在红色荧光通道设定阈值，使之适合采集压载水浮游生物样品的测定，并做好参数设定的记录，采集Log信号；
e)选择和校准流速：流速控制在(10～30)cm3/min范围内，采集速度(10～50)个颗粒/s为宜；
f)选择和校准流速：进样，至少稳定15s后开始采集数据，使用列表模式(Listmode)提取数据，采集数量宜大于5000个颗粒。记录样品分析时仪器设置的各项参数；
g)测定样品流速：测量进样前后样品重量(或体积)，并对进样过程计时，精确计算样品流速；
h)分析计算结果，记录于压载水浮游生物测定结果记录表中。
仪器与材料为：
流式细胞仪，具有488nm和633nm激光器；
离心机，最高转速10000rpm
电动振荡器：每分钟振荡次数不小于200次；
其他：流式进样管，移液枪，枪头。
试剂为：
FDA贮备溶液：取100mg FDA溶于5mL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为50mmol/L的FDA准备液，取20μLFDA准备液，溶于980μL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为1mM的FDA储备液,2-8℃避光保存。
CMFDA(invitrogen)贮备溶液：取50μgCMFDA溶于430μL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为250μM的CMFDA储备液,2-8℃避光保存。
BD鞘液(Ref.342003)
BD清洗液(Ref.340345)
内标准：Polysciences荧光微球10μm(Ref)和Polysciences荧光微球40μm(Ref)
计算方法为：
压载水中样品中浮游生物的细胞密度可用下式计算：
Cphyto＝N/(R·T)·(Vtotal/Vsample)
式中：
Cphyto——压载水浮游生物细胞密度，单位为个每立方毫米；
N——获取细胞数，单位为个；
R——样品流速，单位为立方毫米每分钟(mm3/min)；
T——样品测定时间，单位为分钟(min)；
Vtotal——样品体积加添加物(荧光微珠等)体积，单位为立方毫米(mm3)；
Vsample——样品体积，单位为立方毫米(mm3)。
质量控制方法为：
标准曲线：利用流式细胞仪自带CST程序，通过运行CS&T质量控制微球建立基线(半年一次)，每日运行CS&T仪器性能状态自动监控，保证仪器运行正常。
每批样品提取的同时，需按同样操作制备全程序空白样品，并平行测定，以考察化学药品、溶剂、环境等因素引入的杂质和污染水平。
重复性试验：主要考察分析方法的重现性。准备5份平行样品，按规定的分析流程进行检测。考察色谱峰的相对保留时间和峰面积响应的一致性，其峰面积响应因子的相对标准偏差RSD不得大于15％。
下面结合附图对本发明的技术方案作详细的说明。
如图1所示，本发明实施例提供的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法具体包括：
S101，对微小亚历山大藻、三角褐指藻、小球藻、赤潮异弯藻采用f/2培养基配方，按照培养温度为20±1℃，光照强度100μmol/(m2·s)，光暗周期比12h:12h进行相应的培养；并配制CMFDA/FDA染色剂。
S102，当步骤S101中培养的四种藻类进入指数生长期时，将其进行混合；并对混合藻细胞稀释1倍。
S103，利用配制好的FDA/CMFDA染色剂对稀释后的藻细胞进行染色。
S104，向染色的藻细胞中加入10μm和40荧光标准微球。
S105，利用Annexin V与碘化丙啶确定10-50μm浮游生物生存状态。
步骤S102中，本发明实施例提供的染色剂配制方法具体包括：
CMFDA储备液：取50μgCMFDA溶于430μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为250μM的CMFDA储备液；
FDA储备液：取100mg FDA溶于5mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为50mmol/L的FDA准备液；
取20μLFDA准备液，溶于980μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为1mM的FDA储备液。
步骤S103中，本发明实施例提供的染色终浓度为0,5mM和2.5μM。
步骤S105中，本发明实施例提供的利用Annexin V与碘化丙啶确定10-50μm浮游生物生存状态具体包括：
利用Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪检测浮游生物细胞是否凋亡。
利用碘化丙啶染红浮游生物凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞核。
通过确定浮游生物细胞凋亡情况确定浮游生物的生存状态。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：
1、活体染色双荧光染料的选择及染色条件的优化
1.1藻种及培养
从甲藻、硅藻、绿藻和黄藻门中，选取一到两种代表性的种类进行培养。实验所用藻种有微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum Bohlin)、小球藻(Chlorella.sp)、赤潮异弯藻(Heterosigma akaskiwo)4株单细胞微藻藻种均为国家海洋局第一海洋研究所生态中心微藻种质库保存。海洋微藻培养采用f/2培养基配方，培养条件：温度分别设定为(20±1)℃，光照强度100μmol/(m2·s)，光暗周期比12h:12h，待进入指数生长期开始实验。
1.2染色剂的配制
收集了现有的浮游生物荧光染料资料，对适用的活体双染色荧光染料进行了初选，初步选定了荧光染料CMFDA/FDA、SYBR Green I/PI、Annexin V-FITC/PI。
CMFDA储备液：取50μgCMFDA溶于430μL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为250μM的CMFDA储备液；FDA储备液：取100mg FDA溶于5mL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为50mmol/L的FDA准备液，取20μLFDA准备液，溶于980μL的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为1mM的FDA储备液；SYBR Green I储备液：用Milli-Q水将SYBR试剂稀释成为1:100(V:V)的储备液，PI储备液：称取定量PI粉末，用Milli-Q水溶解配制成为浓度50mg/mL的储备液，所有染色储存液均在4℃下避光保存，试剂必需现用现配。
1.3三对染料双染色浓度梯度实验
根据预实验结果，染色时将三对染料分别加入到样品溶液中，每种染料设定了4个染色浓度梯度如表1所示，每个梯度设置3个平行组。
表1三对染料双染色浓度梯度设计
从实验结果可以看出：对于每对染色剂来说，染色剂Annexin V-FITC和PI，染色终浓度为1μg/ml和1.25g/ml；染色剂FDA和CMFDA，染色终浓度为0,5mM和2.5μM；染色剂SYBRgreen I和PI，染色终浓度为0.1‰和1.25g/ml，染色效果最好。三对染色剂相比较而言，染色效果FDA/CMFDA>Annexin V-FITC/PI>SYBR green I/PI，FDA/CMFDA染色效果最佳。
1.4三对染料双染色染色时间确定
根据预实验结果，染色时将三对染料分别加入到样品溶液中，每种染料设定了15min、30min、45min和60min4个时间梯度，每个梯度设置3个平行组。
从实验结果可以看出：对于每对染色剂每种藻综合考虑来说，30min染色效果最好。
1.5藻类浓度梯度及藻类混合藻浓度梯度染色实验
根据上述染色剂浓度和时间实验结果，对四种藻进行藻浓度梯度实验，将每种藻及其混合藻细胞分别稀释1倍、10倍、20倍、50倍、100倍。分别利用FDA/CMFDA和SYBR greenI/PI进行染色，染色时间和浓度参照上述实验结果。
从实验结果看，对于流式细胞仪来讲，测定的结果受到仪器噪音及样品中杂质碎片的影响较大，样品中细胞浓度为105～106cell/ml，结果相对稳定可靠。
2、浮游生物大小及生存状态的评价技术
2.1流式细胞仪中10-50μm浮游生物大小确定方法
购买10μm和40荧光标准微球的荧光标准微球，在样品中加入10μL加入两种荧光标准微球，如图12所示，方框中浮游生物大小为10-40μm之间，如图中的微小亚历山大藻(15-29μm)正好处于这个范围。
2.2 10-50μm浮游生物生存状态的评价技术
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来,图13是利用Annexin V-FITC/PI对双染色研究小球藻细胞凋亡。图中四个象限代表的意义为：B1区域的细胞为坏死细胞，也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中；B2区域的细胞为晚期凋亡细胞；B3区域的细胞为早期凋亡细胞；B4区域的细胞为活细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，其特征在于，所述10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法包括以下步骤：
步骤一，对微小亚历山大藻、三角褐指藻、小球藻、赤潮异弯藻进行培养；并配制CMFDA/FDA染色剂；
步骤二，当步骤一中培养的四种藻类进入指数生长期时，将其进行混合；并对混合藻细胞稀释1倍；
步骤三，利用配制好的FDA/CMFDA染色剂对稀释后的藻细胞进行染色；
步骤四，向染色的藻细胞中加入10μm和40荧光标准微球；
步骤五，利用Annexin V与碘化丙啶确定10-50μm浮游生物生存状态；
所述检测方法还进一步包括：
a)准备好鞘液，开机，应注意更换鞘液过滤器；
b)仪器自较：按照仪器厂商提供的方法检查仪器的灵敏度和准确度；
c)取压载水样品400μL，离心4000rpm，5min，弃上清液，再加入200μL磷酸缓冲液，将样品悬浮，再加入FDA和CMFDA，染色终浓度为0,5mM和2.5μM，染色30min，再离心4000rpm，5min，弃上清液，再加入200μL磷酸缓冲液，重复离心4000rpm，5min，弃上清液，将上述离心管中样品加入200μL磷酸缓冲液，样品制备完成；
d)设定仪器各荧光通道的参数：在红色荧光通道设定阈值，使之适合采集压载水浮游生物样品的测定，并做好参数设定的记录，采集Log信号；
e)选择和校准流速：流速控制在10～30cm3/min范围内，采集速度10～50个颗粒/s；
f)选择和校准流速：进样，至少稳定15s后开始采集数据，使用列表模式提取数据，采集数量大于5000个颗粒；记录样品分析时仪器设置的各项参数；
g)测定样品流速：测量进样前后样品重量或体积，并对进样过程计时，精确计算样品流速；
h)分析计算结果，记录于压载水浮游生物测定结果记录表中；
所述检测方法包括的计算方法为：
压载水中样品中浮游生物的细胞密度可用下式计算：
Cphyto＝N/(R·T)·(Vtotal/Vsample)
式中：
Cphyto——压载水浮游生物细胞密度，单位为个每立方毫米；
N——获取细胞数，单位为个；
R——样品流速，单位为立方毫米每分钟；
T——样品测定时间，单位为分钟；
Vtotal——样品体积加添加物体积，单位为立方毫米；
Vsample——样品体积，单位为立方毫米；
质量控制方法为：
标准曲线：利用流式细胞仪自带CST程序，通过运行CS&T质量控制微球建立基线，每日运行CS&T仪器性能状态自动监控，保证仪器运行正常；
每批样品提取的同时，需按同样操作制备全程序空白样品，并平行测定，以考察化学药品、溶剂、环境等因素引入的杂质和污染水平；
重复性试验：准备5份平行样品，按规定的分析流程进行检测；考察色谱峰的相对保留时间和峰面积响应的一致性，其峰面积响应因子的相对标准偏差RSD不得大于15％。
2.如权利要求1所述的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤一中，所述微小亚历山大藻、三角褐指藻、小球藻、赤潮异弯藻培养条件包括：
采用f/2培养基，培养条件：温度为20±1℃，光照强度100μmol/(m2·s)，光暗周期比12h:12h。
3.如权利要求1所述的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤二中，所述染色剂配制方法具体包括：
CMFDA储备液：取50μgCMFDA溶于430μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为250μM的CMFDA储备液；
FDA储备液：取100mg FDA溶于5mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为50mmol/L的FDA准备液；
取20μLFDA准备液，溶于980μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为1mM的FDA储备液。
4.如权利要求1所述的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤三中，所述染色终浓度为0,5mM和2.5μM。
5.如权利要求1所述的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，其特征在于，步骤五中，所述利用Annexin V与碘化丙啶确定10-50μm浮游生物生存状态具体包括：
利用Annexin V进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪检测浮游生物细胞是否凋亡；
利用碘化丙啶染红浮游生物凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞核；
通过确定浮游生物细胞凋亡情况确定浮游生物的生存状态。
6.如权利要求1所述的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，其特征在于，所述检测方法包括的仪器与材料为：
流式细胞仪，具有488nm和633nm激光器；
离心机，最高转速10000rpm；
电动振荡器：每分钟振荡次数不小于200次；
其他：流式进样管，移液枪，枪头。
7.如权利要求1所述的10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法，其特征在于，所述检测方法包括的试剂为：
FDA贮备溶液：取100mg FDA溶于5mL的二甲基亚砜中，配制成浓度为50mmol/L的FDA准备液，取20μLFDA准备液，溶于980μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为1mM的FDA储备液,2-8℃避光保存；
CMFDA贮备溶液：取50μgCMFDA溶于430μL的二甲基亚砜中，配制成浓度为250μM的CMFDA储备液,2-8℃避光保存；
BD鞘液；
BD清洗液；
内标准：Polysciences荧光微球10μm和Polysciences荧光微球40μm。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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