CN114981384A - 发光两性聚合物纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及两性离子发光聚合物纳米颗粒、它们的制备方法以及这些纳米颗粒在医学领域和生物学研究领域中的用途。

Description

发光两性聚合物纳米颗粒
本发明涉及发光两性离子聚合物纳米颗粒、它们的制备方法以及这些纳米颗粒在医学领域和生物学研究领域中的用途。
单分子荧光显微镜和超分辨率荧光显微镜的出现开辟了新的成像领域，有望在活细胞的分子水平上可视化生物过程。为了追踪或可视化细胞质中的单个生物分子，荧光发射器需要非常明亮。事实上，时空分辨率与收集的光子数量直接相关。最近，载有染料的聚合物纳米颗粒通过将大量荧光染料包裹在纳米颗粒中实现了非常高的亮度(Reisch,A.；Klymchenko,A.S.Fluorescent Polymer Nanoparticles Based on Dyes:SeekingBrighter Tools for Bioimaging.Small 2016,12(15),1968–1992.)。已经使用了几种新的策略例如具有聚集诱导发射1的荧光有机点或使用具有疏水的大体积反离子的荧光团盐2以克服聚集引起的以非常高的浓度包裹的荧光团的猝灭。
然而，为了在生物环境中使用，单分子成像不仅需要高亮度的纳米颗粒，还需要小的探针尺寸并且不与生物环境发生非特异性相互作用。3首先，为了提高定位精度，粒径需要与要标记的生物分子(例如蛋白质)的尺寸相同。其次，纳米颗粒的尺寸和表面涂层在定义其细胞内行为方面起着至关重要的作用，它们对标记生物分子行为的影响应该受到限制。4,5由于细胞内结构限制和大分子拥挤效应，纳米颗粒在生物环境(例如细胞中)的扩散可能会受到限制。6Etoc等人确定了≤50nm的颗粒在胞质溶胶中可以发生布朗扩散。4发明人在过去还表明，NP可以到达胞质溶胶的几乎所有部分的极限核心尺寸约为23nm。5同时，表面化学对纳米颗粒在生物系统7中的行为也有重要影响，可以影响纳米颗粒在胞质溶胶中的扩散和运动。4原因之一是表面化学将决定与蛋白质的相互作用。特别地，导致蛋白质冠的形成的蛋白质的吸附会影响从细胞摄取到它们的降解的NP行为的各个方面，8并且只要蛋白质与NP表面之间存在强相互作用，纳米颗粒就不能自由在胞质溶胶中移动。4因此，控制表面性质以减少(抑制)蛋白质吸附至关重要。
迄今为止，引入聚乙二醇(PEG)是抑制蛋白质在纳米颗粒上吸附的最著名策略。9然而，聚乙二醇化并不能完全适于产生具有与生物分子(例如蛋白质)相似尺寸的纳米颗粒，因为有效抑制与蛋白质相互作用所需的PEG链也显著增加了几纳米通常约10nm的粒径。10,11
例如，WO 2018/044688描述了水分散性荧光颗粒，其包含一种或多于一种疏水聚合物的混合物，其包裹在一种或多于一种两亲聚合物中。所述两亲聚合物是包含至少一个疏水片段和至少一个亲水片段的嵌段共聚物，例如PS-b-PEG。
另一种方法是使用两性离子(ZI)基团，模拟细胞膜的外表面。12在两性离子的情况下抑制蛋白质吸附的机制与它们非常亲水的性质以及它们含有自己的反离子这一事实有关，11,12而与PEG的立体排斥无关。因此，与PEG涂层不同，两性离子涂层可以非常薄，从而限制了粒径的增加。已经开发了几种方法来在NP表面上实现两性离子基团，尤其是羧基甜菜碱、磺基甜菜碱和磷酸胆碱。然而，过去开发的大多数两性离子纳米颗粒都是无机纳米颗粒，如量子点(QD)13、二氧化硅NP、11或Au NP。14
迄今为止，在聚合物纳米颗粒的情况下，两性离子聚合物颗粒主要由带有两性离子嵌段和疏水嵌段的嵌段共聚物获得。
这种方法的缺点是这些NP的直径并不令人满意，这限制了它们在体内环境中的使用。顺便说一下，他们的合成过程通常很复杂。
因此，为了改进靶生物分子的体外或体内检测或追踪，有必要提供具有高亮度和可控较小尺寸和有限蛋白质表面相互作用的两性离子聚合物纳米颗粒的新家族。
为了满足这些需求，本发明的发明人基于专门设计的随机疏水聚合物开发了带有非极性、带电、两性离子和反应性基团的用于生物缀合的新型发光两性离子纳米颗粒。
与现有技术中已知的嵌段两性离子共聚物相反，其中两性离子嵌段和疏水嵌段分离并定位在聚合物链的两端，形成本发明纳米颗粒的两性离子共聚物具有随机排列在共聚物的疏水侧基中的聚合物主链上的带负电荷的基团和两性离子基团。
尽管如此，令人惊讶的是，少量两性离子基团和带负电荷的基团的这种随机排列可以同时进一步减小纳米颗粒的尺寸，并有效地防止蛋白质吸附在纳米颗粒表面，同时保持高发光亮度。
本发明的纳米颗粒的直径可以小至7nm至20nm，特别适合在活细胞和固定的细胞和组织的细胞质中直接在单颗粒水平上进行监测。
本发明的第一方面是提供两性离子发光聚合物纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少一种发光染料和至少一种无规共聚物，所述无规共聚物包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的重复单元具有侧基，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-0摩尔％至5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
-60摩尔％至95摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是疏水基团。
不受任何理论的束缚，本发明的纳米颗粒可能具有主要由共聚物的疏水部分和染料盐组成的疏水内核。另一方面，对蛋白质吸附的优异抗性和胞质溶胶中颗粒的高迁移率表明具有高密度两性离子基团的非常亲水的表面。因此，本发明的纳米颗粒应该具有核-壳结构，两亲聚合物的疏水部分主要集中在核中，负责包裹发光染料，而带电和两性离子部分富集在壳中，负责控制相互作用。
对于给定的颗粒-核尺寸，本发明的纳米颗粒可以使纳米颗粒的总尺寸相对于基于相同主要单体的聚乙二醇化纳米颗粒的总尺寸减小1/2。这是由于与它们的聚乙二醇化对应物相比，在两性离子颗粒的情况下，颗粒壳的尺寸更小。颗粒的亮度取决于包裹在其核中的染料数量，因此，对于给定的总尺寸，取决于核与总粒径(核和壳)的比率。因此，对于相同的总粒径，由于非常薄的壳而具有大近2倍的核直径的本发明颗粒的亮度可以增加近8倍。已经证实本发明的颗粒的高负载(>20重量％)和量子产率(>30％)。这意味着与非两性离子纳米颗粒相比本发明的纳米颗粒是超亮的。
因此，本发明的纳米颗粒一方面结合了高效的染料包裹和高量子产率，从而产生了高的颗粒亮度，另一方面，还具有优异的稳定性和抗蛋白质吸附性。
如本文所用，术语“无规共聚物”是指具有两种或多于两种聚合成无特定序列的单体的共聚物。在无规共聚物中，各个重复单元沿共聚物的主链无规分布。
术语“重复单元”是指通过将重复单元沿链依次连接在一起，而产生完整聚合物链的单元。
如本文所用，就聚合物而言，术语“侧基”是指与聚合物主链相连的一组分子。
因此，主要单体的侧基也是与该主要单体聚合的无规共聚物的主要侧基。
术语聚合物的“主链”是指聚合物的直链，其上的所有其他长链或短链或两者都可视为未决的。
如本文所用，表述“适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应基团”是指任何用于生物缀合的反应性基团，即能够与识别靶生物分子的分子的相应反应性官能团发生化学反应例如通过共价键的任何反应性基团，特别是在细胞、组织或生物流体中，例如抗体、抗体片段、配体、天然生物分子的激动剂或拮抗剂、肽、适配体、寡核苷酸、毒素或化学药物。
根据本发明，所述无规共聚物可以是基于甲基丙烯酸(C1至C6)烷基酯的聚合物、基于丙烯酸(C1至C6)烷基酯的聚合物、基于丙烯酰胺的聚合物、基于聚酯的聚合物、基于聚酰胺(多肽)的聚合物、基于苯乙烯的聚合物及其共聚物。
在本发明的上下文中，术语“基于甲基丙烯酸(C1至C6)烷基酯的聚合物”应理解为由甲基丙烯酸(C1至C6)烷基酯作为主要单体与其他次要单体形成的共聚物。
在本发明的上下文中，术语“基于(C1至C6)丙烯酸烷基酯的聚合物”、“基于丙烯酰胺的聚合物”、“基于聚酯的聚合物”、“基于聚酰胺的聚合物”、“基于苯乙烯的聚合物”应以类似方式解释。
(C1至C6)甲基丙烯酸烷基酯的聚合物的实例可以是基于甲基丙烯酸甲酯的共聚物、基于甲基丙烯酸乙酯的共聚物、基于甲基丙烯酸丙酯的共聚物、基于甲基丙烯酸异丙酯的共聚物或基于甲基丙烯酸丁酯的共聚物。
基于聚酯的聚合物的实例可以被引用为但不限于基于聚乙醇酸(PGA)的共聚物、基于聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)的共聚物、基于聚乳酸(PLA)的共聚物或基于聚己内酯(PCL)的共聚物。
本发明的纳米颗粒中包含的无规共聚物的实施方案由下式I表示：
Figure BDA0003748004090000041
其中：
-m为0或1，
-n为选自1至6的整数
-R1为两性离子基团，
-R2为带负电荷的基团，
-R3为适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
-x为0.5摩尔％至20摩尔％，
-y为3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％，
-z为0摩尔％至5摩尔％，
本发明的纳米颗粒中包含的无规共聚物的更特定的实施方案由下式I表示：
Figure BDA0003748004090000051
其中：
-m为0或1，
-n为选自1至6的整数
-x为0.5摩尔％至20摩尔％，
-y为3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％，
-z为0摩尔％至5摩尔％，
-R2为带负电荷的基团，例如O-或–(O-(CH2)3-SO3-,
-R3为适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
本发明的纳米颗粒中包含的无规共聚物的另一个实施方案由下式II表示：
Figure BDA0003748004090000061
其中：
-R1为两性离子基团，
-R2为带负电荷的基团，
-R3为适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
-x为0.5摩尔％至20摩尔％，
-y为3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％，
-z为0摩尔％至5摩尔％，
根据特定的实施方案，本发明的两性离子发光聚合物纳米颗粒包含无规共聚物，无规共聚物为基于甲基丙烯酸(C1至C6)烷基酯聚合物，所述无规共聚物包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-0摩尔％至5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
-70摩尔％至95摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是(C1至C6)烷基。
本发明的无规聚合物中包含的一种次要侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团。
本发明的纳米颗粒中包含的无规共聚物具有0.5％至20％的具有带负电荷的基团作为侧基的重复单元。
本发明的无规聚合物中包含的另一种次要侧基是两性离子基团。
术语“两性离子基团”是指同时包含具有正电荷的部分和具有负电荷的另一个不相邻部分的化学基团。可以包含在上述无规共聚物中的两性离子基团的实例可以选自铵基磷酸盐、铵基膦酸盐、铵基亚膦酸盐、铵基磺酸盐、铵基硫酸盐、铵基羧酸盐、铵基磺酰胺、铵基磺酰亚胺、胍
Figure BDA0003748004090000071
基羧酸盐、吡啶
Figure BDA0003748004090000072
基羧酸盐、吡啶
Figure BDA0003748004090000073
基磺酸盐、铵基(烷氧基)二氰基乙烯醇盐、铵基硼酸盐、锍基羧酸盐、
Figure BDA0003748004090000074
基磺酸盐、
Figure BDA0003748004090000075
基羧酸盐。
包含在本发明的纳米颗粒中的无规共聚物具有3％至30％，特别是5％至20％，更特别是7％至17％的具有两性离子基团作为侧基的重复单元。
所述无规共聚物中非常亲水的两性离子基团的存在增加了共聚物的亲水性。然而，本发明的纳米颗粒中包含的无规共聚物由于疏水侧基的主要部分而基本保持疏水性。
由于两性离子基团和带负电荷的基团的存在，本发明的纳米颗粒具有特定的减小的尺寸。
本发明的纳米颗粒的直径为5nm至200nm，特别是5nm至150nm，更特别是5nm至100nm，还更特别是5nm至50nm，还更特别是7nm至30nm，还更特别是7nm至20nm.
可以通过常规的电子显微镜或动态光散射法测量纳米颗粒的直径和尺寸分布。
本发明的纳米颗粒还包含发光染料。
在本发明的范围内，所述发光染料可以是荧光染料或磷光染料。
所述发光染料也可以是发光金属络合物。
在优选的实施方案中，所述发光染料是荧光染料，任选地具有反离子，所述染料和所述反离子被包裹在纳米颗粒内。
荧光染料的实例可列举为但不限于罗丹明衍生物、青色素衍生物、荧光素衍生物、BODIPY衍生物、氮杂-BODIPY衍生物、香豆素、方酸类化合物、卟啉类化合物或酞菁类化合物。
它们适用于离子染料的反离子可以是无机反离子或大体积的有机反离子。
无机反离子的实例可包括但不限于氯离子、高氯酸根、磺酸根、硝酸根、四氟硼酸根、六氟磷酸根。
如本文所用，术语“大体积的有机反离子”是指带有芳香残基和/或脂肪族残基的大体积的有机阴离子。大体积的有机反离子的实例可列举为但不限于四(五氟苯基)硼酸根、四(4-氟苯基)硼酸根、四[3,5-双(三氟甲基)苯基]硼酸根、四[3,5-双(1),1,1,3,3,3-六氟-2-甲氧基-2-丙基)苯基]硼酸根、四[全氟叔丁氧基]铝酸盐或四苯基硼酸根。
根据一些实施方案，本发明的无规共聚物还可以包含第三种次要侧基，其是适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团。
例如，所述反应性基团可以是适用于“点击化学”的反应性基团例如叠氮化物、四嗪、烯基或其他可以进行环加成的反应性基团，或反应性基团例如马来酰亚胺基团，或活性酯例如五氟苯酯或NHS-酯。
该第三种次要侧基使得将天然或合成的生物学上感兴趣的分子与本发明的发光两性离子纳米颗粒结合成为可能。
所述天然或合成的生物感兴趣分子的实例可以是但不限于识别细胞、组织或生物体液中的靶生物分子的分子，例如抗体、抗体片段、配体、天然生物分子的激动剂或拮抗剂，肽、适配体、寡核苷酸、毒素或化学药物。
这种带有反应性基团的发光两性离子纳米颗粒特别有趣，因为它们可以根据纳米颗粒的指定应用容易地进一步功能化。
根据一些实施方案，本发明的发光两性离子聚合物纳米颗粒可以包含如前所述的作为唯一聚合物材料的无规共聚物。
根据一些其他的实施方案，本发明的发光两性离子聚合物纳米颗粒可以包含如上所述无规共聚物和另一种聚合物，或包含至少两种如上所述的无规共聚物。
在优选的实施方案中，本发明的发光两性离子聚合物纳米颗粒包含：
-具有适用于用生物学上感兴趣的分子进行纳米颗粒功能化的反应性基团的如上所述的第一无规共聚物，和
-如上所述但不含用于纳米颗粒功能化的反应性基团的第二无规共聚物。
带有反应性基团的无规共聚物与另一种不含反应性基团的无规共聚物的混合物可以更准确地控制通过这些反应性基团与纳米颗粒结合的生物感兴趣分子的数量，这将进一步影响例如纳米颗粒的检测灵敏度、靶分子定量或单分子追踪。
在特定的实施方案中，本发明的发光两性离子聚合物纳米颗粒包含第一无规共聚物和第二无规共聚物，第一无规共聚物包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-高于0摩尔％但是低于5摩尔％或等于5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，不含有适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团的第二无规共聚物，并且包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
在另一个特定的实施方案中，本发明的发光两性离子聚合物纳米颗粒包含：
-如上所述的第一无规共聚物，其具有适用于与第一种生物学上感兴趣的分子进行纳米颗粒功能化的反应性基团，和
-如上所述的第二无规共聚物，其具有适用于与第二种生物学上感兴趣的分子进行纳米颗粒功能化的反应性基团。
因此，这种纳米颗粒可以被两种生物学上感兴趣的分子功能化。
发光两性离子纳米颗粒上反应性基团的存在允许所述纳米颗粒通过与所述聚合物链的共价键容易被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化。
因此，本发明的另一个方面是提供新型功能化两性离子发光聚合物纳米颗粒。
所述功能化两性离子发光聚合物纳米颗粒包含至少一种无规共聚物，其包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-高于0摩尔％但是低于5摩尔％或等于5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是与聚合物的链共价结合的天然或合成的生物学上感兴趣的分子
-60摩尔％至95摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是疏水基团。
在特定的实施方案中，所述本发明的功能化发光两性离子聚合物纳米颗粒可以由下式III表示：
Figure BDA0003748004090000101
-其中m为0或1，
-n为选自1至6的整数
-R1为两性离子基团，
-R2为带负电荷的基团，
-R4为适合与天然或合成的生物学上感兴趣的分子共轭的反应性基团，
-x为0.5摩尔％至20摩尔％，
-y为3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％，
-z大于0摩尔％但是低于5摩尔％或等于5摩尔％。
在特定的实施方案中，所述本发明的功能化发光两性离子聚合物纳米颗粒可以由下式IV表示：
Figure BDA0003748004090000102
-R1为两性离子基团，
-R2为带负电荷的基团，
-R4为适合与天然或合成的生物学上感兴趣的分子共轭的反应性基团，
-x为0.5摩尔％至20摩尔％，
-y为3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％，
-z大于0摩尔％但是低于5摩尔％或等于5摩尔％。
所述天然或合成的生物学上感兴趣的分子选自抗体、抗体片段、肽、适配体、寡核苷酸、毒素或化学药物。
纳米颗粒上这种天然或合成的生物学上感兴趣的分子的存在赋予所述纳米颗粒检测相应生物分子的能力。
根据待检测的靶生物分子，带有反应性基团的发光两性离子纳米颗粒可以被相应的天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化。例如为了检测特定蛋白的表达，发光两性离子的纳米颗粒可以被针对上述蛋白质的抗体功能化。
本发明的这些将小尺寸、超高亮度、低蛋白质吸附与靶特异性结合的功能化的发光两性离子纳米颗粒，特别适用于体外或体内疾病诊断、治疗或生物学研究中的应用。
本发明的功能化纳米颗粒可以用作例如用于检测靶生物分子的生物传感器，例如用于检测特定蛋白质、抗体或肽。
由于其高亮度，本发明的功能化发光两性离子纳米颗粒比ELISA测试更灵敏、更易于使用。
特别地，这些功能化的纳米颗粒可用作可用于体内检测、追踪靶分子或细胞以进行体内医学诊断的造影剂或医学成像剂，或用作可用于体外检测或鉴定生物分子或表达所述生物分子的细胞的诊断剂。
本发明还涉及通过如上所述的功能化发光两性离子聚合物纳米颗粒体外或体内检测或追踪靶生物分子的方法。
所述靶生物分子的实例可以是但不限于蛋白质、抗体、DNA、RNA、siRNA、微RNA、毒素。
由于其超高亮度，本发明的纳米颗粒可用于单分子追踪。
根据特定的实施方案，本发明涉及用于体外检测或追踪样品中的靶生物分子，特别是抗原的方法。
所述样品可以是从生物流体、体外细胞培养物或组织、植物、微生物、含有生物分子的溶液、环境样品、食品样品、药物样品中获得的生物样品。
“生物流体”是指从活的动物或植物中包含、排泄或分泌的液体，例如：血液、血液的不同成分、淋巴、胆汁、唾液、渗出液。在本发明优选的实施方案中，生物流体为选自血清、灭活血清、血浆或血液的人源液体或动物源性流体。
“组织”是指人、动物或植物组织。在本发明的特定实施方案中，组织样本是通过活检或在外科手术期间获得的样本。在更特定的实施方案中，组织是通过活检或在外科手术期间从患有癌症或疑似患有癌症的患者处获得的肿瘤组织。
“环境样品”是指从环境中收集的样品，例如土壤、污泥或废水。
对于检测，本发明的功能化发光两性离子纳米颗粒可以悬浮在溶液中或固定在微孔板的表面上。
本发明还涉及包含本发明的功能化发光两性离子纳米颗粒的药物组合物，其用作造影剂、诊断剂或医学成像剂。
所述组合物可以用作体内诊断剂。
如前所述的发光两性离子疏水聚合物纳米颗粒中所含的无规共聚物可以通过自由基聚合、可控自由基聚合、缩合、加成开环聚合来合成。
发光两性离子疏水聚合物纳米颗粒可以通过纳米沉淀的方法获得。
本发明还提供了制备如前所述的功能化荧光两性离子聚合物纳米颗粒的方法，所述方法包括：
-纳米沉淀至少一种无规共聚物，该无规共聚物包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-高于0摩尔％但是低于5摩尔％或等于5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是与聚合物的链共价结合的天然或合成的生物学上感兴趣的分子。
制备如前所述的功能化发光两性离子聚合物纳米颗粒的另一种方法包括：
-纳米沉淀至少一种无规共聚物，该无规共聚物包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-高于0摩尔％但是低于5摩尔％或等于5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
-纳米沉淀后获得的发光两性离子聚合物纳米颗粒与天然或合成的生物学上感兴趣的分子的反应。
在以下附图和实施例中更详细地揭示了本发明。
附图说明：
图1示出了含磺酸根和两性离子(ZI)基团的基于甲基丙烯酸酯的共聚物的简化化学结构，染料(R18)及其反离子(F5-TPB)用于通过纳米沉淀制备两性离子发光染料负载的NP。需要注意的是，疏水基团、两性离子基团和磺酸根基团随机排列在主链聚合物链上。
图2(A)示出了两性离子磺酸根纳米颗粒(PMMA-ZI10％-SO3H 1％和2％)和非两性离子磺酸根纳米颗粒(PMMA-SO3H 1％,PMMA-SO3H 2％)尺寸的TEM分析。通过纳米沉淀法制备负载10重量％R18/F5-TPB的纳米颗粒；图2(B)示出了具有10％的两性离子和1％的SO3H基团的不同甲基丙烯酸酯聚合物尺寸的TEM分析。在每个图像下方给出了相应纳米颗粒的尺寸分布。比例尺对应于50nm。每种条件至少分析了100个纳米颗粒。
图3示出了使用FCS测定的NP的稳定性及其与蛋白质的相互作用:(A)ZI密度对颗粒保持稳定时最大盐浓度的影响。(B)具有不同ZI百分比的PMMA-SO3H 2％的NP和(C)在10％胎牛血清(FBS)存在下由具有或不具有ZI基团的不同甲基丙烯酸酯单体制成的1％磺酸根NP的尺寸。所有NP均负载1％的R18/F5-TPB。给出的是来自三个独立测量的平均值。误差条与s.e.m.相对应。
图4示出了显微注射了不同类型的负载有10重量％R18/F5-TPB的NP的HeLa细胞的代表性落射荧光显微照片。显示了超过60秒的最大投影。比例尺对应于10μm。
图5示出了单颗粒追踪：A)在细胞质中负载20重量％R18/F5-TPB的PEMA-ZI10％-SO3H 1％NP超过30秒的轨迹。(B)PEMA-ZI 10％-SO3H 1％NP的均方位移(MSD)。黑色曲线对应于平均MSD曲线，灰色直线为拟合图。误差条与s.e.m.相对应。(C)PEMA-ZI10％-SO3H 1％NP的扩散系数分布。(D)不同聚合物NP的平均扩散系数。误差条给出了FWHM。每个样本至少分析50条轨迹。
图6(A)示出了通过带有羧酸根(带电)、磺基甜菜碱(两性离子)和叠氮基团的基于甲基丙烯酸乙酯的聚合物与染料盐R18/F5-TPB的纳米沉淀组装的带有叠氮化物的荧光NP的简化化学方案。(B)带有DBCO的抗体是通过DBCO-EG4-马来酰亚胺与用TCEP处理的抗体反应获得的。
图7示出了表达HER2受体的SKBR-3细胞的显微照片，仅与带有两性离子NP(上)的叠氮化物或与DBCO修饰的HER2受体抗体孵育，然后与带有两性离子纳米颗粒(下)的叠氮化物孵育。给出的是，从左到右，荧光图像和DIC图像的叠加、荧光图像和DIC图像。
实施例
实施例1
1.材料和方法
1.1材料
甲基丙烯酸甲酯(99％,M55909)、甲基丙烯酸(99％,155721)、甲基丙烯酸3-磺丙基钾盐(99％,251658)和甲基丙烯酸2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)乙酯(99％,537284)购自Sigma-Aldrich。二甲基亚砜(DMSO，分析级)购自Fisher-Scientific。Milli-Q水(Millipore)、乙腈(≥99.9％，Sigma-Aldrich)和甲醇(≥99.9％，Carlo Erba reagents)用于制备纳米颗粒。购自CarloErba的二氯甲烷(≥99.8％)和购自VWR的甲醇(HPLC级)。6-羧基-四甲基罗丹明(来自Sigma-Aldrich的TMR)、磷酸盐缓冲液(PBS，FisherScientific)、胎牛血清(FBS，Lonza)用于稳定性研究。使用柱色谱法或重结晶纯化单体。偶氮二异丁腈(Aldrich,≥98％)从乙醇中重结晶两次。其他化合物按原样使用。R18/F5-TPB由罗丹明B高氯酸十八烷基酯(Aldrich，>98.0％)和四(五氟苯基)硼酸乙醚合乙酯锂(AlfaAesar，97％)通过离子交换合成，然后如前所述通过柱色谱纯化。2
1.2聚合物合成
本发明的聚合物的合成：通过自由基聚合合成不同的聚合物。不同的单体都溶解在脱气的DMSO中并以所需的比例混合。加入0.01当量的AIBN，并将圆底烧瓶置于预热至70℃的油浴中。一旦转化率达到25％，就停止反应，聚合物在甲醇和/或水中再沉淀两次。干燥后，通过NMR和在可能的情况下使用尺寸排阻色谱法表征聚合物。以PMMA-SO3H-ZI的合成为例：
聚(甲基丙烯酸甲酯-co-3-甲基丙烯酸磺酸丙酯-co-2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯)(PMMA-ZI-SO3H)：将甲基丙烯酸甲酯、2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯和3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐溶解在脱气的DMSO中，浓度为2M(1M用于2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯，加入少量甲醇)。然后将这三种溶液在配备有搅拌棒的50mL双颈圆底烧瓶中以所需比例混合，得到20mL的总体积。混合物通过鼓泡氩气脱气5分钟并置于氩气气氛下。加入0.01当量的在DMSO(40mg/mL)中的AIBN，并将圆底烧瓶置于预热至70℃的油浴中。定期抽取样品，溶解在DMSO-d6中并通过NMR分析。一旦转化率达到25％，通过将其快速冷却至室温来停止反应。然后将反应混合物滴加到甲醇中，或者对于更高百分比的带电和两性离子单体，滴加到水中。过滤后，将沉淀物重新溶解在少量乙腈中(当需要时加入少量甲醇)并在甲醇中再沉淀两次(对于最高百分比的ZI，溶解在水中)。将获得的聚合物在真空下干燥。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ)：4.36(br,0.04-0.2H),3.96(br.s,0.02-0.04H),3.55(m,3.4H),3.13(br,0.12-0.6H),2.45(br,被溶剂峰覆盖),2.04(br,0.04-0.2H),2.00-0.30(m,6H)。基于分别在4.36ppm和3.97ppm处的峰获得的ZI和SO3H基团的分数(进料：获得)：ZI 10％:10.2％-SO3H 1％:1.4％；ZI 10％:11％-SO3H 2％:2.8％。GPC测得的分子量:1％SO3H:Mw＝51200,Mw/Mn＝1.58；1％ZI:Mw＝43100,Mw/Mn＝1.14。对于具有较高量的两性离子单体的聚合物，没有合适的GPC溶剂系统可用。
聚(甲基丙烯酸乙酯-co-3-甲基丙烯酸磺酸丙酯-co-2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯)(PEMA-ZI-SO3H)：1H NMR(400MHz,MeOD-,δ):4.50(br,0.2H),4.34-3.92(m,2.02H),3.81(br,0.2H),3.70(br,0.2H),3.29(br,被溶剂峰部分覆盖),2.92(br,0.2H),2.31(br,0.2H),2.23-0.5(m,9H)。基于4.50ppm处的峰获得的ZI基团的分数：10.3％。
聚(甲基丙烯酸丙酯-co-3-甲基丙烯酸磺酸丙酯-co-2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯)(PPMA-ZI-SO3H)：1H NMR(400MHz,MeOD,δ):4.50(br,0.2H),4.29-3.54(m,2.42H),3.29(br,部分被溶剂峰覆盖),2.92(br,0.2H),2.31(br,0.2H),2.23-0.5(m,11H)。
基于4.50ppm处的峰获得的ZI基团的分数：9.4％。
聚(甲基丙烯酸丁酯-co-3-甲基丙烯酸磺酸丙酯-co-2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯)(PBMA-ZI-SO3H)：1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):4.40(br,0.2H),4.30-3.55(m,2.42H),3.33(br,0.6H),2.99(br,0.2H),2.36(br,0.2H),2.28-0.4(m,13H)。基于4.40ppm处的峰获得的ZI基团的分数：8.3％。
聚(甲基丙烯酸甲酯-co-3-甲基丙烯酸磺酸丙酯)(PMMA-SO3H)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):3.97(br.s,0.02-0.04H),3.57(s,3H),2.45(m,部分被溶剂峰覆盖),2.1–0.5(m,6H)。基于3.97ppm处的峰获得的SO3H基团的分数(进料：获得)：SO3H 1％:1.1％；SO3H2％:2.3％。
1.3纳米颗粒的制备
在乙腈中制备浓度为10g.L-1的共聚物储备溶液(ZI聚合物：20体积％甲醇)。这些溶液在含有1重量％、10重量％或20重量％的R18/F5-TPB(相对于聚合物)的相应溶剂中以2g.L-1稀释。在震荡下(Thermomixer comfort,Eppendorf,1000rpm,21℃)下将该溶液快速加入到10倍体积过量的水中，然后在水中进行第二次稀释。
1.4纳米颗粒的表征
在配备有恒温隔室的Cary4000Scan紫外-可见分光光度计(Varian)和FS5分光荧光计(Edinburgh Instruments)上分别记录吸收光谱和发射光谱。激发波长设置为530nm，发射波长为540nm至750nm。使用乙醇中的罗丹明101作为参考(QY＝0.9)计算QY。
透射电子显微镜：在戊胺辉光放电后，将5μL纳米颗粒溶液沉积在碳涂层的铜铑电子显微镜网格上。然后用2％的乙酸双氧铀溶液处理20秒进行染色。使用配备LaB6灯丝并在100kV下操作的Philips CM120透射电子显微镜观察获得的网格。用Peltier冷却CCD相机(794型，Gatan，Pleasanton，CA)记录感兴趣区域的采集。使用Fiji软件分析图像。
荧光相关光谱：使用水中的TMR作为参考，使用532nm的激发在自制的共聚焦装置上进行测量。将含有1重量％染料的NP溶液稀释2倍，然后将200μL沉积在96孔光学底板上进行测量。通过将50体积％的10倍PBS(10x)、FBS或水逐滴添加至低结合的1.5mL的微量离心管中的NP溶液中来研究NP在盐和蛋白质存在下的稳定性。添加后5分钟记录数据，然后使用PyCorrFit软件进行分析。
1.5细胞实验
在37℃下，在含有5％的CO2的潮湿环境中，HeLa细胞在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，不含酚红，Gibco-Invitrogen)中辅以10％的胎牛血清(FBS，Lonza)、L-谷氨酰胺和1％的抗生素溶液(青霉素-链霉素，Gibco-Invitrogen)生长。在显微注射前24小时，将细胞以125×103个细胞/孔的密度接种到放置在6孔板中的圆形显微镜盖玻片(直径18mm)上。
NP的显微注射和细胞成像：对于显微注射实验，将铺在玻璃盖玻片上的亚融合HeLa细胞安装在Ludin Chamber(Life Imaging Services，Basel，Switzerland)中。将细胞放置在莱卡DMIRE 2显微镜(37℃,5％CO2,100x物镜,sCMOS相机，氙灯)上，使用Femtojet/InjectMan NI2微型注射器(Eppendorf)将颗粒浓度为0.5nM至2nM的不同纳米颗粒的溶液微注射到细胞的核周区域。然后在样品转移后在相同的设置或配备Mutli-LED Spectra X(Lumencor)、Olympus 60x TIRFM(1.45NA)物镜和Flash 4V2+相机(Hamamatsu)的iMIC显微镜(Till Photonics)上获取图像序列。
使用环境控制系统(Life Imaging Services)将活细胞维持在在37℃、5％的CO2加湿的环境中。以50ms的帧速率和2的像素合并记录延时摄影超过60秒。然后用ImageJ(National Institutes of Health,USA)对他们进行分析。对于单颗粒追踪，对于Imic显微镜以43ms的帧速率，或对于Leica DMIRE 2显微镜50ms的帧速率和1的像素合并记录延时摄影超过30s，以提高分辨率。使用Fiji软件，轨迹从TrackMate插件恢复。然后用MATLAB脚本绘制MSD曲线，并从MSD曲线中提取斜率，用于颗粒追踪分析。
2.实验结果
2.1带负电荷的基团和两性离子基团对颗粒尺寸的影响
根据上面“材料和方法”中描述的方法合成了带有磺酸根和两性离子(ZI)基团的基于甲基丙烯酸酯的共聚物。在下文中，聚合物记为PXMA-ZI-x％-SO3H-y％，其中XMA表示相应的主要单体(MMA表示甲基丙烯酸甲酯，EMA表示甲基丙烯酸乙酯，PMA表示甲基丙烯酸丙酯，BMA表示甲基丙烯酸丁酯)，x和y对应于两性离子和磺酸根基团的摩尔百分比。顺便说一下，还制备了仅带有磺酸根但不带有两性离子基团的聚合物作为对照。
然后将这些聚合物用于通过纳米沉淀组装负载有染料的聚合物NP。为此，将含有不同量的罗丹明B衍生物(R18)与全氟硼酸盐(F5-TPB)的盐的聚合物在乙腈中的溶液(含有少量甲醇)快速添加到大量过量的水中。通过透射电子显微镜(TEM，图2，表1)分析形成的NP的尺寸。
在聚合物只含磺酸根但不含两性离子基团的情况下，观察到非常小的颗粒:PMMA-SO3H 1％产生的NP的尺寸约13nm，对于2％的磺酸根，颗粒的尺寸减少至9nm。在聚合物链上引入10％的ZI对基于PMMA-ZI-SO3H的纳米颗粒的粒径影响很小。对于1％的磺酸根NP和2％的磺酸根NP，它们的直径分别达到11nm和9nm。因此，ZI基团的存在不会影响颗粒形成的过程，并且获得的“ZI壳”足够薄，不会影响NP的尺寸。另一方面，增加甲基丙烯酸烷基酯单体的疏水性导致颗粒尺寸增加(图2，表1)，顺序为PMMA-ZI10％-SO3H1％<PEMA-ZI10％-SO3H1％<PPMA-ZI10％-SO3H1％<PBMA-ZI10％-SO3H1％，从11nm至35nm。
表1从透射电子显微镜和荧光相关光谱中获得的由不同聚合物制成的NP的尺寸。误差对应于TEM的半峰分布宽度，以及FCS的3次测量的变化。
表1
Figure BDA0003748004090000181
1)用10重量％的R18/F5-TPB制备NP。2)用1重量％的R18/F5-TPB制备NP。
通过包裹大量的染料(相对于聚合物为1重量％至20重量％)，使纳米颗粒发出荧光颗粒。在这里，阳离子罗丹明R18与大且非常疏水的反离子F5-TPB结合，因为这种结合避免了聚集引起的猝灭并导致非常疏水的染料反离子对。在超过48小时对负载有染料的NP进行透析，显示所用染料的释放量小于5％，这表明这种方法在颗粒中产生了非常有效的染料盐的包裹，这与先前显示F5-TPB反离子对染料的高效包裹的结果一致。15此外，对于所有带有两性离子聚合物，在10重量％负载的情况下，颗粒的量产率保持在大于30％，因此确保极佳的颗粒亮度。
2.2两性离子聚合物纳米颗粒的稳定性
通过荧光相关光谱(FCS)研究了所得颗粒在生物介质中的稳定性，特别是两性离子基团改善这一点的潜力。聚合物中ZI基团的百分比从0％变化至10％以改变颗粒上ZI的密度。从FCS数据中获得的NP的粒径与从TEM中获得的粒径非常一致(图3，表1，较小的尺寸与在FCS实验中使用的较少的染料盐相关。)。在第一步中，通过添加浓度增加的NaCl溶液来评估NP的稳定性(图3A)。稳定性极限定义为未观察到NP聚集的最后的NaCl浓度。一旦添加少量盐，由不含ZI基团的聚合物制成的颗粒已经开始聚集(和沉淀)(图3A)。ZI基团的添加导致颗粒稳定性随着ZI基团量的增加而增加。在10％的两性离子基团中，NP没有显示出任何尺寸变化，并且在NaCl高达1M时也没有沉淀迹象。
然后通过添加胎牛血清(FBS)来测试两性离子基团对NP与蛋白质和其他生物分子相互作用的影响，胎牛血清(FBS)是其中含有大量蛋白质的盐和生物分子的复杂混合物(图3B)。在没有ZI基团的颗粒的情况下，观察到大约10nm的尺寸增加，这对应于吸附至少一层蛋白质，从而形成“硬”蛋白质冠(图3B)。从5％的ZI基团开始，NP在与蛋白质相互作用时的尺寸增加显著减少。在10％的ZI基团中，未观察到粒径显著增加，表明这些颗粒的表面抵抗蛋白质吸附(图3C)。
2.3两性离子聚合物纳米颗粒的体外行为
然后将这些NP直接显微注射到活HeLa细胞胞质溶胶的核周区域，并使用落射荧光显微镜监测它们的行为(图4)。在所有的情况下，胞质结构几乎无弥漫性染色。这证实了染料在NP内的有效和稳定包裹，并且没有染料浸出。超过60秒的荧光强度的最大投影给出了颗粒在整个胞质溶胶中的总体分布的一般概念：在没有ZI基团的情况下，大多数颗粒仍然停留在注射点，胞质溶胶中的少数颗粒具有低迁移率，表明颗粒与细胞成分的强相互作用。另一方面，带有10％ZI基团的颗粒通常很好地分布在整个胞质溶胶中。基于PMMA的含ZI的NP显示出在整个胞质溶胶中的分布和高迁移率，即使有时在靠近注射点的细胞核上存在“投影”。PEMA-ZI颗粒在几乎所有NP中都表现出均匀分布和高迁移率。对于PPMA-ZI颗粒也观察到了这种情况，尽管此处颗粒的某些部分仍然接近注射点。在基于PBMA的颗粒的情况下，它们比基于其他测试聚合物的颗粒更定位于注射点。这些结果证实，10％的ZI基团足以强烈减少颗粒与细胞成分的相互作用，并能够在整个胞质溶胶中扩散。然而，这些结果也证实了颗粒尺寸对细胞内颗粒扩散也有重大影响，由于细胞结构的空间位阻，只有低于23nm左右的临界核心尺寸的颗粒才能在整个胞质溶胶中扩散。6这里，PBMA颗粒的尺寸明显高于该阈值，导致它们的固定。部分PPMA颗粒也高于此阈值，导致部分颗粒固定。
2.4单颗粒追踪
本发明颗粒的高亮度使得能够在单个颗粒水平上监测纳米颗粒的迁移和扩散行为，从而更好地了解ZI基团和所用聚合物类型对我们的纳米颗粒细胞内行为的影响。图5A示出了基于PEMA的含ZI的NP的细胞质轨迹的实例。绘制这些NP的均方位移(MSD)与滞后时间的关系图示出了线性增加，最高可达约10μm2，指数α为1(图5B)。这表明这些颗粒在胞质溶胶中的正常扩散或布朗扩散，这在二维中被描述为MSD＝4DΔtα，其中D为扩散系数以及α＝1。16然后从相应的MSD曲线中提取单个NP的扩散系数。图5C示出了对于PEMA-ZI NP，扩散系数的分布以1μm2.s-1为中心，平均D为0.80μm2.s-1，与类似尺寸的QD获得的值非常一致。4分布示出了扩散系数低于0.2μm2.s-1的NP仅占很小比例。PMMA-ZI NP的扩散系数分布相似，平均值略低，为0.65μm2.s-1(图5D)，与稍大的流体动力学尺寸一致。另一方面，PPMA-ZI NP的平均扩散系数明显较低，为0.25μm2.s-1。这可能是由于它们较大的尺寸导致细胞质扩散受限，正如它们在注射点周围更强的聚集已经表明的那样。由于没有ZI基团的PMMA-SO3H1％的NP仍然聚集在注射点周围，因此无法表征它们的扩散行为。然而，我们可以更早地证明，在这种纳米颗粒上的聚乙二醇化的表面活性剂Tween80(T80)的简单吸附，强烈地减少了它们与蛋白质的相互作用，并允许它们在胞质溶胶中扩散。5,15有趣的是，这些NP的平均扩散系数为0.2μm2.s-1，比PMMA和PEMAZI NP低四分之一至三分之一，尽管它们的核心尺寸非常接近(图2)。其原因之一当然是加入聚乙二醇化表面活性剂使NP尺寸增加>5nm。扩散系数的巨大差异还表明，ZI基团在减少与细胞内生物分子和结构的非特异性相互作用方面比吸附的PEG壳更有效。
实施例2用于与生物分子特异性相互作用的两性离子荧光纳米颗粒的制备
在本实施例中，将带有两性离子基团的荧光纳米颗粒(NP)设计为防止非特异性相互作用，并且带有靶基团以引入与生物分子的特异性相互作用。为了引入特异性相互作用，使用了抗体，更具体地说是针对HER2受体的西妥昔单抗。为了实现抗体与纳米颗粒的缀合，它依赖于叠氮基和环炔烃二苄基环辛炔(DBCO)之间的无铜环加成点击化学。一方面，通过带有两性离子、带电基团和叠氮基团的疏水共聚物与疏水染料盐的纳米沉淀，已经组装了在其表面带有叠氮基团的两性离子明亮荧光纳米颗粒。另一方面，抗体已经过修饰以引入反应性DBCO基团。细胞分析表明，荧光纳米颗粒通过抗体与HER2表达细胞特异性结合。
1.材料和方法
1.1聚(甲基丙烯酸乙酯-co-甲基丙烯酸-co-2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯-co-Asp(OtBu)-N3)(PEMA-ZI-MAA-Asp(OtBu)-N3)的合成
该聚合物可以由以下式(Ia-1)表示
Figure BDA0003748004090000211
由聚(甲基丙烯酸乙酯-co-甲基丙烯酸-co-2-(N-3-磺丙基-N,N-二甲基铵)甲基丙烯酸乙酯)(PEMA-ZI-MAA)经三步反应制得了PEMA-ZI-MAA-Asp(OtBu)-N3。如上述实施例1所述，通过自由基聚合反应获得PEMA-ZI-MAA。
1H NMR(400MHz,DMSO-D6)δ,ppm:4.35(br,0.33H),3.98(m,2.00H),3.66(br,部分被溶剂峰覆盖),3.10(m,0.87H),1.82(br,1.78H),1.19(m,3.06H),0.94(m,1.12H),0.78(m,1.53)。
在第一步中，使PEMA-ZI-MAA与Asp(OtBu)-N3(3-氨基-4-((3-叠氮丙基)氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯反应，Asp(OtBu)-N3(3-氨基-4-((3-叠氮丙基)氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯是根据Melnychuk,N等人描述的程序(A.S.DNA-Functionalized Dye-Loaded PolymericNanoparticles:Ultrabright FRET Platform for Amplified Detection of NucleicAcids,J.Am.Chem.Soc.2018,140,10856.)在二甲基甲酰胺(DMF，Sigma Aldrich)中，使用苯并三唑-1基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐作为缀合剂，以N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，SigmaAldrich)作为碱来合成的。获得的聚合物通过在甲醇水混合物中的沉淀进行纯化。
在第二步中，通过用三氟乙酸(Sigma Aldrich)和二氯甲烷(Sigma Aldrich)的1比1混合物处理除去叔丁基。
蒸发后，在第三步中，聚合物通过沉淀和柱色谱法纯化。
1H NMR(400MHz,DMSO-D6)δ,ppm:4.34(br,0.23H),3.96(m,2.00H),3.63(m,0.22H),3.51(m,0.23H),3.09(m,0.54H),1.78(br,1.97H),1.37(s,0.41H),1.17(m,3.55H),0.92(m,1.06H),0.76(m,1.65H)。
因此，在该聚合物中，主要单体为甲基丙烯酸乙酯，并且COOH基团和两性离子基团的摩尔量分别为5摩尔％和10摩尔％。
1.2纳米颗粒的制备
如上在1.1中获得的PEMA-ZI-MAA-Asp(OtBu)-N3储备溶液以10g/L的浓度在含有20体积％的甲醇的乙腈中制备。这些溶液在含有10重量％、20重量％或30重量％的R18/F5-TPB的相应溶剂中以2g/L稀释，R18/F5-TPB是荧光疏水染料盐(相对于聚合物)。在震荡下(Thermomixer comfort，Eppendorf,1000rpm，21℃)下将该溶液快速加入到体积过量9倍的磷酸盐缓冲溶液(20mM，pH 7.4)中，然后用水相进行第二次稀释。
1.3抗体的修饰
西妥昔单抗(Merck)是HER2受体的嵌合IgG1全长抗体。该抗体是在其临床制剂中获得的。通过超滤(MWCO 50kDa，Vivaspin)对pH 8.14的硼酸盐缓冲液进行抗体的缓冲液交换。通过紫外-可见吸光度确定抗体浓度(对于西妥昔单抗mAb，ε280＝210.000M-1cm-1)，将抗体浓度调整至48μM(10.0mg/mL)并等分后在-20℃储存。在实验中，等分样品解冻后立即使用。
1.4西妥昔单抗与马来酰亚胺-PEG4-DBCO的缀合
使用报告的方案的修饰方法制备缀合物。1在硼酸盐缓冲液pH 8.4中制备西妥昔单抗(23μM，300μL，0.0069μmol)。接下来，加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，SigmaAldrich)(45.8mM，1.2μL，4当量)，并在轻微搅拌(450RPM)下将反应在37℃下孵育2小时。然后，在干燥的DMF(10mM)中制备二苯并环辛炔-PEG4-马来酰亚胺(DBCO-PEG4-马来酰亚胺，Sigma Aldrich)溶液，并添加到西妥昔单抗(8μL，8当量)中。随后，将温度降至4℃并继续孵育18小时。之后，通过用PBS缓冲液(pH 7.4)超滤(50kDa MWCO)除去多余的试剂，以提供在PBS缓冲液中的修饰抗体-马来酰亚胺-PEG4-DBCO，通过UV-vis确定产率为60％至70％。
1.5细胞维护和荧光成像
在补充有10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(100U/mL，Gibco)的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco,DMEM)中培养过表达Her2(Neu/ErbB-2)的人乳腺癌细胞系SKBR-3细胞。将SKBR-3细胞以2.0x104的细胞密度接种在8孔Lab-Tek腔室盖玻片(ThermoScientific)上，然后在37℃和5％的CO2下孵育48小时。对于荧光成像，弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤细胞。然后，将200μL抗体-马来酰亚胺-PEG4-DBCO(10μg/mL在Optimem中，Gibco)和200μL仅Optimem培养基(对照)添加到细胞中，并在37℃和5％的CO2下孵育20分钟。然后将细胞用PBS反复洗涤，并在37℃和5％的CO2下用4％的多聚甲醛PBS固定12分钟，然后加入3％的BSA的PBS并在37℃和5％的CO2下再孵育15分钟。然后，添加带有两性离子、带电基团和叠氮基团的荧光NP(见1.2，100pM在含有0.1％BSA的PBS的溶液中)，并将细胞在37℃和5％的CO2下孵育3小时。最后，用含有0.1％BSA的PBS的溶液洗涤细胞，并使用带有60倍物镜的NikonTi-E倒置显微镜(ApoTIRF，油，NA1.49，Nikon)通过落射荧光显微镜检查。激发由发光二极管(SpectraX，Lumencor)提供，波长为550nm。
2.结果与讨论
在本实施例中，组装了具有反应性基团的荧光两性离子纳米颗粒，允许引入生物上感兴趣的分子。为此，通过自由基聚合合成了带有羧酸根和磺基甜菜碱基团的基于甲基丙烯酸乙酯的聚合物(图6A)。然后，在该聚合物中，我们通过与带有叠氮基、用于与聚合物上的COOH基团缀合的氨基和受保护的羧酸基团(Asp(OtBu)-N3，衍生自天冬氨酸)的三官能分子反应引入叠氮基团。羧酸根去保护后，得到了结合了ZI基团、用于在纳米沉淀过程中控制纳米颗粒尺寸的COOH基团和叠氮化物反应性基团(例如10摩尔％的两性离子基团、5摩尔％的COOH、3摩尔％至5摩尔％的N3)的疏水聚合物(上式Ia-1)。
然后将该聚合物用于通过纳米沉淀组装负载有染料的纳米颗粒(NP)：将聚合物的乙腈溶液(含10％甲醇)和10重量％至30重量％(相对于聚合物)的染料盐R18/F5-TPB快速添加到过量9倍的pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，然后进一步稀释。如表2所示，这导致形成尺寸为15nm至18nm的NP，随着染料负载的增加，NP的尺寸略有增加。这些NP显示出明亮的荧光，荧光量子产率约为32％。根据颗粒的尺寸和负载，荧光团的数量可以估计为每个纳米颗粒分别有100个、250个和500个荧光团，负载分别为10重量％、20重量％和30重量％。然后可以使用公式εxNxQY计算每个颗粒的亮度，其中ε是罗丹明的消光系数(125000M-1.cm-1)，N是每个颗粒的染料数量，QY是量子产率，x是乘法运算符。这导致在负载30重量％的情况下，每个颗粒亮度为2.1×107M-1.cm-1。
表2
负载R18/F5-TPB(重量％) NP的尺寸(以nm为单位) 量子产率(％)
10 15±2 31±1
20 16±2 30±4
30 18±2 34±2
另一方面，带有DBCO的抗体是通过两步一锅法获得的(图6B)。在第一步中，(三(2-羧乙基)膦)(TCEP)用于打开西妥昔单抗的二硫键。在第二步中，抗体随后与带有马来酰亚胺的双功能试剂反应，以与一侧的硫醇基团和另一侧的DBCO基团缀合，通过短的寡(乙二醇)接头连接。纯化后，已通过紫外-可见吸收测量证实了通过与带有叠氮化物基团的荧光团缀合的反应性DBCO基团的存在。
然后将抗体/NP系统应用于NP与表达HER2受体的细胞的特异性结合。原位实现抗体-NP缀合。SKBR-3细胞在玻璃盖玻片(Labtek)上的孔中培养，培养48小时后用我们的DBCO修饰抗体处理。固定细胞后，我们添加了带有叠氮化物的NP。作为对照，在不添加抗体的情况下进行相同的实验。
图7中示出的荧光显微镜结果表明，在没有抗体的情况下，在SKBR-3细胞中几乎没有检测到NP。然而，在用DBCO修饰的HER2受体抗体处理后，添加NP会产生强烈的荧光，特别是在细胞外围，可能在含有受体的质膜上。
这表明我们将带有DBCO的抗体与带有叠氮化物的荧光两性离子NP结合的系统能够使NP与细胞上的生物动机(受体)特异性结合。
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Claims (12)

1.一种两性离子发光聚合物纳米颗粒，其包含至少一种发光染料和至少一种无规共聚物，所述无规共聚物包含:
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-0摩尔％至5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
-60摩尔％至95摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是疏水基团。
2.根据权利要求1所述的两性离子发光聚合物纳米颗粒，其中所述无规共聚物选自基于甲基丙烯酸(C1至C6)烷基酯的聚合物、基于丙烯酸(C1至C6)烷基酯的聚合物、基于丙烯酰胺的聚合物、基于聚酯的聚合物、基于聚酰胺(多肽)的聚合物、基于苯乙烯的聚合物及其共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的两性离子发光聚合物纳米颗粒，其中两性离子基团选自铵基磷酸盐、铵基膦酸盐、铵基亚膦酸盐、铵基磺酸盐、铵基硫酸盐、铵基羧酸盐、铵基磺酰胺、铵基磺酰亚胺、胍
Figure FDA0003748004080000011
基羧酸盐、吡啶
Figure FDA0003748004080000012
基羧酸盐、吡啶
Figure FDA0003748004080000013
基磺酸盐、铵基(烷氧基)二氰基乙烯醇盐、铵基硼酸盐、锍基羧酸盐、
Figure FDA0003748004080000014
基磺酸盐、
Figure FDA0003748004080000015
基羧酸盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的两性离子发光聚合物纳米颗粒，其中所述无规共聚物为基于甲基丙烯酸(C1至C6)烷基酯的聚合物，并且所述无规共聚物包含：
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-0摩尔％至5摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是适合被天然或合成的生物学上感兴趣的分子功能化的反应性基团，
-60摩尔％至95摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是(C1至C6)烷基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的两性离子发光聚合物纳米颗粒，其中纳米颗粒包含任选的带有反离子的荧光染料，所述染料和所述反离子被包裹在纳米颗粒内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的两性离子发光聚合物纳米颗粒，其中荧光染料选自罗丹明衍生物或花青衍生物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的两性离子发光聚合物纳米颗粒，其中纳米颗粒的直径为5nm至200nm，特别是5nm至150nm，更特别是5nm至100nm，还更特别是5nm至50nm，还更特别是7nm至30nm，还更特别是7nm至20nm。
8.一种包含至少一种无规共聚物的功能化两性离子发光聚合物纳米颗粒，所述无规共聚物包含:
-0.5摩尔％至20摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是选自膦酸根、磺酸根和羧酸根的带负电荷的基团，
-3摩尔％至30摩尔％，特别是5摩尔％至20摩尔％，更特别是7摩尔％至17摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是两性离子基团，
-高于0摩尔％但是低于5摩尔％或等于5摩尔％具有侧基的重复单元，该侧基是与聚合物的链共价结合的天然或合成的生物学上感兴趣的分子，
-60摩尔％至95摩尔％的具有侧基的重复单元，该侧基是疏水基团。
9.根据权利要求8所述的功能化两性离子发光聚合物纳米颗粒，其中所述天然或合成的生物学上感兴趣的分子选自抗体、抗体片段、肽、适配体、寡核苷酸、毒素或化学药物。
10.根据权利要求8或9所述的功能化两性离子发光聚合物纳米颗粒，其用作造影剂、诊断剂或医学显像剂。
11.一种通过根据权利要求8或9所述的两性离子功能化的负载荧光染料的聚合物纳米颗粒在体外或体内检测或追踪靶生物分子的方法。
12.根据权利要求11所述的方法，其用于在样本中体外检测或追踪靶生物分子，特别是抗原。
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