CN106018688A - 一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法 - Google Patents

Abstract

一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法，属于人工金属纳米颗粒毒性效应评价领域，选择海洋中的贝类血淋巴细胞为实验对象，根据金属纳米颗粒释放的金属离子含量，设定含有金属离子或纳米颗粒的细胞培养基为两个实验组，研究离子效应和纳米效应对其毒性得贡献率。本发明首次将金属纳米颗粒的纳米效应和离子效应分别进行研究，选择海洋底栖生物免疫系统的血淋巴细胞为实验对象，该细胞对污染物胁迫十分敏感。同时选择多项生理指标将研究水平推进到分子免疫水平，提高了人工金属纳米颗粒毒性效应评价的有效性和准确性。

Description

一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法

技术领域

本发明属于人工金属纳米颗粒毒性效应评价领域，具体涉及一种金属纳米颗粒离子效应和纳米效应在海洋生态环境中对海洋生物毒性效应贡献率的估算方法。

背景技术

近十年来，纳米技术迅猛发展，纳米产品包括药物传递载体、电导配件、防晒霜、纺织品和化妆品等急速增加。随着纳米产品的范围种类不断扩展，预计未来十年其年产量可能会增加至58000吨。这会导致释放到环境中的人工合成纳米颗粒(EngineeredNanoparticles，ENPs)逐年增加，对生态系统和生态环境带来潜在的危害。人工纳米颗粒指的是三维空间中至少有一维处于1-100nm的尺寸范围内，或由其作为基本构成单元的材料才能称为人工纳米颗粒。目前，ENPs已经被认为是一种潜在的新型有毒物质，它们的小尺寸、高比表面积等纳米效应在给人类带来巨大便利的同时也能够对生物体造成潜在的破坏效应，因而人工纳米颗粒的纳米效应备受生态毒理学研究者的关注。多项研究表明纳米颗粒尤其是金属纳米颗粒会对海洋生态系统中的细胞、细菌、藻类、贝类以及鱼类等产生生物毒性，但对其毒性机制还存在很多争议，因为金属纳米颗粒可以在环境中不同程度的释放金属离子，产生离子毒性效应，而金属离子尤其是重金属离子会对生物造成很大的危害。因而，我们在研究金属纳米颗粒的毒性机制，对其毒性效应进行评价时，首先应该搞清楚其离子效应和纳米效应对其毒性的贡献率。

ENPs释放进入环境后会在大气圈、土壤圈、水圈和生物圈进行复杂的迁移转化过程，最终进入海洋沉积环境中，对海洋生态系统构成威胁。海洋沉积环境是纳米颗粒最终的汇，因而本发明把研究目标定位到底栖生活的双壳贝类上。双壳贝类只有非特异性免疫系统，而且大部分体液因子是由血淋巴细胞分泌到血浆中发挥其防御作用，因此，贝类的血淋巴细胞在贝类免疫中扮演着十分重要的角色。研究者早在1995年就在文中指出双壳贝类血淋巴细胞在适应环境变化上起着十分重要的作用，其受到环境胁迫后血淋巴细胞会发生一系列的免疫反应，包括细胞膜受损、吞噬活性增强、活性氧大量产生、溶酶体释放量增加以及DNA损伤等。这些免疫反应已经被用以评估细菌或污染物暴露下贝类个体的免疫系统的状态，很多研究结果也显示贝类的免疫系统对纳米材料的响应十分敏锐。

“整合生物标志物响应法”(IBR)最先由Beliaeff等(Beliaeff B,BurgeotT.Integrated biomarker response:A useful tool for ecological riskassessment.Environmental Toxicology and Chemistry,2002,21(6):1316-1322)研发，并用该方法进行生态环境污染评估，后来Wilfried Sanchez等(Wilfried Sanchez,Thierry Burgeot,Jean-Marc Porcher.A novel“Integrated Biomarker Response”calculation based on reference deviation concept.Environ Sci Pollut Res,2012,20:2721–2725)对其计算方法进行改进，本发明利用Wilfried Sanchez等改进的IBR计算方法获得整合数据后，对数据进行显著差异性分析，获得生物体受胁迫因子胁迫后的生物标志物整体响应值。然后，利用所确定的离子效应响应值占金属纳米颗粒总体响应值的百分比，来确定金属纳米氧化物离子效应和纳米效应对其毒性的贡献率，该方法在金属纳米颗粒毒性效应评价方面尚未见到报道。

目前关于金属纳米颗粒的毒性效应研究，主要是针对其整体的毒性效应进行研究，但是很多金属纳米颗粒可以不同程度的释放金属离子，而金属离子的毒性作用方式和金属纳米颗粒有存在很大的差异性，因而要搞清楚金属纳米颗粒对生物体的毒性效应，对其毒性效应进行评价，必须将其离子效应和纳米效应剥离开分别进行研究才能更好的研究金属纳米颗粒的致毒机制。所以，对金属纳米颗粒的离子效应和纳米效应分别进行研究确定二者对金属纳米颗粒毒性效应的贡献率以及以体外培养的贝类血淋巴细胞为实验对象的选择是本发明的关键所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法。

本发明选择体外培养的贝类血淋巴细胞为实验对象，降低其他外界因素的干扰风险。同时，将研究水平推进到分子免疫水平，提高金属纳米颗粒离子效应和纳米效应毒性贡献率计算的准确性。本发明是由如下技术方案实现的：

一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法，具体步骤包括如下：

⑴实验对象的选择:选择当地分布广泛、容易采集、体积适中的一种贝类生物，采集后抽取血淋巴细胞进行体外培养用于后续实验；

⑵24h LC₅₀值：设定一系列实验浓度梯度测定金属纳米颗粒对血淋巴细胞的24h致死率以确定LC₅₀值，以此作为参考选择低于LC₅₀的金属纳米颗粒浓度作为胁迫组浓度C_NPs；

⑶金属纳米颗粒离子释放量的测定：配置血细胞培养基，在血细胞培养基中加入C_NPs金属纳米颗粒，测定金属纳米颗粒的金属离子释放达到稳定后的浓度，以此作为浓度参考设定后续胁迫实验中采用的金属离子浓度C_NPion；

⑷血淋巴细胞免疫系统各项指标的测定：采用含有C_NPs金属纳米颗粒或C_NPion释放金属离子的实验液分别胁迫血淋巴细胞24h，然后分别测定其血淋巴细胞DNA损伤量、细胞吞噬能力、细胞膜破损率、溶酶体释放量的变化情况；

⑸用整合生物标志物法获得血淋巴细胞的整体响应值；

⑹离子效应和纳米效应贡献率的计算公式：

${\mathrm{CR}}_{ion}=\frac{{\mathrm{IBR}}_{ion}}{{\mathrm{IBR}}_{NPs}}\×100\%,{\mathrm{CR}}_{partical}=(1-\frac{{\mathrm{IBR}}_{ion}}{{\mathrm{IBR}}_{NPs}})\×100\%;$

其中，IBR_ion为金属离子胁迫组获得的响应值，IBR_NPs为金属纳米颗粒胁迫组获得的响应值，CR_ion为离子效应贡献率，CR_particle为纳米效应贡献率。

进一步，所述血细胞培养基(L-15)的成分见表1。

表1 血细胞培养基(L-15)的成分

进一步，所述血淋巴细胞的整体响应值的计算方法为：

a首先根据血淋巴细胞免疫系统各项指标数据计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X_i；

b降低数值差异性：Y_i＝log(X_i/X₀)，X₀为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试验水平的X_i的平均值；

c数据标准化：Y_i标准化得到Z_i，Z_i＝(Y_i-u)/s，其中u和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；

d确定一个生物标志物偏差指数A＝Z_i-Z₀；Z₀为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试验水平的Z_i的平均值；

e将所有偏差指数相加即为整合生物标志物响应值，也即IBR，

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明是建立在以海洋底栖贝类血淋巴细胞为研究对象，以血淋巴细胞免疫系统各项生理指标变化为研究指标的基础之上，以LC₅₀作为参考选取合适的纳米颗粒纳米效应实验浓度，并以释放稳定后的离子释放量为参考作为离子效应实验浓度，结合整合生物标志物响应法将各个指标整合到一起，从分子、细胞水平上更精细地计算金属纳米颗粒纳米效应和离子效应的贡献率，这对深入分析金属纳米颗粒的毒性效应机制以及有效评价金属纳米颗粒的毒性效应具有重要意义。

本发明首先在目标生物的选择上有所改进，本发明技术方案选用体外培养的血淋巴细胞为实验对象，可以降低金属纳米颗粒的胁迫浓度，在本着节约实验成本，保护生态环境的前提下很好的将纳米效应和离子效应分别进行研究，克服了以生物个体为实验对象，所需实验浓度较高和生物个体需求量大的缺点；选取的检测对象为同一批次、规格大小一致的双壳贝类的血淋巴细胞，具有样本规格一致、背景水平相似、环境特征明晰等优势。

其次，在监测指标上，选择双壳贝类免疫系统中的血淋巴细胞，利用流式技术和彗星实验从细胞和分子水平上确定金属纳米颗粒离子效应和纳米效应对血淋巴细胞各项生理指标的响应值，使研究结果更为准确、可靠；目前，流式技术和彗星实验的技术方法已经成熟，可以运用市场化的试剂盒进行规范化操作，测定结果稳定性好、可重复性高、可比性强。

再次，在计算方法上，采用整合生物标志物响应法，该方法计算方法操作简便，系统误差小，国际认可度高，已经在欧盟水框架指令中的一些标准制定中多次使用。上述分析均显示该方法在估算金属纳米颗粒离子效应和纳米效应对其毒性效应贡献率中的良好功能。

附图说明

图1体外培养血细胞0h和24h的显微图片，图片显示24h时血细胞贴壁状态良好。

图2血淋巴细胞受离子效应(A)和纳米效应(B)胁迫后各项生理指标的响应值以及离子效应和纳米效应贡献率(C)。运用整合生物标志物法将所测得的细胞膜受损量，DNA损伤量以及溶酶体释放量进行整合，最终将整合结果进行百分比计算，结果显示纳米氧化铜离子效应的贡献率为44.34％，纳米效应的贡献率为55.66％。

具体实施方式：

以下仅示例性描述本发明，以明确该发明能够重复实现并可达到突出的实质性效果，但不构成对本发明的限制。

一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法，包括如下步骤：

(1)贝类采集:从养殖场购买健康贝类。首先，对采集到的贝类进行简单的冲洗，然后选取规格大小一致、活动自如、外壳完好无损的贝类进行室内暂养，暂养7天后选择活性好的贝类，抽取血淋巴细胞，在L-15培养基中(表1)进行培养，用于后续实验。

(2)金属纳米颗粒实验浓度及释放离子胁迫浓度的确定：设定一系列实验浓度梯度(100,50,20,10,5,1,0.1mg/L)测定金属纳米颗粒对血淋巴细胞的致死率，确定LC₅₀值。以此作为参考选择低于LC₅₀的金属纳米颗粒浓度作为实验组浓度C_NPs。配置血细胞培养基L-15，在血细胞培养基中加入C_NPs金属纳米颗粒，测定金属纳米颗粒的金属离子释放达到稳定后的浓度，以此作为后续实验中采用的金属离子胁迫浓度C_NPion。

(3)血淋巴细胞免疫系统各项指标的测定：采用金属纳米颗粒(C_NPs)和金属离子(CNP_ion)分别胁迫体外培养的血淋巴细胞24h。然后，将培养的血细胞分成5组，每组3个重复，第1组加入PI染料(Sigma)检测细胞膜破损率，第2组采用2，7-二氯双乙酸钠(DCFH-DA，Sigma)来检测胞内ROS含量，第3组加入荧光微球(Invitrogen)检测血细胞的吞噬活性，第4组加入溶酶体追踪试剂(Invitrogen)检测血细胞中溶酶体的含量，同时对第5组进行彗星实验检测DNA的损伤情况。具体操作如下：

①用流式细胞仪检测血淋巴液中各项免疫指标：检测之前首先要对前向角散射(forward scatter,FSC)阈值进行设定，以消除细胞碎片和其他杂质的干扰。细胞分布图以细胞相对大小(FSC值)和粒度(SSC值)表示。每次测试对至少20000个细胞进行分析。

a:细胞膜破损率：使用染料为碘化丙啶(PI)(1mg/mL)溶液，按照PI：血淋巴液体积比1:40的比例进行染色，黑暗中孵化30min后上机测试。最终，细胞膜破损率＝PI荧光的细胞数/总血细胞数。

b:活性氧释放量：用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)将10mmol/L DCFH-DA稀释10倍，按照400μl血淋巴加入4μl DCFH-DA的比例黑暗中孵育15min，磷酸缓冲液(phosphate buffer saline,PBS,pH 7.4)清洗后，上流式细胞仪进行检测。

c:吞噬能力：用体外细胞吞噬荧光微球的能力来进行评价血细胞的吞噬能力，每400μl血淋巴中加入10μl稀释10倍的荧光微球，黑暗中室温孵化4h之后上流式细胞仪检测吞噬荧光微球的细胞数。

d:溶酶体含量：溶酶体含量的测定使用溶酶体追踪试剂盒(LysoTracker,1mmol/Lin DMSO,Invitrogen)。1μl的LysoTracker加入到400μl的血淋巴中，在黑暗中室温下孵化2h，上机检测个实验组合对照组血淋巴细胞溶酶体的释放量。

②DNA损伤：参照Singh等的方法开展。取1.0％正常熔点琼脂糖100μL铺于载玻片毛面，于4℃放置30min；将1.0％低熔胶琼脂糖与细胞悬液3：1(体积比)快速混匀，取100μL混合液铺层并盖上盖玻片。待胶完全凝固，去掉盖玻片将载玻片放入预冷的细胞裂解液中，黑暗条件下4℃裂解60min；用蒸馏水冲洗，置于盛有新鲜配置电泳液的电泳槽内解旋20min，电泳液盖过胶面约0.25cm，调节电压为25V，电流300mA，电泳40min；取出载玻片用Tris-Hcl缓冲液浸没漂洗15min，重复3次，用滤纸吸干再用蒸馏水洗3遍滴加20μL浓度为5μg/L的荧光染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5min。在荧光显微镜下选取彗星图像，用CASP软件进行分析，以Tail DNA％(尾部DNA百)对DNA损伤程度进行评价。

(4)整合生物标志物法的运用：首先，根据血淋巴细胞免疫系统各项指标数据计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X_i，为了降低数值差异性，进一步对数据进行log化处理，即Y_i＝log(X_i/X₀)，X₀为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试验水平的X_i的平均值；然后，将数据进行标准化处理：Y_i标准化得到Z_i，Z_i＝(Y_i-u)/s，其中u和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；其次，确定一个生物标志物偏差指数A＝Z_i-Z₀；Z₀为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试验水平的Z_i的平均值；再次，将所有偏差指数相加即为整合生物标志物响应指数(IBR)，

(5)离子效应和纳米效应贡献率的计算：

${\mathrm{CR}}_{ion}=\frac{{\mathrm{IBR}}_{ion}}{{\mathrm{IBR}}_{NPs}}\×100\%,;{\mathrm{CR}}_{partical}=(1-\frac{{\mathrm{IBR}}_{ion}}{{\mathrm{IBR}}_{NPs}})\×100\%$

其中IBR_ion为金属离子胁迫组获得的响应值，IBR_NPs为金属纳米颗粒胁迫组获得的响应值，CR_ion为离子效应贡献率,CR_particle为纳米效应贡献率(CR:Contribution Rate)。

下面本发明将结合实施例作进一步描述：

在本发明中，优选采用当地贝类的血淋巴细胞进行体外培养，血淋巴细胞自身承担着贝类免疫系统的很多功能，在贝类免疫中扮演着重要角色，对纳米材料的毒性响应十分敏感，也便于研究者从细胞和分子水平上研究纳米材料的毒性效应，增强了评估结果的准确性和可靠性。以下做详细描述。

实施例1

一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法，具体步骤如下：

实验受试生物栉孔扇贝取自胶州湾养殖区(山东省青岛胶州市)，采样点的水温为20.6℃，盐度为32.3‰。投放前先将栉孔扇贝简单冲洗一下，选取大小规格一致(壳长：5.9～6.8cm；壳高：1.68～2.10cm；壳宽：4.9～6.0cm，带壳重：25.2～29.1g)、结构完好、活动自如的扇贝120个，然后在室内暂养1周。

整个实验均在玻璃缸中进行，实验用水为青岛近岸采集的海水进行室内过滤后使用，投喂饵料为小球藻，室内温度始终保持在20℃左右。实验进行时，每个缸中放入30个扇贝，12L海水,室内暂养扇贝7d。实验期间始终保持充气状态，每24h更换2/3体积的相同浓度新鲜实验液(每天在更换试验液之前2h投喂饵料)。

贝类血淋巴细胞的抽取和原代培养：抽取栉孔扇贝闭壳肌血窦处的血淋巴液，PBS清洗后添加于含有L-15血清培养基(成分见表1)的6孔板中培养贴壁后，对血细胞进行计数调整血淋巴中细胞密度为2×10⁶cell/L(图1)。

设定一系列实验浓度梯度(100,50,20,10,5,1,0.1mg/L)测定纳米氧化铜颗粒对血淋巴细胞的致死率，确定LC₅₀值为45mg/L。以此作为参考选择低于LC₅₀的纳米氧化铜颗粒浓度10mg/L作为胁迫组实验浓度C_NPs。配置血细胞培养基，在血细胞培养基中加入C_NPs金属纳米颗粒，测定金属纳米颗粒的金属离子释放达到稳定后的浓度，24h时后C_NPs氧化铜纳米颗粒离子释放量已经达到平衡，此时的的铜离子浓度为4.8mg/L，以此作为后续胁迫实验中采用的铜离子胁迫浓度C_NPion。

设置空白对照组、铜离子胁迫实验组(NP_ion)和纳米氧化铜(CuONP_total)实验组，每组各设置3个平行组。将培养的原代血淋巴细胞进行体外胁迫试验，胁迫24h后，将培养的血细胞分成5组，每组3个重复，第1组加入PI染料(Sigma)检测细胞膜破损率，第2组采用2，7-二氯双乙酸钠(DCFH-DA，Sigma)来检测胞内ROS含量，第3组加入荧光微球(Invitrogen)检测血细胞的吞噬活性，第4组加入溶酶体追踪试剂(Invitrogen)检测血细胞中溶酶体的含量，同时对第5组进行彗星实验检测DNA的损伤情况。具体操作如下：

①用流式细胞仪检测血淋巴液中各项免疫指标：检测之前首先要对前向角散射(forward scatter,FSC)阈值进行设定，以消除细胞碎片和其他杂质的干扰。细胞分布图以细胞相对大小(FSC值)和粒度(SSC值)表示。每次测试对至少20000个细胞进行分析。

a:细胞膜破损率：使用染料为碘化丙啶(PI)(1mg/mL)溶液，按照PI：血淋巴液体积比1:40的比例进行染色，黑暗中孵化30min后上机测试。最终，细胞膜破损率＝PI荧光的细胞数/总血细胞数。

b:活性氧释放量：用DMSO将10mmol/L DCFH-DA稀释10倍，按照400μl血淋巴加入4μl DCFH-DA的比例黑暗中孵育15min，PBS清洗后，上流式细胞仪进行检测。

c:吞噬能力：用体外细胞吞噬荧光微球的能力来进行评价血细胞的吞噬能力，每400μl血淋巴中加入10μl稀释10倍的荧光微球，黑暗中室温孵化4h之后上流式细胞仪，检测血淋巴细胞吞噬荧光微球的细胞数。

d:溶酶体含量：溶酶体含量的测定使用溶酶体追踪试剂盒(LysoTracker,1mmol/Lin DMSO,Invitrogen)。1μl的LysoTracker加入到400μl的血淋巴中，在黑暗中室温下孵化2h，之后上机检测血淋巴细胞溶酶体的释放量。

②DNA损伤：参照Singh等的方法开展。取1.0％正常熔点琼脂糖100μL铺于载玻片毛面，于4℃放置30min；将1.0％低熔熔琼脂糖与细胞悬液3：1快速混匀，取100μL混合液铺层并盖上盖玻片。待胶完全凝固，去掉盖玻片将载玻片放入预冷的细胞裂解液中，黑暗条件下4℃裂解60min；用蒸馏水冲洗，置于盛有新鲜配置电泳液的电泳槽内解旋20min，电泳液盖过胶面约0.25cm，调节电压为25V，电流300mA，电泳40min；取出载玻片用Tris-Hcl缓冲液浸没漂洗15min，重复3次，用滤纸吸干再用蒸馏水洗3遍滴加20μL浓度为5μg/L的荧光染料4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5min。在荧光显微镜下选取彗星图像，用彗星分析软件进行分析，以Tail DNA％(尾部DNA百分比)对DNA损伤程度进行评价。

对实验结果进行统计处理，数据均为平均值±标准差(表2)，使用SPSS统计软件进行分析。采用方差分析法(ANOVA)对组间数据进行差异性显著分析，p＜0.05表明差异显著，p＜0.01表明差异极显著。应用整合生物标志物法对栉孔扇贝血淋巴细胞的各项生理指标进行整合(图2A，B)，获得的Y值(表3)和A值(表4)，估算CuONP_ion离子效应和CuONP_particle纳米效应对栉孔扇贝血淋巴细胞毒性效应的贡献率(图2C)，CR_ion＝2.93/6.60×100％＝44.34％，CR_particle＝1-2.93/6.60×100％＝55.66％。这一数据将为金属纳米颗粒的毒性效应评价工作提供基础资料。因此，利用本发明贝类血淋巴细胞为指示生物，通过各项生理指标的测定以及整合生物标志物响应(IBR)的计算方法的运用，本发明可以作为一种金属纳米颗粒毒性效应研究、评价的参考方法。

表2 血淋巴细胞受胁迫24h后各项生理指标的平均值(X)

表3 将X值进行log化处理后的Y值

表4 生物标志物偏差指数A值

Claims (3)

1.一种金属纳米颗粒离子和纳米效应毒性贡献率的估算方法，其特征在于它的具体步骤包括如下：

⑴实验对象的选择:选择当地分布广泛、容易采集、体积适中的一种贝类生物，采集后抽取血淋巴细胞进行体外培养用于后续实验；

⑵24h LC50值：设定一系列实验浓度梯度测定金属纳米颗粒对血淋巴细胞的24h致死率以确定LC50值，以此作为参考选择低于LC50的金属纳米颗粒浓度作为胁迫组浓度C_NPs；

⑶金属纳米颗粒离子释放量的测定：配置血细胞培养基，在血细胞培养基中加入C_NPs金属纳米颗粒，测定金属纳米颗粒的金属离子释放达到稳定后的浓度，以此作为浓度参考设定后续胁迫实验中采用的金属离子浓度C_NPion；

⑷血淋巴细胞免疫系统各项指标的测定：采用含有CNPs金属纳米颗粒或C_NPion释放金属离子的实验液分别胁迫血淋巴细胞24h，然后分别测定其血淋巴细胞DNA损伤量、细胞吞噬能力、细胞膜破损率、溶酶体释放量的变化情况；

⑸用整合生物标志物法获得血淋巴细胞的整体响应值；

⑹离子效应和纳米效应贡献率的计算公式：

${\mathrm{CR}}_{ion}=\frac{{\mathrm{IBR}}_{ion}}{{\mathrm{IBR}}_{NPs}}\×100\%,{\mathrm{CR}}_{partical}=(1-\frac{{\mathrm{IBR}}_{ion}}{{\mathrm{IBR}}_{NPs}})\×100\%;$

其中，IBR_ion为金属离子胁迫组获得的响应值，IBR_NPs为金属纳米颗粒胁迫组获得的响应值，CR_ion为离子效应贡献率，CR_particle为纳米效应贡献率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述血细胞培养基的成分见表1

表1血细胞培养基的成分

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述血淋巴细胞的整体响应值的计算方法为：

a首先根据血淋巴细胞免疫系统各项指标的测定数据计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X_i；

b降低数值差异性：Y_i＝log(X_i/X₀)，X₀为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试验水平的X_i的平均值；

c数据标准化：Y_i标准化得到Z_i，Z_i＝(Y_i-u)/s，其中u和s是计算每一个生物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；

d确定一个生物标志物偏差指数A＝Z_i-Z₀；Z₀为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试验水平的Z_i的平均值；

e将所有偏差指数相加即为整合生物标志物响应值，也即IBR，