CN112114137A - 一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法 - Google Patents

一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112114137A
CN112114137A CN202010103205.8A CN202010103205A CN112114137A CN 112114137 A CN112114137 A CN 112114137A CN 202010103205 A CN202010103205 A CN 202010103205A CN 112114137 A CN112114137 A CN 112114137A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aie
specific protein
detection
polymer
detection reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010103205.8A
Other languages
English (en)
Inventor
丁丹
郑磊
司徒博
张国强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nankai University
Original Assignee
Nankai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nankai University filed Critical Nankai University
Priority to CN202010103205.8A priority Critical patent/CN112114137A/zh
Publication of CN112114137A publication Critical patent/CN112114137A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属特异性蛋白检测技术领域，具体涉及一种新型特异性蛋白检测试剂其制备方法。所述特异性蛋白检测试剂包括利用AIE小分子化合物或聚合物直接标记的捕捉蛋白，所述捕捉蛋白与所述特异性蛋白能够相互特异性结合。有益效果在于：试剂制备工艺简单(利用AIE材料直接标记抗体，无需制备纳米粒子环节)；在检测微生物领域，相比于核酸检测试剂，生产环境要求低、感染风险低；检出限低(1ng/mL)，检出准确度高；使用便捷，对操作人员技术要求低；检测迅速(仅需15min)。

Description

一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法
技术领域
本发明属特异性蛋白检测技术领域，具体涉及一种新型特异性蛋白检测试 剂及其制备方法。
背景技术
体外诊断(In Vitro Diagnosis，IVD)是指通过血液、体液、组织等生物样本 进行检测而获取诊断信息，进而判断机体疾病或功能。对生物样本的快速、灵 敏和定量检测是目前体外诊断发展的方向。基于免疫层析试纸条的生物医学检 测，因其具有快速、简便、直观、成本低等优势在疾病的早期诊断、预防等方 面产生巨大社会效益和经济效益。免疫层析试纸技术(Immunochromatographic Assay，ICA)是基于抗原-抗体特异免疫学反应和层析反应的原理，标记了抗体 的指示剂会特异性识别与结合如尿样、血样或是唾液等生物样本中的特定待测 物，且在试纸条检测区域滞留与显色，并可结合读数仪进行定量检测，达到快 速、准确地检测待测物的目的。
但是在临床使用的过程中，目前现有的试剂盒检测效果不佳，部分确诊病 人检测了6次核酸试剂都是阴性，对于有的确诊的病人，很多试剂盒的阳性率 只有30％-50％，通过咽试子的办法，还是有很多假阴性的，没有发现核酸， 核酸检测试剂盒核酸检出率低，许多病例要重复多次检测，有的病人咽拭子阴 性但肺细胞灌洗液里有病毒。
诊断新冠肺炎，在分子生物学的手段上，目前常用的办法有两种：一种是 病毒的基因测序，另一种是核酸检测。二代测序因为可以检测微量物质，所以 可以适用的体液类型更多。但是大多数医院没有测序的设备。尤其是二代测序， 不仅仅需要设备，还需要生物信息团队来协助测序结果的解读。但是就算如此， 研发阶段的流程和试剂配比的优化，阳参阴参的设立，以及预临床试验也是需 要的。而且，因为二代测序的成本高检测周期也比较长，不一定适合做这个检 测。
因此，现在的诊断方法以核酸检测(PCR或者real-time PCR)为主，这 主要受制于：试剂盒质量(而非产能)，能够承担临床检测的P3实验室(生物 安全3级实验室)数量，P3实验室设备的准确性和稳定性，能进行熟练稳定 操作的工作人员人数。在实际临床应用的时候，除了高质量的试剂盒以外，样 本的类型，样品的收集运输和储存方法，核酸(RNA)提取方法，检测设备 (PCR仪器或real-time PCR仪)的准确性和稳定性，操作人员的技术，都会 影响到实际的检测效果。除此以外，因为考虑到检测的样品具有高度的传染性， 用于做此检测的实验室理论上应是P3实验室。检测实验室内部需要做严格的 防护，净化负压等等都是最基本的，对于操作流程也有严格的规范。如果实验 室级别达不到，可能存在实验室感染的隐患。
免疫层析试纸技术(Immunochromatographic Assay，ICA)是基于抗原-抗体 特异免疫学反应和层析反应的原理，标记了指示剂的抗体会特异性识别与结合 如尿样、血样或是唾液等生物样本中的特定待测物，且在试纸条检测区域滞留 与显色，并可结合读数仪进行定量检测，达到快速、准确地检测待测物的目的。
现有技术中，通常采用胶体金作为指示剂及有机染料分子的荧光纳米粒子 作为指示剂。胶体金在早孕检测、食品安全、环境、农药残留领域得到了应用。 但是，胶体金的检出准确度和检测灵敏度均较低，因此，只能用于定性或者对 准确度要求不高的定量检测领域。
有机染料分子的荧光纳米粒子相对于胶体金指示剂在检出准确度和检测 灵敏度上有所提高，但是在传染类疾病、感染类疾病等有较高要求的领域仍然 受限。究其原因在于，机染料在稀溶液状态下的荧光性能良好，但这些化合物 在薄膜状态或者高浓度状态下，存在聚集诱导淬灭(Aggregation-Caused Quenching，ACQ)的缺陷。ACQ严重限制了有机染料在免疫层析试纸方面的 应用，在使用过程中浓度过高会发生淬灭，但浓度过低又会导致荧光信号较弱、 背景信号干扰严重等问题，因此不得不花费大量时间去找一个平衡值。
聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission，AIE)材料的问世，根本地解 决了传统荧光材料在实际应用中出现ACQ的弊端，使人们对有机发光材料的 认识转向一个全新的高度。相对于传统有机荧光染料，AIE材料在荧光检测、 生物成像等方面展现了一些显著优势：在聚集态下的高发光效率使其随着浓度 升高而荧光强度逐渐增强，间接降低了背景信号的干扰，可实现高对比度的荧 光检测；其光稳定性好，可有效解决光漂白；可修饰性强，可用于设计具有响 应能力的荧光指示剂。
申请号为201910918011.0的中国发明专利申请公开了一种AIE免疫层析 试纸，其技术方案是利用AIE纳米粒子标记捕捉蛋白或检测抗原。具体的是 利用四苯乙烯类AIE衍生物、噻咯类AIE衍生物、1,4-均二苯乙烯类AIE衍 生物、五元杂环类AIE衍生物、有机硼类AIE衍生物制成纳米粒子，再标记 在特异性蛋白上。不过AIE纳米粒子存在如下问题：
1、小分子AIE材料制成AIE纳米粒子需要额外的合成步骤，会导致成本 升高，不利于产业化的推广；
2、与纯的小分子AIE材料相比，纳米粒子尺寸的均一性较差。相同浓度 条件下，纳米粒子的重复性和显色灵敏度均低于小分子AIE材料。
采用AIE免疫层析技术标记特异蛋白，可以选择标记抗体来检测抗原的 存在，也可以选择标记抗原来捕捉蛋白的存在。
现有的检测试剂通常更加关注病例的确诊，但是由于2019-nCoV新型冠 状病毒潜伏期较长、无症状感染者也具备传染性的特点，为了防止无症状的病 毒携带者在人群中传染他人，我们需要一种能够直接快捷的检测出病毒是否存 在，进而筛查出病毒携带者的检测手段。
基于此，亟需一种生产成本低、对生产条件要求低、无传染风险、检出限 低、准确度高、使用方便并且在生物体内容易代谢的的检测试剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新型特异性蛋白检测试 剂。能够满足生产过程中无感染风险，对生产条件要求低，使用方便、检测准 确的要求。
本发明公开了一种新型特异性蛋白检测试剂，包括利用AIE小分子化合 物或聚合物直接标记的捕捉蛋白，所述捕捉蛋白与所述特异性蛋白能够相互特 异性结合。
进一步地，所述AIE小分子化合物采用D-π-A结构为基础的分子结构， 所述AIE聚合物的重复单元中至少包括D-π-A结构为基础的结构。
进一步地，所述AIE小分子化合物或聚合物包括至少一个羧基(-COOH)。
优选地，所述AIE小分子化合物采用通式(I)所示的分子结构或其盐、 水合物、螯合物中的至少一种：
Figure BDA0002387560110000041
其中，R1采用如下结构或其衍生物中至少一种：
Figure BDA0002387560110000042
Figure BDA0002387560110000051
优选地，所述AIE聚合物采用通式(II)所示的分子结构或其盐、水合物、 螯合物中的至少一种：
Figure BDA0002387560110000052
其中，R2采用如下结构或其衍生物中至少一种：
Figure BDA0002387560110000053
进一步地，以物质的量计，所述捕捉蛋白的加入量为1eq，与所述AIE 小分子化合物加入量为200-1000eq。
进一步地，所述新型特异性蛋白检测试剂，可以有效检测1ng以上的特 异性蛋白。
进一步地，所述特异性蛋白包括细菌、病毒、真菌、肿瘤标志物中至少一 种。
本发明还公开了新型特异性蛋白检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
取捕捉蛋白分散在PBS缓冲液中，加入1％的DMSO，加入带有所述AIE 分子或聚合物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐(EDC)也加入到反应体系中并在捕捉蛋白的活性适宜温度下孵育 1～2h，得AIE分子或聚合物直接连接抗体的复合物即为所述标记试剂。
优选的，所述AIE分子或聚合物含有羧基时，新型特异性蛋白检测试剂 的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，羧基的活化：将所述AIE分子或聚合物与N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)于DMSO中反 应2～3h制备AIE-NHS，洗涤后冻存备用；
步骤2，取捕捉蛋白分散在PBS缓冲液中，加入AIE-NHS并在捕捉蛋白 的活性适宜温度下孵育1～2h，用1％牛血清蛋白(BSA)封闭，得AIE分子 或聚合物直接连接抗体的复合物即为所述检测试剂。
本发明还公开了一种新型特异性蛋白检测装置，利用所述新型特异性蛋白 检测试剂。
进一步地，所述新型特异性蛋白检测装置，包括测试试纸，所述测试试纸 包括结合物垫，所述结合物垫上设置有所述特异性蛋白检测试剂。
进一步地，所述新型特异性蛋白检测装置，所述测试试纸还包括测试线、 质控线，所述测试线上包被有用于捕获待检测样品中目标物的捕获抗体，所述 的质控线包被有所述捕捉蛋白的二抗。
进一步地，所述新型特异性蛋白检测装置，所述测试试纸还包括底板、样 品垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，所述的底板上沿底板长度方向依次搭接有样品 垫、结合物垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，所述的测试线、质控线沿样品层析方 向依次设置在硝酸纤维素膜上。
进一步地，所述的样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，所述的结合物垫为 玻璃纤维膜，所述的底板为聚氯乙烯胶板。
进一步地，所述新型特异性蛋白检测装置，还包括外壳，所述的外壳上设 有第一孔洞及第二孔洞，所述第一孔洞用于滴加待检测样品，所述第二孔洞用 于观察或读取信号的显色；所述外壳设置在所述测试试纸外部。
进一步地，所述外壳上还设置有定量检测装置，所述定量检测装置包括发 光装置、接收装置、显示装置、电源；所述电源为所述发光装置、所述接收装 置、所述显示装置提供电能；所述发光装置设置在所述第二孔洞内靠近侧壁位 置，所述接收装置设置在所述第二孔洞外；所述发光装置为设置有滤光片的光 源；所述接收装置采用外部设置有滤光片的光电转化器；所述接收装置与所述 显示装置电信号连接。
进一步地，所述发光装置发射的光波长为250-1000nm。
优选的，所述发光装置发射的光波长为365nm。
进一步地，所述新型特异性蛋白检测装置，可以用于检测咽拭子、鼻拭子、 痰液、肛拭子、粪便、血液、唾液、肺泡灌洗液、尿液或组织液中至少一种待 检测样品中是否含有特异性蛋白，也可以用于检测环境中收集的样本中是否含 有特异性蛋白。
进一步地，所述新型特异性蛋白检测试剂，可以用于检测咽拭子、鼻拭子、 痰液、肛拭子、粪便、血液、唾液、肺泡灌洗液、尿液或组织液中至少一种待 检测样品中是否含有特异性蛋白，也可以用于检测环境中收集的样本中是否含 有特异性蛋白。
由于本技术方案是利用靶向的捕捉蛋白直接检测目标特异性蛋白，因此， 在应用于微生物检测领域，相比于现有的核酸检测手段，本技术不涉及遗传物 质，在生产和使用过程中更为安全，生产的实验室条件更低。尤其是在利用标 记二抗检测病毒等的抗体时，使用的是生物体血液，完全不会接触到病毒等微 生物，从生产到使用环节都不存在被感染的风险。
同时，也可以利用本发明的技术方案检测环境空气、水体、甚至物品表面 是否存在特定病毒等目标微生物，有利于确定目标微生物所接触过的环境是否 存在目标微生物，防止目标微生物通过“气溶胶”途径传播。
而在检测肿瘤标志物的领域，可以用于血液中肿瘤标志物的检测，也可以 将注入生物体内，用来标记和观测肿瘤细胞的位置。由于本技术是利用AIE 分子直接标记在蛋白质上的，无需先制成纳米粒子，因此在体内代谢较快，对 生物体伤害低。
定性检测时，通过所述第一孔洞将待测样品滴在所述试纸上，经激发光照 射后，通过所述第二孔洞观察，发现所述测试线与所述质控线同时显色，证明 检出待测特异性蛋白。
定量检测时，通过所述第一孔洞将待测样品滴在所述试纸上，经发光装置 照射后，如果含有待测特异性蛋白，则所述测试线与所述质控线同时显色。接 受装置接受到荧光，并且荧光强度与目标微生物含量成线性关系，所述接收装 置会将荧光强度与预先输入的标准曲线对比后(如附图9-10)的转化为电信号 传输至所述显示装置出显示示数，即为待测特异性蛋白的浓度。
本发明的有益效果在于：
1、试剂制备工艺简单(利用AIE材料直接标记抗体，无需制备纳米粒子 环节)；
2、在检测微生物领域，相比于核酸检测试剂，生产环境要求低、感染风 险低；在检测肿瘤标志物等领域，可以用于生物体内。
3、检出限低(1ng/mL)，检出准确度高，可以用于定量检测；
4、使用便捷，对操作人员技术要求低；
5、检测迅速(仅需15min)。
附图说明
图1本发明所述测试试纸结构示意图；
图2本发明所述外壳结构示意图；
图3本发明所述测试试纸与所述外壳装配结构示意图；
图4本发明所述定量检测装置结构示意图；
图5本发明实施例1检出限测试图；
图6本发明实施例13检出限测试图；
图7本发明实施例1抗体与AIE分子有效配比测试图；
图8本发明实施例1抗体与AIE分子有效配比测试图；
图9本发明T线荧光强度随抗原蛋白浓度线性关系图；
图10本发明T线荧光强度随抗体浓度线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，以下实施例仅用 于更加清楚地说明本发明的技术实施例，而不能以此来限制本发明的保护范 围。
实施例1
一种新型特异性蛋白检测试剂，包括利用AIE小分子化合物或聚合物直 接标记的捕捉蛋白，所述捕捉蛋白采用目标微生物IgG抗体。
本实施例所述的，所述AIE小分子化合物采用如下分子结构：
Figure BDA0002387560110000091
本实施例所述的，所述捕捉蛋白采用2019-nCoV新型冠状病毒IgG抗体。
本实施例所述的，以物质的量计，所述捕捉蛋白的加入量为1eq，与所述 AIE小分子化合物加入量为200eq。
本发明还公开了新型特异性蛋白检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，羧基的活化：将所述AIE分子与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)于DMSO中反应2～3h制备 AIE-NHS，洗涤后冻存备用；
步骤2，取2.5μg2019-nCoV新型冠状病毒IgG抗体分散在100μL PBS缓 冲液中，加(200eq的AIE-NHS于37℃孵育1～2h，用1％牛血清蛋白(BSA) 封闭，得AIE连接IgG抗体的复合物AIE-IgG即为所述检测试剂。
以上制备的复合物AIE-IgG在激发光照射下发出光信号，所述的激发光的 波长为300～800nm，照射功率是10～300mW/cm2。并且AIE-IgG在层析试纸 上的荧光强度远远强于稀溶液中荧光强度。利用上述特性，将所述试剂用于 2019-nCoV新型冠状病毒的检测。
本发明还公开了一种新型特异性蛋白检测装置，利用所述新型特异性蛋白 检测试剂。
本实施例所述的，所述新型特异性蛋白检测装置，采用测试试纸1，包括 结合物垫13，所述结合物垫13上设置有所述特异性蛋白检测试剂。
本实施例所述的，所述新型特异性蛋白检测装置，所述测试试纸1还包括 测试线16、质控线17，所述测试线16上包被有用于捕获待检测样品中目标物 的捕获抗体，所述的质控线17包被有所述捕捉蛋白的二抗。
本实施例所述的，所述新型特异性蛋白检测装置，所述测试试纸1还包括 底板11、样品垫12、硝酸纤维素膜14及吸水垫15，所述的底板11上沿底板 11长度方向依次搭接有样品垫12、结合物垫13、硝酸纤维素膜14及吸水垫 15；所述的测试线16、质控线17沿样品层析方向依次设置在硝酸纤维素膜14 上。
本实施例所述的，所述的样品垫12采用玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，所述 的结合物垫13采用玻璃纤维膜，所述的底板11采用聚氯乙烯胶板。
本实施例所述的，所述新型特异性蛋白检测装置，还包括外壳2，所述的 外壳2上设有第一孔洞21及第二孔洞22，所述第一孔洞21用于滴加待检测 样品，所述第二孔洞22用于观察或读取信号的显色；所述外壳2设置在所述 测试试纸1外部。
本实施例所述的，所述外壳2上还设置有定量检测装置23，所述定量检 测装置23包括发光装置231、接收装置232、显示装置233、电源234；所述 电源234为所述发光装置231、所述接收装置232、所述显示装置233提供电 能；所述发光装置231设置在所述第二孔洞22内靠近侧壁位置，所述接收装 置232设置在所述第二孔洞22外；所述发光装置231为设置有滤光片的光源； 所述接收装置232采用外部设置有滤光片的光电转化器；所述接收装置232 与所述显示装置233电信号连接。
本实施例所述的，所述发光装置233发射的光波长为250-1000nm。
优选的，所述发光装置233发射的光波长为365nm。
本实施例所述的，所述的待检测样品为咽拭子、鼻拭子、痰液、肛拭子、 粪便、血液、唾液、肺泡灌洗液、尿液或组织液中至少一种。
实施例2-10
实施例2-10所述的检测试剂及其制备方法与实施例1相似，所述AIE分 子选用通式(1)所述的化合物：
Figure BDA0002387560110000101
其中，R1采用如下结构或其衍生物中至少一种：
Figure BDA0002387560110000102
Figure BDA0002387560110000111
区别在于下表(表1)所述的参数的替换：
表1 AIE小分子化合物实施例参数表
Figure BDA0002387560110000112
Figure BDA0002387560110000121
实施例11-12
实施例11-12所述的检测试剂及其制备方法与实施例1相似，所述AIE聚 合物采用通式(II)所示的分子结构中至少一种：
Figure BDA0002387560110000122
其中，R2采用如下结构或其衍生物中至少一种：
Figure BDA0002387560110000123
区别在于下表(表2)所述的参数的替换：
表2 AIE聚合物实施例参数表
Figure BDA0002387560110000124
实施例13
一种新型特异性蛋白检测试剂，包括利用AIE小分子化合物或聚合物直 接标记的检测抗体，所述捕获抗原采用2019-nCoV新型冠状病毒特异性蛋白。
本实施例所述的，所述AIE小分子化合物采用如下分子结构：
Figure BDA0002387560110000131
本实施例所述的，所述捕获抗原采用2019-nCoV新型冠状病毒特异性蛋 白。
本实施例所述的，以物质的量计，所述检测抗体的加入量为1eq，与所述 AIE小分子化合物加入量为200eq。
本发明还公开了新型抗体检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，羧基的活化：将所述AIE分子与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)于DMSO中反应2～3h制备 AIE-NHS，洗涤后冻存备用；
步骤2，取2.5μg针对人血清或全血中IgG的二抗分散在100μL PBS缓 冲液中，加200eq的AIE-NHS于37℃孵育1～2h，用1％牛血清蛋白(BSA) 封闭，得AIE连接二抗的复合物AIE-抗体即为所述检测试剂。
以上制备的复合物AIE-抗原蛋白在激发光照射下发出光信号，所述的激 发光的波长为300～800nm，照射功率是10～300mW/cm2。并且AIE-抗体在层 析试纸上的荧光强度远远强于稀溶液中荧光强度。利用上述特性，将所述试剂 用于2019-nCoV新型冠状病毒血清抗体的检测。
本实施例所述的，待检测样品为血清、全血中至少一种。
实施例14-22
实施例2-10所述的检测试剂及其制备方法与实施例13相似，所述AIE分 子选用通式(1)所述的化合物，区别在于下表(表3)所述的参数的替换：
表3 AIE小分子化合物实施例参数表
Figure BDA0002387560110000132
Figure BDA0002387560110000141
实施例23-24
实施例23-24所述的检测试剂及其制备方法与实施例13相似，所述AIE 聚合物采用通式(II)所示的分子结构中至少一种，区别在于下表(表3)所 述的参数的替换：
表3 AIE聚合物实施例参数表
Figure BDA0002387560110000142
为了进一步说明本发明的有益效果，特设置了如下的实验，对实施例1(利 用标记抗体直接检测抗原)及实施例13(利用标记二抗检测抗体)的产品分 别进行测试：
检出限(检出精度)测试：
将实施例1制备的是测试试纸分别用不同量的待测抗原(2019-nCoV新型 冠状病毒抗原)进行测试；
将实施例13制备的是测试试纸分别用不同量的待测抗体(2019-nCoV新 型冠状病毒IgG抗体)进行测试；
得到如下数据：(附图5-6，附图5中由左到右分别是测试组1-4；附图6 中由右到左分别是测试组5-8)
表3 检出限测试表
Figure BDA0002387560110000143
Figure BDA0002387560110000151
通过上述测试可知，本发明实施例1的在待测抗原(2019-nCoV新型冠状 病毒抗原)加入量为1ng时仍然能够被检出。
通过上述测试可知，本发明实施例13的在待测抗体(2019-nCoV新型冠 状病毒IgG抗体)加入量为1ng时仍然能够被检出。
抗体与AIE分子配比的选取
设置对比例，其中：
对比例1与实施例1制备方法相似，区别仅在添加的抗体浓度不同；
对比例2与实施例13制备方法相似，区别仅在添加的抗体浓度不同；
测试数据见下表：(附图7-8附图7中从左到右分别为对比例1及实施例 1；附图8中从右到左分别为实施例13及对比例2)
表4 AIE小分子化合物与抗体配比变化测试表
组别 抗体浓度(μg/mL) 外加待测抗原量(ng) 是否有T线
对比例1 1 0 有
实施例1 0.25 0 无
对比例2 1 0 有
实施例13 0.25 0 无
通过实施例1与对比例1相比较，在不添加待测抗原时候，对比例1仍然 会显示出T线，说明包被过量的抗体会出现假阳性，包被抗体与AIE分子标 记抗体配比是有一定范围要求的。
通过实施例13与对比例2相比较，在不添加待测抗体时候，对比例2仍 然会显示出T线，说明T线包被过量的抗原会出现假阳性，抗原与AIE标记 的抗体配比是有一定范围要求的。
由此也证明了本发明的技术方案中，AIE标记蛋白与包被蛋白的配比的选 取范围是需要发明人付出创造性劳动才能够取得的，而并本领域技术人员的常 规选择。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其 限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术 人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者 对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相 应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，包括利用AIE小分子化合物或聚合物直接标记的捕捉蛋白，所述捕捉蛋白与所述特异性蛋白能够相互特异性结合。
2.根据权利要求1所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，所述AIE化合物采用D-π-A结构为基础的分子结构，所述AIE聚合物的重复单元中至少包括D-π-A结构为基础的结构。
3.根据权利要求2所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，所述AIE小分子化合物或聚合物包括羧基或氨基。
4.根据权利要求2所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，所述AIE小分子化合物采用通式(I)所示的分子结构或其盐、水合物、螯合物中的至少一种：
Figure FDA0002387560100000011
其中，R1采用如下结构或其衍生物中至少一种：
Figure FDA0002387560100000012
Figure FDA0002387560100000021
或如下所示的分子结构或其盐、水合物、螯合物中的至少一种：
Figure FDA0002387560100000022
所述AIE聚合物采用通式(II)所示的分子结构或其盐、水合物、螯合物中的至少一种：
Figure FDA0002387560100000023
其中，R2采用如下结构或其衍生物中至少一种：
Figure FDA0002387560100000031
5.根据权利要求1所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，以物质的量计，所述捕捉蛋白的加入量为1eq，与所述AIE小分子化合物加入量为200-1000eq。
6.根据权利要求1所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，可以有效检测1ng/mL以上的待测所述特异性蛋白。
7.根据权利要求1所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，可用于定量检测。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
取捕捉蛋白分散在PBS缓冲液中，加入1％的DMSO，加入带有所述AIE分子或聚合物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)也加入到反应体系中并在捕捉蛋白的活性适宜温度下孵育1～2h，得AIE分子或聚合物直接连接抗体的复合物即为所述标记试剂。
9.根据权利要求1-7任意一项所述的新型特异性蛋白检测试剂，其特征在于，所述AIE分子或聚合物含有羧基时，制备方法包括如下步骤：
步骤1，羧基的活化：将所述AIE分子或聚合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)于DMSO中反应2～3h制备AIE-NHS，洗涤后冻存备用；
步骤2，取捕捉蛋白分散在PBS缓冲液中，加入AIE-NHS并在捕捉蛋白的活性适宜温度下孵育1～2h，用1％牛血清蛋白(BSA)封闭，得AIE分子或聚合物直接连接抗体的复合物即为所述标记试剂。
10.根据权利要求1-7任意一项所述的新型特异性蛋白检测试剂的用途，其特征在于，可以用于检测咽拭子、鼻拭子、痰液、肛拭子、粪便、血液、唾液、肺泡灌洗液、尿液或组织液中至少一种待检测样品中是否含有特异性蛋白，也可以用于检测环境中收集的样本中是否含有特异性蛋白。
CN202010103205.8A 2020-02-19 2020-02-19 一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法 Pending CN112114137A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010103205.8A CN112114137A (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010103205.8A CN112114137A (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112114137A true CN112114137A (zh) 2020-12-22

Family

ID=73798744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010103205.8A Pending CN112114137A (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112114137A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114354924A (zh) * 2021-11-18 2022-04-15 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种AIE纳米微球的2019-nCoV新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101007904A (zh) * 2007-01-19 2007-08-01 南开大学 含三苯胺基团的有机染料及制备和应用
CN109152849A (zh) * 2016-04-15 2019-01-04 发光体私人有限公司 Aie纳米粒子缀合物及其方法
CN110441521A (zh) * 2018-05-03 2019-11-12 深圳市疾病预防控制中心 检测Zika病毒NS1抗原的试纸条和试剂盒及方法
CN110702893A (zh) * 2019-09-26 2020-01-17 同济大学 一种aie免疫层析试纸

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101007904A (zh) * 2007-01-19 2007-08-01 南开大学 含三苯胺基团的有机染料及制备和应用
CN109152849A (zh) * 2016-04-15 2019-01-04 发光体私人有限公司 Aie纳米粒子缀合物及其方法
US20190212335A1 (en) * 2016-04-15 2019-07-11 Luminicell Pte. Ltd. AIE Nanoparticle Conjugates And Methods Therefor
CN110441521A (zh) * 2018-05-03 2019-11-12 深圳市疾病预防控制中心 检测Zika病毒NS1抗原的试纸条和试剂盒及方法
CN110702893A (zh) * 2019-09-26 2020-01-17 同济大学 一种aie免疫层析试纸

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114354924A (zh) * 2021-11-18 2022-04-15 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种AIE纳米微球的2019-nCoV新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法与应用
CN114354924B (zh) * 2021-11-18 2024-05-17 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 一种AIE纳米微球的2019-nCoV新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111239391B (zh) 一种2019-nCoV新型冠状病毒抗原检测试剂及检测装置
Wang et al. The application of lateral flow immunoassay in point of care testing: a review
WO2015070702A1 (zh) 一种试条卡
US20080032281A1 (en) Method and Device for Rapid Detection and Quantitation of Macro and Micro Matrices
CN104655616A (zh) 用于检测肿瘤标志物muc1的电化学发光适配体传感器的制备方法及其应用
CN110940806B (zh) 腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用
WO2015070747A1 (zh) 一种试条卡
JP2013060448A (ja) ２本鎖ｄｎａへの高い選択性を有する蛍光化学物質及びそれらの使用
CN111239390B (zh) 一种抗原检测试剂及其制备方法
CN109470862A (zh) 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒
CN112114137A (zh) 一种新型特异性蛋白检测试剂及其制备方法
JP2013535693A (ja) 非診断用分析物のためのラテラルフローアッセイ
CN107101981A (zh) 一种利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物的方法
CN112730832B (zh) 一种covid-19抗原检测卡、其制备方法和应用
Forghani Diagnosis by viral antigen detection
CN112683968A (zh) 一种检测唾液酸化糖链抗原kl-6铱纳米点电化学发光传感器的制备及应用
CN112782401A (zh) 一种体外快速检测新型冠状病毒的方法及应用
CN114062668A (zh) 一种快速检测新型冠状病毒抗原的量子点荧光免疫层析试纸条
CN109374882A (zh) 检测黄盖鲽鱼卵黄蛋白原免疫胶体金试纸条及制备方法及应用
CN212111446U (zh) 一种狗白介素-6荧光微球免疫层析定量试纸条
CN118130785B (zh) 一种猴痘病毒免疫标记物及其在磁/光三模式免疫层析检测猴痘病毒中的应用
CN112683969B (zh) 一种检测ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用
CN114720449B (zh) 一种共振拉曼散射-红外吸收双模纳米探针的制备及应用
CN211179854U (zh) 白色念珠菌检测试剂条及试剂盒
CN109781994B (zh) 一种基于核酸适配体信号放大的血小板衍生生长因子pdgf-bb试纸条及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination