CN109073555A - 流式细胞术用荧光探针和荧光标记细胞的分选方法 - Google Patents

流式细胞术用荧光探针和荧光标记细胞的分选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种流式细胞术用荧光探针，其包含载体分子和与所述载体分子结合的卟啉，并且激发波长在350～650nm的范围内。本发明还涉及一种利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选方法，其包含用所述的流式细胞术用荧光探针对细胞进行荧光标记的工序、和利用流式细胞仪对用流式细胞术用荧光探针标记的荧光标记细胞进行分选的工序，所述利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选通过对荧光标记细胞照射波长为350～650nm的激发光、对荧光进行检测来进行。

Description

流式细胞术用荧光探针和荧光标记细胞的分选方法
技术领域
本发明涉及流式细胞术用荧光探针和荧光标记细胞的分选方法。
背景技术
近年来，在癌、发生学的研究领域中，广泛进行使用了小鼠等动物的生物体内的荧光成像分析。移植到小鼠的iPS细胞或ES细胞等干细胞、癌细胞及肝硬化细胞等疾病相关细胞等细胞在移植后、在什么位置进行分化、生长、转移等的信息分析中，荧光成像分析为主要的方法。特别是，为了在维持小鼠等动物的生存的状态下观察移植细胞的进程，目前的情况是只有使用荧光成像分析的方法，其被定位为特别重要的分析方法。
生物体内的移植细胞的荧光成像分析通常通过如下来进行：在移植前预先在体外(in vitro)用荧光探针标记细胞，将该细胞移植到小鼠等生物体内，在体内(in vivo)用荧光成像装置进行观察。例如，专利文献1中记载了将结合有阴离子性卟啉与阳离子性有机烷氧基硅烷和非阳离子性硅烷的含卟啉的复合物用作用于生物体观察的近红外荧光探针。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-136555号公报
发明内容
发明所要解决的课题
但是，在生物体观察用的近红外荧光探针的情况下，目前的情况是无法用荧光显微镜或流式细胞仪等体外荧光成像装置检测荧光，难以确认在体外与近红外荧光探针结合的荧光标记细胞。
本发明为了解决上述以往的问题，提供一种能够用于使用了流式细胞仪的流式细胞术分析的流式细胞术用荧光探针和荧光标记细胞的分选方法。
用于解决课题的手段
本发明涉及一种流式细胞术用荧光探针，其特征在于，其包含载体分子和与所述载体分子结合的卟啉，并且激发波长为350～650nm的范围。
本发明还涉及一种利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选方法，其特征在于，其包含用流式细胞术用荧光探针对细胞进行荧光标记的工序、和利用流式细胞仪对用流式细胞术用荧光探针标记的荧光标记细胞进行分选的工序，所述流式细胞术用荧光探针包含载体分子和与所述载体分子结合的卟啉、且激发波长为350～650nm的范围，所述利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选通过对荧光标记细胞照射波长为350～650nm的激发光、对荧光进行检测来进行。
上述载体分子优选为聚硅氧烷。
上述流式细胞术用荧光探针可以通过特异性结合于细胞表面来标记细胞，也可以通过被摄入细胞内部来标记细胞。
所述流式细胞术用荧光探针的荧光波长优选为400～800nm。
发明效果
本发明能够提供一种能够用于利用流式细胞仪进行的流式细胞术分析的流式细胞术用荧光探针。另外，通过使用该流式细胞术用荧光探针标记细胞，能够利用流式细胞仪对荧光标记细胞进行分选。
附图说明
图1表示四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)及TCPP与(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)的混合分子(PPS HNPs)的用傅里叶变换红外分光光度计(FT-IR)测定的FR-IR光谱。
图2表示PPS HNPs的29Si固体核磁共振(固体NMR)光谱。
图3表示PPS HNPs的TG和DTA曲线。
图4中，图4A表示FA-PEG/ICG-PPS HNPs生成反应后的上清液的吸收光谱，图4B表示叶酸的浓度校准曲线。
图5表示PPS HNPs、及进一步使吲哚菁绿(ICG)及叶酸(FA)与PPS HNPs结合而成的复合物(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)的吸收光谱。
图6中，图6A表示FA-PEG/ICG-PPS HNPs的短波长侧的激发光谱及荧光光谱，图6B表示FA-PEG/ICG-PPS HNPs的长波长侧的激发光谱及荧光光谱。
图7中，图7A表示来自小鼠的巨噬细胞的RAW264.7细胞的明视野图像(Brightfield)、用DAPI染色的RAW264.7细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(DAPI)、用进一步使吲哚菁绿(ICG)与PPS HNPs结合而成的复合物(ICG-PPS HNPs)标记的RAW264.7细胞的由荧光显微镜得到荧光图像(ICG-PPS HNPs)、以及将这三个图像重叠而得到的图像(融合，Merge)。图7B表示来自人的宫颈癌的HeLa S3细胞的明视野图像(Bright field)、用DAPI染色的HeLa S3细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(DAPI)、利用FA-PEG/ICG-PPS HNPs标记的HeLa S3细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)、以及将这三个图像重叠而得到的图像(融合)。图7C表示来自人的结肠癌的HCT116细胞的明视野图像(Bright field)、用DAPI染色的HCT116细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(DAPI)、用FA-PEG/ICG-PPS HNPs标记的HCT116细胞的由荧光显微镜得到的荧光图像(FA-PEG/ICG-PPSHNPs)、以及将这三个图像重叠而得到的图像(融合)。
图8中，图8A表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为670nm)分析用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW264.7细胞的结果。图8B表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为670nm)分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果。图8C表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为670nm)分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
图9中，图9A表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为710nm)分析用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW264.7细胞的结果。图9B表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为710nm)分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果。图9C表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为710nm)分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
图10中，图10A表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为780nm)分析用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW264.7细胞的结果。图10B表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为780nm)分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果。图10C表示用流式细胞仪(激发波长为405nm、荧光波长为780nm)分析用FA-PEG/ICG-PPSHNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
图11中，图11A表示用流式细胞仪(激发波长为640nm、荧光波长为780nm)分析用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW264.7细胞的结果。图11B表示用流式细胞仪(激发波长为640nm、荧光波长为780nm)分析用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果。图11C表示用流式细胞仪(激发波长为640nm、荧光波长为780nm)分析用FA-PEG/ICG-PPSHNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
具体实施方式
本发明的发明者们发现了将包含载体分子和与载体分子结合的卟啉、且激发波长为350～650nm的范围的荧光探针用于利用流式细胞术荧光分析进行的荧光标记细胞的检测/分选，从而完成了本发明。
(流式细胞术用荧光探针)
本发明的流式细胞术用荧光探针包含载体分子和与载体分子结合的卟啉。
所述流式细胞术用荧光探针的激发波长为350～650nm，从适于利用通用的流式细胞仪进行的流式细胞术分析的观点出发，激发波长优选为380～580nm。另外，从适于利用通用的流式细胞仪进行的流式细胞术分析的观点出发，所述流式细胞术用荧光探针的荧光波长优选为400～800nm的范围，更优选为450～680nm的范围。
卟啉没有特别限定，从适于利用流式细胞术进行的荧光分析的观点出发，可以使用具有羧基的卟啉。其中，“卟啉”以4个吡咯环在α位置与4个次甲基交替键合而成的环状化合物及其衍生物的总称的含义使用。具有羧基的卟啉一般激发波长为400～650nm的范围、荧光波长为600～740nm的范围。
作为具有羧基的卟啉，例如可以使用下述通式(I)所示的化合物。
[化学式编号1]
所述通式(I)中，R1b、R2b、R3b和R4b可以相同或不同，表示羧基(COOH)、磺基(SO3H)或氢原子(H)(其中，全部为氢原子或全部为磺基的情况除外)。优选所述通式(I)中，R1b、R2b、R3b和R4b全部为羧基，或R1b为羧基、R2b、R3b和R4b为氢原子。具有羧基的卟啉更优选为所述通式(I)所示的R1b、R2b、R3b和R4b全部为羧基的化合物。R1b、R2b、R3b和R4b全部为羧基的化合物被称为四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)。
[化学式编号2]
另外，例如胆红素、氯化血红素、原卟啉等也可以作为具有羧基的卟啉使用。
本发明中使用的具有羧基的卟啉可以是公知的化合物，或者可以通过公知的方法容易地制造。例如可以从东京化成工业株式会社等获得市售品。
另外，本发明的荧光探针除了卟啉之外，还可以含有其他荧光色素。含有其他荧光色素时，卟啉与其他荧光色素之间不发生荧光共振能量移动(FRET)。其他荧光色素(以下也记为荧光色素b)的激发波长只要与卟啉的激发波长不同且不产生FRET就没有特别限定。
荧光色素b的激发波长只要在不影响使用了卟啉的流式细胞术分析的范围内则没有限定，优选600～850nm的范围，更优选630～790nm的范围。
作为荧光色素b，例如可以使用吲哚花青化合物、香豆素、罗丹明、呫吨、血卟啉及荧光胺等体内荧光成像用荧光色素。
优选所述载体分子可以与卟啉结合，可以维持卟啉本来的激发波长。例如，可以使用聚硅烷、聚锗烷、聚锡烷、聚硅氧烷、聚倍半硅氧烷、聚硅氮烷、聚硼氨(polyborazylene)、聚磷腈等无机聚合物，聚吡咯、聚乙二醇、多糖等有机聚合物。如后所述，二氧化硅聚合物通过硅烷水解、缩聚而形成。
所述流式细胞术用荧光探针可以通过特异性结合于细胞表面来标记细胞。此时，优选所述流式细胞术用荧光探针具有与特异性识别细胞表面的物质结合的细胞表面结合物质。流式细胞术用荧光探针可以通过细胞表面结合物质与细胞表面特异性结合来标记细胞。特异性识别细胞表面的物质是指存在于特定的细胞表面的蛋白、脂质、糖链和/或核酸等。例如，在癌细胞的表面存在癌细胞特异性的叶酸受体、转铁蛋白受体、抗原等。通过使荧光探针含有叶酸、转铁蛋白、抗体等，可以对癌细胞进行特异性地标记。另外，iPS细胞或ES细胞等干细胞的表面存在细胞表面标记物(膜蛋白)等。通过在荧光探针上结合与细胞表面标记物特异性结合的分子等，可以对iPS细胞或ES细胞等干细胞进行特异性标记。
所述流式细胞术用荧光探针还可以通过被摄入到细胞内部来标记细胞。作为这样的细胞，例如可举出巨噬细胞、树突细胞、免疫细胞、癌细胞、iPS细胞等。使用将荧光探针摄入到细胞内部的巨噬细胞、树突细胞、免疫细胞、癌细胞、iPS细胞等，能够在免疫细胞疗法中确认巨噬细胞、树突细胞在体内的动态。
本发明的流式细胞术用荧光探针可以通过使载体分子与卟啉结合、优选共价键合，形成载体分子和卟啉的复合物来制作。另外，根据需要，也可以使细胞表面结合物质与载体分子和卟啉的复合物中的载体分子结合。在本发明的流式细胞术用荧光探针中，卟啉的激发波长和荧光波长优选在与载体分子结合前后几乎不发生变化。
载体分子为聚硅氧烷时，本发明的流式细胞术用荧光探针例如可以如下制作。
首先，使具有氨基的硅烷与具有羧基的卟啉反应，得到在分子内含有卟啉的硅烷(以下也记为“卟啉-硅烷”)。具体而言，在溶剂中使具有氨基的硅烷和具有羧基的卟啉溶解，加入缩合剂，引起酰胺化反应。作为溶剂，例如可以使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等。作为缩合剂，例如可以使用碳二亚胺等。作为碳二亚胺，没有特别限定，例如可以举出N,N’-二丙基碳二亚胺等。为了减少副产物，可以添加琥珀酰亚胺等。作为琥珀酰亚胺，没有特别限定，例如可以举出N-羟基琥珀酰亚胺等。反应温度没有特别限定，从合成成本的观点出发，例如优选为20～150℃，更优选为20～80℃。反应时间没有特别限定，例如优选为1～24小时，更优选为3～15小时。反应后，进行离心分离，将产物作为沉淀进行回收，由此可以得到卟啉-硅烷。
在上述反应中，含有氨基的硅烷和具有羧基的卟啉的摩尔比(含有氨基的硅烷：具有羧基的卟啉)优选为4：1～1：1，更优选为4：1～2：1，进一步优选为4：1。
接着，通过上述得到的卟啉-硅烷与具有一种以上官能团的硅烷(以下也记为“官能团硅烷”)的水解、缩合反应，得到聚硅氧烷与卟啉的复合物。具体而言，使卟啉-硅烷和官能团硅烷溶解于溶剂中，进而加入碱溶液使其反应。作为溶剂，例如可以使用DMF等。作为碱溶液，例如可以使用pH为8以上的氨水、氢氧化钠的水溶液等。反应温度没有特别限定，从合成成本的观点出发，例如优选为20～200℃，更优选为60～80℃。反应时间没有特别限定，例如优选为1～72小时，更优选为3～24小时。反应后，通过进行离心分离，将产物作为沉淀进行回收，由此可以得到聚硅氧烷上共价键合有卟啉的聚硅氧烷与卟啉的复合物。
在上述反应中，卟啉-硅烷与官能团硅烷的摩尔比(卟啉-硅烷：官能团硅烷)优选为1：2～1：100、更优选为1：21～1：50、进一步优选为1：30～1：40。
作为具有氨基的硅烷，只要具有氨基即可，没有特别限定。例如，可以优选使用下述通式(II)所示的化合物。
Xi-Si(R2a)j(OR1a)(4-i-j) (II)
通式(II)中，X表示H2NCmH2m-、H2NCnH2n-HNCmH2m-、或Ph-NHCmH2m-[这里，Ph表示苯基]所示的基团，其中优选H2NCmH2m-、或H2NCnH2n-HNCmH2m-所示的基团。m和n相同或不同，表示1～6的整数。m优选为1、2、3或4，更优选为1、2或3。n优选为1、2、3或4，更优选为1、2或3。另外，上述的H2NCmH2m-、H2NCnH2n-HNCmH2m-、Ph-NHCmH2m-分别优选为H2N(CH2)m-、H2N(CH2)n-HN(CH2)m-、Ph-NH(CH2)m-。
另外，R1a及R2a相同或不同，表示碳原子数为1～6的烷基。该烷基可以为直链状或支链状，优选为直链状。另外，优选碳原子数为1、2、3或4的烷基。作为碳原子数为1～6的烷基，具体而言，可例示出甲基、乙基、正丙基、异丙基，正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1-乙基丙基，异戊基、新戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、异己基、3-甲基戊基等。其中，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基。
另外，i表示1或2，j表示0或1，[其中(4-i-j)≥2]。即，(i，j)表示(1，0)、(1，1)或(2，0)。
作为通式(II)所示的化合物，例如可列举出3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基甲基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、三甲氧基[3-(苯基氨基)丙基]硅烷等。其中，优选3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和/或3-氨基丙基三甲氧基硅烷。
上述具有氨基的硅烷例如可以使用东京化成工业株式会社制的市售品。另外，具有氨基的硅烷可以单独使用1种或组合使用2种以上。
官能团硅烷只要具有一种以上的官能团就没有特别限定，可以是具有一种官能团的单官能团硅烷，也可以是具有两种以上官能团的多官能团硅烷。作为具有官能团的硅烷，例如可优选使用通式(III)所示的化合物：
Yp-Si(R2c)q(OR1c)(4-p-q) (III)
上述通式(III)中，Y表示CH2＝CH-所示的基团、CH2＝CHCH2-所示的基团、具有链烯的基团、具有硫醇的基团、具有二硫化物的基团、具有胺的基团、具有酯的基团、具有酰胺的基团、具有羧酸的基团、具有脲的基团、具有硫脲的基团、OCNCH2CH2-所示的基团、ClCαH2α-所示的基团、HSCβH2β-所示的基团、CF3CγF2γ-CδH2δ-所示的基团、CH2＝C(CH3)COOCεH2ε-所示的基团、CH2＝CHCOOCζH2ζ-所示的基团、HN-CONH-CηH2η-所示的基团、下述化学式(a)所示的基团、下述化学式(b)所示的基团、碳原子数为1～18的烷基或苯基。
[化学式编号3]
[化学式编号4]
在上述中，α、β、δ、ε、ζ、η、θ及ι分别独立地表示1～6的整数、优选表示1、2、3或4的整数，γ表示0～8的整数、优选为0、1、2、3、4、5、6或7的整数。另外，碳原子数为1～18的烷基优选碳原子数为1～12，更优选碳原子数为1、2、3、4、5、6、7或8。另外，可以为直链状也可以为支链状，优选为直链状。另外，上述ClCαH2α-、HSCβH2β-、CF3CγF2γ-CδH2δ-、CH2＝C(CH3)COOCεH2ε-、CH2＝CHCOOCζH2ζ-、HN-CONH-CηH2η-分别优选为Cl(CH2)α-、HS(CH2)β-、CF3(CF2)γ-(CH2)δ-、CH2＝C(CH3)COO(CH2)ε-、CH2＝CHCOO(CH2)ζ-、HN-CONH-(CH2)η-。
另外，R1c表示碳原子数为1～6的烷基或-(CH2)τ-OCH3，R2c表示碳原子数为1～6的烷基或苯基。R1c及R2c可以相同也可以不同。R1c及R2c中的任一个中，碳原子数为1～6的烷基也可以为直链状或支链状，优选为直链状。另外，优选碳原子数为1、2、3或4的烷基。作为碳原子数为1～6的烷基，具体而言，可例示出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1-乙基丙基、异戊基、新戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、异己基、3-甲基戊基等。其中，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基。另外，τ表示1～4的整数(优选为1、2或3)。
另外，p表示1、2或3，q表示0、1或2，其中(4-p-q)≥1。即，(p、q)表示(1、0)、(1、1)、(1、2)、(2、0)、(2、1)或(3、0)。
另外，作为官能团硅烷，例如也可以优选使用下述通式(IV)所示的化合物。
Z-SiCl3 (IV)
上述通式(IV)中，Z表示CH2＝CH-所示的基团、CH2＝CHCH2-所示的基团、具有链烯的基团、具有硫醇的基团、具有二硫化物的基团、具有胺的基团、具有酯的基团、具有酰胺的基团、具有羧酸的基团、具有脲的基团、具有硫脲的基团、ClCκH2κ-所示的基团、CF3CλF2λ-CξH2ξ-所示的基团、碳原子数为1～18的烷基、苯基或环己基。κ及ξ分别独立地表示1～6的整数、优选表示1、2、3或4的整数，λ表示0～8的整数、优选表示0、1、2、3、4、5、6或7的整数。另外，碳原子数为1～18的烷基优选碳原子数为1～12，更优选碳原子数为1、2、3、4、5、6、7或8。另外，可以为直链状也可以为支链状，优选为直链状。另外，上述ClCκH2κ-、CF3CλF2λ-CξH2ξ-分别优选为Cl(CH2)κ-、CF3(CF2)λ-(CH2)ξ-。
另外，作为多官能团性硅烷，也可以使用N-[2-(N-乙烯基苄基氨基)乙基]-3-氨基丙基三甲氧基硅烷盐酸盐。
作为式(III)所示的化合物，具体而言，可以举出四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、四丙氧基硅烷、四丁氧基硅烷、四异丙氧基硅烷、烯丙基三乙氧基硅烷、烯丙基三甲氧基硅烷、二乙氧基甲基乙烯基硅烷、二甲氧基甲基乙烯基硅烷、三乙氧基乙烯基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷、(氯甲基)三乙氧基硅烷、3-氯丙基二甲氧基甲基硅烷、3-氯丙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、异氰酸3-(三乙氧基甲硅烷基)丙酯、甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯、三乙氧基-1H,1H,2H,2H-十三氟-正辛基硅烷、丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯、3-氯丙基三甲氧基硅烷、1-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]脲、三甲氧基(3,3,3-三氟丙基)硅烷、3-脲基丙基三乙氧基硅烷、二乙氧基(3-缩水甘油氧基丙基)甲基硅烷、3-缩水甘油氧基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷、2-氰基乙基三乙氧基硅烷、二乙酰氧基二甲基硅烷、二乙氧基二甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、二甲氧基二苯基硅烷、二甲氧基甲基苯基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、己基三甲氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷、戊基三乙氧基硅烷、三乙酰氧基甲基硅烷、三乙氧基乙基硅烷、三甲氧基(甲基)硅烷、三甲氧基苯基硅烷、三甲氧基(丙基)硅烷等。其中，优选3-巯基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷等。
另外，作为通式(IV)所示的化合物，具体而言，可以举出烯丙基三氯硅烷、三氯乙烯基硅烷、3-氯丙基三氯硅烷、三氯(1H,1H,2H,2H-十七氟癸基)硅烷，三氯(1H,1H,2H,2H-十三氟-正辛基)硅烷、丁基三氯硅烷、环己基三氯硅烷、癸基三氯硅烷、十二烷基三氯硅烷、乙基三氯硅烷、正辛基三氯硅烷、苯基三氯硅烷、三氯-2-氰基乙基硅烷、三氯己基硅烷、三氯(甲基)硅烷、三氯十八烷基硅烷、三氯(丙基)硅烷、三氯十四烷基硅烷等。
上述官能团硅烷例如可以使用东京化成工业株式会社制的市售品。另外，官能团硅烷可以单独使用1种或组合使用2种以上。
接着，根据需要，使细胞表面结合物质与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子结合。具体而言，通过在由聚硅氧烷与卟啉的复合物构成的纳米粒子的水溶液中加入细胞表面结合物质的水溶液、在4～50℃的温度下搅拌1～24小时，使其反应。例如，作为细胞表面结合物质，可以使叶酸与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子结合。使用经与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子表面的官能团结合的官能团修饰的细胞表面结合物质。例如，在形成了聚硅氧烷与卟啉的复合物的官能团硅烷为3-巯基丙基(二甲氧基)甲基硅烷、(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷及(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷等具有硫醇基的情况下，作为叶酸，可以使用在聚乙二醇(PEG)的两末端分别结合有马来酰亚胺基及叶酸的物质。
在上述反应中，与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子的叶酸共价键合的官能团、和对叶酸进行修饰并与聚硅氧烷和卟啉的复合物共价键合的官能团的摩尔比(与由聚硅氧烷和卟啉的复合物构成的纳米粒子的叶酸共价键合的官能团：对叶酸进行了修饰的官能团)优选为1：1～3：1、更优选为1：1～2：1、进一步优选为1：1。另外，本发明的流式细胞术用荧光探针除了卟啉之外还含有荧光色素b时，可以与叶酸同时使荧光色素b与聚硅氧烷和卟啉的复合物结合。
在使用TCPP作为卟啉的情况下，在聚硅氧烷与卟啉的复合物中，TCPP的羧基优选形成酰胺键而存在，TCPP更优选通过酰胺键嵌入硅氧烷网络(聚硅氧烷的主链)中。本发明中，聚硅氧烷与卟啉的复合物等荧光探针的结构可以如后所述，通过傅里叶变换红外分光法进行分析。
所述流式细胞术用荧光探针没有特别限定，从适于利用流式细胞仪进行的流式细胞术分析的观点出发，优选含有1质量％以上的卟啉的4个吡咯的环状结构部分(卟啉)，更优选含有5～90质量％。本发明中，如后所述，通过由硅氧烷和卟啉构成的纳米粒子等荧光探针的热重-差热分析，可以测定卟啉等荧光色素、二氧化硅聚合物等载体分子的含量。
所述流式细胞术用荧光探针没有特别限定，从易于标记细胞的观点出发，平均粒径优选为3～250nm、更优选为10～80nm。本发明中，平均粒径用动态光散射法测定。
(荧光标记细胞的分选方法)
本发明的荧光标记细胞的分选方法包含用所述流式细胞术用荧光探针对细胞进行标记的工序、和利用流式细胞仪对用流式细胞术用荧光探针标记的荧光标记细胞进行分选的工序。
首先，用荧光探针对细胞进行荧光标记。细胞的标记可以通过使流式细胞术用荧光探针结合于细胞表面、或者使流式细胞术用荧光探针被摄入到细胞内而进行。在使荧光探针结合于细胞表面的情况下，荧光探针具有细胞表面结合物质。例如，在荧光探针具有叶酸的情况下，能够与来自人的宫颈癌的HeLa S3细胞、来自人的结肠癌的HCT116细胞等癌细胞的表面结合而对这些癌细胞进行标记。具体而言，通过在加有荧光探针的细胞培养用培养基中培养细胞，可以用荧光探针对细胞进行标记。作为细胞，可以举出iPS细胞或ES细胞等干细胞、癌细胞以及肝硬化细胞等疾病相关细胞等。
然后，用流式细胞仪对经流式细胞术用荧光探针标记的荧光标记细胞进行分选。利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选通过对进行了荧光标记操作后的细胞照射350～650nm的激发光并检测荧光来进行。具体而言，通过将用流式细胞术用荧光探针进行荧光标记操作后的细胞供给至流式细胞仪，在特定的激发波长和荧光波长、例如350～650nm的激发波长、400～800nm的荧光波长下进行流式细胞分析，可以对用流式细胞术用荧光探针进行了荧光标记的荧光标记细胞进行分选。作为流式细胞仪，没有特别限定，可以使用所有的流式细胞仪。
实施例
以下，使用实施例对本发明进行具体说明。另外，本发明并不限定于下述的实施例。
(试剂)
四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、在两末端结合有叶酸和马来酰亚胺基的聚乙二醇(PEG)(分子量为3400，以下也简记为“FA-PEG-Mal”)、结合有马来酰亚胺基的吲哚菁绿(分子量为853，以下也简记为“ICG-Mal”)均从东京化成工业株式会社获得。MPTMS、FA-PEG-Mal、ICG-Mal的结构式如下所示。
[化学式编号5]
[化学式编号6]
[化学式编号7]
(实施例1)
(荧光探针的制作)
<载体分子与卟啉的复合物的制作>
(1)在使TCPP溶解于DMF中而成的TCPP的DMF溶液(3.8mM、32mL)中加入APTES(462μmol)，接着加入N,N′-二丙基碳二亚胺(480μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(480μmol)，在50℃下搅拌24小时。
(2)将上述得到的卟啉-硅烷的DMF溶液200μL(卟啉-硅烷0.75μmol)与MPTMS 5μL(0.027mmol)混合。在得到的混合液中加入500μL的DMF和300μL的氨水(浓度：28质量％，pH为11)，在80℃下进行24小时反应。
(3)24小时后，通过离心分离(15000rpm、20分钟)将产物作为沉淀物回收，将产物用水和乙醇洗涤数次，最终使其分散于1mL的水中。
(4)得到的物质是以聚硅氧烷为载体分子、以卟啉为荧光色素的在聚硅氧烷上共价键合有卟啉的聚硅氧烷与卟啉的复合物，通过动态光散射法(Beckman Coulter制“DelsaMax PRO”)进行测定，结果为平均粒径为约40nm的荧光杂化纳米粒子(以下也简记为“PPS HNPs”)。
<使荧光色素b与载体分子和卟啉的复合物结合的工序>
(1)向上述得到的PPS HNPs的水分散液1mL中添加ICG-Mal的水溶液63μL(浓度：2mg/mL、ICG-Mal：1.48×10-4mmol)，在30℃下搅拌3小时使其反应。
(2)反应后，通过离心分离(15000rpm、20分钟)将产物作为沉淀物回收，用水洗涤数次，最终分散于1mL的水中。
(3)所得物质是在聚硅氧烷上共价键合有卟啉及吲哚菁绿(荧光色素b)的复合物(荧光探针)，通过动态光散射法(Beckman Coulter制“DelsaMax PRO”)进行测定，结果是平均粒径约为50nm的荧光杂化纳米粒子(以下也简记为“ICG-PPS HNPs”)。
(实施例2)
(荧光探针的制作)
<载体分子与卟啉的复合物的制作>
与实施例1同样地得到PPS HNPs。
<使荧光色素b及细胞表面结合物质与载体分子和卟啉的复合物结合的工序>
(1)向上述得到的PPS HNPs的水分散液1mL中添加FA-PEG-Mal的水溶液251μL(浓度：2mg/mL、FA-PEG-Mal：1.48×10-4mmol)和ICG-Mal的水溶液63μL(浓度：2mg/mL、ICG-Mal：1.48×10-4mmol)，在30℃下搅拌3小时。
(2)反应后，通过离心分离(15000rpm、20分钟)将产物作为沉淀物回收，用水洗涤数次，最终分散于1mL的水中。
(3)得到的物质是在聚硅氧烷上共价键合有卟啉、吲哚菁绿(荧光色素b)和叶酸(细胞表面结合物质)的复合物(荧光探针)，通过动态光散射法(Beckman Coulter制“DelsaMax PRO”)进行测定，结果是平均粒径为约65nm的荧光杂化纳米粒子(以下也简记为“FA-PEG/ICG-PPS HNPs”)。
(利用傅里叶变换红外分光法进行确认)
将实施例1及实施例2中得到的PPS HNPs和作为原料使用的TCPP用傅里叶变换红外分光光度计(Nicolet公司制“NEXUS470”)进行分析，将PPS HNPs及TCPP的FT-IR光谱示于图1。由图1的FT-IR光谱可知，均在3430～3250cm-1下显示来源于吡咯环的峰。在PPS HNPs中，TCPP在1800～1640cm-1的羧酸(羧基)的峰消失而显现1740～1620cm-1的来源于酰胺的峰，由此确认了TCPP的羧基形成酰胺键，与硅氧烷共价键合而成(通过卟啉-硅烷和MPTMS的水解、缩合形成的)的聚硅氧烷与卟啉的复合物已可靠地合成。另外，PPS HNPs在1260～1010cm-1(νSi-O-Si)、870～740cm-1(νSi-O-Si)、540～410cm-1(σSi-O-Si)处显现出来源于硅氧烷键的峰。即，确认了在PPS HNPs中，利用卟啉-硅烷和MPTMS(具有官能团的硅烷)形成了硅氧烷网络，卟啉通过酰胺键嵌入到硅氧烷网络中。
用29Si固体NMR对实施例1和实施例2中得到的PPS HNPs进行结构分析，将PPS HNPs的29Si固体NMR光谱示于图2。从图2确认了-58和-69ppm处出现峰。推测-58ppm的峰表示下述化学式所示的T2结构，-69ppm的峰表示下述化学式所示的T3结构。由该结果确认了，虽然在PPS HNPs中存在一部分T2结构的Si，但大部分MPTMS和卟啉硅烷受到水解、缩聚。卟啉与硅氧烷共价键合而形成复合物。
[化学式编号8]
(热重-差热分析)
使用热分析仪(Rigaku制，TG8120)对PPS HNPs进行热重-差热分析(TG-DTA)。图3中示出了PPS HNPs的TG(热重)及DTA(差示热)曲线。分析的结果推测，100℃下的重量减少是因吸附水而导致的，300℃下的重量减少是因氨基丙基部分和巯基丙基部分的燃烧而导致的，300～400℃下的重量减少是因卟啉的4个吡咯的环状结构部分(卟啉)的分解而导致的，剩余的部分是硅氧烷部分。具体而言，推测在PPS HNPs中含有7重量％的吸附水、29重量％的氨基丙基部分和巯基丙基部分、17重量％的卟啉的4个吡咯的环状结构部分(卟啉)、47重量％的聚硅氧烷部分。
(与PPS HNPs结合的FA-PEG和ICG的定量)
为了求出与PPS HNPs结合的FA-PEG和ICG的量，，在实施例2中，用分光光度计(日本分光公司制“V-570”)测定反应结束后的上清液(1mL)的吸收光谱，计算未反应的FA-PEG-Mal、ICG-Mal量。图4A中示出了上清液的吸收光谱。由于FA-PEG-Mal在叶酸的水溶液中的吸光系数不清楚，因此制作叶酸的峰值波长377nm下的标准曲线，由此计算浓度。图4B中示出了叶酸的标准曲线。在图4A中，377nm的吸光度为0.032，由此求出的上清液中的叶酸的浓度为12nmol/mL。所使用的FA-PEG-Mal量为148nmol，因此确认了92％的FA-PEG-Mal发生了反应。接着，对于ICG-Mal，使用ICG的水溶液中的800nm下的摩尔吸光系数ε800＝147000L/mol·cm，根据朗伯-比尔(Lambert–Beer)公式A800＝ε800cL计算上清液中的浓度，结果为0.094nmol/mL。由于所使用的ICG-Mal量为148nmol，因此能够估计99.9％的ICG-Mal发生了反应。由以上的计算结果判断，92％的FA-PEG、大致100％的ICG结合于PPS HNPs。同样地，在实施例1中，求出与PPS HNPs结合的ICG的量，结果确认到大致100％的ICG结合于PPS HNPs。
(利用分光法进行吸收光谱的确认)
用分光光度计(日本分光公司制“V-570”)测定实施例1和实施例2中得到的PPSHNPs的水分散液(也称为水溶液)和实施例2中得到的FA-PEG/ICG-PPS HNPs的水溶液的吸收光谱，将其结果示于下述图5中。由图5的PPS HNPs以及FA-PEG/ICG-PPS HNPs的吸收光谱确认了，通过ICG与PPS HNPs结合，在波长700～900nm附近出现来源于ICG的峰。另外确认了，在FA-PEG/ICG-PPS HNPs中，来源于卟啉的380～650nm附近的峰几乎没有变化。
(荧光探针的波长特性确认)
使用实施例2中得到的FA-PEG/ICG-PPS HNPs的水溶液，用日本分光公司制的分光荧光光度计FP-6600分析了FA-PEG/ICG-PPS HNPs的激发波长光谱和荧光波长光谱。将其结果示于图6。图6A表示用于体外荧光成像的短波长侧的波长特性，图6B表示用于体内荧光成像中使用的长波长侧的波长特性。由图6A和图6B可知，在最大激发波长425nm、最大荧光波长655nm的短波长侧和最大激发波长650nm、最大荧光波长905nm的长波长侧的任一侧，斯托克斯位移(Stokes shift)均大。确认了ICG-PPS HNPs和FA-PEG/ICG-PPS HNPs均是具有与载体分子(聚硅氧烷)结合的卟啉和ICG(荧光色素b)且在2个荧光色素之间不产生荧光共振能量移动的荧光探针。
(利用荧光显微镜进行的分析)
(1)细胞
使用来自作为与小鼠同种的细胞的小鼠的巨噬细胞的RAW264.7细胞、来自作为与小鼠不同种的细胞的人的宫颈癌的HeLa S3细胞和来自人的结肠癌的HCT116细胞。在实施例中，细胞和细胞培养用培养基从Sigma-Aldrich公司获得。细胞培养皿使用了ThermoFisher Scientific公司制的细胞培养皿。
(2)细胞的荧光探针标记
(a)将细胞接种于细胞培养皿(直径为35mm)中的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)上(0.3×105细胞/mL)，培养一晚。
(b)对于经培养的细胞，更换为加有荧光探针(50μg/mL)的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)，进行24小时培养。此时，对于RAW264.7细胞，更换为加有荧光探针ICG-PPS HNPs的细胞培养用培养基，对于HeLa S3细胞和HCT116细胞，更换为加有荧光探针FA-PEG/ICG-PPS HNPs的细胞培养用培养基。
(c)弃去上清，用2mL的磷酸缓冲生理盐水(1×PBS，pH为7.4，和光纯药“D-PBS(-)(045-29795)”)洗涤培养细胞。
(d)弃去上清，在培养细胞中添加2mL的4％多聚甲醛(PFA)，在室温(20±5℃)下静置30分钟。
(e)弃去上清，向培养细胞中加入1mL 1×PBS。将该工序重复3次。
(3)利用荧光显微镜进行的观察
使用Life Technologies公司的荧光显微镜EVOS(注册商标)FL Cell ImagingSystem观察用荧光探针标记了的荧光标记细胞。任一细胞均在激发波长为422nm、荧光波长为655nm下进行观察。将其结果示于图7。
图7A中示出了RAW 264.7细胞的明视野图像(Bright field)、使用了荧光色素DAPI(4，6-二脒-2-苯基吲哚)的细胞核的荧光图像(DAPI)、利用ICG-PPS HNPs(荧光探针)得到的荧光成像、将这三个图像重叠而得到的图像(融合)。从图7A的明视野图像可知存在细胞。另外，从DAPI的图像确认到被DAPI染色的细胞核。由ICG-PPS HNPs的图像可知，细胞被荧光探针标记。由融合的图像可知，在RAW4264.7细胞中，在细胞质中大量观察到荧光探针产生的荧光，核不产生荧光。由该结果确认了，ICG-PPS HNPs(荧光探针)被摄入到细胞内并停留在细胞质中。认为RAW264.7细胞是巨噬细胞，通过吞噬能力将荧光探针摄入到细胞内，荧光探针聚集在细胞质中。
图7B中示出了HeLa S3细胞的明视野图像(Bright field)、使用了荧光色素DAPI的细胞核的荧光图像(DAPI)、利用FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针得到的荧光成像、将这三个图像重叠而得到的图像(融合)。从图7B的明视野图像可知存在细胞。另外，从DAPI的图像确认到被DAPI染色的细胞核。由FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针的图像可知，细胞被荧光探针标记。由融合的图像可知，HeLa S3细胞的荧光探针的荧光包含细胞核在内的细胞整体发出荧光。由该结果可知，荧光探针与细胞表面结合，细胞整体发光而被观测到。认为癌细胞具有使叶酸与细胞表面结合的受体，荧光探针(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)通过叶酸与癌细胞即HCT116细胞的表面结合。
图7C中示出了HCT116细胞的明视野图像(Bright field)、使用了荧光色素DAPI的细胞核的荧光图像(DAPI)、利用FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针得到的荧光成像、将这三个图像重叠得到的图像(融合)。从图7C的明视野图像可知存在细胞。另外，从DAPI的图像确认到被DAPI染色的细胞核。由FA-PEG/ICG-PPS HNPs荧光探针的图像可知，细胞被荧光探针标记。由融合的图像可知，HCT116细胞的荧光探针的荧光包含细胞核在内的细胞整体发出荧光。由该结果可知，荧光探针与细胞表面结合，细胞整体发光而被观测到。认为癌细胞具有使叶酸与细胞表面结合的受体，荧光探针(FA-PEG/ICG-PPS HNPs)经由叶酸与癌细胞即HCT116细胞的表面结合。
(利用流式细胞仪进行的分析)
(1)细胞
使用来自作为与小鼠同种的细胞的小鼠的巨噬细胞的RAW264.7细胞和来自作为与小鼠不同种的细胞的人的宫颈癌的HeLa S3细胞和来自人的结肠癌的HCT116细胞。
(2)细胞的荧光探针标记
(a)将细胞以下述表1所示的接种量接种于细胞培养皿(直径为35mm)中的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)上，培养一晚。
(b)对于经培养的细胞，更换为下述表1所示的加有荧光探针(50μg/mL)的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)，进一步进行48小时培养。
(c)从细胞培养皿回收细胞。此时，HeLa S3细胞和HCT116细胞的回收中使用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液。
(d)将回收液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，将细胞悬浮于400μL的细胞培养用培养基(加有10％FBS的DMEM培养基)中。
(e)将悬浮液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，在细胞中添加1mL 4％PFA，在室温(20±5℃)下静置30分钟。
(f)将再悬浮液以1000转离心分离5分钟后，弃去上清，在细胞中加入1mL 1×PBS。将该工序重复3次。
表1
(3)利用流式细胞仪进行的观察
使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20观察用荧光探针进行了标记的细胞。
图8中示出了在激发波长为405nm、荧光波长为670nm下进行观察的结果。图8A是使用用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW 264.7细胞的结果，图8B是使用用FA-PEG/ICG-PPSHNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果，图8C是使用用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
图9中示出了在激发波长为405nm、荧光波长为710nm下进行观察的结果。图9A是使用用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW 264.7细胞的结果，图9B是使用用FA-PEG/ICG-PPSHNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果，图9C是使用用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
图10中示出了在激发波长为405nm、荧光波长为780nm下进行观察的结果。图10A是使用用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW 264.7细胞的结果，图10B是使用用FA-PEG/ICG-PPSHNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果，图10C是使用用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
图11中示出了在激发波长为640nm、荧光波长为780nm下进行观察的结果。图11A是使用用ICG-PPS HNPs进行了标记的RAW 264.7细胞的结果，图11B是使用用FA-PEG/ICG-PPSHNPs进行了标记的HeLa S3细胞的结果，图11C是使用用FA-PEG/ICG-PPS HNPs进行了标记的HCT116细胞的结果。
由图8～11可知，在任一的激发波长及荧光波长下，能够将全部的细胞样品中经荧光标记的细胞和未经荧光标记的细胞分离来进行观察。作为光强度，存在100～10000倍左右的差。对细胞利用荧光探针进行标记后，能够明确判别并分离经荧光标记的细胞和未经荧光标记的细胞。通过使用流式细胞仪，能够仅分选出被荧光探针标记的荧光标记细胞。

Claims (10)

1.一种流式细胞术用荧光探针，其特征在于，其包含载体分子和与所述载体分子结合的卟啉，并且激发波长为350～650nm的范围。
2.根据权利要求1所述的流式细胞术用荧光探针，其中，所述载体分子为聚硅氧烷。
3.根据权利要求1或2所述的流式细胞术用荧光探针，其通过特异性结合于细胞表面来标记细胞。
4.根据权利要求1或2所述的流式细胞术用荧光探针，其通过被摄入到细胞内部来标记细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的流式细胞术用荧光探针，其中，所述流式细胞术用荧光探针的荧光波长为400～800nm的范围。
6.一种利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选方法，其特征在于，其包含：
用流式细胞术用荧光探针对细胞进行荧光标记的工序、和
利用流式细胞仪对用流式细胞术用荧光探针标记的荧光标记细胞进行分选的工序，
所述流式细胞术用荧光探针包含载体分子和与所述载体分子结合的卟啉、且激发波长为350～650nm的范围，所述利用流式细胞仪进行的荧光标记细胞的分选通过对荧光标记细胞照射波长为350～650nm的激发光、对荧光进行检测来进行。
7.根据权利要求6所述的荧光标记细胞的分选方法，其中，所述载体分子为聚硅氧烷。
8.根据权利要求6或7所述的荧光标记细胞的分选方法，其中，所述流式细胞术用荧光探针通过特异性结合于细胞表面来标记细胞。
9.根据权利要求6或7所述的荧光标记细胞的分选方法，其中，所述流式细胞术用荧光探针通过被摄入到细胞内部来标记细胞。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的荧光标记细胞的分选方法，其中，所述流式细胞术用荧光探针的荧光波长为400～800nm的范围。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110108682A (zh) * 2019-05-08 2019-08-09 济南大学 几种非典型红光含硅染料的应用
CN111234813A (zh) * 2020-01-24 2020-06-05 复旦大学 卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova-1及其制备方法和应用
CN111848664A (zh) * 2020-07-15 2020-10-30 河西学院 用于比色检测氟离子的受体化合物及其制备方法和应用
CN113502320A (zh) * 2021-08-06 2021-10-15 海南微氪生物科技股份有限公司 一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102363819B1 (ko) * 2014-02-28 2022-02-17 주식회사 동진쎄미켐 실세스퀴옥산 복합 고분자 및 이의 제조방법
WO2023091767A1 (en) * 2021-11-19 2023-05-25 Bioaffinity Technologies, Inc. Compositions and methods for use in flow cytometry

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991012801A1 (en) * 1990-02-20 1991-09-05 The University Of British Columbia Compositions containing green porphyrins to destroy malignant cells in mononuclear cell populations
WO2007064841A3 (en) * 2005-11-30 2009-04-30 Univ North Carolina State Porphyrinic compounds for use in flow cytometry
WO2009137062A2 (en) * 2008-05-05 2009-11-12 The General Hospital Corporation Photoactivatable antimicrobial agents and therapeutic and diagnostic methods of using same
JP5810195B1 (ja) * 2014-07-01 2015-11-11 古河電気工業株式会社 紫外励起蛍光粒子、これを用いた検出方法、画像表示方法、画像表示スクリーンおよび画像表示装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3420765B2 (ja) * 1992-09-14 2003-06-30 エス・アール・アイ・インターナシヨナル レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ
WO2007047925A2 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 North Carolina State University Swallowtail motifs for imparting water solubility to porphyrinic compounds
CN106519588B (zh) * 2009-11-09 2019-08-20 华盛顿大学商业化中心 官能化发色聚合物点及其生物共轭体
US20140363496A1 (en) * 2011-01-07 2014-12-11 Vindico NanoBio Technology Inc. Compositions and Methods for Inducing Nanoparticle-mediated Microvascular Embolization of Tumors

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991012801A1 (en) * 1990-02-20 1991-09-05 The University Of British Columbia Compositions containing green porphyrins to destroy malignant cells in mononuclear cell populations
WO2007064841A3 (en) * 2005-11-30 2009-04-30 Univ North Carolina State Porphyrinic compounds for use in flow cytometry
WO2009137062A2 (en) * 2008-05-05 2009-11-12 The General Hospital Corporation Photoactivatable antimicrobial agents and therapeutic and diagnostic methods of using same
JP5810195B1 (ja) * 2014-07-01 2015-11-11 古河電気工業株式会社 紫外励起蛍光粒子、これを用いた検出方法、画像表示方法、画像表示スクリーンおよび画像表示装置

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110108682A (zh) * 2019-05-08 2019-08-09 济南大学 几种非典型红光含硅染料的应用
CN110108682B (zh) * 2019-05-08 2021-09-24 济南大学 几种非典型红光含硅染料的应用
CN111234813A (zh) * 2020-01-24 2020-06-05 复旦大学 卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova-1及其制备方法和应用
CN111234813B (zh) * 2020-01-24 2022-12-20 复旦大学 卵泡颗粒细胞近红外荧光探针Nirova-1及其制备方法和应用
CN111848664A (zh) * 2020-07-15 2020-10-30 河西学院 用于比色检测氟离子的受体化合物及其制备方法和应用
CN113502320A (zh) * 2021-08-06 2021-10-15 海南微氪生物科技股份有限公司 一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法

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