CN104395306B - 作为生物分子的标记染料的吲哚衍生物 - Google Patents
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Abstract
用作具有与已知荧光化合物相当的特性的标记的吲哚衍生物。该化合物可以与用于生物成像和分析的蛋白质和核酸缀合。提供了所述化合物的合成、缀合化合物的形成和用途以及它们各自的非限制性实例。
Description
本申请要求2012年3月2日提交的序列号为61/606,210和2012年10月26日提交的序列号为61/718,805的待审美国申请的优先权，通过参考将它们各自明确、完整地引入本文。
公开了可用作具有与已知荧光化合物相当的特性的标记物的化合物。该化合物可以与蛋白质和核酸分子缀合以便进行生物成像和分析。公开了所述化合物的合成、缀合化合物的形成和用途和以及它们各自具体的非限制性实例。
与生物分子(例如抗原、抗体、具有相应互补种类的DNA-片段，所述互补种类用于体外和体内测定酶动力学、受体-配体相互作用、核酸杂交动力学等)反应的化合物(被称作标记物或染料)可用于例如受体和药物的药理学表征、结合数据等。化合物例如呫吨盐(美国专利No.5,846,737)和/或菁蓝类(美国专利No.5,627,027)用于这类应用，但由于其π-系统的平面性，它们聚集并且形成二聚体，尤其是在水溶液中。亲水性不足的化合物与不同表面发生非特异性相互作用，导致在尝试纯化相应的缀合物时产生问题，以及不令人满意的信噪比。
针对通过引入增加化合物亲水性的取代基来减少不期望的特性进行了尝试。例如，已经将磺酸官能取代基引入菁蓝发色团。美国专利No.6,083,485(Licha)以及美国专利Nos.6,977,305和6,974,873(Molecular Probes)公开了菁蓝化合物，其在被ω-羧基烷基官能取代的末端吲哚杂环的3-位上具有常用的甲基之一，且其中先前存在的(例如在Cy3或Cy5上)N-烷基或N-ω-羧基烷基官能被N-ω-烷基磺酸官能替代。WO05/044923公开了在被ω-羧基烷基官能取代的末端吲哚杂环的3-位上具有常用的甲基取代基的菁蓝化合物。在这些公开文献中，具有多于2个的磺酸官能取代基的菁蓝化合物显示比美国专利No.5,627,027中所述菁蓝化合物(Cy3，Cy5)更高的溶解度和相应更低的二聚体形成倾向。
所公开的菁蓝化合物可用作光学，尤其是荧光光学、测定和检测方法中的标记物。所述化合物具有高亲水性、高摩尔吸光度、高对光稳定性和高贮存稳定性。这些化合物可以被紫外线(UV)、可见光和近红外(NIR)光谱区中的单色(例如激光、激光二极管)或多色(例如白光源)光激发。
典型的应用方法基于所述化合物与生物分子例如蛋白质(例如抗原、抗体等)、具有相应互补种类的DNA和/或RNA片段等的反应。因此，除了其它实施方案以外，所述化合物还可用于体外和/或体内测定酶动力学、受体-配体相互作用和核酸杂交动力学。所述化合物可用于受体和/或药物的药理学表征。应用包括，但不限于在药物、药剂、生物科学、材料科学、环境控制、天然存在的有机和无机微量样品的检测等。
将如下命名法用于描述实施方案：550化合物1/X、550化合物2/X、550化合物3/X、550化合物4/X、550化合物5/X、550化合物6/X、650化合物1/X、650化合物2/X、650化合物3/X、650化合物4/X、650化合物5/X、650化合物6/X、755化合物1/X、755化合物2/X、755化合物3/X、755化合物4/X、755化合物5/X、755化合物6/X，其中550、650和755化合物分别包含3个碳、5个碳和7个碳原子的多次甲基链；第一个数字是吲哚N上乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇(本文将其共同称作PEG)的长度，例如1是吲哚N上的乙二醇(PEG1)，2是上吲哚N的二甘醇(PEG2)，3是吲哚N上的(聚)乙二醇(聚＝3，PEG3)，4是吲哚N上的(聚)乙二醇(聚＝4，PEG4)，5是吲哚N上的(聚)乙二醇(聚＝5，PEG5)，6是吲哚N上的(聚)乙二醇(聚＝6，PEG6)；并且X是所述化合物上PEG基团的总数。例如，650化合物4/4包含吲哚N上的PEG4和该化合物上总计4个PEG基团。
在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在一个杂环的N-位上具有乙二醇、二甘醇或乙二醇聚合物(即聚乙二醇，缩写为PEG)，而另一个杂环在N-位上具有用于使所述化合物与生物分子缀合的官能团，以及该菁蓝化合物的另一个位置上的乙二醇、二甘醇或乙二醇聚合物(即聚乙二醇，缩写为PEG)。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物的任意位置上具有至少一个磺基和/或磺烷基。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物的任意位置上具有磺酰胺和/或羧酰胺，其包含直接或间接连接至所述化合物的乙二醇基或乙二醇聚合物(即聚乙二醇，缩写为PEG)。间接连接表示使用连接基，直接连接表示没有这种连接基。连接基可以是任意部分。
在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在一个杂环的N-位上具有乙二醇、二甘醇或乙二醇聚合物(即聚乙二醇，缩写为PEG)，而另一个杂环在N-位上具有乙二醇、二甘醇或乙二醇聚合物(即聚乙二醇，缩写为PEG)和用于使所述化合物与生物分子缀合的官能团，以及苯并菁蓝化合物的另一个位置上的乙二醇基或乙二醇聚合物(即聚乙二醇，缩写为PEG)。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物的任意位置上具有至少一个磺基和/或磺烷基。在一个实施方案中，所述菁蓝化合物在该化合物的任意位置上具有磺酰胺和/或羧酰胺，其包含直接或间接连接至所述化合物的乙二醇、二甘醇或乙二醇聚合物(即聚乙二醇，缩写为PEG)。间接连接表示使用连接基，直接连接表示没有这种连接基。连接基可以是任意部分。
附图简述
图1A-C显示化合物和缀合的化合物的最大吸收。
图2显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图3显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图4显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图5显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图6显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图7显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图8显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图9显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的荧光板功能测定结果。
图10A-B显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的总体未结合的荧光强度的平均值。
图11A-B显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的总体未结合的荧光强度的平均值。
图12A-B显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的总体未结合的荧光强度的平均值。
图13A-B显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的总体未结合的荧光强度的平均值。
图14A-E显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的免疫荧光测定结果。
图15显示表示为荧光强度的图14的免疫荧光测定结果。
图16显示表示为信号-背景比率的图14的免疫荧光测定结果。
图17A-D显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的免疫荧光测定结果。
图18显示表示为荧光强度的图17的免疫荧光测定结果。
图19显示表示为信号-背景比率的图17的免疫荧光测定结果。
图20A-D显示在一个实施方案中使用本发明化合物和商业染料的免疫荧光测定结果。
图21显示表示为荧光强度的图20的免疫荧光测定结果。
图22显示表示为信号-背景比率的图20的免疫荧光测定结果。
除非另有注明，否则对通式(例如下文各自描述的I、II、III、IV、V和VI)的提及包括它们各自的a、b、c等结构。
在一个实施方案中，所述化合物是根据通式Ia的化合物，其中“a”表示所述链从右侧吲哚N开始终止于COX：
或通式Ib，其中“b”表示所述链从右侧吲哚N开始终止于OH：
其中R1和R2各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团、PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH、CO-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；o是0～12的整数，包含端值本身；且n是1～3的整数，包含端值本身；条件是R1和R2中的至少一个包含PEG基团。
在一个实施方案中，PEG基团选自-C-C-O-C(带有末端甲基的乙二醇)、-C-C-O-C-C-O-C(带有末端甲基的二甘醇)、-C-C-O-C-C-O-C-C-O-C(带有末端甲基的(聚)乙二醇(3))、-C-C-O-C-C-O-C-C-O-C-C-O-C(带有末端甲基的(聚)乙二醇(4))、-C-C-O-C-C-O-C-C-O-C-C-O-C-C-O-C(带有末端甲基的(聚)乙二醇(5))或C-C-O-C-C-O-C-C-O-C-C-O-C-C-C-O-C-C-O-C(带有末端甲基的(聚)乙二醇(6))。在一个实施方案中，PEG基团P可以是未封端的，例如没有末端甲基，或可以被不是甲基的原子或基团封端。在一个实施方案中，PEG基团P终止于Z基团，其中Z选自H、CH3、CH3基团、烷基或杂烷基。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是甲基，R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1和R2是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式I，其中R1是磺烷基，R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是3。
在一个实施方案中，提供了分离的对映体混合物，其选自如下所示的通式Ia的非对映异构体Ia：
如下所示的通式Ia的非对映异构体Ib：
如下所示的通式Ib的非对映异构体Ic：
或如下所示的通式Ib的非对映异构体Id：
其中R1和R2各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH、CO-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自-H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH,-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；o是0～12的整数，包含端值本身；且n是1～3的整数，包含端值本身；条件是R1和R2中的至少一个包含PEG基团。
在一个实施方案中，所述化合物具有通式IIa，其中“a”表示所述链从右侧吲哚N开始终止于COX：
或通式IIb，其中“b”表示来自右侧的吲哚N的链终止于COH：
其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；R7和R8各自相同或不同且独立地选自H；SO3；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH、CO-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS,-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；o是0～12的整数，包含端值本身；且n是1～3的整数，包含端值本身；条件是R1、R2、R5、R6、R7和R8中的至少一个包含PEG基团。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R1、R5和R6是甲基，R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-L-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；o是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式II，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；o是3；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物具有通式IIIa，其中“a”表示所述链从右侧吲哚N开始终止于COX：
或通式IIIb，其中“b”表示所述链从右侧吲哚N开始终止于COH：
其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；R7和R8各自相同或不同且独立地选自H；SO3；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH、O-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑,-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；p是1～6的整数，包含端值本身；且n是1～3的整数，包含端值本身；且R1、R2、R5、R6、R7和R8中的至少一个包含PEG基团。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R1、R5和R6是甲基；R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7和R8是磺基；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是磺酰胺-SO2NH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是1。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是1。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是2。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是2。
在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是0；p是1；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是1；p是2；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是2；p是3；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是3；p是4；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是4；p是5；且n是3。在一个实施方案中，所述化合物是通式III，其中R5和R6是甲基；R1和R2是PEG基团；R7是磺基；R8是羧酰胺基-CONH-P，其中P是PEG基团；X是-OH、-NHS、-O-TFP或-NR-L-马来酰亚胺；m是5；p是6；且n是3。
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物1/2
550化合物1/2(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-2-((1E,3E)-3-(1-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)丙-1-烯基)-3-甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含乙二醇，即甲基化乙二醇，如上述结构中所示，并且乙二醇可以以缩写形式表示为-[C-C-O]1-，其在上下文中通用。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的乙二醇基、二甘醇基或(聚)乙二醇基末端(在本申请中将它们共同称作未保护的PEG末端)上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。
在例如用于功能性测定的实施方案中，活化本发明化合物。化合物的活化添加了化学部分，使得该化合物为可以与生物部分缀合的形式。用于活化的化学部分的实例如下参照活化550化合物1所述，但本领域技术人员理解活化不限于这些实例。被活化的化合物的一个非限制性实例是550化合物1/2的NHS-酯，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物1/2的NHS-酯，其中，根据通式I，o是1，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物1/2的NHS-酯，其中，根据通式I，o是5，如下所示：
根据式III，其中m＝1，p＝1的550化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝2的550化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝3的550化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝4的550化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝5的550化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝6的550化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝1的550化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝2的550化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝3的550化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝1的550化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III的其中m＝3和p＝2的550化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝3的550化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝4，p＝1的550化合物4/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝5，p＝1的550化合物5/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝6，p＝1的550化合物6/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
活化的550化合物1/2的一个非限制性实例是550化合物1的四氟苯基(TFP)-酯形式，如下所示：
活化的550化合物1/2的一个非限制性实例是550化合物1的磺基四氟苯基(STP)-酯形式，如下所示：
活化的550化合物1/2的一个非限制性实例是550化合物1的酰肼形式，如下所示：
活化的550化合物1/2的一个非限制性实例是550化合物1的马来酰亚胺形式，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物2/2
550化合物2/2(1-(5-羧基戊基)-2-((1E,3E)-3-(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)丙-1-烯基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含二甘醇。具有上下文中通用的缩写标记所示的二甘醇的550化合物2/2表示如下结构。
乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化550化合物2/2，它的一个非限制性实例是550化合物2/2的NHS-酯形式，如下所示。
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物3/2
550化合物3/2(1-(5-羧基戊基)-2-((1E,3E)-3-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)丙-1-烯基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。具有上下文中通用的缩写标记所示的(聚)乙二醇的550化合物3/2表示如下结构。
乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化550化合物2/2。
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物4/2
550化合物4/2(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-2-((1E,3E)-3-(3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)-1-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)二氢吲哚-2-亚基)丙-1-烯基)-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。具有上下文中通用的缩写标记所示的(聚)乙二醇的550化合物4/2表示如下结构。
乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化550化合物4/2。
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物5/2
550化合物5/2(2-((1E,3E)-3-(1-(2,5,8,11,14-五氧杂十六烷-16-基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)丙-1-烯基)-1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。具有上下文中通用的缩写标记所示的(聚)乙二醇的550化合物5/2表示如下结构。
乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化550化合物5/2。
在一个实施方案中，所述化合物是550化合物6/2
550化合物6/2(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-2-((1E,3E)-3-(3-甲基-1-(2,5,8,11,14,17-六氧杂十九烷-19-基)-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)丙-1-烯基)-3H-吲哚5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。具有上下文中通用的缩写标记所示的(聚)乙二醇的550化合物6/2表示如下结构。
乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化550化合物6/2。
在实施方案中，磺化程度是可变的，例如改变化合物的亲水性或疏水性程度。一个非限制性实例是如下所示的550化合物1/2的一磺酸盐形式，但应理解，单个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的550化合物1/2的二磺酸盐形式，但应理解，两个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的550化合物1/2的三磺酸盐形式，但应理解，三个磺基各自可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的550化合物1/2的四磺酸盐形式，但应理解，四个磺基各自可以位于所述位置的任意位置上：
在实施方案中，所述化合物包含一个或多个多次甲基连接基的取代。在一个实施方案中，所述化合物具有：通式IVa，其中“a”表示左侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，且右侧吲哚N上的链终止于COX：
通式IVb，其中“b”表示左侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，且右侧吲哚N上的链终止于COH：
通式IVc，其中“c”表示左侧和右侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，且右侧吲哚N上的链终止于COX：
或通式IVd，其中“d”表示左侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，且右侧吲哚N上的链终止于COH：
其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；杂脂族基团带有末端的SO3、PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；R7和R8各自相同或不同且独立地选自H；SO3；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z或羧酰胺基-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH、CO-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自H，脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；p是1～6的整数，包含端值本身；R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团、杂脂族基团或PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4使用选自-(CH2)q-、-(CH2)qO(CH2)q’-、-(CH2)qS(CH2)q’-、-(CH2)qCH＝CH-、-OCH＝CH-的二价结构元件结合，其中q和q’各自相同或不同且是2～6的整数，包含端值本身；Y选自氢、烷基、磺烷基、氟、氯、溴、取代或未取代的芳基-、苯氧基-或苯巯基官能团；并且Y选自氢、烷基、磺烷基、氟、氯、溴和PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；条件是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8中的至少一个包含PEG基团。
在通式IV的化合物的一个实施方案中，其中R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团或杂脂族基团，或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4直接结合或使用选自-(CH2)q-和CH＝CH的二价结构元件结合，其中q是1～2的整数，包含端值本身，形成3-、4-或5-元环。
一个非限制性实例是550化合物1/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是550化合物2/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例550化合物3/2是的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是550化合物4/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是550化合物5/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是550化合物6/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是具有如对通式IV所述乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇的550的被取代的多次甲基形式，例如如下所示的化合物：
在实施方案中，除非有具体定义，否则共同称作PEG基团的乙二醇基、二甘醇基和/或(聚)乙二醇基还可以存在于其它位置上，除了这些基团存在于吲哚N原子上。
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R1是羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R2是羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R1和R2均是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R1和R2均是用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R1和R2均是用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R1和R2均是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式III的550化合物4/4，其中R1和R2均是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是磺基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式III的550化合物4/4，其中R1和R2均是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是H，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R1和R2均是用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R1和R2均是用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R8是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R8是磺酰胺-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R8是羧酰胺-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R7是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R7是磺酰胺基-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/2，其中R7是羧酰胺基-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R7和R8均为用甲基封端的是乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R7和R8均为磺酰胺基-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的550化合物1/3，其中R7和R8均为羧酰胺基-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物1/2
650化合物1/2((2-((1E,3E,5E)-5-(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根二氢吲哚-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-1-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚-5-磺酸三钠盐)在左侧杂环的吲哚N上包含乙二醇，即甲基化乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端(即未保护的乙二醇基、二甘醇基或(聚)乙二醇基)。添加甲基醚提供了终止保护并且防止了于亲电子反应基团反应。
在例如用于功能性测定的实施方案中，活化本发明化合物。化合物的活化添加了化学部分，使得该化合物是可以与生物部分缀合的形式。用于活化的化学部分的实例如下参照650化合物1活化所述，但本领域技术人员理解，活化不限于这些实例。活化化合物的一个非限制性实例是650化合物1/2的NHS-酯，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物1/2的NHS-酯，其中，根据通式I，o是1，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物1/2的NHS-酯，其中，根据通式I，o是5，如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝1的650化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝2的650化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝3的650化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝4的650化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝5的650化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝6的650化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝1的650化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝2的650化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝3的650化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝1的650化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝2的650化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝3的650化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝4，p＝1的650化合物4/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝5，p＝1的650化合物5/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝6，p＝1的650化合物6/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
活化的650化合物1/2的NHS-酯的一个非限制性实例是650化合物1/2的四氟苯基(TFP)-酯，如下所示：
活化的650化合物1/2的NHS-酯的一个非限制性实例是650化合物1/2的磺基四氟苯基(STP)-酯，如下所示：
活化的650化合物1/2的NHS-酯的一个非限制性实例是650化合物1的酰肼，如下所示：
活化的650化合物1/2的NHS-酯的一个非限制性实例是650化合物1的马来酰亚胺，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物2/2
650化合物2/2(2-((1E,3E,5E)-5-(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根二氢吲哚-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-3-甲基-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚5-磺酸三钠盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化650化合物2/2，它的一个非限制性实例是如下所示的650化合物2/2的NHS-酯形式。
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物3/2
650化合物3/2(2-((1E,3E,5E)-5-(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根二氢吲哚-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲基-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚-5-磺酸三钠盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化650化合物3/2，它的一个非限制性实例是如下所示的650化合物3/2的NHS-酯形式。
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物4/2
650化合物4/2(2-((1E,3E,5E)-5-(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根二氢吲哚-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-3-甲基-3-(3-磺酸根丙基)-1-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化650化合物4/2。
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物5/2
650化合物5/2(2-((1E,3E,5E)-5-(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根二氢吲哚-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-1-(2,5,8,11,14-五氧杂十六烷-16-基)-3-甲基-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化650化合物5/2。
在一个实施方案中，所述化合物是650化合物6/2
650化合物6/2(2-((1E,3E,5E)-5-(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根二氢吲哚-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-3-甲基-1-(2,5,8,11,14,17-六氧杂十九烷-19-基)-3-(3-磺酸根丙基)-3H-吲哚5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化650化合物6/2。
在实施方案中，所述化合物包含一个或多个多次甲基连接基的取代。在一个实施方案中，所述化合物具有通式Va
通式Vb
通式Vc
或通式Vd
其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；R7和R8各自相同或不同且独立地选自H；SO3；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z或羧酰胺基-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH，CO-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；p是1～6的整数，包含端值本身；R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团、杂脂族基团或PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4使用选自-(CH2)q-、-(CH2)qO(CH2)q’-、-(CH2)qS(CH2)q’-、-(CH2)qCH＝CH-、-OCH＝CH-的二价结构元件结合，其中q和q’各自相同或不同并且是2～6的整数，包含端值本身；Y选自氢、烷基、磺烷基、氟、氯、溴和PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；条件是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8中的至少一个包含PEG基团。
在通式V化合物的一个实施方案中，其中R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团或杂脂族基团，或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4直接结合或使用选自-(CH2)q-和CH＝CH的二价结构元件结合，其中q是1～2的整数，包含端值本身，形成3-、4-或5-元环。
在一个实施方案中，提供了分离的对映体混合物，其选自通式Va的非对映异构体Ia
通式Va的非对映异构体Ib
通式Vb的非对映异构体Ic
或通式Vb的非对映异构体
其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；R7和R8各自相同或不同且独立地选自H；SO3；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z或羧酰胺基-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH、CO-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；o是0～12的整数，包含端值本身；R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团、杂脂族基团或PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4使用选自-(CH2)q-、-(CH2)qO(CH2)q’-、-(CH2)qS(CH2)q’-、-(CH2)qCH＝CH-,-OCH＝CH-的二价结构元件结合，其中q和q’各自相同或不同并且是2～6的整数，包含端值本身；Y选自氢、烷基、磺烷基、氟、氯、溴和PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；条件是R1、R2、R3和R4中的至少一个包含PEG基团。
在一个实施方案中，通式V的化合物，其中R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团或杂脂族基团，或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4直接结合或使用选自-(CH2)q-和CH＝CH的二价结构元件结合，其中q是1～2的整数，包含端值本身，形成3-、4-或5-元环。
一个非限制性实例是650化合物1/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物2/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物3/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物4/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物5/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物6/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是具有如对通式V所述的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇的650化合物1/3的被取代的多次甲基形式，例如如下所示的化合物：
一个非限制性实例是650化合物1/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物2/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物3/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物4/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物5/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是650化合物6/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是具有如对通式V所述的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇的650化合物1/3的被取代的多次甲基形式，例如如下所示的化合物：
在实施方案中，磺化程度是可变的，例如改变化合物的亲水性或疏水性程度。一个非限制性实例是如下所示的650化合物1/2的一磺酸根形式，但应理解，单个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的650化合物1/2的二磺酸根形式，但应理解，两个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的650化合物1/2的三磺酸根形式，但应理解，三个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的650化合物1/2的四磺酸根形式，但应理解，四个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
在不同的实施方案中，除非有具体定义，否则共同称作PEG基团的乙二醇基、二甘醇基和/或(聚)乙二醇基还可以存在于其它位置上，除了这些基团存在于吲哚结构N原子上以外。
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R2是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R2是用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R1是用甲基封端的二甘醇基，其中R2是羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式III的650化合物4/4，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是磺基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式III的650化合物4/4(V19-03005)，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是磺基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式III的650化合物4/4，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是H，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式III的650化合物4/4，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是H，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R1和R2均为羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R8是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R8是磺酰胺-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R8是羧酰胺-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R7是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R7是磺酰胺基-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/2，其中R7是羧酰胺基-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R7和R8均为用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R7和R8均为磺酰胺基-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的650化合物1/3，其中R7和R8均为羧酰胺基-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物1/2
755化合物1/2(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-3-甲基-3H-吲哚5-磺酸三钠盐)在左侧杂环的吲哚N上包含乙二醇，即甲基化乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端(即未保护的乙二醇基、二甘醇基或(聚)乙二醇基末端)上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。
在例如用于功能性测定的实施方案中，活化本发明化合物。化合物的活化添加了化学部分，使得该化合物是可以缀合生物部分的形式。用于活化的化学部分的实例如下参照755化合物1/2活化所述，但本领域技术人员理解，活化不限于这些实例。活化化合物的一个非限制性实例是755化合物1/2的NHS-酯，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物1/2的NHS-酯，其中，根据通式I，o是1，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物1/2的NHS-酯，其中，根据通式I，o是5，如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝1的755化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝2的755化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝3的755化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝4的755化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝5的755化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝1，p＝6的755化合物1/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝1的755化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝2的755化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝2，p＝3的755化合物2/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝1的755化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝2的755化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝3，p＝3的755化合物3/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝4，p＝1的755化合物4/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝5，p＝1的755化合物5/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
根据通式III，其中m＝6，p＝1的755化合物6/3的NHS-酯的一个非限制性实例如下所示：
活化的755化合物1/2的一个非限制性实例是755化合物1/2的四氟苯基(TFP)-酯形式，如下所示：
活化的755化合物1/2的一个非限制性实例是755化合物1/2的磺基四氟苯基(STP)-酯形式，如下所示：
活化的755化合物1/2的一个非限制性实例是755化合物1/2的酰肼形式，如下所示：
活化的755化合物1/2的一个非限制性实例是755化合物1/2的马来酰亚胺形式，如下所示：
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物2/2
755化合物2/2(1-(5-羧基戊基)-2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-3H-吲哚5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。对于功能性测定，如上所述活化755化合物2/2，它的一个非限制性实例是755化合物2/2的NHS-酯形式，如下所示。
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物3/2
755化合物3/2(1-(5-羧基戊基)-2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化755化合物3/2，它的一个非限制性实例是如下所示的755化合物3/2的NHS-酯形式。
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物4/2
755化合物4/2(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-2-((1E,3E,5E,7E)-7-(3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)-1-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)二氢吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化755化合物3/2。
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物5/2
755化合物5/2(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1-(2,5,8,11,14-五氧杂十六烷-16-基)-3-甲基-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化755化合物5/2。
在一个实施方案中，所述化合物是755化合物6/2
755化合物6/2(1-(5-羧基戊基)-3-(2-甲氧基乙基)-3-甲基-2-((1E,3E,5E,7E)-7-(3-甲基-1-(2,5,8,11,14,17-六氧杂十九烷-19-基)-5-磺酸根-3-(3-磺酸根丙基)二氢吲哚-2-亚基)庚-1,3,5-三烯基)-3H-吲哚-5-磺酸盐)在左侧杂环的吲哚N上包含(聚)乙二醇。乙二醇上的甲基防止末端-OH氧化。已知氧化随时间发生在未保护的PEG末端上。添加甲基醚提供了这种保护并且防止了与亲电子反应基团反应。对于功能性测定，如上所述活化755化合物6/2。
在实施方案中，所述化合物包含一个或多个多次甲基连接基的取代。在一个实施方案中，所述化合物具有通式VIa，其中“a”表示左侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，而右侧吲哚N上的链终止于COX：
通式VIb，其中“b”表示左侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，而右侧吲哚N上的链终止于COH：
通式VIc，其中“c”表示左侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，而右侧吲哚N上的链终止于COX：
或通式VId，其中“d”表示左侧和右侧吲哚N上的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇基，而右侧吲哚N上的链终止COH：
其中R1、R2、R5和R6各自相同或不同且独立地选自脂族基团；杂脂族基团；磺烷基；带有末端SO3的杂脂族基团；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-L-SO2NH-P-L-Z和羧酰胺基-L-CONH-P-L-Z；R7和R8各自相同或不同且独立地选自H；SO3；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；磺酰胺基-SO2NH-P-L-Z或羧酰胺基-CONH-P-L-Z；其中L选自二价线性(-(CH2)o-，o＝0～15)、交叉或环状烷基，其可以被至少一个选自氧、取代的氮和/或硫的原子取代；其中Z选自H、CH3、烷基、杂烷基、NH2、-COO-、-COOH、-COSH、CO-NH-NH2、-COF、-COCl、-COBr、-COI、-COO-Su(琥珀酰亚胺基/磺基-琥珀酰亚胺基)、-COO-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-TFP(2,3,5,6-四氟苯基)、-COO-苯并三唑、-CO-苯并三唑、-CONR'-CO-CH2-I、-CONR'R″、-CONR'-生物分子、-CONR'-L-COO-、-CONR'-L-COOH、-CONR'-L-COO-Su、-CONR'-L-COO-STP、-CONR'-L-COO-TFP、-CONR'-L-CONR″2、-CONR'-L-CO-生物分子、-CONR'-L-CO-NH-NH2、-CONR'-L-OH、-CONR'-L-O-亚磷酰胺、-CONR'-L-CHO、-CONR'-L-马来酰亚胺和-CONR'-L-NH-CO-CH2-I；R'和R″选自H、脂族基团和杂脂族基团，且所述生物分子是蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、生物素或半抗原；X选自-OH、-SH、-NH2、-NH-NH2、-F、-Cl、-Br、I、-NHS(羟基琥珀酰亚胺基/磺基琥珀酰亚胺基)、-O-TFP(2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-STP(4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基)、-O-苯并三唑、-苯并三唑、-NR-L-OH、-NR-L-O-亚磷酰胺、-NR-L-SH、-NR-L-NH2、-NR-L-NH-NH2、-NR-L-CO2H、-NR-L-CO-NHS、-NR-L-CO-STP、-NR-L-CO-TFP、-NR-L-CO-苯并三唑、-NR-L-CHO、-NR-L-马来酰亚胺和-NR-L-NH-CO-CH2-I，其中R是-H或脂族基团或杂脂族基团；Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是0～5的整数，包含端值本身；p是1～6的整数，包含端值本身；R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团、杂脂族基团或PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4使用选自-(CH2)q-、-(CH2)qO(CH2)q’-、-(CH2)qS(CH2)q’-、-(CH2)qCH＝CH-、-OCH＝CH-的二价结构元件结合，其中q和q’各自相同或不同且是2～6的整数，包含端值本身；Y选自氢；烷基；磺烷基；氟；氯；溴；PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基、二甘醇基和(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；以及含氧的基团ORPM，其中RPM选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基，其中所述基团可以被至少一个羟基、磺基、羧基和/或氨基取代；条件是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8中的至少一个包含PEG基团。
在一个实施方案中，通式VI化合物，其中R3和R4各自相同或不同且独立地是氢、脂族基团或杂脂族基团，或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4直接结合或使用选自-(CH2)q-和CH＝CH的二价结构元件结合，其中q是1～2的整数，包含端值本身，形成3-、4-或5-元环。
在一个实施方案中，通式VI化合物，其中或R3和R4一起形成环状结构，其中R3和R4使用-(CH2)q的二价结构元件结合，其中q是3，形成6-元环，Y是ORPM，其中RPM是取代的6-元芳基，其中所述取代基是磺基。
一个非限制性实例是755化合物1/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是755化合物2/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是755化合物3/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是755化合物4/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是755化合物5/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是755化合物6/2的被取代的多次甲基形式，如下所示：
一个非限制性实例是具有如对通式VI所述的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇的755化合物1/3的被取代的多次甲基形式，例如如下所示的化合物：
一个非限制性实例是具有如对通式VI所述的乙二醇、二甘醇或(聚)乙二醇的755化合物4/4的被取代的多次甲基形式，例如如下所示的化合物：
在实施方案中，磺化程度是可变的，例如改变化合物的亲水性或疏水性的程度。一个非限制性实例是如下所示的755化合物1/2的一磺酸根形式，但应理解，单个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的755化合物1/2的二磺酸根形式，但应理解，两个磺基可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的755化合物1/2的三磺酸根形式，但应理解，三个磺基各自可以位于所述位置的任意位置上：
一个非限制性实例是如下所示的755化合物1的四磺酸根形式，但应理解，四个磺基各自可以位于所述位置的任意位置上：
在实施方案中，除非有具体定义，否则共同称作PEG基团的乙二醇基、二甘醇基和/或(聚)乙二醇基还可以存在于其他位置上，除这些基团存在于吲哚结构N原子上以外。
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R1是羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R2是羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的二甘醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(3)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物4/4，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是磺基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物4/4，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(4)基，R7和R8是H，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(5)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为用甲基封端的(聚)乙二醇(6)基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为磺酰胺基-L-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R1和R2均为羧酰胺基-L-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R8是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R8是磺酰胺-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R8是羧酰胺-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R7是用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R7是磺酰胺基-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/2，其中R7是羧酰胺基-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R7和R8均为用甲基封端的乙二醇基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R7和R8均为磺酰胺基-SO2NH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
另外PEG取代的化合物的一个非限制性实例是根据通式II的755化合物1/3，其中R7和R8均为羧酰胺基-CONH-P-Z，其中Z是甲基，如下所示：
使用所公开的化合物被用作且可用作发色团和/或荧光团。例如，它们可以用于光学标记，因此用于定性和/或定量地检测蛋白质、核酸、寡聚体、DNA、RNA、生物细胞、脂质、单糖、寡糖和多糖、配体、受体、聚合物、药物、聚合物珠等。
包含所公开的官能团或官能基的本发明化合物可以使用本领域公知的方法合成，例如如下所述的方法，通过参考明确将全部参考文献完整地并入本文。通过亲水性基团例如磺基、羧基、羟基等基团的数量和位置改变本发明化合物的亲水性或疏水性。在实施方案中，亲水性基团的数量和位置是对称的，使得本发明菁蓝化合物的吲哚之一上的亲水性基团的数量和位置也可以在另一个吲哚上找到。在不同的实施方案中，在本发明菁蓝化合物的吲哚上各自发现至少一种亲水性基团。类似地，溶解度、缺乏聚集性、反应性、缺乏交叉反应性等受所公开的所述化合物上官能团或官能基的数量和位置影响。
在一个实施方案中，将短PEG基团添加到吲哚菁蓝化合物的相对侧和相对端上，以有效地包围分子的疏水性核心结构。在另一个实施方案中，将磺酸根基团沿相对侧和相对端上的短PEG链的对称布局添加到吲哚菁蓝染料的外部苯环上。
添加PEG1-6(如果在以策略方式包围核心染料结构的适合位置上)对这些染料在生物学应用中的亲水性和性能表现具有显著的有益作用。以前使染料更具有亲水性和对生物分子的“粘性”更小的尝试包括添加多个磺酸根或更长的PEG链至染料分子上的一些位置。然而，添加过多的磺酸根，虽然对染料的相对水溶性具有增加的作用，但由于与带正电荷的生物分子，特别是蛋白质的负电荷相互作用而可能产生不期望的非特异性结合特性。此外，以前通过添加更长的PEG链至染料上的一个或两个位置上使染料更具有水溶性的尝试具有显著增加染料的分子量的有害作用，可能阻止染料标记的抗体和其它染料标记的靶向分子有效地结合内部分子靶标，同时也无法完全包围和掩蔽疏水性染料核心结构。本发明人已经发现，通过在染料结构上的关键位置使用短PEG链修饰，所标记的分子的总分子大小可以受到限制，同时因掩蔽了疏水性染料核心非特异性得到显著地减少。
在一个实施方案中，PEG1-6基团被添加到吲哚菁蓝化合物的相对侧和相对端，以有效地包围该分子的疏水性核心结构。在另一个实施方案中，磺酸根基团沿相对侧和相对端上的短PEG链的对称布局被添加到吲哚菁蓝染料的外部苯环上。
没有另外官能团的核心吲哚菁蓝结构以及其合成描述在的美国专利No.1,524,791和BP434875中，且包括3-、5-和7-元多次甲基链。
已描述了核心吲哚菁蓝结构的大量修饰物的合成。这类修饰提供了不同的能团，例如N-异硫氰酸基-烷基官能化和芳族-羧基烷基官能化的吲哚菁蓝类的合成描述在美国专利No.5,627,027；6,048,982；4,981,977；美国专利申请公开No.2006/0199949；Southwick，Anal.Chem.67(1995)1742-48)中。
具有一个或两个N-羧基烷基官能团的吲哚菁蓝类的合成描述在美国专利No.5,268,486；5,486,616；5,569,587；5,569,766；JP03217837中。
包含C-羧基烷基的吲哚菁蓝类的合成描述在JP05-313304；美国专利申请公开Nos.2006/0099638；2006/0004188；2002/0077487；2002/0064794；美国专利No.6,977,305和6,974,873中。
具有N-磺烷基和C-磺烷基的吲哚菁蓝类的合成描述在JP05-313304；WO2005/044923；美国专利申请公开No.2007/0203343中。
具有混合的C-羧基烷基和C-磺烷基的吲哚菁蓝类的合成描述在EP1792949和美国专利No.7,745,640中。
具有包含PEG的N-羧基烷基间隔基的吲哚菁蓝类的合成描述在美国专利No.6,939,532中。
使用氨基官能化的PEG-烷基链以及N-和C-取代的PEG-烷基链对N-羧基烷基的官能化描述在美国专利申请公开No.2009/0305410中。
吲哚菁蓝类的不同多次甲基桥取代物和其它官能化物的合成描述在下列文献中：Heterocycle Polymethine Dyes:Synthesis，Properties andApplications，(2008)Springer-Verlag，Berlin Heidelberg；Gragg，"Synthesis ofNear-Infrared Heptamethine Cyanine Dyes"(2010).Chemistry Theses.28页.http://digitalarchive.gsu.edu/chemistry_theses/28；Patonay等人2004)NoncovalentLabeling of biological moleculars with Red and Near-Infrared Dyes，Molecules9(2004)40-49；以及美国专利No.7,172,907。
在一个实施方案中，通过本领域技术人员已知的两种不同取代的被(多)次甲基连接基或桥例如C1、C3或C5分隔开的吲哚杂环的缩合反应合成所述化合物。其它合成方法是可能的。仅仅作为一个实例，首先使吲哚杂环之一与C1、C3或C5连接基反应。分离1:1的缩合产物，然后使其与第二个吲哚杂环缩合，得到菁蓝化合物。使吲哚杂环反应的顺序无关紧要。因此，制备了在用于固定的活性基团的总电荷和特异性/反应性方面不同的多个不同官能化的强亲水性的非对映异构体化合物。
通过使用吲哚环的N-位置上的官能取代基使所述化合物与生物分子共价偶合制备了化合物的缀合物。用本领域技术人员公知的常规蛋白质化学反应方法活化这种官能取代基。可以将所活化的化合物转化成例如，但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯、酰氟、四氟苯基(TFP)-或磺基四氟苯基(STP)-酯、碘乙酰基、马来酰亚胺、酰肼、磺酰氯或苯基叠氮化物。制备这种化合物的方法是本领域技术人员公知的。在一个实施方案中，然后使所活化的取代基与生物分子上的氨基在缀合所期望的生物分子的条件下反应。
在一个实施方案中，可以使用碳二亚胺使所述化合物上吲哚的N-位置上未活化的羧基与胺偶合。
在一个实施方案中，化合物的N-羟基琥珀酰亚胺基酯(X＝-NHS)如下形成：将20μmol具有X＝OH(羧基烷基)的染料、8mg(40μmol)二环己基碳二亚胺和5mg(40μmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶于2ml DMF和100μl水。加入6μl(40μmol)三乙胺。将该反应混合物在室温(约20℃－约22℃)搅拌24小时，然后过滤。除去溶剂，用乙醚洗涤残余物。该反应定量地进行。
在一个实施方案中，化合物的马来酰亚胺(X＝-NH-CH2CH2-马来酰亚胺)如下形成：将20μmol具有X＝-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺-酯)的染料溶于2ml DMF和100μl水，与7.6mg(30μmol)2-马来酰亚氨基乙胺-三氟乙酸盐和5μl(30μmol)N-乙基二异丙基-胺混合。将该反应混合物在室温(约20℃－约22℃)搅拌3h。减压蒸发溶剂。用乙醚和丙酮洗涤残余物，真空干燥。该反应定量地进行。
在一个实施方案中，化合物的碘乙酰胺(X＝-NH-CH2CH2-NH-CO-CH2-I)如下形成：将20μmol具有X＝-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺-酯)的染料溶于2ml DMF和100μl水，然后添加40mg(300μmol)乙二胺二盐酸盐和26μl(150μmol)N-乙基二异丙基-胺。将该反应混合物在室温(约20℃－约22℃)搅拌3h。然后减压蒸发溶剂，将残余物溶于甲醇，通过过滤除去乙二胺二盐酸盐。减压蒸发甲醇。将残余物溶于2ml干DMF，然后添加7mg(25μmol)碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯和4μl(25μmol)N-乙基二异丙基胺。将该反应混合物在室温搅拌3h。减压蒸发溶剂，通过反相HPLC纯化残余物。
在一个实施方案中，随后可以活化羟基，例如末端羟基，得到能够与例如蛋白质和其它分子连接的反应衍生物。活化基团的实例包括甲苯磺酰氯(TsCl)、2,2,2-三氟乙磺酰氯(TrCl)、碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)、二乙烯基砜、双-环氧化合物、羰基二咪唑(CDI)、2-氟-1-甲基吡啶(FMP)和三氯-s-三嗪(TsT)。在一个实施方案中。羟基被活化成碳酸琥珀酰亚胺酯，其可与胺类反应。
所述化合物与生物分子之间的偶合可以如下进行。使所述化合物与所述生物分子在pH在pH5～pH12(包含端值本身)之间的有机或水溶液中反应。在添加所述生物分子之前，无需将该化合物溶于有机溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO)。在一个实施方案中，偶合反应在100％水溶液中进行。在一个实施方案中，偶合反应在室温(约20℃－约22℃)进行。
为了形成组合物(染料)，将至少一种生物相容性赋形剂加入到本领域技术人员已知的化合物中。赋形剂包括，但不限于缓冲剂、增溶剂、稳定剂等。
在一个实施方案中，用于进行测定方法的试剂盒包含所公开的化合物和使用该化合物进行所述方法的说明书。
所公开的活化化合物(即用反应性基团修饰的化合物)可用于使用本领域技术人员公知的方法标记大分子(例如抗体、链霉抗生物素等)，例如Hermanson，BioconjugateTechniques，第2版，London，Elsevier Inc.2008。该反应在室温(约20℃－约22℃)进行1-2h，然后通过对几次改变的磷酸盐缓冲盐水(pH7.2)透析脱盐或通过凝胶过滤纯化，以除去未反应的荧光染料。得到的化合物-生物分子缀合物用于检测例如免疫测定中的特异性蛋白质、具有凝集素糖的蛋白中的糖类、蛋白质-蛋白质相互作用、核酸中的寡核苷酸、杂交和电泳迁移位移试验(EMSA)。
得到的化合物-生物分子缀合物显示荧光特性。在该实施方案中，它们用于光学方法，包括荧光光学定性和定量测定方法。这种方法的实例包括，但不限于显微镜检查、免疫测定法、杂交方法、色谱法和电泳法、荧光共振能量转移(FRET)系统、生物发光共振能量转移(BRET)、高流通量筛选、微阵列上的受体-配体相互作用分析等。
任意实施方案中的化合物用作光学标记有机或无机生物分子的染料，其被称作识别单位。识别单位是对一类特异分子具有特异性和/或亲和力的分子。实例包括，但不限于对抗原具有亲和力的抗体、结合肽中氨基酸序列内特异性一个或多个键和/或与之反应的或与底物反应的酶、增强或抑制特异性相互作用的辅因子例如金属、结合特异性糖或糖序列(例如寡糖类、多糖类、葡聚糖类等)的凝集素、生物素结合性蛋白例如结合生物素和生物素标记的分子的抗生物素蛋白和链霉抗生物素、抗体结合蛋白例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G和蛋白质L、彼此具有亲和力的氨基酸序列或金属(例如结合镍或铜的组氨酸序列、包含磷酸的结合镓、铝的蛋白质等)、对蛋白质具有亲和力的核酸例如DNA和/或RNA寡核苷酸的特异性序列、对DNA和/或RNA具有亲和力的特异性氨基酸序列、半抗原、类胡萝卜素、激素(例如神经激素)、神经递质、生长因子、毒素、生物细胞、脂质、受体结合性药物或有机或无机聚合物载体材料、荧光蛋白例如藻胆蛋白(例如枣红蛋白(phycoethrin)、别藻蓝蛋白)等。识别单位与所公开的化合物之间的离子相互作用导致标记识别单位。可以共价结合识别单位和化合物。结果是用于使用光学方法定性或定量测定不同生物材料或其它有机或无机材料的缀合物。
本发明化合物和/或缀合物用于光学，包括荧光光学定性和/或定量测定方法，以诊断细胞的诊断特性(分子成像)、生物传感器(护理测量点)、用于研究基因组和小型化技术。显微镜检查术、细胞计量术、细胞分选、荧光相关光谱法(FCS)、超高流通量筛选(uHTS)、多色荧光原位杂交(mc-FISH)、FRET-系统、BRET-系统和微阵列(DNA芯片和蛋白质芯片)是典型的应用领域。正如本领域技术人员已知的，微阵列是栅格-样排列，其中两种以上不同分子被固定在至少一种表面上的已知预定区域中并且用于评价受体配体相互作用。正如本领域技术人员已知的，受体是天然存在的或合成的分子，其显示对指定配体的亲和力。受体可以以纯化形式或结合另一种种类的形式使用。可以使受体与结合配偶体直接或间接(例如通过偶合介体)共价或非共价偶合。受体实例包括，但不限于细胞膜受体激动剂和拮抗剂、毒素和其它毒物、病毒表位、激素(例如阿片类、类固醇)、激素受体、肽类、酶、酶底物、作为辅因子起作用的药物、凝集素、糖类、寡核苷酸、核酸、寡糖类、细胞、细胞碎片、组织碎片、蛋白质、抗体等。正如本领域技术人员已知的，配体是被一些受体识别的分子。配体实例包括，但不限于细胞膜受体的激动剂和拮抗剂、毒素和其它毒物、病毒表位、激素(例如阿片类、类固醇)、激素受体、肽类、酶、酶底物、作为辅因子起作用的药物、凝集素、糖类、寡核苷酸、核酸、寡糖类、蛋白质、抗体等。
下列非限制性实施例进一步描述所述化合物、方法、组合物、用途和实施方案。
实施例1 用于合成实施例2化合物2,3-二甲基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚-5-磺酸二钾盐和实施例8化合物1,2-二甲基-1-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-6,8-二磺酸三钾盐的4-甲基-5-氧代己烷磺酸的合成
将氢化钠(2.1g，80wt％＝69mmol)在10ml无水THF中搅拌成淤浆。将该混悬液冷却至0℃，滴加乙基-2-甲基乙酰乙酸酯(10g，69mmol)在10ml无水THF中的溶液。将该溶液在室温搅拌1h。滴加1,3-丙磺内酯(8.42g，69mmol)在10ml无水THF中的溶液。一旦添加完成，则将该溶液在40℃搅拌2h。将该溶液蒸发至干。将残余物溶于100ml水。用乙酸乙酯将水溶液萃取2次，然后加入100ml浓HCl，将该溶液回流2h。真空蒸发溶剂。通过柱色谱法纯化残余物(硅胶，甲醇/二氯甲烷)，得到4-甲基-5-氧代己烷磺酸。收率10g；MS(ESI-):193.2[M]-
实施例2 用于合成实施例3化合物1-(2-甲氧基-乙基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚和实施例4化合物1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚和实施例5化合物1-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚和实施例6化合物1-(5-羧基戊基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚的2,3-二甲基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚-5-磺酸二钾盐的合成
将10g(51mmol)4-肼基-苯磺酸和9.85g(51mmol)4-甲基-5-氧代己烷磺酸溶于50ml乙酸。将该溶液在140℃加热4h。真空蒸发溶剂。将油状残余物溶于20ml甲醇，然后加入50ml饱和KOH的2-丙醇溶液，得到黄色沉淀。过滤出固体，真空干燥。收率11g，MS(ESI-):172.5[M]2-
实施例3 用于合成550、650、755化合物1的1-(2-甲氧基-乙基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚的合成
将5g(12.4mmol)2,3-二甲基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚-5-磺酸二钾盐和5.89g(25.6mmol)2-甲氧基乙基-对-甲苯磺酸酯的混合物在氩气气氛中加热24h。通过柱色谱法纯化残余物(反相硅胶，甲醇/水，TFA)。
收率2.3g，MS(ESI-):404.1[M–H]-
实施例4 用于合成550、650、755化合物2的1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚的合成
将5g(12.4mmol)2,3-二甲基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚-5-磺酸二钾盐和7.1g(25.6mmol)[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-对-甲苯磺酸酯的混合物在氩气气氛中加热24h。通过柱色谱法纯化残余物(反相硅胶，甲醇/水，TFA)。收率2.0g.MS(ESI-):448.2[M–H]-
实施例5 用于合成550、650、755化合物3的1-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚的合成
将5g(12.8mmol)2,3-二甲基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚-5-磺酸二钾盐和8.14g(25.6mmol)[2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]对-甲苯磺酸酯的混合物在氩气气氛中加热24h。通过柱色谱法纯化残余物(反相硅胶，甲醇/水，TFA)。收率1.9g，MS(ESI-):492.1[M–H]-
实施例6 用于合成实施例7化合物1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((E)-2-苯基氨基-乙烯基)-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚和实施例8化合物1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E)-4-苯基氨基-丁-1,3-二烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和实施例9化合物1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E,5E)-6-苯基氨基-己-1,3,5-三烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚的1-(5-羧基戊基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚的合成
将5g(15.7mmol)6-肼基-萘-1,3-二磺酸和4.93g(25mmol)4-甲基-5-氧代己烷磺酸溶于50ml乙酸。将该溶液在140℃加热4h。真空蒸发溶剂。将油状残余物溶于20ml甲醇，然后加入50ml饱和KOH的2-丙醇溶液，得到黄色沉淀。过滤出固体，真空干燥。收率4.1g，MS(ESI-):158.2[M]3-
实施例7 用于合成550化合物的1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((E)-2-苯基氨基-乙烯基)-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚的合成
将0.92g(2mmol)1-(5-羧基戊基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和0.43g(2.2mmol)N,N’-二苯基甲脒的组合溶于20ml甲醇，回流搅拌4h。真空除去溶剂。用乙酸乙酯谨慎地洗涤残余物。得到深黄色固体，其在不进一步纯化的情况下被处理。
MS(ESI-):563.1[M–H]-
实施例8 用于合成650化合物的1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E)-4-苯基氨基-丁-1,3-二烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚的合成
将0.92g(2mmol)1-(5-羧基戊基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和0.57g(2.2mmol)丙二醛-二苯基亚胺-盐酸盐的组合溶于溶于10ml乙酸和10ml乙酸酐，在120℃搅拌4h。真空除去溶剂。用乙酸乙酯谨慎地洗涤残余物。得到深棕色固体，其在不进一步纯化的情况下被处理。MS(ESI-):589.2[M–H]-
实施例9 用于合成755化合物的1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E,5E)-6-苯基氨基-己-1,3,5-三烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚的合成
0.92g(2mmol)1-(5-羧基戊基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和0.63g(2.2mmol)戊烯二醛双苯胺-盐酸盐的组合溶于10ml乙酸和10ml乙酸酐，在120℃搅拌4h。真空除去溶剂。用乙酸乙酯谨慎地洗涤残余物。得到深色固体，其在不进一步纯化的情况下被处理。MS(ESI-):615.2[M–H]-
实施例10 550化合物12-{(E)-3-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-丙烯基}-1-(2-甲氧基-乙基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚三钠盐的合成
将564mg(1mmol)1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((E)-2-苯基氨基-乙烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和404mg(1mmol)1-(2-甲氧基-乙基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后加入200mg乙酸钠。将该溶液回流搅拌15min。冷却至室温后，加入20ml乙醚。通过抽吸萃取得到的沉淀(非对映异构体550化合物1(异构体1)和550化合物1(异构体2)的混合物)，用乙醚洗涤，干燥。
通过柱色谱法纯化残余物(RP-18，乙腈/水和浓HCl)，以使所述非对映异构体彼此分离。首先从柱上洗脱的非对映异构体称作非对映异构体1(550化合物1(异构体1))。第二从柱上洗脱的非对映异构体称作非对映异构体2(550化合物1(异构体2))。分离所述的非对映异构体，然后中和并蒸发。用RP-18柱、乙腈/水纯化单一非对映异构体化合物。集合相应的级分，通过蒸馏除去溶剂。高度真空干燥两种产物(非对映异构体550化合物1(异构体1)和550化合物1(异构体2))。
550化合物1(异构体1):
收率：12％
UV-vis(PBS):λmax＝557nm，λem＝572nm
MS(ESI-)[M/z]:291.2[M]3-；448.3[M+Na]2-
550化合物1(异构体2):
收率：23％
UV-vis(PBS):λmax＝557nm，λem＝572nm
MS(ESI-)[M/z]:291.1[M]3-；448.2[M+Na]2-
实施例11 550化合物22-{(E)-3-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-丙烯基}-1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚三钠盐的合成
将1mmol1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((E)-2-苯基氨基-乙烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和1mmol1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后添加200mg乙酸钠。将该溶液回流搅拌15min。冷却至室温后，加入20ml乙醚。通过抽吸萃取得到的沉淀(非对映异构体550-1化合物2和550-2化合物2的混合物)，用乙醚洗涤，干燥。
如实施例10中所述，通过柱色谱法(RP-18、乙腈/水和浓HCl)纯化残余物，由此使所述的非对映异构体彼此分离。
实施例12 550化合物32-{(E)-3-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-丙烯基}-1-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚三钠盐的合成
将1mmol1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((E)-2-苯基氨基-乙烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和1mmol1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后添加200mg乙酸钠。将该溶液回流搅拌15min。冷却至室温后，加入20ml乙醚。通过抽吸萃取得到的沉淀(非对映异构体550-1化合物2和550-2化合物2的混合物)，用乙醚洗涤，干燥。
通过柱色谱法(RP-18、乙腈/水和浓HCl)纯化残余物，如实施例10中所述，由此使所述的非对映异构体彼此分离。
实施例13 650化合物1 2-{(1E,3E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-戊-1,3-二烯基}-1-(2-甲氧基-乙基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚三钠盐的合成
将90mg(1mmol)1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E)-4-苯基氨基-丁-1,3-二烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和404mg(1mmol)1-(2-甲氧基-乙基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后加入200mg乙酸钠。将该溶液回流搅拌15min。冷却至室温后，加入20ml乙醚。通过抽吸萃取得到的沉淀(非对映异构体650化合物1(异构体1)和650化合物1(异构体2)的混合物)，用乙醚洗涤，干燥。
通过柱色谱法纯化残余物(RP-18，乙腈/水和浓HCl)，以彼此分离非对映异构体。首先从柱上洗脱的非对映异构体称作非对映异构体1(650化合物1(异构体1))。第二次从柱上洗脱的非对映异构体称作非对映异构体2(650化合物1(异构体2))。分离所述的非对映异构体，然后中和并蒸发。用RP-18柱、乙腈/水纯化单一非对映异构体化合物。集合相应的级分，通过蒸馏除去溶剂。高度真空干燥两种产物(非对映异构体650化合物1(异构体1)和650化合物1(异构体2))。
650化合物1(异构体1):
收率：11％
UV-vis(PBS):λmax＝654nm，λem＝672nm
MS(ESI-)[M/z]:299.7[M]3-；461.0[M+Na]2-
650化合物1(异构体2):
收率：24％
UV-vis(PBS):λmax＝654nm，λem＝672nm
MS(ESI-)[M/z]:299.6[M]3-；461.1[M+Na]2-
实施例14 650化合物22-{(1E,3E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-戊-1,3-二烯基}-1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚三钠盐的合成
将564mg(1mmol)1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E)-4-苯基氨基-丁-1,3-二烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和449mg(1mmol)1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后添加200mg乙酸钠。根据实施例13进行合成和后处理。
650-1化合物2:
收率:11％
UV-vis(PBS):λmax＝654nm，λem＝672nm
MS(ESI-)[M/z]:314.4[M]3-；483.0[M+Na]2-
650-2化合物2:
收率:16％
UV-vis(PBS):λmax＝654nm，λem＝672nm
MS(ESI-)[M/z]:314.5[M]3-；483.1[M+Na]2-
实施例15 650化合物3 2-{(1E,3E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-戊-1,3-二烯基}-1-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚三钠盐–650化合物3的合成
将564mg(1mmol)1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E)-4-苯基氨基-丁-1,3-二烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和493mg(1mmol)1-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后添加200mg乙酸钠。根据实施例13进行合成和后处理。
650-1化合物3:
收率：10％
UV-vis(PBS):λmax＝654nm，λem＝672nm
MS(ESI-)[M/z]:329.2[M]3-；505.0[M+Na]2-
650-2化合物3:
收率：23％
UV-vis(PBS):λmax＝654nm，λem＝672nm
MS(ESI-)[M/z]:329.1[M]3-；505.1[M+Na]2-
实施例16 755化合物1 2-{(1E,3E,5E)-7-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-庚-1,3,5-三烯基}-1-(2-甲氧基-乙基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚三钠盐的合成
将616mg(1mmol)1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E,5E)-6-苯基氨基-己-1,3,5-三烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和404mg(1mmol)1-(2-甲氧基-乙基)-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后加入200mg乙酸钠。将该溶液回流搅拌15min。冷却至室温后，加入20ml乙醚。通过抽吸萃取得到的沉淀(非对映异构体755化合物1(异构体1)和755化合物1(异构体2)的混合物)，用乙醚洗涤，干燥。
通过柱色谱法纯化残余物(RP-18，乙腈/水和浓HCl)，以使非对映异构体彼此分离。首先从柱上洗脱的非对映异构体称作非对映异构体1(755化合物1(异构体1))。第二从柱上洗脱的非对映异构体称作非对映异构体2(755化合物1(异构体2))。分离所述的非对映异构体，然后中和并蒸发。用RP-18柱、乙腈/水纯化单一非对映异构体化合物。集合相应的级分，通过蒸馏除去溶剂。高度真空干燥两种产物(非对映异构体755化合物1(异构体1)和755化合物1(异构体2))。
755化合物1(异构体1):
收率:8％
UV-vis(PBS):λmax＝752nm；λem＝778nm
MS(ESI-)[M/z]:308.4[M]3-；474.2[M+Na]2-
755化合物1(异构体2):
收率:16％
UV-vis(PBS):λmax＝752nm；λem＝778nm
MS(ESI-)[M/z]:308.4[M]3-；474.2[M+Na]2-.
实施例17 755化合物2 2-{(1E,3E,5E)-7-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-庚-1,3,5-三烯基}-1-(2-甲氧基-乙氧基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚的合成
将1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E,5E)-6-苯基氨基-己-1,3,5-三烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和1mmol1-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙基]-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后加入200mg乙酸钠。将该溶液回流搅拌15min。冷却至室温后，加入20ml乙醚。通过抽吸萃取得到的沉淀(非对映异构体755化合物2(异构体1)和755化合物2(异构体2)的混合物)，用乙醚洗涤，并干燥。如实施例16中所述，通过柱色谱法纯化残余物(RP-18、乙腈/水和浓HCl)，由此使所述的非对映异构体彼此分离。
实施例18 755化合物3 2-{(1E,3E,5E)-7-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-1,3-二氢-吲哚-(2E)-亚基]-庚-1,3,5-三烯基}-1-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-3-甲基-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚的合成
将1-(5-羧基戊基)-3-甲基-2-((1E,3E,5E)-6-苯基氨基-己-1,3,5-三烯基)-5-磺基-3-(3-磺基丙基)-3H-吲哚和1mmol1-{2-[2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2,3-二甲基-5-磺基-3-(3-磺基-丙基)-3H-吲哚溶于20ml乙酸/乙酸酐(1/1)，然后加入200mg乙酸钠。将该溶液回流搅拌15min。冷却至室温后，加入20ml乙醚。通过抽吸萃取得到的沉淀(非对映异构体755化合物3(异构体1)和755化合物3(异构体2)的混合物)，用乙醚洗涤，并干燥。如实施例16中所述，通过柱色谱法纯化残余物(RP-18、乙腈/水和浓HCl)，由此使所述的非对映异构体彼此分离。
实施例19
如下所示，将作为NHS酯类的650化合物的特性与商购染料比较。
如下所示，将作为NHS酯类的755化合物的特性与商购染料比较：
与DyLight800-NHS相比，755化合物4/4-NHS的激发/发射光谱在+/-10nm内。
实施例20
将DyLight6501/1和DyLight6504/4以10mg/ml溶于二甲基甲酰胺(DMF)，在涡旋混合器上混合15秒，观察以确定是否有染料进入溶液。然后将染料温育5分钟，再在涡旋混合器上混合30秒。DyLight650(4/4)即刻溶解，DyLight650(1/1)在温育5分钟并再次混合之前不溶入溶液。
实施例21
使各自为NHS酯的本发明化合物和商购化合物与山羊抗小鼠(GAM)和山羊抗兔(GAR)抗体缀合。将GAM和GAR以在磷酸缓冲盐水(PBS)中10mg/ml对50mM硼酸盐缓冲液(pH8.5)透析。所述化合物用DMF重构，CF647用二甲亚砜(DMSO)以10mg/ml重构，在室温以2.5X、5X、10X或15X摩尔过量与GAM或GAR合并约2小时，与标记所述抗体。
使标记的化合物(也称作染料或标记物)进行PDDR以除去未标记的(游离)化合物；每mg纯化的蛋白质中使用100-200μl填充树脂。然后用PBS按照1:50稀释纯化的抗体-标记染料，用UV Cary分光光度计扫描从700nm至230nm的旋光度，以测定蛋白质浓度，并且测定染料摩尔与蛋白质摩尔之比。用50％甘油按照1:10稀释每种缀合物，在10mM二硫苏糖醇(DTT)的存在下在95℃加热5min，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、在十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)的存在下分离。使用Typhoon9400Imager扫描凝胶以验证除去未缀合的化合物。比较标记效率，结果显示下列标记程度，其中650化合物1/1(4S)表示该化合物上有四个磺基，650化合物1/1(2S)表示该化合物上有两个磺基。
| GAM | 2.5X | 5X | 10X | 15X |
| 650化合物4/4-NHS | 2.4 | 4.7 | 9.6 | 14.2 |
| 650化合物1/1(4S)-NHS | 2.6 | 4.4 | 7.9 | 10.0 |
| CF647-NHS | 1.7 | 2.9 | 4.3 | 5.1 |
| Alexa Fluor647-NHS | 2.4 | 4.0 | 6.5 | 8.2 |
| GAR | 2.5X | 5X | 10X | 15X |
| 650化合物4/4-NHS | 2.3 | 4.6 | 8.5 | 13.4 |
| 650化合物1/1(4S)-NHS | 2.8 | 4.1 | 7.6 | 10.0 |
| CF647-NHS | 1.7 | 2.6 | 4.2 | 4.9 |
| Alexa Fluor647-NHS | 2.3 | 3.6 | 6.1 | 7.7 |
与其它各自为摩尔过量的染料相比，全部650化合物4/4缀合物的标记效率是最高的，然后是650化合物1/1。650化合物1/1和CF647需要额外的时间完全溶解。
使各自为NHS酯的755化合物4/4和DyLight800与上述山羊抗小鼠(GAM)和山羊抗兔(GAR)抗体缀合。简言之，用DMF以重构755化合物4/4-NHS和DyLight800-NHS。每种10mg/ml化合物显示良好的溶解度。用硼酸盐缓冲液pH8.5以10.0mg/ml制备在100μl GAM或GAR中1mg。用硼酸盐缓冲液pH8.5以10.0mg/ml制备在1000μl GAM中10mg。用PBS pH7.4以10.0mg/ml制备在1000μl GAM中10mg。用每种化合物以2.5X、5X、7X(10mg)和9X摩尔过量标记GAM和GAR。用每种化合物在PBS缓冲液中5X和7X摩尔过量标记10mg GAM，温育60min以上。在Harvard柱上用Pierce Dye Removal Resin纯化缀合物，其中每mg每种缀合物中使用100-200μl树脂。全部缀合物按照1:50稀释，用UV Cary分光光度计扫描。游离化合物的旋光度最大值如图1A中所示，其中游离染料755化合物4/4-NHS在783nm显示单一吸收峰，游离染料DyLight800-NHS在770nm显示单一吸收峰。与55化合物4/4(D/P of2.2)和DyLight800(D/P为1.4)的GAM缀合物的吸收最大值如图1B中所示，其中显示了基线100％传递。755化合物4/4-GAM缀合物在783nm显示单一吸收峰，DyLight800-GAM缀合物显示2个峰：在775nm的最大峰，706nm的最小峰。与755化合物4/4(D/P为2.2)、DyLight800(D/P of1.4)和IR800-GAR(D/P为2.6；使用LI-COR IR800Dye制备缀合物)的GAR缀合物的吸收最大值如图1C中所示，其中显示了基线100％传递。755化合物4/4-GAR缀合物在783nm显示单一吸收峰，DyLight800-GAR缀合物显示2个吸收峰：在774nm的最大峰，在705nm的最小峰，IR800-GAR在779nm显示主峰，在709nm显示小峰。使用DyLuight800在706nm观察到的第二个峰约为在775nm的主峰的60％，这第二个峰可以影响读出值，视所用的仪器而定。
比较了标记效率，如下结果显示了标记度(D/P)。
| 2.5X | 5X | 7X | 9X | |
| GAM硼酸盐缓冲液 | ||||
| 755化合物4/4-NHS | 0.97 | 1.72 | 2.24 | 2.94 |
| DyLight800-NHS | 0.74 | 1.12 | 1.41 | 1.91 |
| GAR硼酸盐缓冲液 | ||||
| 755化合物4/4-NHS | 0.84 | 1.64 | 2.22 | 2.91 |
| DyLight800-NHS | 0.71 | 1.17 | 1.39 | 1.88 |
| GAM硼酸盐缓冲液 |
| 755化合物4/4-NHS | 1.75 | 2.32 | ||
| DyLight800-NHS | 1.20 | 1.55 | ||
| GAM PBS缓冲液 | ||||
| 755化合物4/4-NHS | 0.74 | 1.16 | ||
| DyLight800-NHS | 0.89 | 1.15 |
在类似摩尔过量下，755化合物4/4在硼酸盐缓冲液中的缀合导致标记效率高于DyLight800约50％。对于两种染料，在PBS缓冲液pH7.2中进行的缀合显示，与在硼酸盐缓冲液pH8.5中的缀合相比，标记效率低约2倍。在硼酸盐缓冲液中以7X摩尔过量的DyLight800缀合物在3天内沉淀，而在3周后，没有观察到755化合物4/4缀合物沉淀。以5X摩尔过量使用755化合物4/4避免了染料聚集，且产生与7X摩尔过量的DyLight800类似的D/P。
实施例22
在功能性测定中评价染料-GAM缀合物和染料-GAR缀合物的性能表现。用靶蛋白小鼠gG免疫球蛋白或兔IgG免疫球蛋白包被96白色不透明培养板的各孔。将浓度为10μg/ml的100μl小鼠或兔IgG施用于第1和2栏的相应孔。使用100μl PBS从第2－11栏的各孔中依次稀释靶蛋白。弃去来自第11栏中各孔的100μl样品。将100μl PBS加入到第12栏的各孔中。将培养板在4℃温育过夜然后用Thermo Scientific封闭缓冲液2X200μl封闭。用2x200μl PBS-Tween和1x200μl PBS洗涤包被的培养板。基于计算的浓度，用PBS缓冲液按照1:250(1mg/ml)稀释GAM和GAR缀合物。将用PBS稀释至4μg/ml的缀合物加入到相应的培养板(100μl/孔)中，然后在黑暗中温育1h。用2x200μl PBS-Tween和1x200μl PBS洗涤培养板，充满PBS缓冲液(100μl/孔)，然后用Tecan Safire扫描以检测荧光强度。
正如图2-9中所示，比较了使用所示的缀合条件、不同浓度的染料的相对荧光单位(RFU)或信噪比(S/B)。
图2显示使用与2.5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)、650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或Alexa Fluor647(正方形)缀合的GAR的功能性测定结果，显示相对荧光单位(RFU)与靶抗体/孔的量(ng/孔)的关系。图3显示图2的功能性测定的信噪比(SB)，显示2.5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)、650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或AlexaFluor647(正方形)650化合物4/4(菱形)、0化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或AlexaFluor647(正方形)。图4显示使用与5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)、650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或Alexa Fluor647(正方形)缀合的GAR的功能性测定结果，显示相对荧光单位(RFU)与靶抗体/孔的量(ng/孔)的关系。图5显示图4的功能性测定的信噪比(SB)，显示5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)、650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或Alexa Fluor647(正方形)。650化合物1/1-GAR在全部摩尔过量下是性能最佳的缀合物。直到125ng/孔兔IgG，650化合物4/4-GAR显示与Alexa Fluor647-GAR类似，但优于CF647-GAR的结合荧光。CF647显示全部缀合物的性能表现显著较低。
图6显示使用与2.5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)、650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或Alexa Fluor647(正方形)缀合的GAM的功能性测定结果，显示相对荧光单位(RFU)与靶抗体/孔的量(ng/孔)的关系。图7显示图6的功能性测定的信噪比(SB)，显示2.5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)、650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或AlexaFluor647(正方形)。图8显示使用与5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)，650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或Alexa Fluor647(正方形)缀合的GAM的功能性测定结果，显示相对荧光单位(RFU)与靶抗体/孔的量(ng/孔)的关系。图9显示图8的功能性测定的信噪比(SB)，显示5X摩尔过量染料的650化合物4/4(菱形)、650化合物1/1(圆圈)、CF647(三角形)或Alexa Fluor647(正方形)。650化合物1/1-GAM在全部摩尔过量下是性能最佳的缀合物。直到125ng/孔小鼠IgG，650化合物4/4-GAM显示与Alexa Fluor647-GAM类似，但优于CF647-GAM的结合荧光。CF647显示全部缀合物的性能表现显著较低。
如上所述，在荧光板测定法中评价了染料-GAM缀合物和染料-GAR缀合物的性能表现。温育后，用LiCor Odyssey在800通道扫描培养板(未结合的)。用2x200μl PBS-Tween20和1x200μl PBS洗涤培养板，充满PBS缓冲液(100μl/孔)，然后用LiCor Odyssey在800通道扫描培养板(结合的)。平均未结合的荧光总强度如图10A中所示，相应的培养板图像如图10B中所示，其显示1(755化合物4/4-GAR；2.5X摩尔过量；D/P0.84)、2(755化合物4/4-GAR；5X摩尔过量；D/P1.64)、3(755化合物4/4-GAR；7X摩尔过量；D/P在2.22)、4(755化合物4/4-GAR；9X摩尔过量；D/P2.91)、5(DyLight800-GAR；2.5X摩尔过量；D/P0.71)、6(DyLight800-GAR；5X摩尔过量；D/P1.17)、7(DyLight800-GAR；7X摩尔过量；D/P1.39)和8(DyLight800-GAR；9X摩尔过量；D/P1.88)。平均总结合荧光强度如图11A所示，其中755化合物4/4-GAR(实线)和DyLight800-GAR(虚线)为2.5X摩尔过量(三角形)、5X摩尔过量(菱形)、7X摩尔过量(圆圈)或9X摩尔过量(正方形)。图11B显示图11A的培养板图像，其显示1(755化合物4/4-GAR；2.5X摩尔过量)、2(755化合物4/4-GAR；5X摩尔过量)、3(755化合物4/4-GAR；7X摩尔过量)、4(755化合物4/4-GAR；9X摩尔过量)、5(DyLight800-GAR；2.5X摩尔过量)、6(DyLight800-GAR；5X摩尔过量)、7(DyLight800-GAR；7X摩尔过量)和8(DyLight800-GAR；9X摩尔过量)。在上述功能性荧光培养板测定法中，在硼酸盐缓冲液中相比于DyLight800-GAR缀合物，755化合物4/4-GAR显示显著更高的结合荧光强度。
平均未结合的荧光总强度如图12A中所示，相应的培养板图像如图12B中所示，其显示1(755化合物4/4-GAR；7X摩尔过量；D/P2.22)、2(DyLight800-GAR；7X摩尔过量；D/P1.39)、3(IR800-GAR(Rockland)；D/P2.6)和4(DyLight800-GAR(Rockland)；D/P2.1)。平均总结合荧光强度图13A如所示，其具有755化合物4/4-GAR(菱形；7X摩尔过量；D/P2.24)、DyLight800-GAR(圆圈；7X摩尔过量；D/P1.39)、IR800-GAR(Rockland)(三角形；D/P2.6)和DyLight800-GAR(Rockland)(正方形；D/P在2.1)。图13B显示图13A的培养板图像，其显示1(755化合物4/4-GAR；7X摩尔过量)、2(DyLight800-GAR；7X摩尔过量)、3(IR800-GAR(Rockland))和4(DyLight800-GAR(Rockland))。在上述功能性荧光培养板测定法中，755化合物4/4-GAR显示在硼酸盐缓冲液中明显高于DyLight800-GAR缀合物的结合荧光强度。在约2的类似D/P下，755化合物4/4-GAR性能表现比IR800-GAR(由Rockland使用来自LiCOR的IR800染料制备的缀合物；以冻干形式销售)和DyLight800-GAR(由Rockland使用DyLight800制备的缀合物；以冻干形式销售)更好。使用755化合物4/4未观察到在高染料摩尔过量下猝灭。
实施例23
在基于细胞的测定法中，使用如下方案评价了本发明化合物和商购染料的免疫荧光。在室温将包含U2OS细胞(人骨肉瘤细胞系)的培养板固定在PBS/0.1％Triton X-100中4％的低聚甲醛中15min。在室温然后用在PBS/0.1％Triton X-100中2％的BSA渗透化处理细胞15min。阴性对照仅包含2％BSA/PBS-0.1％Triton-X100阻断剂。将稀释的初级抗体、用2％BSA/PBS-0.1％Triton-X100稀释的小鼠-抗蛋白质二硫化物异构酶(PDI)或兔-抗HDAC2加入到培养板中，在室温温育1小时。阴性对照仅包含2％BSA/PBS-0.1％Triton-X100阻断剂。用3x100μl PBS洗涤培养板。基于计算的蛋白质浓度，用PBS/0.1％Triton X-100将实施例22中制备的缀合物稀释至4μg/ml，加入到培养板中(50μl/孔)，在黑暗中在室温温育1小时。温育后，从培养板中取出初级抗体溶液，用3x100μl PBS洗涤培养板。每孔加入100μl0.1μg/ml烟酸己可碱染料的PBS溶液。然后用Plate Reader扫描培养板以便成像和定量。
图14A-E显示使用兔-抗HDAC2作为初级抗体和650化合物4/4-GAR(图14A；A柱)、650化合物1/1(4S)-GAR(图14B；A柱)、CF647-GAR(图14C；A柱)、Alexa Fluor647-GAR(图14D；A柱)或650化合物1/1(2S)-GAR(图14E；A柱)作为二次抗体的免疫荧光测定结果，其中B栏中显示的是阴性对照，其中使所述化合物与2.5X摩尔过量(第1列)、5X摩尔过量(第2列)，10X摩尔过量(第3行)或15X摩尔过量(第4行)的GAR(二次抗体)缀合。使用全部缀合物在高染料摩尔过量下均观察到非特异性结合。650化合物4/4-GAR在2.5X和5X较低摩尔过量下的光亮度不如与650化合物1/1-GAR。然而，650化合物4/4-GAR未显示使用650化合物1/1-GAR观察到的猝灭。CF647-GAR和Alexa Fluor647-GAR缀合物在全部摩尔过量下均显示较低的强度。
在2.5X(空心条)、5X(向上的对角线条)、10X(向下的对角线条)和15X(垂直线条)摩尔过量下，表示为平均总强度的图14A-E的数据定量分析如图15中所示，其中所述的平均总强度是定义区域或定义的主要目标例如核内所有像素的平均总强度，信号与背景比(S/B)如图16中所示。650化合物1/1-GAR和650化合物4/4-GAR显示最高荧光强度。尽管650化合物4/4-GAR未显示猝灭，但是650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物在高摩尔过量下显示明显猝灭。在所有摩尔过量下，CF647-GAR和Alexa647-GAR缀合物显示较低的强度。
图17A-D显示使用小鼠-抗PDI作为初级抗体和650化合物4/4-GAR(图17A；A柱)、650化合物1/1(4S)-GAR(图17B；A柱)、CF647-GAR(图17C；A柱)或Alexa Fluor647-GAR(图17D；A柱)作为二次抗体的免疫荧光测定结果，其中阴性对照如B栏中所示，其中所述化合物与2.5X摩尔过量(第1列)、5X摩尔过量(第2列)、10X摩尔过量(第3行)或15X摩尔过量(第4行)的GAM(二次抗体)缀合。使用任意染料(用200μl树脂/mg蛋白质纯化)未观察到非特异性结合。650化合物4/4-GAM在所有摩尔过量下为最亮。在高于2.5X摩尔过量，650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物显示显著的猝灭。在所有摩尔过量下，CF647-GAM和Alexa647-GAM缀合物显示较低的强度。
在2.5X(空心条)、5X(向上的对角线条)、10X(向下的对角线条)和15X(垂直线条)摩尔过量下，表示为平均总强度的图17A-D的数据定量分析如图18中所示，其中所述的平均总强度是定义区域或定义的主要目标例如核内所有像素的平均总强度，信号与背景比(S/B)如图19中所示。650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物在2.5X染料摩尔过量下显示其最高结合强度。在所有摩尔过量下，650化合物4/4-GAM为最亮。在高于5X摩尔过量650化合物4/4-GAM显示猝灭，但在高于2.5X摩尔过量650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物显示显著的猝灭。在所有摩尔过量下，CF647-GAM和Alexa647-GAM缀合物显示较低的强度。
图20A-D显示使用兔-抗HDAC2作为初级抗体和650化合物4/4-GAR(图20A；A柱)、650化合物1/1(4S)-GAR(图20B；A柱)、CF647-GAR(图20C；A柱)或Alexa Fluor647-GAR(图20D；A柱)作为二次抗体的免疫荧光测定结果，其中阴性对照如B栏中所示，其中所述化合物与2.5X摩尔过量(第1列)、5X摩尔过量(第2列)、10X摩尔过量(第3行)或15X摩尔过量(第4行)的GAR(二次抗体)缀合。使用任意缀合物(用200μl树脂/mg蛋白质纯化)未观察到非特异性结合。650化合物4/4-GAR在所有摩尔过量下为最亮。在高于2.5X摩尔过量，650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物显示显著的猝灭。在所有摩尔过量下，CF647-GAR和Alexa647-GAR缀合物显示较低的强度。
在2.5X(空心条)、5X(向上的对角线条)、10X(向下的对角线条)和15X(垂直线条)摩尔过量下，表示为平均总强度的图20A-D的数据定量分析如图21中所示，其中所述的平均总强度是定义区域或定义的主要目标例如核内所有像素的平均总强度，信号与背景比(S/B)如图22中所示。在2.5X染料摩尔过量下，650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物显示其最高结合强度，然而，在所有摩尔过量下650化合物4/4为最亮。尽管650化合物4/4-GAR未显示猝灭，但是在高于2.5X摩尔过量下650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物显示明显的猝灭。在所有摩尔过量下，CF647-GAR和Alexa647-GAR缀合物显示较低的强度。
所述数据显示，与650化合物1/1-NHS、Alexa Fluor647-NHS和CF647-NHS酯相比，650化合物4/4-NHS的激发/发射光谱在+/-10nm范围内。在每种摩尔过量下，与其它染料相比，650化合物4/4的标记效率为最高，然后是650化合物1/1。650化合物1/1和CF647需要额外的时间以便完全溶解。在所有摩尔过量下，650化合物1/1-GAM/R为性能表现最佳的缀合物。直到125ng/孔的小鼠/兔IgG，650化合物4/4-GAM显示与650化合物1/1-GAM和AlexaFluor647-GAM类似的结合荧光，好于CF647-GAM。CF647显示所有染料的显著较低的性能表现。当使用200μl树脂/毫克蛋白质纯化时，所述缀合物未显示任何非特异性结合。使用650化合物4/4(GAM/R)制备的缀合物为最亮且显示最高信号与背景比。高于2.5X摩尔过量，650化合物1/1、CF647和Alexa Fluor647缀合物显示明显的猝灭。在所有摩尔过量下，CF647和Alexa Flour647缀合物显示较低的强度。
实施例24
评价本发明化合物的稳定性。将全部化合物处于氩气气氛中在塑料小瓶中。在用铝涂覆的小袋中用干燥垫密封小瓶，然后将其贮存在50℃下7天。
实施例25
使用本领域公知的方法评价本发明化合物的细胞表面蛋白的直接荧光标记。例如，洗涤适合的细胞培养板，例如IMR90细胞(人肺胚胎成纤维细胞)，然后与所述缀合物一起温育。然后洗涤细胞培养板，使用适合的仪器成像，例如Thermo Scientific ArrayScanVTI HCS Reader。
实施例26
本发明化合物用于体内成像，以得到有关不易于得到的生物组织的信息。所述化合物对近红外(NIR)光谱区中的光有响应，近红外光谱区是具有来自生物材料吸光度的最小干扰的光谱部分。在一个实施方案中，所述化合物用于使动物体内的靶标进行荧光成像。例如，可以使用例如X-射线、磁共振成像、正电子发射断层摄影术、超声成像和探测和其它用于诊断和治疗疾病的无创方法这样的方法得到体内成像信息。在约650nm－约1000nm波长的NIR区内的光可以透过几厘米的组织，且由此可以用于体内成像。荧光染料例如对这些较长波长内的光有响应的本发明化合物可以用作与例如抗体这样靶向分子的缀合物，以结合和蓄积在例如患病组织例如肿瘤内，并且可以用于区分健康组织与患病组织。在一些方法中，本发明化合物可以连接生物分子，例如蛋白质、肽或药物，其定位于或保留在期望的组织环境中。使用NIR染料例如本发明化合物的荧光体内成像是诊断试剂，以分散地直接靶向动物或人体内的疾病组织。
为了体内成像，将所述化合物或所述化合物与靶向剂的缀合物施用于组织(例如通过静脉内)，允许蓄积，过量的化合物由循环系统除去，然后用适合波长的光照射该组织。记录NIR荧光和/或从得到的数据中生成图像，以特异性地检测靶细胞或组织并且使其显影。所施用的化合物的剂量可以不同，这取决于具体的组织、应用等，只要该方法使所述化合物在所评价的组织内达到可检测到的浓度即可。
实施例27
在生物分布和生物清除研究中评价了本发明染料。将1mg NHS-DyLight6504/4和NHS-DyLight6501/1重构成10mg/ml并且用PBS稀释至1mg/ml。将染料温育30分钟，然后通过添加十分之一体积的3M N-乙醇胺猝灭。通过无肿瘤裸鼠眶后的血管丛经静脉内注射100μL1mg/mL每种水解的染料溶液。给1只小鼠注射每种染料。用Carestream MSFX在注射后0h、3h、6h、12h和24h给动物成像。在最终时间点后，处死动物，采集组织用于离体成像。从来自1个小组的1只小鼠中采集心脏、肝、肺和肾，固定，使用苏木精和伊红染色。用Nikon90i显微镜在20X获取比色图像。结果显示从循环系统中除去了水解的NHS-DyLight6504/4，而水解的NHS-DyLight6501/1NHS-Alexa647蓄积的肝中。
实施例28
使用与抗HER2抗体缀合的650化合物4/4体内成像
通过将所述化合物用二甲基甲酰胺(DMF)以10mg/ml重构使650化合物4/4-NHS与兔抗HER2抗体(Genscript USA，Piscataway NJ)缀合，然后在室温与10X摩尔过量的兔抗HER2抗体(0.1mg)一起温育1h，得到650化合物4/4-抗HER2缀合物。然后使样品进行PDDR以除去未标记的(游离)650化合物4/4。通过静脉内(IV)给具有BT474肿瘤的无胸腺小鼠注射10微克所述缀合物。在注射后1、24、48、72、96和120小时使用来LI-COR Biosciences(LI-COR Instruments，Lincoln NE)自的Pearl Impulse Imager使动物随时间成像。
在整体成像时，观察到荧光强度在前1小时成像过程中分布于整个动物内且在72小时时显著减小。96小时后，信号定位于肿瘤并且对肿瘤是特异的。
实施例29
使用一磺酸化或二磺酸化650化合物4/4体内成像
可以通过改变磺酸酯基的数量使所述化合物具有较低的亲水性，即更高的疏水性或带较少的负电荷。较少的磺酸酯赋于化合物更高的疏水性和较少的负电荷。在该实施方案中，如果确定了适当数量的磺酸酯，则所述化合物更易于保留在期望的组织或位置内。例如，如果较少的磺酸酯位于化合物上，则化合物更有效地透入细胞。所述化合物可以包含1、2、3或4个磺酸酯基。还已知疏水性化合物更有效地通过细胞膜且由此在所关注的靶标定位于细胞内时是更期望的。
通过在室温将包含1mM二磺酸化或一磺酸化650化合物4/4-NHS在1ml PBS和0.5ml四氢呋喃(THF)中的溶液与0.1mM阿屈膦酸盐(一种结合至并且保留在LNCap前列腺癌细胞内的化合物)和0.2mM二异丙基乙胺一起温育过夜，使阿屈膦酸盐与二磺酸化或一磺酸化650化合物4/4缀合。使用反相HPLC、0-50％甲醇对0.1M乙酸铵缓冲液纯化所述缀合物，然后将其冻干。
使LNCap细胞在裸鼠内常位生长。将650化合物1(异构体1)-阿屈膦酸盐(5nmole)注入肿瘤。给对照组小鼠注射游离650化合物4/4，其包含羧酸残基而不是反应性NHS酯。俘获X-射线和近红外荧光图像。
在使整个小鼠成像时，一磺酸化和二磺酸化650化合物4/4-阿屈膦酸盐缀合物保留在小鼠组织中，而未保留游离染料；所述缀合物保留在LNCap细胞诱导的肿瘤内至少18小时。
实施例30
使用一磺酸化或二磺酸化650化合物4/4体内成像
如下制备与二磺酸化和一磺酸化650化合物4/4缀合的递药纳米粒系统。将在1mlPBS中包含1mM二磺酸化或一磺酸化650化合物4/4-NHS的溶液在室温与0.1mM缀合了转铁蛋白的纳米粒形式的抗癌药一起温育过夜。通过离心纯化得到的650化合物4/4-纳米粒缀合物，然后冻干。
将650化合物4/4-纳米粒缀合物(1nmole)通过静脉内注入不同小鼠的尾静脉。给对照组小鼠注射无反应性650化合物4/4染料，其包含羧酸残基而不是反应性NHS酯。俘获X-射线和近红外荧光图像。
发现650化合物4/4-纳米粒缀合物在注射后定位于小鼠脑中约24小时以上。相比于不使用抗癌药的650化合物4/4-纳米粒，在注射650化合物4/4-纳米粒缀合物后肿瘤大小进行性减小。
实施例31
一磺酸化衍生物可以位于650化合物上6个可能的位置的任意一个上，这解释为环上碳位置周围的立体化学以及每种染料的两端的不对称性质。类似地，二取代和三取代的磺酸盐可以位于本发明化合物上的多个可能的位置上。
实施例32
测定了本发明化合物和商购化合物的LogP(分配系数和logD(分布系数)以评价化合物的亲水性。化合物的logP值是正辛醇与水之间的化合物的分配系数的对数log(C辛醇/C水)并且是化合物亲水性的充分建立的测量值。LogP对于中性形式下的分子而言是恒定的。低亲水性和由此的高logP导致吸收或渗透差。对于具有充分吸收的合理可能性的化合物，其logP一般是<5.0。亲脂性不由中性种类在辛醇/水中的分配决定，而是由分子的中性和带正电荷形式的分布决定。LogD与化合物的亲水性相关。由logD给出的分布系数考虑到了分子的所有中性和带电荷形式，这种分布随pH改变。在pH范围内，其中所述分子大部分未电离，logD＝logP。在pH范围内，其中大部分级分电离，logD变成logP、pH和pKa的函数。如果推定带电荷的分子完全未进入辛醇，则可以将logD表示为logD＝logP-log(1+10**(pH-pKa))。
下表提供了计算的通过ChemAxon程序测定的755化合物4/4和DyLight800的理论logD和logP值。
比较带有4个PEG4链的755化合物4/4和来自Thermo Fisher的没有PEG修饰的DyLight800染料的logP和logD计算说明了令人意外的有益性，即甚至短PEG4链也对菁蓝-类染料的亲水性具有影响。尽管文献教导了小染料分子上较长PEG聚合物修饰的亲水性有益性，但是未提示这种有益性发生在使用短PEG链的情况下。DyLight800染料LogD的计算显示该分子上的3个磺酸根导致在中性pH左右适度亲水性指数为-0.32。相反，755化合物4/4在相同的中性pH值下展示出更好得多的亲水性，其logD测定值为-1.77。这种计算的亲水性的差异对应于所观察到的结果，即聚乙二醇化染料溶入水溶液更轻易得多，DyLight800染料更具有疏水性。当将所述染料溶于与水易溶混的有机溶剂例如DMF或DMSO中时，也观察到所述聚乙二醇化染料的溶解度增加。755化合物4/4与抗体分子的缀合物在所有水平的染料与蛋白质之比下在溶液中都比DyLight800缀合物更稳定得多。实际上，DyLight800-抗体缀合物倾向于在缀合反应过程中从溶液中沉淀出来并且在贮存时存在稳定性问题，而755化合物4/4-抗体缀合物在缀合过程中不会沉淀并且不存在贮存稳定性问题。这些观察结果强调了令人意外的有益性，即本发明提供了本申请中所述的用相对短的PEG链修饰的菁蓝染料化合物。
本说明书中所示和所述的实施方案仅是为本领域技术人员的发明人的具体实施方案，但不以任何方式起限定作用。因此，可以在不脱离如下权利要求范围的本发明精神的情况下进行各种改变、变型或变化。特别地将所引述的参考文献完整地引入本文参考。
Claims (11)
1.化合物，其选自下组化合物
其中R1和R2各自相同或不同且独立地选自PEG基团P-L-Z，其中P选自(聚)乙二醇基，其中所述(聚)乙二醇基是(CH2CH2O)s，其中s是3～6的整数，包含端值本身；
R5和R6各自是甲基；
R7和R8各自是磺基；
L-Z是甲基；
X选自羟基琥珀酰亚胺基、磺基琥珀酰亚胺基、2,3,5,6-四氟苯氧基、和4-磺基-2,3,5,6-四氟苯氧基；
Kat是多个Na+、K+、Ca2+、铵或补偿菁蓝携带的负电荷所需的其它阳离子；m是1～5的整数，包含端值本身；p是1～6的整数，包含端值本身；
R3和R4各自是氢；且
Y是氢。
2.化合物，选自
和
3.标记至少一种生物分子的方法，该方法包括在足以用权利要求1或2的化合物标记至少一种生物分子的条件下，将包含至少一种赋形剂和有效浓度的所述化合物的组合物提供给所述生物分子，其中所述方法不包括疾病的治疗或诊断。
4.权利要求3的方法，其中所述生物分子选自蛋白质、抗体、酶、三磷酸核苷、寡核苷酸、生物素、半抗原、辅因子、凝集素、抗体结合蛋白、类胡萝卜素、碳水化合物、激素、神经递质、生长因子、毒素、生物细胞、脂质、受体结合性药物、荧光蛋白、有机聚合物载体材料、无机聚合物载体材料以及它们的组合。
5.检测至少一种生物分子的方法，该方法包括在足以使权利要求1或2的化合物与至少一种生物分子结合且检测所述与生物分子结合的化合物的条件下，将包含至少一种赋形剂和有效浓度的所述化合物的组合物提供给所述生物分子，其中所述方法不包括疾病的治疗或诊断。
6.权利要求5的方法，其中所述生物分子选自蛋白质、抗体、酶、三磷酸核苷、寡核苷酸、生物素、半抗原、辅因子、凝集素、抗体结合蛋白、类胡萝卜素、碳水化合物、激素、神经递质、生长因子、毒素、生物细胞、脂质、受体结合性药物、荧光蛋白、有机聚合物载体材料、无机聚合物载体材料以及它们的组合。
7.权利要求5的方法，其中在一种测定法中检测所述至少一种生物分子，所述测定法选自荧光显微镜检查术、流式细胞术、体内成像、免疫测定法、杂交、色谱测定法、电泳测定法、基于微孔板的测定法、荧光共振能量转移(FRET)系统、高流通量筛选或微阵列。
8.权利要求5的方法，其中通过体内成像检测所述生物分子，其包括将所述与生物分子结合的化合物提供给至少一种生物样品、组织或生物体并且检测所述至少一种生物样品、组织或生物体内的所述生物分子。
9.权利要求7的方法，其中通过体内成像检测所述生物分子，其包括将所述与生物分子结合的化合物提供给至少一种生物样品、组织或生物体并且检测所述至少一种生物样品、组织或生物体内的所述生物分子。
10.用于标记样品中至少一种生物分子的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2的化合物和至少一种赋形剂，以及该化合物用于标记样品中生物分子的使用说明书。
11.用于检测样品中至少一种生物分子的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2的化合物和至少一种赋形剂，以及该化合物用于检测样品中生物分子的使用说明书。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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