CN109073556A - 荧光探针、荧光检测方法及荧光探针的使用方法 - Google Patents

荧光探针、荧光检测方法及荧光探针的使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109073556A
CN109073556A CN201780026210.XA CN201780026210A CN109073556A CN 109073556 A CN109073556 A CN 109073556A CN 201780026210 A CN201780026210 A CN 201780026210A CN 109073556 A CN109073556 A CN 109073556A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescence
fluorchrome
cell
fluorescence probe
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780026210.XA
Other languages
English (en)
Inventor
林幸朗
林幸一朗
坂本涉
余语利信
丸冈弘规
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagoya University NUC
Kurashiki Spinning Co Ltd
Original Assignee
Nagoya University NUC
Kurashiki Spinning Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagoya University NUC, Kurashiki Spinning Co Ltd filed Critical Nagoya University NUC
Publication of CN109073556A publication Critical patent/CN109073556A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种荧光探针，其包含载体分子、和与载体分子结合的荧光色素a和荧光色素b，荧光色素a和荧光色素b的激发波长不同，并且荧光色素a与荧光色素b之间不产生荧光FRET。本发明还涉及一种荧光检测方法，其包含：用上述荧光探针对目标细胞进行标记的工序、和向用荧光探针标记的目标细胞照射激发光，观察来自荧光探针的荧光的工序。本发明还涉及一种荧光探针的使用方法，其包含：利用所述荧光探针对细胞进行荧光标记的工序、利用流式细胞仪或荧光显微镜对荧光标记细胞进行分选的工序、将分选出的荧光标记细胞移植到生物体内的工序、和利用体内荧光成像装置观察生物体内的荧光标记细胞的工序。

Description

荧光探针、荧光检测方法及荧光探针的使用方法
技术领域
本发明涉及含有两种荧光色素的荧光探针、荧光检测方法及荧光探针的使用方法。
背景技术
近年来，在癌、发生学的研究领域中，广泛进行使用了小鼠等动物的生物体内的荧光成像分析。移植到小鼠的iPS细胞或ES细胞等干细胞、癌细胞及肝硬化细胞等疾病相关细胞等细胞在移植后、在什么位置进行分化、生长、转移等的信息分析中，荧光成像分析为主要的方法。特别是，为了在维持小鼠等动物的生存的状态下观察移植细胞的进程，目前的情况是只有使用荧光成像分析的方法，其被定位为特别重要的分析方法。
生物体内的移植细胞的荧光成像分析通常通过如下来进行：在移植前预先在体外(in vitro)用荧光探针标记细胞，将该细胞移植到小鼠等生物体内，在体内(in vivo)用荧光成像装置进行观察。例如，专利文献1中记载了将结合有阴离子性卟啉与阳离子性有机烷氧基硅烷及非阳离子性硅烷的含卟啉的复合物用作用于生物体观察的近红外荧光探针。
另一方面，在用荧光探针对规定量的细胞进行标记的情况下，通常，并不是所有的细胞都被荧光探针标记。因此，有时不与荧光探针结合的细胞也被移植到小鼠等的生物体内。在生物体观察用的近红外荧光探针的情况下，目前的情况是无法用荧光显微镜或流式细胞仪等体外荧光成像装置检测荧光，难以确认在体外与近红外荧光探针结合的荧光标记细胞。这是因为体外荧光成像装置和体内荧光成像装置所要求的波长特性不同。在体外荧光成像装置中，一般在激发波长为350～650nm、荧光波长为400～800nm的波长区域内进行分析，在体内荧光成像装置中，一般在激发波长为600～850nm、荧光波长为650～920nm的波长区域内进行分析。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-136555号公报
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述，适于体外荧光成像分析和体内荧光成像分析的荧光色素的波长特性显著地不同，因此目前，不存在能够用于体外和体内这两方的荧光成像分析的荧光探针。
本发明为了解决上述以往的问题，提供能够用于体外以及体内这两方的荧光成像分析的荧光探针、荧光检测方法以及荧光探针的使用方法。
用于解决课题的手段
本发明涉及一种荧光探针，其特征在于，在包含载体分子、和与所述载体分子结合的荧光色素a和荧光色素b的荧光探针中，荧光色素a的激发波长与荧光色素b的激发波长不同，并且在荧光色素a与荧光色素b之间不产生荧光共振能量移动(FRET)。
所述荧光探针优选为细胞标记用荧光探针，荧光色素a为体外荧光成像用荧光色素，荧光色素b为体内荧光成像用荧光色素。上述荧光探针可以通过特异性结合于细胞表面来标记细胞，也可以通过被摄入到细胞内部来标记细胞。
荧光色素a优选激发波长为350～650nm的范围，荧光色素b优选激发波长为600～850nm的范围。荧光色素a优选为卟啉。荧光色素b优选为吲哚菁绿。
上述载体分子优选为聚硅氧烷。
上述荧光探针也可以用于利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选。
本发明还涉及用于观察目标细胞的荧光检测方法，其特征在于，其包含用荧光探针对目标细胞进行标记的工序、和对用荧光探针标记的目标细胞照射激发光，观察来自荧光探针的荧光的工序，上述荧光探针包含载体分子、和与载体分子结合的荧光色素a和荧光色素b，荧光色素a的激发波长与荧光色素b的激发波长不同、且在荧光色素a与荧光色素b之间不产生荧光共振能量移动。
也可以向用荧光探针标记的目标细胞照射激发荧光色素a的激发光，通过体外荧光成像观察来自荧光探针的荧光。另外，也可以将用荧光探针标记的目标细胞移植到生物体(其中人体除外)内，向该生物体照射激发荧光色素b的激发光，通过体内荧光成像观察来自荧光探针的荧光。
本发明还涉及上述荧光探针的使用方法，其包含用荧光探针对细胞进行荧光标记的工序、利用流式细胞仪或荧光显微镜确认经荧光探针荧光标记的荧光标记细胞并进行分选的工序、将所分选的荧光标记细胞移植到生物体(其中人体除外)内的工序、和利用体内荧光成像装置对生物体内的荧光标记细胞进行观察的工序，上述利用所述流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选通过检测来自荧光色素a的荧光来进行，所述生物体内的荧光标记细胞的利用体内荧光成像装置进行的观察通过检测来自荧光色素b的荧光来进行。
发明效果
本发明通过使用具有激发波长不同且不产生荧光共振能量移动的荧光色素a和荧光色素b的荧光探针，可以进行体外和体内这两方的荧光成像分析。特别是，在现有的荧光显微镜、流式细胞仪等体外荧光成像装置中，能够进行细胞的体外荧光成像分析，能够用已有的体内荧光成像装置进行生物体内的体内荧光成像分析。另外，通过流式细胞仪对经荧光探针标记的荧光标记细胞进行分析，将分选出的荧光标记细胞移植到小鼠等生物体内，能够经时地观察存活的小鼠等生物体内的荧光标记细胞的局部分布。
附图说明
图1表示四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)及TCPP与(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)通过水解、缩合产生的杂化纳米粒子(PPS HNPs)的用傅里叶变换红外分光光度计(FT-IR)测定的FT-IR光谱。
图2表示PPS HNPs的29Si固体核磁共振(固体NMR)光谱。
图3表示PPS HNPs的TG和DTA曲线。
图4中，图4A表示FA-PEG/ICG-PPS HNPs生成反应后的上清液的吸收光谱，图4B表示叶酸的浓度校准曲线。
图5表示PPS HNPs、及进一步使吲哚菁绿(ICG)及叶酸(FA)与PPS HNPs结合而成的复合物(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)的吸收光谱。
图6中，图6A表示FA-PEG/ICG-PPS HNPs的短波长侧的激发光谱及荧光光谱，图6B表示FA-PEG/ICG-PPS HNPs的长波长侧的激发光谱及荧光光谱。
图7中，图7A表示来自小鼠的巨噬细胞的RAW264.7细胞的明视野图像(Brightfield)、用DAPI染色的RAW264.7细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(DAPI)、用进一步使吲哚菁绿(ICG)与PPS HNPs结合而成的复合物(ICG-PPS HNPs)标记的RAW264.7细胞的由荧光显微镜得到荧光图像(ICG-PPS HNPs)、以及将这三个图像重叠而得到的图像(Merge)。图7B表示来自人的宫颈癌的HeLa S3细胞的明视野图像(Bright field)、用DAPI染色的HeLaS3细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(DAPI)、利用FA-PEG/ICG-PPS HNPs标记的HeLa S3细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)、以及将这三个图像重叠而得到的图像(Merge)。图7C表示来自人的结肠癌的HCT116细胞的明视野图像(Brightfield)、用DAPI染色的HCT116细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(DAPI)、用FA-PEG/ICG-PPS HNPs标记的HCT116细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)、以及将这三个图像重叠而得到的图像(Merge)。
图8表示用流式细胞仪分析用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW 264.7细胞的结果。
图9表示用流式细胞仪分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果。
图10表示用流式细胞仪分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
图11表示用荧光体内成像装置观察移植了用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW264.7细胞的小鼠体内的荧光标记细胞的经时局部分布的结果。
图12表示用荧光体内成像装置观察移植了用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的小鼠体内的荧光标记细胞的经时局部分布的结果。
图13表示用体内荧光成像装置观察移植了用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW264.7细胞的小鼠24小时后的各脏器的荧光图像。
图14表示用体内荧光成像装置分析移植了用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW264.7细胞的小鼠24小时后的各脏器的结果。
图15表示用体内荧光成像装置观察移植了用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的小鼠24小时后的各脏器的荧光图像。
图16表示用荧光体内成像装置分析移植了用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的小鼠24小时后的各脏器的结果。
具体实施方式
本发明的发明者们对能够用于体外和体内这两方的荧光成像分析的荧光探针进行了深入研究，结果发现，通过在包含载体分子和与上述载体分子结合的荧光色素a和荧光色素b的荧光探针中，作为荧光色素a及荧光色素b，使用激发波长互不相同且相互不产生荧光共振能量移动的荧光色素，可得到能够用于体外及体内这两方的荧光成像分析的荧光探针，从而完成了本发明。以往，虽然存在含有两种荧光色素的荧光探针，但这些荧光探针在两种荧光色素之间产生荧光共振能量移动，不能用于体外以及体内这两方的荧光成像分析。
(荧光探针)
本发明的荧光探针包含载体分子、和与所述载体分子结合的荧光色素a及荧光色素b，荧光色素a及荧光色素b的激发波长不同、且在荧光色素a与荧光色素b之间不产生荧光共振能量移动。荧光色素a和荧光色素b优选与载体分子共价键合。
荧光色素a优选为体外荧光成像用荧光色素(也称为可见光线荧光成像用荧光色素)，更优选激发波长为350～650nm的范围、荧光波长为400～800nm的范围，进一步优选激发波长为380～580nm的范围、荧光波长为450～680nm的范围。激发波长和荧光波长为上述范围时，可以用通用的荧光显微镜或流式细胞仪等体外荧光成像装置观察经荧光探针标记的荧光标记细胞。
作为荧光色素a，例如可以使用卟啉、荧光素、罗丹明等体外荧光成像用荧光色素。卟啉没有特别限定，从适合作为体外荧光成像用荧光色素的观点出发，可以使用具有羧基的卟啉。另外，“卟啉”以4个吡咯环在α位置与4个次甲基交替键合而成的环状化合物及其衍生物的总称的含义使用。具有羧基的卟啉一般激发波长为400～650nm的范围、荧光波长为600～740nm的范围。
作为具有羧基的卟啉，例如可以使用下述通式(I)所示的化合物。
[化学式编号1]
所述通式(I)中，R1b、R2b、R3b和R4b可以相同或不同，表示羧基(COOH)、磺基(SO3H)或氢原子(H)(其中，全部为氢原子或全部为磺基的情况除外)。优选所述通式(I)中，R1b、R2b、R3b和R4b全部为羧基，或R1b为羧基、R2b、R3b和R4b为氢原子。具有羧基的卟啉更优选为所述通式(I)所示的R1b、R2b、R3b和R4b全部为羧基的化合物。R1b、R2b、R3b和R4b全部为羧基的化合物被称为四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)。
[化学式编号2]
另外，例如胆红素、氯化血红素、原卟啉等也可以作为具有羧基的卟啉使用。
本发明中使用的具有羧基的卟啉可以是公知的化合物，或者可以通过公知的方法容易地制造。例如可以从东京化成工业株式会社等获得市售品。
荧光色素b使用激发波长与荧光色素a不同且其与荧光色素a之间不产生荧光共振能量移动的荧光色素。荧光色素b优选为体内荧光成像用荧光色素(也称为近红外线荧光成像用荧光色素)，更优选激发波长为600～850nm的范围、荧光波长为650～920nm的范围，进一步优选激发波长为630～790nm的范围、荧光波长为680～910nm的范围。激发波长和荧光波长在上述范围内时，可以用通用的体内荧光成像装置观察小鼠等生物体内的经荧光探针标记的荧光标记细胞。
作为荧光色素b，例如可以使用吲哚花青化合物、香豆素、罗丹明、呫吨、血卟啉及荧光胺等体内荧光成像用荧光色素。从生物体内的安全性的观点出发，作为吲哚花青化合物，优选使用吲哚菁绿或其衍生物。吲哚菁绿通常激发波长为740～790nm的范围，荧光波长为810～860nm的范围。吲哚菁绿的衍生物是指在维持吲哚菁绿的主要骨架及功能的同时将其一部分用其他官能团等取代而得到的化合物，激发波长为750～790nm的范围，荧光波长为790～900nm的范围。作为荧光色素b，通过使用激发波长为740～790nm的范围、且荧光波长为790～900nm范围的吲哚菁绿或其衍生物，可以在小鼠等生物体中的饵料不会对自身荧光产生影响的情况下，用通用的体内荧光成像装置观察小鼠等生物体内的用荧光探针标记的荧光标记细胞。另外，能够观察局部分布于小鼠等生物体内的脏器的用荧光探针标记的荧光标记细胞。
上述载体分子与荧光色素a及荧光色素b结合，只要能够维持荧光色素a及荧光色素b不同的激发波长即可。例如，可以使用聚硅烷、聚锗烷、聚锡烷、聚硅氧烷、聚倍半硅氧烷、聚硅氮烷、聚硼氨(polyborazylene)、聚磷腈等无机聚合物，聚吡咯、聚乙二醇、多糖等有机聚合物等聚合物。作为荧光色素a和荧光色素b，可以适当选择使用以使荧光色素a的荧光不会激发荧光色素b。荧光色素a和荧光色素b中的任一方优选嵌入作为载体分子的聚合物的主链结构中，另一方优选与存在于该载体表面的官能团结合。当为这样的结构时，不易产生FRET。从使荧光色素a和荧光色素b之间不产生FRET的观点出发，所述载体分子优选为聚硅氧烷(以下也记为具有硅氧烷键的聚合物)。聚硅氧烷例如如后所述，通过硅烷化合物水解、缩聚而形成。
本发明的荧光探针优选用作细胞标记用荧光探针。作为细胞标记用荧光探针使用时，可以通过特异性结合于细胞表面来标记细胞。在这种情况下，本发明的荧光探针优选具有与特异性识别细胞表面的物质结合的细胞表面结合物质。荧光探针通过细胞表面结合物质与细胞表面特异性结合而标记细胞，由此可以用作细胞标记用荧光探针。特异性识别细胞表面的物质是指存在于特定的细胞表面的蛋白、脂质、糖链和/或核酸等。例如，在癌细胞的表面存在癌细胞特异性的叶酸受体、转铁蛋白受体、抗原等。通过在荧光探针上结合叶酸、转铁蛋白、抗体等，可以特异性地标记癌细胞。另外，iPS细胞或ES细胞等干细胞的表面存在细胞表面标记物(膜蛋白)等。通过在荧光探针上结合与细胞表面标记物特异性结合的分子等，可以特异性地标记iPS细胞或ES细胞等干细胞。
本发明的荧光探针也可以通过被摄入到细胞内部来标记细胞。作为这样的细胞，例如可举出巨噬细胞、树突细胞、免疫细胞、癌细胞、iPS细胞等。使用在细胞内部摄入有荧光探针的巨噬细胞、树突细胞、免疫细胞、癌细胞、iPS细胞等，能够在免疫细胞疗法中确认巨噬细胞、树突细胞在体内的动态。
本发明的荧光探针可以通过如下来制作：使载体分子与荧光色素a结合、优选共价键合而形成载体分子与荧光色素a的复合物，其后，使荧光色素b与由载体分子与荧光色素a的复合物构成的纳米粒子表面结合、优选共价键合，形成载体分子、荧光色素a及荧光色素b的复合物。在使荧光色素b与由载体分子和荧光色素a的复合物构成的纳米粒子结合时，也可以同时使细胞表面结合物质与由载体分子和荧光色素a的复合物构成的纳米粒子结合。或者本发明的荧光探针也可以通过如下来制作：使载体分子与荧光色素b结合、优选共价键合而形成载体分子与荧光色素b的复合物，其后，使荧光色素a与由载体分子与荧光色素b的复合物构成的纳米粒子结合、优选为共价键合，形成载体分子、荧光色素a及荧光色素b的复合物。在使荧光色素a与由载体分子和荧光色素b的复合物构成的纳米粒子结合时，也可以同时使细胞表面结合物质与由载体分子和荧光色素b的复合物构成的纳米粒子结合。其中，在载体分子与荧光色素a的复合物、载体分子与荧光色素b的复合物、载体分子、荧光色素a及荧光色素b的复合物中，优选荧光色素a及荧光色素b的激发波长及荧光波长在与载体分子结合的前后几乎不发生变化。
作为荧光色素a和荧光色素b，通过选择激发波长不同且一方的荧光色素的荧光不激发另一方的荧光色素的荧光色素、通过调整载体分子、荧光色素a及荧光色素b的复合物中的荧光色素a与荧光色素b的配置等，使得荧光色素a与荧光色素b之间不产生FRET。在载体分子、荧光色素a和荧光色素b的复合物中，当载体分子为聚硅氧烷时，荧光色素a和荧光色素b中的任一个嵌入硅氧烷网络(聚合物的主链)中，另一个优选不嵌入硅氧烷网络中而与由聚硅氧烷和一方荧光色素的复合物形成的纳米颗粒表面的官能团(未形成硅氧烷网络的官能团)结合。当为这样的结构时，在荧光色素a及荧光色素b之间不易产生FRET。
在载体分子为聚硅氧烷、荧光色素a为卟啉、荧光色素b为吲哚菁绿的情况下，例如可如下述那样制作荧光探针。
首先，使具有氨基的硅烷与具有羧基的卟啉反应，得到在分子内含有卟啉的硅烷(以下也记为“卟啉-硅烷”)。具体而言，使具有氨基的硅烷和具有羧基的卟啉溶解于溶剂，加入缩合剂，引起酰胺化反应。作为溶剂，例如可以使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等。作为缩合剂，例如可以使用碳二亚胺等。作为碳二亚胺，没有特别限定，例如可以举出N,N’-二丙基碳二亚胺等。为了减少副产物，可以添加琥珀酰亚胺等。作为琥珀酰亚胺，没有特别限定，例如可以举出N-羟基琥珀酰亚胺等。反应温度没有特别限定，从合成成本的观点出发，例如优选为20～150℃，更优选为20～80℃。反应时间没有特别限定，例如优选为1～72小时，更优选为1～24小时。反应后，进行离心分离，将产物作为沉淀回收，由此可以得到卟啉-硅烷。
在上述反应中，具有氨基的硅烷和具有羧基的卟啉的摩尔比(具有氨基的硅烷：具有羧基的卟啉)优选为4：1～1：1，更优选为4：1～2：1，进一步优选为4：1。
接着，将上述得到的卟啉-硅烷与具有一种以上官能团的硅烷(以下也记为“官能团硅烷”)的水解、缩合反应，得到硅氧烷与卟啉的复合物。具体而言，使卟啉-硅烷和官能团硅烷溶解于溶剂中，进而加入碱溶液使其反应。作为溶剂，例如可以使用DMF等。作为碱溶液，例如可以使用pH为8以上的氨水、氢氧化钠的水溶液等。反应温度没有特别限定，从合成成本的观点出发，例如优选为20～200℃、更优选为60～80℃。反应时间没有特别限定，例如优选为1～72小时、更优选为3～24小时。反应后，通过进行离心分离，将产物作为沉淀进行回收，由此能够得到聚硅氧烷上共价键合有卟啉的聚硅氧烷与卟啉的复合物。
在上述反应中，卟啉-硅烷与官能团硅烷的摩尔比(卟啉-硅烷：官能团硅烷)优选为1：2～1：100，更优选为1：21～1：50，进一步优选为1：30～1：40。
作为具有氨基的硅烷，只要具有氨基即可，没有特别限定。例如，可以优选使用由下述通式(II)表示的化合物。
Xi-Si(R2a)j(OR1a)(4-i-j) (II)
通式(II)中，X表示H2NCmH2m-、H2NCnH2n-HNCmH2m-、或Ph-NHCmH2m-[这里，Ph表示苯基]所示的基团，其中优选H2NCmH2m-、或H2NCnH2n-HNCmH2m-所示的基团。m和n相同或不同，表示1～6的整数。m优选为1、2、3或4，更优选为1、2或3。n优选为1、2、3或4，更优选为1、2或3。另外，上述的H2NCmH2m-、H2NCnH2n-HNCmH2m-、Ph-NHCmH2m-分别优选为H2N(CH2)m-、H2N(CH2)n-HN(CH2)m-、Ph-NH(CH2)m-。
另外，R1a及R2a相同或不同，表示碳原子数为1～6的烷基。该烷基可以为直链状或支链状，优选为直链状。另外，优选碳原子数为1、2、3或4的烷基。作为碳原子数为1～6的烷基，具体而言，可例示出甲基、乙基、正丙基、异丙基，正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1-乙基丙基，异戊基、新戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、异己基、3-甲基戊基等。其中，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基。
另外，i表示1或2，j表示0或1，[其中(4-i-j)≥2]。即，(i，j)表示(1，0)、(1，1)或(2，0)。
作为通式(II)所示的化合物，例如可列举出3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基甲基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、三甲氧基[3-(苯基氨基)丙基]硅烷等。其中，优选3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和/或3-氨基丙基三甲氧基硅烷。
上述具有氨基的硅烷例如可以使用东京化成工业株式会社制的市售品。另外，具有氨基的硅烷可以单独使用1种或组合使用2种以上。
官能团硅烷只要具有一种以上的官能团就没有特别限定，可以是具有一种官能团的单官能团硅烷，也可以是具有两种以上官能团的多官能团硅烷。作为具有官能团的硅烷，例如可优选使用通式(III)所示的化合物：
Yp-Si(R2c)q(OR1c)(4-p-q) (III)
上述通式(III)中，Y表示CH2＝CH-所示的基团、CH2＝CHCH2-所示的基团、具有链烯的基团、具有硫醇的基团、具有二硫化物的基团、具有胺的基团、具有酯的基团、具有酰胺的基团、具有羧酸的基团、具有脲的基团、具有硫脲的基团、OCNCH2CH2-所示的基团、ClCαH2α-所示的基团、HSCβH2β-所示的基团、CF3CγF2γ-CδH2δ-所示的基团、CH2＝C(CH3)COOCεH2ε-所示的基团、CH2＝CHCOOCζH2ζ-所示的基团、HN-CONH-CηH2η-所示的基团、下述化学式(a)所示的基团、下述化学式(b)所示的基团、碳原子数为1～18的烷基或苯基。
[化学式编号3]
[化学式编号4]
在上述中，α、β、δ、ε、ζ、η、θ及ι分别独立地表示1～6的整数、优选表示1、2、3或4的整数，γ表示0～8的整数、优选为0、1、2、3、4、5、6或7的整数。另外，碳原子数为1～18的烷基优选碳原子数为1～12，更优选碳原子数为1、2、3、4、5、6、7或8。另外，可以为直链状也可以为支链状，优选为直链状。另外，上述ClCαH2α-、HSCβH2β-、CF3CγF2γ-CδH2δ-、CH2＝C(CH3)COOCεH2ε-、CH2＝CHCOOCζH2ζ-、HN-CONH-CηH2η-分别优选为Cl(CH2)α-、HS(CH2)β-、CF3(CF2)γ-(CH2)δ-、CH2＝C(CH3)COO(CH2)ε-、CH2＝CHCOO(CH2)ζ-、HN-CONH-(CH2)η-。
另外，R1c表示碳原子数为1～6的烷基或-(CH2)τ-OCH3，R2c表示碳原子数为1～6的烷基或苯基。R1c及R2c可以相同也可以不同。R1c及R2c中的任一个中，碳原子数为1～6的烷基也可以为直链状或支链状，优选为直链状。另外，优选碳原子数为1、2、3或4的烷基。作为碳原子数为1～6的烷基，具体而言，可例示出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1-乙基丙基、异戊基、新戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、异己基、3-甲基戊基等。其中，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基。另外，τ表示1～4的整数(优选为1、2或3)。
另外，p表示1、2或3，q表示0、1或2，其中(4-p-q)≥1。即，(p、q)表示(1、0)、(1、1)、(1、2)、(2、0)、(2、1)或(3、0)。
另外，作为官能团硅烷，例如也可以优选使用下述通式(IV)所示的化合物。
Z-SiCl3(IV)
上述通式(IV)中，Z表示CH2＝CH-所示的基团、CH2＝CHCH2-所示的基团、具有链烯的基团、具有硫醇的基团、具有二硫化物的基团、具有胺的基团、具有酯的基团、具有酰胺的基团、具有羧酸的基团、具有脲的基团、具有硫脲的基团、ClCκH2κ-所示的基团、CF3CλF2λ-CξH2ξ-所示的基团、碳原子数为1～18的烷基、苯基或环己基。κ及ξ分别独立地表示1～6的整数、优选表示1、2、3或4的整数，λ表示0～8的整数、优选表示0、1、2、3、4、5、6或7的整数。另外，碳原子数为1～18的烷基优选碳原子数为1～12，更优选碳原子数为1、2、3、4、5、6、7或8。另外，可以为直链状也可以为支链状，优选为直链状。另外，上述ClCκH2κ-、CF3CλF2λ-CξH2ξ-分别优选为Cl(CH2)κ-、CF3(CF2)λ-(CH2)ξ-。
另外，作为多官能团性硅烷，也可以使用N-[2-(N-乙烯基苄基氨基)乙基]-3-氨基丙基三甲氧基硅烷盐酸盐。
作为式(III)所示的化合物，具体而言，可以举出四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、四丙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四异丙氧基硅烷、烯丙基三乙氧基硅烷、烯丙基三甲氧基硅烷、二乙氧基甲基乙烯基硅烷、二甲氧基甲基乙烯基硅烷、三乙氧基乙烯基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷、(氯甲基)三乙氧基硅烷、3-氯丙基二甲氧基甲基硅烷、3-氯丙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙酯、甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯、三乙氧基-1H,1H,2H,2H-十三氟-正辛基硅烷、丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯、3-氯丙基三甲氧基硅烷、1-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]脲、三甲氧基(3,3,3-三氟丙基)硅烷、3-脲基丙基三乙氧基硅烷、二乙氧基(3-缩水甘油氧基丙基)甲基硅烷、3-缩水甘油氧基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、2-氰基乙基三乙氧基硅烷、二乙酰氧基二甲基硅烷、二乙氧基二甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、二甲氧基二苯基硅烷、二甲氧基甲基苯基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷、戊基三乙氧基硅烷、三乙酰氧基甲基硅烷、三乙氧基乙基硅烷、三甲氧基(甲基)硅烷、三甲氧基苯基硅烷、三甲氧基(丙基)硅烷等。其中，优选3-巯基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷等。
另外，作为通式(IV)所示的化合物，具体而言，可以举出烯丙基三氯硅烷、三氯乙烯基硅烷、3-氯丙基三氯硅烷、三氯(1H,1H,2H,2H-十七氟癸基)硅烷，三氯(1H,1H,2H,2H-十三氟-正辛基)硅烷、丁基三氯硅烷、环己基三氯硅烷、癸基三氯硅烷、十二烷基三氯硅烷、乙基三氯硅烷、正辛基三氯硅烷、苯基三氯硅烷、三氯-2-氰基乙基硅烷、三氯己基硅烷、三氯(甲基)硅烷、三氯十八烷基硅烷、三氯(丙基)硅烷、三氯十四烷基硅烷等。
上述官能团硅烷例如可以使用东京化成工业株式会社制的市售品。另外，官能团硅烷可以单独使用1种或组合使用2种以上。
接着，使由聚硅氧烷与卟啉的复合物构成的纳米粒子与吲哚菁绿反应而形成聚硅氧烷、卟啉及吲哚菁绿的复合物。具体而言，在由聚硅氧烷与卟啉的复合物构成的纳米粒子的水溶液中加入吲哚菁绿的水溶液，在4～50℃的温度下搅拌1～24小时使其反应。由聚硅氧烷与卟啉的复合物构成的纳米粒子表面的官能团与吲哚菁绿共价键合而形成聚硅氧烷、卟啉及吲哚菁绿的复合物。作为吲哚菁绿，使用经与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子表面的官能团结合的官能团修饰的吲哚菁绿。例如，在形成了由聚硅氧烷与卟啉的复合物构成的纳米粒子的官能团硅烷具有3-巯基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷及(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷等硫醇基的情况下，可以使用键合有马来酰亚胺基的吲哚菁绿。另外，也可以使由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子与吲哚菁绿反应，使吲哚菁绿与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子结合，同时使细胞表面结合物质、例如叶酸与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子结合。作为叶酸，可以使用在聚乙二醇(PEG)的单末端结合有马来酰亚胺基、另一个单末端结合有叶酸的物质。
上述反应中，与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子的吲哚菁绿共价键合的官能团、和对吲哚菁绿进行修饰并与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子共价键合的官能团的摩尔比(与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子的吲哚菁绿共价键合的官能团：对吲哚菁绿进行了修饰的官能团)优选为1：1～3：1，更优选为1：1～2：1，进一步优选为1：1。
在使用TCPP作为卟啉的情况下，在聚硅氧烷与卟啉的复合物中，TCPP的羧基优选形成酰胺键而存在，TCPP更优选通过酰胺键嵌入硅氧烷网络(聚硅氧烷的主链)中。进而，吲哚菁绿优选与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子表面的官能团(形成由聚硅氧烷与卟啉的复合物构成的纳米粒子的官能团硅烷的官能团)结合。通过形成这样的结构，卟啉与吲哚花青之间不会产生FRET。在本发明中，如后所述，聚硅氧烷与卟啉的复合物等复合物或荧光探针的结构可以通过傅里叶变换红外分光法进行分析。
从适于体外和体内这两方的荧光成像的观点出发，上述荧光探针优选含有1质量％以上的荧光色素a、含有0.1质量％以上的荧光色素b，更优选含有5～90质量％的荧光色素a、含有1～10质量％的荧光色素b。另外，荧光色素a为卟啉、荧光色素b为吲哚菁绿、载体分子为聚硅氧烷时，在荧光探针中，卟啉的4个吡咯的环状结构部分(卟啉)的含量优选为1质量％以上，吲哚菁绿的含量优选为0.1质量％以上。更优选卟啉的4个吡咯的环状结构部分(卟啉)的含量为5～90质量％，吲哚菁绿的含量为1～10质量％。在本发明中，如后所述，通过聚硅氧烷与卟啉的复合物等复合物或荧光探针的热重-差热分析，可以测定卟啉等荧光色素或二氧化硅聚合物等载体分子的含量。
上述荧光探针没有特别限定，从易于标记细胞的观点出发，平均粒径优选为3～250nm、更优选为10～80nm。本发明中，平均粒径用动态光散射法测定。
(荧光检测方法)
本发明的荧光检测方法用于观察目标细胞。具体而言，其包含用荧光探针对目标细胞进行标记的工序，和向用荧光探针标记的目标细胞照射激发光、观察来自荧光探针的荧光的工序。作为荧光探针，使用上述本发明的荧光探针。
目标细胞的标记可以通过使荧光探针结合于细胞表面、或者使荧光探针被摄入到细胞内来进行。在使荧光探针结合于细胞表面的情况下，荧光探针具有细胞表面结合物质。例如，在荧光探针具有叶酸的情况下，能够与来自人的宫颈癌的HeLa S3细胞、来自人的结肠癌的HCT116细胞等癌细胞的表面结合而对这些癌细胞进行标记。具体而言，通过在加有荧光探针的细胞培养用培养基中培养细胞，可以用荧光探针对细胞进行标记。作为目标细胞，可以举出iPS细胞或ES细胞等干细胞、癌细胞以及肝硬化细胞等疾病相关细胞等。
对用荧光探针标记的目标细胞照射激发荧光色素a的激发光，通过使用荧光显微镜或流式细胞仪等体外荧光成像装置的体外荧光成像，能够观察来自荧光探针的荧光。例如，用波长范围为350～650nm的激发光激发荧光色素a，观察400～800nm波长范围的荧光。优选用波长范围为380～580nm的激发光激发荧光色素a，观察450～680nm波长范围的荧光。
另外，将用荧光探针标记的目标细胞移植到生物体(其中人体除外)内，向用该生物体内的荧光探针标记的目标细胞照射激发荧光色素b的激发光，通过使用了体内荧光成像装置的体内荧光成像，能够观察来自荧光探针的荧光。例如，用波长范围为600～850nm的激发光激发荧光色素b，观察650～920nm波长范围的荧光。优选用波长范围为630～790nm的激发光激发荧光色素b，观察680～910nm波长范围的荧光。在本发明中，生物体只要是能够进行荧光观察的动物则没有特别限定。优选为哺乳动物。特别优选为小鼠、大鼠等啮齿类哺乳动物。另外，用荧光探针标记的目标细胞向小鼠等生物体内的移植可如后所述地进行。
通过使用本发明的荧光探针，在体外及体内均可观察用荧光探针标记的目标细胞。
(荧光探针的使用方法)
本发明的荧光探针的使用方法包含用荧光探针对细胞进行荧光标记的工序、通过流式细胞仪或荧光显微镜确认并分选被荧光探针标记的荧光标记细胞的工序、将分选出的荧光标记细胞移植到生物体(其中人体除外)内的工序、以及利用体内荧光成像装置观察生物体内的荧光标记细胞的工序。
首先，用荧光探针对细胞进行荧光标记。细胞的标记可以通过使荧光探针结合于细胞表面、或者使荧光探针被摄入到细胞内来进行。在使荧光探针结合于细胞表面的情况下，荧光探针具有细胞表面结合物质。例如，在荧光探针具有叶酸的情况下，能够与来自人的宫颈癌的HeLa S3细胞、来自人的结肠癌的HCT116细胞等癌细胞的表面结合而对这些癌细胞进行标记。具体而言，通过在加有荧光探针的细胞培养用培养基中培养细胞，可以用荧光探针对细胞进行标记。作为细胞，可以举出iPS细胞或ES细胞等干细胞、癌细胞以及肝硬化细胞等疾病相关细胞等。
接着，通过流式细胞仪对被荧光探针标记的荧光标记细胞进行分选。利用流式细胞仪或荧光显微镜的荧光标记细胞的确认、分选通过检测来自荧光色素a的荧光来进行。具体而言，将通过荧光探针进行了荧光标记操作后的细胞供给至流式细胞仪，用荧光色素a的激发波长的激发光激发荧光色素a，通过检测来自被激发的荧光色素a的荧光，能够对被荧光探针荧光标记的荧光标记细胞进行分选。利用流式细胞仪的观察例如可以在激发波长为350～640nm、荧光波长为630～780nm的条件下进行。或者，将利用荧光探针进行荧光标记操作后的细胞供给至荧光显微镜，用荧光色素a的激发波长的激发光激发荧光色素a，通过检测来自被激发的荧光色素a的荧光，能够对被荧光探针荧光标记的荧光标记细胞进行分选。利用荧光显微镜的观察例如可以在激发波长为350～640nm、荧光波长为630～780nm的条件下进行。以往，将利用荧光探针进行荧光标记操作后的细胞直接移植到小鼠等生物体内，但通过使用本发明的荧光探针，能够利用流式细胞仪仅对被荧光探针荧光标记的荧光标记细胞进行分选并移植到小鼠等生物体内。
接着，将分选出的荧光标记细胞移植到生物体(其中人体除外)内。分选出的荧光标记细胞向生物体内的移植例如可以通过从皮下、静脉、腹腔等的给予进行。例如，在小鼠的情况下，将荧光标记细胞悬浮在磷酸缓冲生理盐水中，使用注射器将荧光标记细胞的悬浮液注射到小鼠的尾静脉，由此将荧光标记细胞移植到小鼠体内。
接着，用体内荧光成像装置观察生物内的荧光标记细胞。作为体内荧光成像装置，没有特别限定，例如可以使用仓敷纺织公司的荧光体内成像装置“KURAVIC KV-700”、PerkinElmer公司的IVIS Imaging System、Maestro TM等。生物体内的荧光标记细胞利用体内荧光成像装置的观察通过检测来自荧光色素b的荧光来进行。具体而言，用激发荧光色素b的波长的激发光激发荧光色素b，检测来自被激发的荧光色素b的荧光。生物体内的荧光标记细胞利用体内荧光成像装置进行的观察例如可以在激发波长为650～760nm、荧光波长为760～850nm的条件下进行。通过经时进行生物体内的荧光标记细胞利用体内荧光成像装置进行的观察，能够获得移植到小鼠等生物体内的iPS细胞、ES细胞等的干细胞、癌细胞以及肝硬化细胞等疾病相关细胞等的细胞在移植后、在怎样的位置分化、生长、转移等信息。
以往，在用荧光探针对细胞进行标记后，不对细胞是否实际上被荧光探针标记进行确认即移植到小鼠等生物体内，而通过使用本发明的荧光探针，能够利用流式细胞仪仅对用荧光探针标记的荧光标记细胞进行选择、移植到小鼠等生物体内，然后用体内荧光成像装置观察移植后的荧光标记细胞在生物体内的经过。
实施例
以下，使用实施例对本发明进行具体说明。另外，本发明并不限定于下述的实施例。
(试剂)
四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、结合有马来酰亚胺基的吲哚菁绿(分子量为853，以下也简记为“ICG-Mal”)、在两末端结合有叶酸和马来酰亚胺基的聚乙二醇(PEG)(分子量为3400，以下也简记为“FA-PEG-Mal”)均从东京化成工业株式会社获得。MPTMS、ICG-Mal及FA-PEG-Mal的结构式如下所示。
[化学式编号5]
[化学式编号6]
[化学式编号7]
(实施例1)
(荧光探针的制作)
<载体分子与荧光色素a的复合物的制作>
(1)在使TCPP溶解于DMF中而成的TCPP的DMF溶液(3.8mM、32mL)中加入APTES(462μmol)，接着加入N,N′-二丙基碳二亚胺(480μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(480μmol)，在50℃下搅拌24小时。
(2)将上述得到的卟啉-硅烷的DMF溶液200μL(卟啉-硅烷0.75μmol)与MPTMS 5μL(0.027mmol)混合。在得到的混合液中加入500μL的DMF和300μL的氨水(浓度：28质量％，pH为11)，在80℃下进行24小时反应。
(3)24小时后，通过离心分离(15000rpm、20分钟)将产物作为沉淀物回收，将产物用水和乙醇洗涤数次，最终使其分散于1mL的水中。
(4)得到的物质是以聚硅氧烷为载体分子、以卟啉为荧光色素a的、在聚硅氧烷上共价键合有卟啉的聚硅氧烷与卟啉的复合物，通过动态光散射法(Beckman Coulter制“DelsaMax PRO”)进行测定，结果为平均粒径为约40nm的荧光杂化纳米粒子(以下也简记为“PPS HNPs”)。
<使荧光色素b与载体分子和荧光色素a的复合物结合的工序>
(1)向上述得到的PPS HNPs的水分散液1mL中添加ICG-Mal的水溶液63μL(浓度：2mg/mL、ICG-Mal：1.48×10-4mmol)，在30℃下搅拌3小时使其反应。
(2)反应后，通过离心分离(15000rpm、20分钟)将产物作为沉淀物回收，用水洗涤数次，最终使其分散于1mL的水中。
(3)得到的物质是在以聚硅氧烷为载体、以卟啉为荧光色素a、以吲哚菁绿为荧光色素b的聚硅氧烷上共价键合有卟啉和吲哚菁绿的复合物(荧光探针)，通过动态光散射法(Beckman Coulter制“DelsaMax PRO”)进行测定，结果为平均粒径为约50nm的荧光杂化纳米粒子(以下也简记为“ICG-PPS HNPs”)。
(实施例2)
(荧光探针的制作)
<载体分子与荧光色素a的复合物的制作>
与实施例1同样地得到PPS HNPs。
<使荧光色素b及细胞表面结合物质与载体分子结合的工序>
(1)向上述得到的PPS HNPs的水分散液1mL中添加251μL的FA-PEG-Mal的水溶液(浓度：2mg/mL、FA-PEG-Mal：1.48×10-4mmol)和63μL的ICG-Mal的水溶液(浓度：2mg/mL、ICG-Mal：1.48×10-4mmol)，在30℃下搅拌3小时。
(2)反应后，通过离心分离(15000rpm、20分钟)将产物作为沉淀物回收，用水洗涤数次，最终分散于1mL的水中。
(3)得到的物质为以聚硅氧烷为载体分子、以卟啉为荧光色素a、以吲哚菁绿为荧光色素b、以叶酸为细胞表面结合物质的、在聚硅氧烷上共价键合有卟啉、吲哚菁绿和叶酸的复合物(荧光探针)，通过动态光散射法(Beckman Coulter制“DelsaMax PRO”)进行测定，结果为平均粒径为约65nm的荧光杂化纳米粒子(以下也简记为“FA-PEG/ICG-PPS HNPs”)。
(利用傅里叶变换红外分光法的确认)
将实施例1及实施例2中得到的PPS HNPs和作为原料使用的TCPP用傅里叶变换红外分光光度计(Nicolet公司制“NEXUS470”)进行分析，将PPS HNPs及TCPP的FT-IR光谱示于图1。由图1的FT-IR光谱可知，均在3430～3250cm-1下显示来源于吡咯环的峰。在PPS HNPs中，TCPP在1800～1640cm-1的羧酸(羧基)的峰消失而显现1740～1620cm-1的来源于酰胺的峰，由此确认了TCPP的羧基形成酰胺键，与硅氧烷共价键合而成(通过卟啉-硅烷和MPTMS的水解、缩合形成的)的聚硅氧烷与卟啉的复合物已可靠地合成。另外，PPS HNPs在1260～1010cm-1(νSi-O-Si)、870～740cm-1(νSi-O-Si)、540～410cm-1(σSi-O-Si)处显现出来源于硅氧烷键的峰。即，确认了在PPS HNPs中，利用卟啉-硅烷和MPTMS(官能团硅烷)形成了硅氧烷网络，卟啉通过酰胺键嵌入到硅氧烷网络中。
用29Si固体NMR对实施例1和实施例2中得到的PPS HNPs进行结构分析，将PPS HNPs的29Si固体NMR光谱示于图2。从图2确认了-58和-69ppm处出现峰。推测-58ppm的峰表示下述化学式所示的T2结构，-69ppm的峰表示下述化学式所示的T3结构。由该结果确认了，虽然在PPS HNPs中存在一部分T2结构的Si，但大部分MPTMS和卟啉-硅烷受到水解、缩聚。卟啉与硅氧烷共价键合而形成复合物。
[化学式编号8]
(热重-差热分析)
使用热分析仪(Rigaku制，TG8120)对PPS HNPs进行热重-差热分析(TG-DTA)。图3中示出了PPS HNPs的TG(热重)及DTA(差示热)曲线。分析的结果推测，100℃下的重量减少是因吸附水而导致的，300℃下的重量减少是因氨基丙基部分和巯基丙基部分的燃烧而导致的，300～400℃下的重量减少是因卟啉的4个吡咯的环状结构部分(卟啉)的分解而导致的，剩余的部分是硅氧烷部分。具体而言，推测在PPS HNPs中含有7重量％的吸附水、29重量％的氨基丙基部分和巯基丙基部分、17重量％的卟啉的4个吡咯的环状结构部分(卟啉)、47重量％的聚硅氧烷部分。
(与PPS HNPs结合的FA-PEG和ICG的定量)
为了求出与PPS HNPs结合的FA-PEG和ICG的量，，在实施例2中，用分光光度计(日本分光公司制“V-570”)测定反应结束后的上清液(1mL)的吸收光谱，计算未反应的FA-PEG-Mal、ICG-Mal量。图4A中示出了上清液的吸收光谱。由于FA-PEG-Mal在叶酸的水溶液中的吸光系数不清楚，因此制作叶酸的峰值波长377nm下的标准曲线，由此计算浓度。图4B中示出了叶酸的标准曲线。在图4A中，377nm的吸光度为0.032，由此求出的上清液中的叶酸的浓度为12nmol/mL。所使用的FA-PEG-Mal量为148nmol，因此确认了92％的FA-PEG-Mal发生了反应。接着，对于ICG-Mal，使用ICG的水溶液中的800nm下的摩尔吸光系数ε800＝147000L/mol·cm，根据朗伯-比尔(Lambert–Beer)公式A800＝ε800cL计算上清液中的浓度，结果为0.094nmol/mL。由于所使用的ICG-Mal量为148nmol，因此能够估计99.9％的ICG-Mal发生了反应。由以上的计算结果判断，92％的FA-PEG、大致100％的ICG结合于PPS HNPs。同样地，在实施例1中，求出与PPS HNPs结合的ICG的量，结果确认到大致100％的ICG结合于PPS HNPs。
(利用分光法进行吸收光谱的确认)
用分光光度计(日本分光公司制“V-570”)测定实施例1和实施例2中得到的PPSHNPs的水溶液和实施例2中得到的FA-PEG/ICG-PPS HNPs的水溶液的吸收光谱，将其结果示于下述图5中。由图5的PPS HNPs以及FA-PEG/ICG-PPS HNPs的吸收光谱确认了，通过ICG与PPS HNPs结合，在波长700～900nm附近出现来源于ICG的峰。另外确认了，在ICG-PPS HNPs及FA-PEG/ICG-PPS HNPs中，来源于卟啉的380～650nm附近的峰几乎没有变化。
(荧光探针的波长特性确认)
使用实施例2中得到的FA-PEG/ICG-PPS HNPs的水溶液，用日本分光公司制的分光荧光光度计FP-6600分析FA-PEG/ICG-PPS HNPs的激发波长光谱和荧光波长光谱。将其结果示于图6。图6A表示用于体外荧光成像的短波长侧的波长特性，图6B表示体内荧光成像中使用的长波长侧的波长特性。由图6A和图6B可知，在最大激发波长425nm、最大荧光波长655nm的短波长侧、和最大激发波长650nm、最大荧光波长905nm的长波长侧的任一侧，斯托克斯位移都大。确认了ICG-PPS HNPs和FA-PEG/ICG-PPS HNPs均是具有结合于载体分子(聚硅氧烷)的不同激发波长的2种荧光色素(卟啉和ICG)且在2种荧光色素之间不产生荧光共振能量移动的荧光探针。该荧光探针也可以用于体外和体内的任一种成像。而且，由于斯托克斯位移大，因此在体内成像中不会妨碍生物体的自身荧光，可预料有非常高的有用性。
(利用荧光显微镜进行的分析)
(1)细胞
使用来自作为与小鼠同种的细胞的小鼠的巨噬细胞的RAW264.7细胞、来自作为与小鼠不同种的细胞的人的宫颈癌的HeLa S3细胞和来自人的结肠癌的HCT116细胞。在实施例中，细胞和细胞培养用培养基从Sigma-Aldrich公司获得。细胞培养皿使用了ThermoFisher Scientific公司制的细胞培养皿。
(2)细胞的荧光探针标记
(a)将细胞接种于细胞培养皿(直径为35mm)中的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)上(0.3×105细胞/mL)，培养一晚。
(b)对于经培养的细胞，更换为加有荧光探针(30μg/mL)的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)，进行24小时培养。此时，对于RAW264.7细胞，更换为加有荧光探针ICG-PPS HNPs的细胞培养用培养基，对于HeLa S3细胞和HCT116细胞，更换为加有荧光探针FA-PEG/ICG-PPS HNPs的细胞培养用培养基。
(c)弃去上清，用2mL的磷酸缓冲生理盐水(1×PBS，pH为7.4，和光纯药“D-PBS(-)(045-29795)”)洗涤培养细胞。
(d)弃去上清，在培养细胞中添加2mL的4％多聚甲醛(PFA)，在室温(20±5℃)下静置30分钟。
(e)弃去上清，向培养细胞中加入1mL 1×PBS。将该工序重复3次。
(3)利用荧光显微镜进行的观察
使用Life Technologies公司的荧光显微镜EVOS(注册商标)FL Cell ImagingSystem观察用荧光探针标记的荧光标记细胞。根据卟啉的波长特性，在激发波长为422nm、荧光波长为655nm下进行观察。将其结果示于图7。
图7A中示出了使用了RAW 264.7细胞的明视野图像(Bright field)、荧光色素DAPI(4,6-二脒-2-苯基吲哚)的细胞核的荧光图像(DAPI)、利用ICG-PPS HNPs(荧光探针)得到的荧光成像、将这三个图像重叠而得到的图像(Merge)。从图7A的明视野图像可知存在细胞。另外，从DAPI的图像确认到被DAPI染色的细胞核。由ICG-PPS HNPs的图像可知，细胞被荧光探针标记。由Merge的图像可知，在RAW4264.7细胞中，在细胞质中大量观察到荧光探针产生的荧光，核不产生荧光。由该结果确认了，ICG-PPS HNPs(荧光探针)被摄入到细胞内并停留在细胞质中。认为RAW264.7细胞是巨噬细胞，通过吞噬能力将荧光探针摄入到细胞内，荧光探针聚集在细胞质中。
图7B中示出了HeLa S3细胞的明视野图像(Bright field)、使用了荧光色素DAPI的细胞核的荧光图像(DAPI)、利用FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针得到的荧光成像、将这三个图像重叠而得到的图像(Merge)。从图7B的明视野图像可知存在细胞。另外，从DAPI的图像确认到被DAPI染色的细胞核。由FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针的图像可知，细胞被荧光探针标记。由Merge的图像可知，HeLa S3细胞的荧光探针的荧光包含细胞核在内的细胞整体发出荧光。由该结果可知，荧光探针与细胞表面结合，细胞整体发光而被观测到。认为癌细胞具有使叶酸与细胞表面结合的受体，荧光探针(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)通过叶酸与癌细胞即HCT116细胞的表面结合。
图7C中示出了HCT116细胞的明视野图像(Bright field)、使用了荧光色素DAPI的细胞核的荧光图像(DAPI)、利用FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针得到的荧光成像、将这三个图像重叠得到的图像(Merge)。从图7C的明视野图像可知存在细胞。另外，从DAPI的图像确认到被DAPI染色的细胞核。由FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针的图像可知，细胞被荧光探针标记。由Merge的图像可知，HCT116细胞的荧光探针的荧光包含细胞核在内的细胞整体发出荧光。由该结果可知，荧光探针与细胞表面结合，细胞整体发光而被观测到。认为癌细胞具有使叶酸与细胞表面结合的受体，荧光探针(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)通过叶酸与癌细胞即HCT116细胞的表面结合。
(利用流式细胞仪进行的分析)
(1)细胞
使用来自作为与小鼠同种的细胞的小鼠的巨噬细胞的RAW264.7细胞和来自作为与小鼠不同种的细胞的人的宫颈癌的HeLa S3细胞和来自人的结肠癌的HCT116细胞。
(2)细胞的荧光探针标记
(a)将细胞以下述表1所示的接种量接种于细胞培养皿(直径为35mm)中的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)上，培养一晚。
(b)对于经培养的细胞，更换为下述表1所示的加有荧光探针(50μg/mL)的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)，进一步进行48小时培养。
(c)从细胞培养皿回收细胞。此时，HeLa S3细胞和HCT116细胞的回收中使用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液。
(d)将回收液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，将细胞悬浮于400μL的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)中。
(e)将悬浮液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，在细胞中添加1mL 4％PFA，在室温(20±5℃)下静置30分钟。
(f)将再悬浮液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，在细胞中加入1mL 1×PBS。将该工序重复3次。
表1
(3)利用流式细胞仪进行的观察
使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20观察用荧光探针标记的细胞。在激发波长为405nm，荧光波长为670nm下进行观察。将其结果示于图8(RAW264.7细胞)、图9(HeLaS3细胞)及图10(HCT116细胞)。
由图8、图9和图10可知，能够将全部的细胞样品中被荧光标记的细胞和未被荧光标记的细胞分离来进行观察。作为光强度，存在100～10000倍左右的差。对细胞用荧光探针进行标记后，能够明确判别被荧光标记的细胞和未被荧光标记的细胞，进行分离。通过使用流式细胞仪，能够仅对被荧光探针标记的荧光标记细胞进行分选，然后移植到小鼠等生物体内，通过荧光体内成像装置，能够更准确地确认小鼠等生物体内的荧光标记细胞的局部分布。
(荧光标记细胞向小鼠的移植)
(1)细胞
使用RAW264.7细胞和HeLa S3细胞。
(2)细胞利用荧光探针进行的标记
(a)将细胞接种于细胞培养皿(直径为60mm)中的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)中(1×106细胞/mL)，培养一晚。
(b)对于经培养的细胞，更换为加有荧光探针(30μg/mL)的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)，进行24小时培养。此时，对于RAW264.7细胞，更换为加有荧光探针ICG-PPS HNPs的细胞培养用培养基，对于HeLa S3细胞，更换为加有荧光探针FA-PEG/ICG-PPS HNPs的细胞培养用培养基。
(c)从细胞培养皿回收细胞。此时，HeLa S3细胞的回收中使用胰蛋白酶/EDTA溶液。
(d)将回收液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，将细胞悬浮于1000μL的无血清培养基(DMEM培养基)中。
(e)将悬浮液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，加入1000μL的血清培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)，使细胞悬浮。
(f)将1×106细胞悬浮在100μL的1×PBS中，使用注射器注射到小鼠(KSN/Slc、雄性、6周龄、日本SLC株式会社)的尾静脉中。使用血细胞计算盘测定细胞数。
(3)用小鼠体内的荧光探针标记的荧光标记细胞的观察
使用仓敷纺织公司的荧光体内成像装置“KURAVIC KV-700”观察小鼠体内的荧光标记细胞。观察将即将注射前记为0小时，隔开间隔进行拍摄至24小时。根据ICG的波长特性，在激发波长为747nm、荧光波长为850nm下进行观察。将其结果示于图11(RAW264.7细胞)及图12(HeLa S3细胞)。
从图11可以确认用荧光探针(ICG-PPS HNPs)标记的RAW 264.7细胞在小鼠体内直至24小时的活动。即，确认了RAW 264.7细胞在小鼠体内进行了怎样的活动。特别是，通过选择适于体内观察的荧光波长，能够不捕捉自体荧光而仅明确地捕捉ICG的荧光。作为24小时后的状态，可知虽然RAW 264.7细胞在脾脏、肝脏较多，但分布于内脏整体。
从图12可以确认用荧光探针(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)标记的HeLa S3细胞在小鼠体内直至24小时的活动。即，能够确认HeLa S3细胞在小鼠体内进行了怎样的活动。特别是，通过选择适于体内观察的荧光波长，能够不捕获自身荧光而仅明确地捕获ICG的荧光。作为24作为时间后的状态，可知细胞特别聚集于肝脏。
(4)小鼠体内用荧光探针标记的细胞的聚集的确认
解剖经过24小时后的小鼠，取出脏器，利用荧光体内成像装置“KURAVIC KV-700”观察24小时后的用荧光探针标记的细胞在小鼠体内的聚集状态。将其结果示于图13(RAW264.7细胞)、图14(RAW264.7细胞)、图15(HeLa S3细胞)和图16(HeLa S3细胞)。
由图13和图14可知，24小时后，用荧光探针(ICG-PPS HNPs)标记的RAW 264.7细胞虽然多聚集在脾脏和肝脏中，但分布于内脏整体。另外，由图15和图16可知，24小时后，用荧光探针(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)标记的HeLa细胞特别多地集聚在肝脏中。
由以上可知，作为荧光探针，通过使用具有结合于ICG-PPS HNPs和FA-PEG/ICG-PPS HNPs等载体分子的不同激发波长的两种荧光色素、并且在2种荧光色素之间荧光色素a与荧光色素b之间不产生荧光共振能量移动的荧光探针，能够用荧光显微镜或流式细胞仪等荧光体内成像装置确认用荧光探针标记的细胞，并且能够用荧光体内成像装置确认移植了用荧光探针标记的细胞的生物体内的荧光标记细胞伴随时间的局部分布等。

Claims (21)

1.一种荧光探针，其特征在于，在包含载体分子、和与所述载体分子结合的荧光色素a和荧光色素b的荧光探针中，荧光色素a的激发波长与荧光色素b的激发波长不同、并且在荧光色素a与荧光色素b之间不产生荧光共振能量移动。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其中，所述荧光探针为细胞标记用荧光探针，荧光色素a为体外荧光成像用荧光色素，荧光色素b为体内荧光成像用荧光色素。
3.根据权利要求1或2所述的荧光探针，其通过特异性结合于细胞表面来标记细胞。
4.根据权利要求1或2所述的荧光探针，其通过被摄入到细胞内部来标记细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的荧光探针，其中，荧光色素a的激发波长为350～650nm的范围。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的荧光探针，其中，荧光色素b的激发波长为600～850nm的范围。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的荧光探针，其中，荧光色素a为卟啉。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的荧光探针，其中，荧光色素b为吲哚菁绿。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的荧光探针，其中，所述载体分子为聚硅氧烷。
10.根据权利要求2～9中任一项所述的荧光探针，其用于利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选。
11.一种检测目标细胞的荧光检测方法，其特征在于，其包含：
用荧光探针对目标细胞进行标记的工序，和
向用荧光探针标记的目标细胞照射激发光，观察来自荧光探针的荧光的工序，
其中，所述荧光探针包含载体分子、和与所述载体分子结合的荧光色素a及荧光色素b，荧光色素a的激发波长与荧光色素b的激发波长不同，并且在荧光色素a与荧光色素b之间不产生荧光共振能量移动。
12.根据权利要求11所述的荧光检测方法，其中，荧光色素a为体外荧光成像用荧光色素，荧光色素b为体内荧光成像用荧光色素。
13.根据权利要求11或12所述的荧光检测方法，其中，对用荧光探针标记的目标细胞照射激发荧光色素a的激发光，通过体外荧光成像观察来自荧光探针的荧光。
14.根据权利要求11或12所述的荧光检测方法，其中，将用荧光探针标记的目标细胞移植到生物体内，向该生物体照射激发荧光色素b的激发光，通过体内荧光成像观察来自荧光探针的荧光，所述生物体除外人体。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的荧光检测方法，其中，所述荧光探针通过特异性结合于细胞表面来标记细胞。
16.根据权利要求11～14中任一项所述的荧光检测方法，其中，所述荧光探针通过被摄入到细胞内部来标记细胞。
17.根据权利要求11～16中任一项所述的荧光检测方法，其中，荧光色素a的激发波长为350～650nm的范围。
18.根据权利要求11～17中任一项所述的荧光检测方法，其中，荧光色素b的激发波长为600～850nm的范围。
19.根据权利要求11～18中任一项所述的荧光检测方法，其中，荧光色素a为卟啉。
20.根据权利要求11～19中任一项所述的荧光检测方法，其中，荧光色素b为吲哚菁绿。
21.权利要求1～10中任一项所述的荧光探针的使用方法，其特征在于，其包含：
用荧光探针对细胞进行荧光标记的工序，
利用流式细胞仪或荧光显微镜确认用荧光探针进行了荧光标记的荧光标记细胞并进行分选的工序，
将分选出的荧光标记细胞移植到生物体内的工序，所述生物体除外人体，和
利用体内荧光成像装置观察生物体内的荧光标记细胞的工序，
其中，所述利用流式细胞仪或荧光显微镜进行的荧光标记细胞的分选通过检测来自荧光色素a的荧光来进行，所述生物体内的荧光标记细胞利用体内荧光成像装置进行的观察通过检测来自荧光色素b的荧光来进行。
CN201780026210.XA 2016-04-28 2017-02-10 荧光探针、荧光检测方法及荧光探针的使用方法 Pending CN109073556A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-091359 2016-04-28
JP2016091359 2016-04-28
PCT/JP2017/004981 WO2017187717A1 (ja) 2016-04-28 2017-02-10 蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109073556A true CN109073556A (zh) 2018-12-21

Family

ID=60161378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780026210.XA Pending CN109073556A (zh) 2016-04-28 2017-02-10 荧光探针、荧光检测方法及荧光探针的使用方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190137396A1 (zh)
EP (1) EP3450963A4 (zh)
JP (1) JPWO2017187717A1 (zh)
CN (1) CN109073556A (zh)
WO (1) WO2017187717A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111234813A (zh) * 2020-01-24 2020-06-05 复旦大学 卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova-1及其制备方法和应用
CN111562241A (zh) * 2019-12-15 2020-08-21 北京化工大学 一种对聚合物材料老化的检测及过程分析方法
CN112697759A (zh) * 2020-12-10 2021-04-23 北京林业大学 荧光相关光谱（fcs）在植物细胞核中的应用方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3764096A4 (en) * 2018-03-07 2021-04-28 Konica Minolta, Inc. IMAGE PROCESSING METHOD, IMAGE PROCESSING DEVICE, AND PROGRAM
CN109632742A (zh) * 2018-12-27 2019-04-16 苏州和迈精密仪器有限公司 一种共振能量转移荧光的检测方法
CN113502320A (zh) * 2021-08-06 2021-10-15 海南微氪生物科技股份有限公司 一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007064841A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 North Carolina State University Porphyrinic compounds for use in flow cytometry
CN101946171A (zh) * 2007-12-14 2011-01-12 拜奥蒂乌姆股份有限公司 荧光化合物
CN102186505A (zh) * 2008-10-21 2011-09-14 通用电气健康护理有限公司 成像和放射治疗方法
CN102443389A (zh) * 2011-09-09 2012-05-09 厦门大学 具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒
JP2013535679A (ja) * 2010-07-30 2013-09-12 プルシオン メディカル システムズ アーゲー 臓器機能を判定するための測定方法
CN103858010A (zh) * 2011-07-06 2014-06-11 Cisbio生物试验公司 对细胞表面的分析物进行检测和/或定量的改进方法
CN103969233A (zh) * 2014-04-03 2014-08-06 浙江大学 一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法
CN105073761A (zh) * 2013-03-15 2015-11-18 文森医学公司 用于体外和体内成像和检测的取代的硅杂蒽阳离子红至近红外荧光染料
JP2016014096A (ja) * 2014-07-01 2016-01-28 古河電気工業株式会社 紫外励起蛍光粒子、これを用いた検出方法、画像表示方法、画像表示スクリーンおよび画像表示装置

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4445065A1 (de) * 1994-12-07 1996-06-13 Diagnostikforschung Inst Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung
WO2007097377A1 (ja) * 2006-02-24 2007-08-30 The Furukawa Electric Co., Ltd. フローサイトメトリーによる生体分子の定量システム、その定量方法、細胞の検出・分取システム、その検出・分取方法、それらに用いる蛍光シリカ粒子、及び複数個の蛍光シリカ粒子を組み合わせたキット
US8647119B1 (en) * 2006-04-18 2014-02-11 President And Fellows Of Harvard College Methods and kits with fluorescent probes for caries detection
US20100183504A1 (en) * 2007-06-14 2010-07-22 Fanqing Frank Chen Multimodal imaging probes for in vivo targeted and non-targeted imaging and therapeutics
EP3065551A4 (en) * 2013-11-04 2017-08-09 Becton, Dickinson and Company Immunomodulatory potential of a multipotent stromal cell (msc) population

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007064841A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 North Carolina State University Porphyrinic compounds for use in flow cytometry
CN101946171A (zh) * 2007-12-14 2011-01-12 拜奥蒂乌姆股份有限公司 荧光化合物
CN102186505A (zh) * 2008-10-21 2011-09-14 通用电气健康护理有限公司 成像和放射治疗方法
JP2013535679A (ja) * 2010-07-30 2013-09-12 プルシオン メディカル システムズ アーゲー 臓器機能を判定するための測定方法
CN103858010A (zh) * 2011-07-06 2014-06-11 Cisbio生物试验公司 对细胞表面的分析物进行检测和/或定量的改进方法
CN102443389A (zh) * 2011-09-09 2012-05-09 厦门大学 具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒
CN105073761A (zh) * 2013-03-15 2015-11-18 文森医学公司 用于体外和体内成像和检测的取代的硅杂蒽阳离子红至近红外荧光染料
CN103969233A (zh) * 2014-04-03 2014-08-06 浙江大学 一种双色荧光标记筛选抗阿霉素心肌毒性活性物质的方法
JP2016014096A (ja) * 2014-07-01 2016-01-28 古河電気工業株式会社 紫外励起蛍光粒子、これを用いた検出方法、画像表示方法、画像表示スクリーンおよび画像表示装置

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111562241A (zh) * 2019-12-15 2020-08-21 北京化工大学 一种对聚合物材料老化的检测及过程分析方法
CN111562241B (zh) * 2019-12-15 2021-06-22 北京化工大学 一种对聚合物材料老化的检测及过程分析方法
CN111234813A (zh) * 2020-01-24 2020-06-05 复旦大学 卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova-1及其制备方法和应用
CN111234813B (zh) * 2020-01-24 2022-12-20 复旦大学 卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova-1及其制备方法和应用
CN112697759A (zh) * 2020-12-10 2021-04-23 北京林业大学 荧光相关光谱（fcs）在植物细胞核中的应用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017187717A1 (ja) 2017-11-02
US20190137396A1 (en) 2019-05-09
EP3450963A1 (en) 2019-03-06
EP3450963A4 (en) 2020-01-29
JPWO2017187717A1 (ja) 2019-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109073556A (zh) 荧光探针、荧光检测方法及荧光探针的使用方法
CN109073555A (zh) 流式细胞术用荧光探针和荧光标记细胞的分选方法
Montalti et al. Dye-doped silica nanoparticles as luminescent organized systems for nanomedicine
JP5313249B2 (ja) ナノ粒子を用いた蛍光共鳴エネルギ移動検出
Feng et al. Conjugated polymer nanoparticles: preparation, properties, functionalization and biological applications
Zhang et al. Supramolecular hybrids of AIEgen with carbon dots for noninvasive long-term bioimaging
CN106039325A (zh) 荧光生物探针以及成像方法
US8221721B2 (en) Polycyclo dyes and use thereof
CN104395306B (zh) 作为生物分子的标记染料的吲哚衍生物
CN109152849A (zh) Aie纳米粒子缀合物及其方法
Hu et al. Aptamer combined with fluorescent silica nanoparticles for detection of hepatoma cells
US20080267883A1 (en) Nicotinic and Picolinic Acid Derived Near-Infrared Fluorophores
JP2009508105A (ja) 蛍光性を有する磁性ナノ粒子、その製造方法及びその用途
TW200809198A (en) Loaded latex optical molecular imaging probes
CN104788433A (zh) 生物相容的含n,n-二取代磺酰胺的荧光染料标记
CN109313135A (zh) 用于癌细胞成像的聚集诱导发光体
CN109490523A (zh) 用于标记的纳米材料、核酸探针及核酸与纳米材料偶联的方法
US8017104B2 (en) Large stoke shift dye used for optical imaging
Warnement et al. Controlling the reactivity of ampiphilic quantum dots in biological assays through hydrophobic assembly of custom PEG derivatives
CN110746963B (zh) 近红外发光的生物质量子点和细胞内mRNA比率荧光成像的纳米探针及其制备方法和应用
JP6709734B2 (ja) アルコキシシリル基含有有機ｅｌ色素およびその製造方法
CN109475638A (zh) 使用碳硅烷树状高分子的靶组织特异性递送型药物递送系统用胶囊
Alford et al. Fluorescence lifetime imaging of activatable target specific molecular probes
Li et al. Macromolecular assembly of bioluminescent protein nanoparticles for enhanced imaging
Fei et al. Folate conjugated chitosan grafted thiazole orange derivative with high targeting for early breast cancer cells diagnosis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181221