CN109152849A - Aie纳米粒子缀合物及其方法 - Google Patents
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Abstract
描述了包含两亲性聚合物纳米粒子(例如DSPE‑PEG)的组合物,其包封具有聚集诱导发射(AIE)特征的光稳定剂。光稳定的AIE试剂优选地是具有四苯基乙烯部分的小有机分子。通过改性的纳米沉淀法合成纳米粒子,并通过改变负载比、溶剂比和该聚合物的亲水性长度与疏水性长度的比例来控制这些纳米粒子的尺寸。用可缀合基团对这些纳米粒子进行表面改性,以共价连接至至少一种靶向部分,例如IgG、EGFR和Her2的抗体或亲和体。描述了使用这些纳米粒子组合物用于免疫染色活细胞或使活细胞成像或检测活细胞或跟踪活细胞(例如癌细胞)的方法。
Description
本申请要求于2016年4月15日提交的美国临时申请号62/323,594的权益。上述申请的全部传授内容通过引用并入本文。
由具有聚集诱导发射特征的荧光团(AIE荧光团)制造的有机纳米粒子作为荧光生物成像的有希望的平台已经受到广泛关注。这些AIE荧光团在良好的溶剂中在分子分散状态下是不发光的,但是可以诱导在聚集或干燥状态下发出强荧光。这种独特的AIE特性使得有可能制造出超亮的基于AIE荧光团的有机纳米粒子(AIE NP),这些有机纳米粒子具有用于生物应用的出色的水分散性和良好的光稳定性。这些纳米粒子通常缺乏对细胞或任何生物学事件的特异性,因为它们没有表面靶向基团。
在另一方面,抗体已广泛用于靶向特定蛋白质,用于研究和理解不同蛋白质的功能以及它们之间的相互作用。荧光标记抗体已成为这些研究的有力工具。包括Cy3、FITC和Alexa等的小有机染料占据了这一领域的主导地位;然而,它们往往在激光激发下迅速漂白,在很大程度上限制了它们长期研究的性能。虽然半导体纳米晶体量子纳米粒子(QD)具有高亮度和大大改善的光稳定性,但是它们由其整体组分产生的内在毒性已引起人们的极大关注。因此,新颖的荧光AIE NP可通过与其表面上的抗体缀合而用作开发下一代免疫染色试剂的有希望的候选物。
调整AIE荧光团的吸收/发射波长的能力不仅允许它们用可相容的常见激光器激发以实现最佳发射,而且还提供多路检测的机会,这进一步简化了检测过程并降低了仪器成本。基于四苯基乙烯(TPE)的AIE发射器是令人感兴趣的。这些分子可以在仅仅很少的步骤中从市售的具有可调的吸收和发射波长以及高达1(unity)的高量子产率的材料合成。结构的颜色代表AIE荧光团的相应发射:分别地蓝色、绿色和红色。参见图1。合成这些分子并使用核磁共振光谱(NMR)和元素分析确认它们的结构。
附图说明
如附图中所示,从示例性实施例的以下更具体的描述中,前述内容将变得显而易见。这些图不一定是按比例绘出,而是着重展示实施例。
图1示出了具有可调的光学特征的AIE荧光团的分子结构。结构的颜色代表AIE荧光团的相应发射:分别地蓝色、绿色和红色。
图2是AIE NP形成的图示。这里中等尺寸意味着尺寸大于25nm且超小尺寸小于5nm。
图3A-3C是纳米粒子的光学特性的图。合成的NP在水中的归一化UV(实线)和光致发光(PL)(虚线)光谱(图3A蓝色,在357nm激发;图3B绿色,在423nm激发;图3C红色,在506nm激发)。
图4示出了合成的纳米粒子的激光散射数据。
图5是蛋白质/抗体与AIE NP缀合的示意图。
图6A-6F分别示出了蓝色(图6A、6D)、绿色(图6B、6E)和红色(图6C、6F)AIE-IgG纳米粒子的UV(实线)和PL(虚线)光谱(图6A-6C)和尺寸分布(图6D-6F)。
图7A示出了在4℃孵育18天后三种AIE-IgG纳米粒子的荧光量子产率变化。图7B-7D示出了在4℃孵育18天之前和之后的蓝色(图7B)、绿色(图7C)和红色(图7D)AIE-IgG的尺寸分布。
图8A示出了红色AIE-EGFR和AIE-Her2纳米粒子的UV-vis和PL光谱。图8B示出了在4℃连续孵育后红色AIE-EGFR和AIE-Her2纳米粒子的荧光量子产率变化。图8C和8D示出了在4℃孵育18天之前和之后AIE-EGFR(图8C)和AIE-Her2(图8D)纳米粒子的尺寸分布。
图9示出了与不同浓度的红色AIE-IgG或QD655-IgG孵育后人IgG的荧光强度变化。
图10示出了与不同浓度的绿色AIE-IgG孵育后人IgG的荧光强度变化。
图11示出了用绿色AIE-EGFR纳米粒子、红色AIE-EGFR纳米粒子或没有EGFR抗体缀合的红色AIE点处理后MDA-MB-231乳腺癌细胞的共聚焦图像。用浓度为2nM的这些纳米粒子在37℃处理细胞2小时。
图12示出了与红色AIE-Her2缀合物在2nM浓度下孵育2小时后SKBR-3乳腺癌细胞和NIH-3T3成纤维细胞正常细胞的共聚焦图像。
图13示出了在2nM浓度下孵育4小时然后传代培养指定的一代后使用AIE670-Her2或QD655-Her2的共聚焦成像追踪活SKBR-3细胞。
图14示出了与绿色AIE-Her2缀合物在2nM浓度下孵育2小时后SKBR-3乳腺癌细胞和NIH-3T3成纤维细胞正常细胞的共聚焦图像。
图15A示出了绿色AIE-EGFR纳米粒子的TPA横切面。图15B示出了用绿色AIE-EGFR纳米粒子处理后MDA-MB-231细胞的双光子荧光图像。图15C示出了红色AIE-EGFR纳米粒子的TPA横切面。图15D示出了用红色AIE-EGFR纳米粒子处理后MDA-MB-231细胞的双光子荧光图像。用2nM的浓度的AIE-EGFR纳米粒子在37℃下处理这些细胞2小时。以820nm的激发波长获得双光子荧光图像;在540nm至580nm之间收集绿色信号;在650nm至680nm之间收集红色信号。
具体实施方式
在一个实施例中,提供了一种纳米粒子组合物,其包含多种表面可缀合基团,其中该纳米粒子包含生物相容性聚合物壳(该生物相容性聚合物壳具有小于约1000nm的平均直径)和包封在该壳中并且包含至少一个适合于成像应用的具有聚集诱导发射特征的均匀的光稳定剂群的纳米粒子核;壳的聚合物表面,该聚合物表面包含至少一个可缀合基团;以及任选地至少一个靶向部分,该至少一个靶向部分特异性地结合靶标,该至少一个靶向部分共价地连接至该至少一个可缀合的基团。在该实施例的一个方面,该聚合物表面包含至少一个可缀合基团,其共价地连接至可特异性地结合靶标的至少一个靶向部分上。在本实施例的另一个方面,该聚合物表面包含至少一个可缀合基团,其不共价地连接至可特异性地结合靶标的至少一个靶向基部分上。
该生物相容性聚合物壳可以是任何亲水性生物相容性聚合物,其可以用可缀合基团进行表面改性。例如,可以使用任何FDA批准的生物相容性亲水聚合物,例如PEGn,其中n是10至1000之间的整数,包括端值。其他生物相容性聚合物描述于WO 2013029340 A9中,例如在段落[0130-0135]中,该参考文献的全部教导通过引用并入本文。
该核可包含疏水性脂质表面活性剂,例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。核的材料的实例描述于WO 2013029340 A9中,例如在段落[0130-0135]中,该参考文献的全部教导通过引用并入本文。
该表面的一部分可以是用可缀合基团官能化的。例如,至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%的表面是衍生化的。在此上下文中术语“约”意指+/-5%。
在一个实施例中,该纳米粒子具有约50nm至约300nm,例如,约50nm的平均直径。在另一个实施例中,该纳米粒子具有约20nm至约30nm的平均直径。在又另一个实施例中,该纳米粒子具有约10nm至约20nm的平均直径。如在此上下文中使用的术语“约”旨在意指+/-5nm。
该具有聚集诱导发射特征的光稳定剂具有可调的吸收或发射波长。在一些实施例中,该具有聚集诱导发射特征的光稳定剂具有式I-III中任一项所述的化学结构:
该四苯基乙烯部分的一个或多个上的一个或多个氢原子可以被电子基团例如甲氧基或吸电子基团例如硝基或氰基取代。
该至少一个可缀合基团可以是但不限于氨基基团、羧酸基基团、巯基基团、马来酰亚胺基基团、肟基基团、炔烃、叠氮化物或其组合。可以使用其他的官能团,其条件是它们可以缀合至靶向部分。
该共价键可以是但不限于肽键、酰胺键、巯基键、马来酰亚胺键、硫酯键、醚键、酯键、肼键、肼键、肟键或其组合。
该靶向部分可以是但不限于配体、生物分子、蛋白质、特异性识别元件,例如肽、适配体、抗体、抗原或其抗原结合片段,例如亲和体。可以选择靶向部分以识别靶标上,例如,在细胞膜上的特定标记或受体。在一个实施例中,该抗原结合片段是亲和体,例如抗her2亲合体。在另一个实施例中,该抗体是结合至表皮生长因子受体的抗EGFR抗体。
该靶标可以是但不限于活细胞例如癌细胞的表面抗原、配体或受体。
在另一个实施例中,提供了一种免疫染色活细胞或使活细胞成像的方法,该方法包括a)使活细胞与纳米粒子靶标部分络合物接触,其中该纳米粒子靶标部分络合物包含:如本文所描述的共价地连接至靶向部分的纳米粒子;b)稳定与该活细胞结合的该纳米粒子靶标部分络合物;c)用能够产生具有特定波长的光并收集图像的激光源激发与该活细胞结合的该纳米粒子靶标部分络合物中的该光稳定剂;和d)处理这些图像,从而使活细胞成像。
在本方法的一个实施例中,该靶向部分可以是但不限于配体、生物分子、蛋白质、特异性识别元件,例如肽、适配体、抗体、抗原或其抗原结合片段。在一个实施例中,该抗原结合片段是亲和体,例如抗her2亲合体。在另一个实施例中,该抗体是结合至表皮生长因子受体的抗EGFR抗体。
该靶标可以是但不限于活细胞例如癌细胞的表面抗原、配体或受体。
在另一个实施例中,提供了一种用于控制纳米粒子尺寸的方法,该方法包括a)用聚集诱导发射改变聚合物与染料的负载比;b)改变用于配制这些纳米粒子的溶剂比(例如,四氢呋喃与水的比率);和c)改变聚合物的亲水性长度与疏水性长度的比例,从而控制纳米粒子的尺寸。
在另一个实施例中,提供了根据纳米粒子的所需特性和预期用途,例如用于免疫染色、细胞特异性癌症检测、多光子成像、细胞追踪,例如,癌细胞追踪,微调纳米粒子的尺寸、颜色和表面官能性的方法。纳米粒子的颜色将取决于并入的纳米粒子中的AIA荧光团。表面官能性将取决于用于包封的聚合物的端基。在一个实施例中,提供了一种用于设计AIE纳米粒子的方法,其包含:选择在所希望的波长上发荧光的AIE荧光团;选自与至少一个靶向部分共价连接的可缀合基团和连接子;和使用本文描述的方法控制纳米粒子的尺寸。
在又另一个实施例中,提供了用于AIE纳米粒子缀合至靶向部分的试剂盒,该试剂盒包含:a)如本文所述的表面官能化AIE纳米粒子,其中该聚合物表面包含至少一个不与所述至少一个靶向部分共价连接的可缀合基团;b)缀合缓冲液;c)洗涤缓冲液;和d)用于进行缀合反应的说明书,例如像本文所述的缀合方案。
纳米粒子缀合物可用于免疫染色、细胞特异性癌症检测、多光子成像、细胞追踪,例如癌细胞追踪。在一些实施例中,该靶向部分附接至表面官能化的纳米粒子。在其他实施例中,表面官能化的纳米粒子能够但尚未与靶向部分缀合。在该实施例配置中,研究人员、研究者等可以使用例如本文所述的方法、试剂盒和纳米粒子附着他们自己选择的靶向部分。
AIE纳米粒子的制造
通过使用改进的纳米沉淀法(图2),通过聚合物包封策略制造具有可修改的表面官能团的AIE纳米粒子。1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)及其具有在PEG链终止的不同末端官能团的衍生物(例如,-COOH、-NH2、-SH、-马来酰亚胺、-生物素、炔烃、叠氮化物、肟等以及这些的组合)将用作包封基质。PEG的长度可以变化,例如,约10至约1000个PEG单位。尽管示出了DSPE-PEG,但该方法不限于DSPE-PEG。任何两亲性嵌段共聚物也可用于制备纳米粒子的方法中。为了形成AIE纳米粒子,简言之,将AIE荧光团(例如像,具有式I-III的荧光团),DSPE-PEG及其衍生物溶解在THF溶剂中的均相溶液中。在超声波超声处理下,以1/9THF/水比将该混合物添加至MilliQ水中。在混合和超声处理后,疏水性DSPE区段将与AIE荧光团交织以形成核,而PEG链将向外延伸至水相以形成壳。在PEG末端终止的这些官能团将用作表面官能团,准备进一步缀合。
具体而言,为了合成尺寸约为10nm的超小AIE NP,将含有AIE荧光团(0.1mg/mL)的1mL稀释THF溶液添加至含有包封基质DSPE-PEGn-X和DSPE-PEGn的10mL水溶液中,其中n是10至1000之间的整数,包括端值(1mg/mL)。术语“超小”旨在意指具有约10nm至约20nm的平均直径的AIE NP。将混合物在水浴超声波仪中进一步超声处理以产生均匀的溶液。DSPE-PEG衍生物将用作表面活性剂和基质以包封AIE荧光团聚集体以形成超小AIE NP。将混合物进一步用水透析以除去THF和过量的DSPE-PEG衍生物。然后将悬浮液离心以除去沉淀的大聚集体。将收集具有亚10nm荧光NP的悬浮溶液用于表征。
对于尺寸为约30nm的中等NP的合成,AIE荧光团和DSPE-PEG衍生物分别地分子溶解在THF溶液中,AIE荧光团的质量浓度为1mg/mL,并且DSPE-PEG衍生物的质量浓度为2mg/mL。然后,在超声波超声处理下,然后将1mL AIE荧光团和DSPE-PEG衍生物的THF混合物添加到9mL水溶液中。超声波超声处理延长2分钟以促进混合和AIE NP形成。在混合和超声波超声处理期间,疏水性DSPE区段将与AIE荧光团交织以形成核,而PEG链将向外延伸至水相以形成壳。术语“中等”旨在意指具有约20nm至约50nm的平均直径的AIE NP。
按照相同的实验程序,但将THF溶剂中的AIE荧光团浓度增加至1.35mg/mL,同时保持所有其他条件不变,合成尺寸约为50nm的大AIE NP。激光散射(LLS)用于研究NP尺寸和尺寸分布,如图4所示,成功实现了具有理想的受控尺寸的AIE NP。术语“大”旨在意指具有约50nm至约300nm的平均直径的AIE NP。
纳米粒子的光学特性
已经成功制造出具有可调尺寸的蓝色、绿色和红色NP。对于每种颜色,这些NP的吸收和发射最大值不依赖于尺寸。这些荧光团的吸收最大值在350nm和550nm之间(图3)。这些NP的UV和PL光谱表明它们具有大的斯托克斯位移,并且因此可用于细胞成像应用。这些NP的激发波长也与当前可用的成像系统相容。可以使用不同的聚合物作为包封基质以提供具有各种表面官能团(例如,NH2/COOH/马来酰亚胺)的纳米粒子(NP)。图4示出了具有不同颜色的代表性纳米粒子的光散射结果。
具有末端官能团的合成的AIE纳米粒子可以用各种配体和生物分子容易地改性,用于体外和体内成像以及用于诊断应用。最常用的方法之一是利用使用与N-乙基-N'-二甲基氨基丙基-碳二亚胺(EDC)的活化反应的羧基官能化的AIE纳米粒子和含胺蛋白质之间的一般偶联反应。然而,由于存在大量游离羧基和胺基基团,这种缀合方法可能引起蛋白质之间的交联。为了抑制不希望的副反应并消除多重保护和去保护步骤,我们选择了另一种方法来利用硫醇和马来酰亚胺基团之间的高反应性和选择性点击反应(图5)。通过改变位于PEG链端的端基,可以容易地将马来酰亚胺基团引入AIE点表面。虽然硫醇基团可通过还原反应引入蛋白质,例如通过二硫苏糖醇(DTT)破碎以暴露游离巯基或通过连接子Traut试剂(2-亚氨基硫羟烷)将胺基转化为硫醇基团。另外地,可以直接使用市售的硫醇改性的配体或蛋白质。将缀合物通过超滤浓缩并通过尺寸排阻色谱法纯化。
在此,我们将山羊抗人IgG缀合至AIE纳米粒子表面作为实例以证明缀合程序。将6μL的Traut试剂(1mg/mL)(购自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))与150μL的IgG抗体(1mg/mL)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.),美国麻萨诸塞州)反应,以将硫醇基团引入抗体。反应1小时后,使用分子截止值为10kDa的过滤管以7500rpm离心混合物10分钟,以除去过量的Traut试剂。弃去上清液,并且将沉淀的抗体用0.4mL 1xPBS洗涤,并再次以7500rpm离心10min。将纯化的IgG抗体溶解在0.5mL的1x PBS中,并进一步在室温下与AIE纳米粒子(0.02nmol)反应2小时。通过向溶液中添加10μL稀释的2-巯基乙醇(将3μL的2-巯基乙醇添加到4ml的1x PBS中)并孵育30min来淬灭缀合反应。通过用分子截止值为300kDa的过滤管以7500rpm离心10min两次除去未反应的IgG抗体。收集最终的缀合物并用1x PBS稀释至0.5mL。此外,表皮生长因子受体(EGFR)抗体和硫醇改性的Her2亲和体也使用相同的策略成功引入AIE点表面。
AIE纳米粒子的表征
通过简单地改变与不同发射相关的AIE荧光团,使用相同的方案制造三种具有不同颜色的AIE-IgG缀合物。它们的UV-vis吸收和发射光谱示于图6A-6F中。对于蓝色、绿色和红色AIE-IgG缀合物,吸收最大值分别位于356nm、422nm和510nm处。此外,绿色缀合物可通过商业405nm、457nm、488nm激光激发,而红色缀合物可通过商业405nm、457nm、488nm、543nm激光激发。激发激光的如此广泛选择使它们适用于各种共焦显微镜。图6A-6F还示出了光致发光光谱,其中对于蓝色、绿色和红色AIE-IgG缀合物,发射峰分别位于510nm、540nm和670nm处。此外,基于它们的发射,所有这三种缀合物都具有高荧光量子产率,而使用4-(二氰基亚甲基)-2-甲基-6-(4-二甲基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃(QY=43%)作为参考,分别地,蓝色AIE-IgG纳米粒子为42.1%,绿色AIE-IgG纳米粒子为60.5%,并且红色AIE-IgG纳米粒子为23.1%。还通过动态光散射研究了三种AIE-IgG纳米粒子的尺寸。它们都具有相似的尺寸分布,其中平均直径为约36nm。
我们进一步评估了AIE-IgG纳米粒子的稳定性。以每天的间隔频率收集它们的吸收和发射光谱(保持在4℃)长达18天,其用于计算随着孵育的荧光量子产率变化。如图7A所示,AIE-IgG纳米粒子示出优异的荧光稳定性,其中18天培养对其量子产率的影响最小。此外,还通过DLS分析了培养18天之前和之后这些纳米粒子的尺寸。参见图7B-7D。结果表明这些AIE-IgG纳米粒子的尺寸没有显著/急剧变化。应该注意的是,该策略适用于EGFR单克隆抗体和Her2亲合体,其中观察到类似的荧光量子产率和纳米粒子尺寸。此外,使用红色AIE点实例,与AIE-IgG纳米粒子相比,这些AIE-EGFR和AIE-Her2纳米粒子示出相似的尺寸、荧光量子产率和优异的稳定性(参见图8A-8D)。这也说明了我们的策略的一般性,该策略可用于制造具有可调发射和长期胶体和光稳定性的抗体缀合的AIE纳米粒子。
通过AIE-IgG纳米粒子的免疫测定
组织的免疫标记通常使用二次标记过程进行,这是由于靶标和未标记的第一抗体之间的高通用性和最大免疫反应性。抗IgG二次抗体及其荧光缀合物已广泛用于第一IgG抗体的特异性标记。在这里,我们使用红色AIE670-IgG点作为实例测试我们的山羊抗人IgG缀合的AIE-IgG纳米粒子对人IgG的结合能力。选择市售的抗人IgG缀合的量子纳米粒子655(QD655-IgG)作为基准。
为了进行标记,首先通过在4℃下每孔孵育100μL的人IgG(1.2μg/mL)将人IgG接种在96孔板的孔底。孵育过夜后,弃去溶液,并且用Tris-HCl缓冲液中的0.05%的Tween-20洗涤孔两次,并用5%的牛血清白蛋白(150μL)在37℃阻断1小时。洗涤后,将红色AIE-IgG纳米粒子或QD655-IgG添加到具有不同浓度的96孔板(100μL/孔)中。在37℃下孵育30分钟后,除去未结合的纳米粒子,并且将孔洗涤三次,并在510nm激发后通过酶标仪记录96孔板的荧光强度。如图9所示,IgG的荧光强度随着AIE-IgG浓度的增加而显著地增加,表明了AIE670-IgG与人IgG的成功结合。市售的QD655-IgG也用作对照;然而,当QD655-IgG的浓度低于5nM时,QD655-IgG荧光强度的变化非常小。因此,与QD655-IgG相比,AIE-IgG纳米粒子在0.1至5nM的浓度范围下检测IgG时示出更高的灵敏度。此外,绿色AIE540-IgG纳米粒子也示出类似的IgG检测灵敏度(图10)。
用AIE-EGFR纳米粒子的癌细胞成像
表皮生长因子受体(EGFR)是ErbB家族的受体酪氨酸激酶,其在许多上皮肿瘤中异常活化。荧光标记的EGFR抗体广泛用于检测EGFR以及用于靶向具有EGFR过表达的癌细胞成像,但它仅限于基于小有机染料的EGFR缀合物,这些EGFR缀合物的荧光在成像过程中可以通过激光容易地漂白。我们的AIE纳米粒子具有高亮度和优异的光稳定性,使它们成为EFGR检测的理想候选物。在这里,我们使用我们的EGFR抗体缀合的AIE纳米粒子(AIE-EGFR纳米粒子)来检测具有EGFR受体过表达的癌细胞和使具有EGFR受体过表达的癌细胞成像。选择MDA-MB-231乳腺癌细胞作为证明细胞系。将MDA-MB-231细胞用绿色或红色AIE-EGFR纳米粒子在37℃处理2小时。我们还用纯红色AIE纳米粒子处理MDA-MB-231细胞,而没有用EGFR抗体缀合作为对照。图11示出了相应的共焦图像。如来自MDA-MB-231细胞的亮绿色和红色荧光信号所示,AIE-EGFR纳米粒子能够成功地内化到具有EGFR过表达的细胞中。作为对照,没有EGFR装饰的AIE纳米粒子示出弱的细胞摄取,其中在细胞内可以观察到非常弱的红色荧光。结果清楚地证明,细胞摄取是通过识别AIE-EGFR纳米粒子和AIE-EGFR纳米粒子与EGFR结合介导的,并且我们的AIE-EGFR纳米粒子可用于检测具有EGFR过表达的细胞和使具有EGFR过表达的细胞成像。
AIE-Her2纳米粒子的靶细胞成像
人表皮生长因子受体HER2(Her2/neu、ErbB2或c-erb-b2)是在许多细胞类型上表达的生长因子受体。抗HER2分子是针对HER2的细胞外结构域选择的高度特异性亲和配体。在这里,我们证明了抗Her2亲合体缀合的AIE纳米粒子(AIE-Her2纳米粒子)对Her2过表达的癌细胞(例如SKBR-3乳腺癌细胞)的选择性优异于其他缺乏Her2表达的细胞(选择NIH-3T3成纤维细胞作为阴性对照)。将两种细胞与红色AIE-Her2纳米粒子(2nM)在37℃下孵育2小时。去除未结合的AIE-Her2后,通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM,奥林巴斯公司(Olympus))使细胞成像。如图12所示,在SKBR-3细胞中观察到明亮的红色荧光,而在对照NIH-3T3细胞中可以检测到可忽略的红色荧光,这清楚地表明红色AIE-Her2对具有Her2过表达的癌细胞的优异选择性。荧光强度的定量分析给出AIE655-Her2处理的细胞的平均亮度比用QD655-Her2缀合物处理的细胞高400%。此外,在第2代SKBR-3细胞中几乎观察不到QD655-Her2的荧光,而AIE-Her2亮度是可交易的,可追踪至多4代(超过两倍寿命,图13)。此外,绿色AIE-Her2纳米粒子也示出对SKBR-3癌细胞的类似的优异选择性(图14)。
多光子成像
具有高双光子吸收(TPA)横切面的荧光材料也可以设计成从FR/NIR区域中的低能量辐射发射强可见荧光。荧光团的这一方面在多光子显微镜中特别重要,用于在深度生物组织内获得高分辨率图像。在这里,我们使用配备有可调Ti:蓝宝石脉冲激光的多光子显微镜,使用在甲醇中的罗丹明6G作为标准,测量了绿色和红色AIE纳米粒子在水溶液中的TPA光谱。如图15A和15C所示,绿色和红色AIE纳米粒子均示出非常高的TPA横切面值,其中针对绿色和红色AIE纳米粒子的最大值分别为10.2x 104GM和6.7x 104GM。为了证明AIE纳米粒子在双光子荧光成像中的巨大潜力,将用绿色或红色AIE-EGFR纳米粒子(2nM)处理2小时后的MDA-MB-231细胞固定并用多光子显微镜成像。图15B和15D示出了相应的双光子荧光图像。在820nm的双光子脉冲激光下,细胞质的亮绿色和红色发射可以清晰可见,这表明内化的AIE-EGFR纳米粒子可以被双光子激光容易地激发,并为生物成像提供优异的荧光。考虑到双光子荧光成像的优异组织穿透深度,我们的AIE-EGFR纳米粒子可以改善的体内分辨率和检测灵敏度用于检测整合素过表达的肿瘤。
虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述,本领域的技术人员应当理解的是,在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下,可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。
Claims (28)
1.一种包含多个表面可缀合基团的纳米粒子组合物,其中该纳米粒子包含:
a)生物相容性聚合物壳,该生物相容性聚合物壳具有小于约1000nm的平均直径;
b)包封在该生物相容性聚合物壳中的纳米粒子核,该核包含至少一个均匀的光稳定剂群,该均匀的光稳定剂群具有适合于成像应用的聚集诱导发射特征;
c)在该聚合物壳表面上的至少一个可缀合基团;和
d)至少一个靶向部分,该至少一个靶向部分特异性地结合靶标,该至少一个靶向部分共价地连接至该至少一个可缀合的基团。
2.如权利要求1所述的组合物,其中该纳米粒子具有约50nm至约300nm的平均直径。
3.如权利要求1所述的组合物,其中该纳米粒子具有约20nm至约50nm的平均直径。
4.如权利要求1所述的组合物,其中该纳米粒子具有约10nm至约20nm的平均直径。
5.如权利要求1所述的组合物,其中该具有聚集诱导发射特征的光稳定剂具有可调的吸收或发射波长。
6.如权利要求4所述的组合物,其中该具有聚集诱导发射特征的光稳定剂具有式I-III中任一项所述的化学结构:
其中在四苯基乙烯部分的至少一个上的至少一个氢原子被电子基团例如甲氧基或吸电子基团例如硝基或氰基取代。
7.如权利要求1所述的组合物,其中该可缀合基团是氨基基团、羧酸基基团、巯基基团、马来酰亚胺基基团、肟基基团、炔烃、叠氮化物或其组合。
8.如权利要求1所述的组合物,其中共价键是肽键、酰胺键、巯基键、马来酰亚胺键、硫酯键、醚键、酯键、肼键、肼键、肟键或其组合。
9.如权利要求1所述的组合物,其中该靶向部分是配体、生物分子、蛋白质、特异性识别元件,例如肽、适配体、抗体、抗原或其抗原结合片段。
10.如权利要求9所述的组合物,其中该抗原结合片段是亲和体。
11.如权利要求9所述的组合物,其中该抗体是结合至表皮生长因子受体的抗EGFR抗体。
12.如权利要求10所述的组合物,其中该亲合体是抗-her2亲合体。
13.如权利要求1所述的组合物,其中该靶标是活细胞的表面抗原、配体或受体。
14.一种免疫染色活细胞或使活细胞成像的方法,该方法包括:
a)使活细胞与纳米粒子靶标部分络合物接触,其中该纳米粒子靶标部分络合物包含:如权利要求1所述的纳米粒子共价连接至如权利要求9所述的靶向部分;
b)稳定与该活细胞结合的该纳米粒子靶标部分络合物;
c)用能够产生具有特定波长的光并收集图像的激光源激发与该活细胞结合的该纳米粒子靶标部分络合物中的该光稳定剂;和
d)处理这些图像,从而使活细胞成像。
15.如权利要求14所述的方法,其中该具有聚集诱导发射特征的光稳定剂具有可调的吸收或发射波长。
16.如权利要求14所述的方法,其中该具有聚集诱导发射特征的光稳定剂具有式I-III中任一项所述的化学结构:
其中在四苯基乙烯部分的至少一个上的至少一个氢原子被电子基团例如甲氧基或吸电子基团例如硝基或氰基取代。
17.如权利要求14所述的方法,其中该靶标部分是配体、生物分子、蛋白质、特异性识别元件,例如肽、适配体、抗体、抗原或其抗原结合片段。
18.如权利要求17所述的方法,其中该抗原结合片段是亲和体。
19.如权利要求17所述的方法,其中该抗体是结合至该表皮生长因子受体的抗EGFR抗体。
20.如权利要求18所述的方法,其中该亲合体是抗her2亲合体。
21.如权利要求15所述的方法,其中该活细胞是癌细胞。
22.一种用于控制纳米粒子尺寸的方法,该方法包括:
a)用聚集诱导发射改变聚合物与染料的负载比;
b)改变用于配制这些纳米粒子的溶剂比(例如,四氢呋喃与水的比率);和
c)改变聚合物的亲水性长度与疏水性长度的比例,
从而控制纳米粒子的尺寸。
23.AIE纳米粒子,其包含DSPE核和PEG壳,其与靶向部分缀合,该AIE纳米粒子靶向部分选自以下:AIE纳米粒子抗体、AIE纳米粒子亲合体、AIE纳米粒子蛋白质、AIE纳米粒子肽、AIE纳米粒子适配体、AIE纳米粒子抗原、或AIE纳米粒子抗原结合片段;其中该AIE荧光团是如下之一:
24.一种用于设计AIE纳米粒子的方法,其包含:
选择在所希望的波长上发荧光的AIE荧光团;
选自与至少一个靶向部分共价连接的可缀合基团和连接子;和
使用如权利要求22所述的方法控制该纳米粒子的尺寸。
25.AIE-IgG缀合物在免疫染色中的用途。
26.AIE-her2和AIE-EGFR用于特异性癌细胞检测的用途。
27.AIE-her2用于癌细胞追踪的用途。
28.用于AIE纳米粒子缀合至靶向部分的试剂盒,该试剂盒包含:
a)如权利要求1所述的表面官能化AIE纳米粒子,其中不存在该靶向部分;
b)缀合缓冲液
c)洗涤缓冲液;和
d)用于进行缀合反应的说明书。
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