JPWO2017187716A1 - フローサイトメトリー用蛍光プローブ及び蛍光標識細胞の選別方法 - Google Patents

フローサイトメトリー用蛍光プローブ及び蛍光標識細胞の選別方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、フローサイトメトリー用蛍光プローブであって、担体分子と、前記担体分子に結合しているポルフィリンを含み、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲であるフローサイトメトリー用蛍光プローブに関する。本発明は、また、フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別方法であって、細胞を前記のフローサイトメトリー用蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、フローサイトメトリー用蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーターによって選別する工程を含み、前記フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別は、蛍光標識細胞に波長が３５０〜６５０ｎｍの励起光を照射し、蛍光を検出することで行う蛍光標識細胞の選別方法に関する。

Description

本発明は、フローサイトメトリー用蛍光プローブ及び蛍光標識細胞の選別方法に関する。
近年、癌や発生学の研究領域において、マウス等の動物を用いた生体内の蛍光イメージング解析が広く行われている。マウスに移植したｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等の細胞が移植後、どの位置で分化、生育、転移するかと言った情報の解析は、蛍光イメージング解析がメジャーな手法である。特にマウス等の動物の生存を維持したまま、移植細胞の経過を観察するには、現状、蛍光イメージング解析を用いる手法しかなく、特に重要な解析手法として位置づけられている。
生体内の移植細胞の蛍光イメージグ解析は、通常、移植する前に予めインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞を蛍光プローブで標識し、該細胞をマウス等の生体内に移植し、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）蛍光イメージング装置で観察することで行われる。例えば、特許文献１には、アニオン性ポルフィリンとカチオン性オルガノアルコキシシラン及び非カチオン性シランを結合させたポルフィリン含有複合体を生体観察のための近赤外蛍光プローブとして用いることが記載されている。
特開２０１３−１３６５５５号公報
しかしながら、生体観察用の近赤外蛍光プローブの場合、現状、蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置で蛍光を検出することができず、インビトロで近赤外蛍光プローブと結合している蛍光標識細胞を確認することは困難である。
本発明は、前記従来の問題を解決するため、フローサイトメーターを用いたフローサイトメトリー分析に用いることができるフローサイトメトリー用蛍光プローブ及び蛍光標識細胞の選別方法を提供する。
本発明は、フローサイトメトリー用蛍光プローブであって、担体分子と、前記担体分子に結合しているポルフィリンを含み、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲であることを特徴とするフローサイトメトリー用蛍光プローブに関する。
本発明は、また、フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別方法であって、細胞をフローサイトメトリー用蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、フローサイトメトリー用蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーターによって選別する工程を含み、前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合しているポルフィリンを含み、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲であり、前記フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別は、蛍光標識細胞に波長が３５０〜６５０ｎｍの励起光を照射し、蛍光を検出することで行うことを特徴とする蛍光標識細胞の選別方法に関する。
前記担体分子は、ポリシロキサンであることが好ましい。
前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識してもよく、細胞内部に取り込まれることで細胞を標識してもよい。
前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、蛍光波長が４００〜８００ｎｍであることが好ましい。
本発明は、フローサイトメーターによるフローサイトメトリー分析に用いることができるフローサイトメトリー用蛍光プローブを提供することができる。また、該フローサイトメトリー用蛍光プローブを用いて細胞を標識することで、フローサイトメーターによって蛍光標識細胞を選別することができる。
図１は、テトラキス（４-カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、及び、ＴＣＰＰと（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）のハイブリット分子（ＰＰＳ ＨＮＰｓ）のフーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ-ＩＲ）にて測定したＦＲ-ＩＲスペクトルを示す。 図２は、ＰＰＳ ＨＮＰｓの29Ｓｉ固体核磁気共鳴（固体ＮＭＲ）スペクトルを示す。 図３は、ＰＰＳ ＨＮＰｓのＴＧ及びＤＴＡ曲線を示す。 図４Ａは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ生成反応後の上澄み液の吸収スペクトルを示し、図４Ｂは、葉酸の濃度検量線を示す。 図５は、ＰＰＳ ＨＮＰｓ、及び、ＰＰＳ ＨＮＰｓにさらにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）及び葉酸（ＦＡ）を結合させた複合体（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）の吸収スペクトルを示す。 図６Ａは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの短波長側の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示し、図６Ｂは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの長波長側の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。 図７Ａは、マウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＰＰＳ ＨＮＰｓにさらにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を結合させた複合体（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識したＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。図７Ｂは、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識したＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。図７Ｃは、ヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＨＣＴ１１６細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識したＨＣＴ１１６細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。 図８Ａは、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍ）で解析した結果を示す。図８Ｂは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍ）で解析した結果を示す。図８Ｃは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍ）で解析した結果を示す。 図９Ａは、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７１０ｎｍ）で解析した結果を示す。図９Ｂは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７１０ｎｍ）で解析した結果を示す。図９Ｃは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７１０ｎｍ）で解析した結果を示す。 図１０Ａは、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍ）で解析した結果を示す。図１０Ｂは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍ）で解析した結果を示す。図１０Ｃは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞をフローサイトメーター（励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍ）で解析した結果を示す。 図１１Ａは、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞をフローサイトメーター（励起波長６４０ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍ）で解析した結果を示す。図１１Ｂは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞をフローサイトメーター（励起波長６４０ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍ）で解析した結果を示す。図１１Ｃは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞をフローサイトメーター（励起波長６４０ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍ）で解析した結果を示す。
本発明の発明者らは、担体分子と、担体分子に結合しているポルフィリンを含み、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲である蛍光プローブをフローサイトメトリー蛍光分析による蛍光標識細胞の検出・選別に用いることを見出し、本発明に至った。
（フローサイトメトリー用蛍光プローブ）
本発明のフローサイトメトリー用蛍光プローブは、担体分子と、担体分子に結合しているポルフィリンを含む。
前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、励起波長が３５０〜６５０ｎｍであり、汎用のフローサイトメーターによるフローサイトメタリー分析に好適である観点から、励起波長が３８０〜５８０ｎｍであることが好ましい。また、汎用のフローサイトメーターによるフローサイトメタリー分析に好適である観点から、前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、蛍光波長が４００〜８００ｎｍの範囲であることが好ましく、４５０〜６８０ｎｍの範囲であることがより好ましい。
ポルフィリンは、特に限定されないが、フローサイトメトリーによる蛍光分析に好適である観点から、カルボキシル基を有するポルフィリンを用いることができる。なお、“ポルフィリン”は、４つのピロール環がα位置で４つのメチン基と交互に結合した環状化合物とその誘導体の総称の意味で用いている。カルボキシル基を有するポルフィリンは、一般的に、励起波長が４００〜６５０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が６００〜７４０ｎｍの範囲である。
カルボキシル基を有するポルフィリンとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を用いることができる。
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bは、同一又は異なっていてもよく、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、スルホ基（ＳＯ3Ｈ）又は水素原子（Ｈ）を示す（ただし、全て水素原子や全てがスルホ基である場合は除く。）。好ましくは、前記一般式（Ｉ）中、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが全てカルボキシル基、又はＲ1bはカルボキシル基でＲ2b、Ｒ3b、及びＲ4bは水素原子である。カルボキシル基を有するポルフィリンは、より好ましくは、前記一般式（Ｉ）で表され、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが、全てカルボキシル基である化合物である。Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが全てカルボキシル基である化合物は、テトラキス（４-カルボキシフェニル)ポルフィリン（ＴＣＰＰ）と呼ばれる。
また、例えばビリルビン、ヘミン、プロトポルフィリン等も、カルボキシル基を有するポルフィリンとして用いることができる。
本発明に用いるカルボキシル基を有するポルフィリンは、公知の化合物であるか、又は公知の方法により容易に製造できる。例えば東京化成工業株式会社等から市販のものを入手することができる。
また、本発明の蛍光プローブは、ポルフィリンに加えて、他の蛍光色素を含んでもよい。他の蛍光色素を含む場合、ポルフィリンと他の蛍光色素の間に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じない。他の蛍光色素（以下において、蛍光色素ｂとも記す。）の励起波長は、ポルフィリンの励起波長と異なり、且つ、ＦＲＥＴを生じさせなければ特に限定はない。
蛍光色素ｂの励起波長は、ポルフィリンを用いたフローサイトメトリー分析に影響しない範囲であれば限定はなく、６００〜８５０ｎｍの範囲が好ましく、６３０〜７９０ｎｍの範囲がより好ましい。
蛍光色素ｂとしては、例えば、インドシアニン化合物、クマリン、ローダミン、キサンテン、ヘマトポルフィリン、及びフルオレスカミン等のインビボ蛍光イメージング用蛍光色素を用いてもよい。
前記担体分子は、ポルフィリンと結合することができ、ポルフィリンの本来の励起波長を維持することができるものであることが好ましい。例えば、ポリシラン、ポリゲルマン、ポリスタナン、ポリシロキサン、ポリシルセスキオキサン、ポリシラザン、ポリボラジレン、ポリホスファゼン等の無機ポリマーやポリピロール、ポリエチレングリコール、多糖等の有機ポリマーを用いることができる。シリカポリマーは、例えば、後述するように、シランが加水分解、重縮合することで形成される。
前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識してもよい。この場合、前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、細胞の表面を特異的に認識する物質と結合する細胞表面結合物質を有することが好ましい。フローサイトメトリー用蛍光プローブが細胞表面結合物質を介して細胞表面に特異的に結合して細胞を標識することができる。細胞の表面を特異的に認識する物質とは、特定の細胞の表面に存在するタンパク質、脂質、糖鎖、及び／又は核酸等である。例えば、癌細胞の表面には、癌細胞に特異的な葉酸受容体、トランスフェリン受容体、抗原等が存在する。蛍光プローブに葉酸、トランスフェリン、抗体等を含ませることにより、癌細胞を特異的に標識することができる。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞の表面には細胞表面マーカー（膜タンパク質）等が存在する。蛍光プローブに細胞表面マーカーと特異的に結合する分子等を結合することにより、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞を特異的に標識することができる。
前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、また、細胞の内部に取り込まれることで細胞を標識してもよい。このような細胞としては、例えば、マクロファージ、樹状細胞、免疫細胞、癌細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。細胞内部に蛍光プローブを取り込んだマクロファージ、樹状細胞、免疫細胞、癌細胞、ｉＰＳ細胞等を用い、免疫細胞療法において、マクロファージや樹状細胞の体内での動態を確認することができる。
本発明のフローサイトメトリー用蛍光プローブは、担体分子とポルフィリンを結合、好ましくは共有結合させて担体分子とポルフィリンの複合体を形成することで作製することができる。また、必要に応じて、担体分子とポルフィリンの複合体中の担体分子に、細胞表面結合物質を結合させてもよい。本発明のフローサイトメトリー用蛍光プローブにおいて、ポルフィリンの励起波長及び蛍光波長は、担体分子と結合する前後でほとんど変化しないことが好ましい。
担体分子がポリシロキサンである場合、本発明のフローサイトメトリー用蛍光プローブは、例えば下記のようにして作製することができる。
まず、アミノ基を有するシランとカルボキシル基を有するポルフィリンを反応させてポルフィリンを分子内に含むシラン（以下において、「ポルフィリン‐シラン」とも記す。）を得る。具体的には、溶媒にアミノ基を有するシランとカルボキシル基を有するポルフィリンを溶解させ、縮合剤を加えアミド化反応を起こす。溶媒としては、例えば、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等を用いることができる。縮合剤としては、例えば、カルボジイミド等を使用することができる。カルボジイミドとしては、特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ´−ジプロピルカルボジイミド等が挙げられる。副生成物を減らすために、スクシンイミド等を加えてもよい。スクシンイミドとしては、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等が挙げられる。反応温度は、特に限定されないが、合成コストの観点から、例えば、２０〜１５０℃であることが好ましく、２０〜８０℃であることがより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１〜２４時間であることが好ましく、３〜１５時間であることがより好ましい。反応後、遠心分離して生成物を沈殿として回収することで、ポルフィリン‐シランを得ることができる。
前記反応において、アミノ基を含むシランとカルボキシル基を有するポルフィリンのモル比（アミノ基を含むシラン：カルボキシル基を有するポルフィリン）は、４：１〜１：１であることが好ましく、より好ましくは４：１〜２：１であり、さらに好ましくは４：１である。
次に、上記で得られたポルフィリン‐シランと一種以上の官能基を有するシラン（以下において、「官能基シラン」とも記す。）との加水分解・縮合反応により、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体を得る。具体的には、溶媒にポルフィリン‐シランと官能基シランを溶解させ、さらにアルカリ溶液を加えて反応させる。溶媒としては、例えば、ＤＭＦ等を用いることができる。アルカリ溶液としては、例えば、ｐＨが８以上のアンモニア水、水酸化ナトリウムの水溶液等を用いることができる。反応温度は、特に限定されないが、合成コストの観点から、例えば、２０〜２００℃であることが好ましく、６０〜８０℃であることがより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１〜７２時間であることが好ましく、３〜２４時間であることがより好ましい。反応後、遠心分離することにより生成物を沈殿として回収することで、ポリシロキサンにポルフィリンが共有結合したポリシロキサンとポルフィリンの複合体を得ることができる。
上記反応において、ポルフィリン‐シランと官能基シランのモル比（ポルフィリン‐シラン：官能基シラン）は、１：２〜１：１００であることが好ましく、より好ましくは１：２１〜１：５０であり、さらに好ましくは１：３０〜１：４０である。
アミノ基を有するシランとしては、アミノ基を有するものであればよく、特に限定されない。例えば、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物を好適に用いることができる。
Ｘi−Ｓｉ（Ｒ2a）j（ＯＲ1a）(4-i-j) （ＩＩ）
一般式（ＩＩ）において、ＸはＨ2ＮＣmＨ2m−、Ｈ2ＮＣnＨ2n−ＨＮＣmＨ2m−、又はＰｈ−ＮＨＣmＨ2m−〔ここでＰｈはフェニル基を示す。〕で示される基を示し、中でもＨ2ＮＣmＨ2m−、又はＨ2ＮＣnＨ2n−ＨＮＣmＨ2m−で示される基が好適である。ｍ及びｎは、同一又は異なって、１〜６の整数を示す。ｍは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。ｎは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。また、上記のＨ2ＮＣmＨ2m−、Ｈ2ＮＣnＨ2n−ＨＮＣmＨ2m−、Ｐｈ−ＮＨＣmＨ2m−は、それぞれ、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）m−、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）n−ＨＮ（ＣＨ2）m−、Ｐｈ−ＮＨ（ＣＨ2）ｍ−であることが好ましい。
また、Ｒ1a及びＲ2aは、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基を示す。当該アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、イソヘキシル、３−メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルが好ましい。
また、ｉは１又は２、ｊは０又は１、〔但し（４−ｉ−ｊ）≧２〕を示す。すなわち、（ｉ、ｊ）は（１、０）、（１、１）、又は（２、０）を示す。
一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシ［３−（フェニルアミノ）プロピル］シラン等が挙げられる。中でも、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及び／又は３−アミノプロピルトリメトキシシランが好ましい。
上述したアミノ基を有するシランは、例えば、東京化成工業株式会社製の市販品を用いることができる。また、アミノ基を有するシランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
官能基シランは、一種以上の官能基を有するものであれば特に限定されず、一種の官能基を有する単官能基シランであってもよく、二種以上の官能基を有する多官能基シランであってもよい。官能基を有するシランとして、例えば一般式（ＩＩＩ）：
Ｙp−Ｓｉ（Ｒ2c）q（ＯＲ1c）(4-p-q) （ＩＩＩ）
で表される化合物を好適に用いることができる。
上記一般式（ＩＩＩ）において、ＹはＣＨ2＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2−で示される基、アルケンを有する基、チオールを有する基、ジスルフィドを有する基、アミンを有する基、エステルを有する基、アミドを有する基、カルボン酸を有する基、ウレアを有する基、チオウレアを有する基、ＯＣＮＣＨ2ＣＨ2−で示される基、ＣｌＣαＨ2α−で示される基、ＨＳＣβＨ2β−で示される基、ＣＦ3ＣγＦ2γ−ＣδＨ2δ−で示される基、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣεＨ2ε−で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＣζＨ2ζ−で示される基、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ2η−で示される基、下記化学式（ａ）で示される基、下記化学式（ｂ）で示される基、炭素数１〜１８のアルキル基、又はフェニル基を示す。
上記において、α、β、δ、ε、ζ、η、θ及びιは、それぞれ独立して１〜６の整数数を示し、好ましくは１、２、３又は４の整数を示し、γは０〜８の整数を示し、好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７の整数を示す。また、炭素数１〜１８のアルキル基は、炭素数１〜１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣαＨ2α−、ＨＳＣβＨ2β−、ＣＦ3ＣγＦ2γ−ＣδＨ2δ−、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣεＨ2ε−、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＣζＨ2ζ−、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ2η−は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ2）α−、ＨＳ（ＣＨ2）β−、ＣＦ3（ＣＦ2）γ−（ＣＨ2）δ−、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ（ＣＨ2）ε−、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2）ζ−、ＨＮ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）η−であることが好ましい。
また、Ｒ1cは、炭素数１〜６のアルキル基、又は−（ＣＨ2）τ−ＯＣＨ3を示し、Ｒ2cは、炭素数１〜６のアルキル基、又はフェニル基を示す。Ｒ1c及びＲ2cは同一であっても異なってもよい。Ｒ1c及びＲ2cのいずれにおいても、炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状又は分岐状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、イソヘキシル、３−メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルが好ましい。また、τは１〜４の整数（好ましくは１、２又は３）を示す。
また、ｐは１、２又は３、ｑは０、１又は２、但し、（４−ｐ−ｑ）≧１を示す。すなわち、（ｐ、ｑ）は（１、０）、（１、１）、（１、２）、（２、０）、（２、１）又は（３、０）を示す。
また、官能基シランとしては、例えば下記の一般式（ＩＶ）で表される化合物も好適に用いることができる。
Ｚ−ＳｉＣｌ3 （ＩＶ）
上記一般式（ＩＶ）において、ＺはＣＨ2＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2−で示される基、アルケンを有する基、チオールを有する基、ジスルフィドを有する基、アミンを有する基、エステルを有する基、アミドを有する基、カルボン酸を有する基、ウレアを有する基、チオウレアを有する基、ＣｌＣκＨ2κ−で示される基、ＣＦ3ＣλＦ2λ−ＣξＨ2ξ−で示される基、炭素数１〜１８のアルキル基、フェニル基、又はシクロヘキシル基を示す。κ及びξは、それぞれ独立して１〜６の整数を示し、好ましくは１、２、３又は４の整数を示し、λは０〜８の整数を示し、好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７の整数を示す。また、炭素数１〜１８のアルキル基は、炭素数１〜１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣκＨ2κ−、ＣＦ3ＣλＦ2λ−ＣξＨ2ξ−は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ2）κ−、ＣＦ3（ＣＦ2）λ−（ＣＨ2）ξ−であることが好ましい。
また、多官能基性シランとして、Ｎ-［２-（Ｎ-ビニルベンジルアミノ）エチル］-３−アミノプロピルトリメトキシシラン塩酸塩を用いてもよい。
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物としては、具体的には、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、アリルトリエトキシシラン、アリルトリメトキシシラン、ジエトキシメチルビニルシラン、ジメトキシメチルビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス(２-メトキシエトキシ)シラン、(クロロメチル)トリエトキシシラン、３-クロロプロピルジメトキシメチルシラン、３-クロロプロピルトリエトキシシラン、２-(３,４-エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン、３-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、イソシアン酸３-(トリエトキシシリル)プロピル、メタクリル酸３-(トリメトキシシリル)プロピル、トリエトキシ-１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ-トリデカフルオロ-n-オクチルシラン、アクリル酸３-(トリメトキシシリル)プロピル、３-トリメトキシシリルプロピルクロリド、１-[３-(トリメトキシシリル)プロピル]尿素、トリメトキシ(３,３,３-トリフルオロプロピル)シラン、３-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ジエトキシ(３-グリシジルオキシプロピル)メチルシラン、３-グリシジルオキシプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、３-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、2-シアノエチルトリエトキシシラン、ジアセトキシジメチルシラン、ジエトキシジメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシジフェニルシラン、ジメトキシメチルフェニルシラン、ドデシルトリエトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、オクタデシルトリエトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、n-オクチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、トリアセトキシメチルシラン、トリエトキシエチルシラン、トリメトキシ(メチル)シラン、トリメトキシフェニルシラン、トリメトキシ(プロピル)シラン等が挙げられる。中でも、３-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン等が好ましい。
また、一般式（ＩＶ）で表される化合物としては、具体的には、アリルトリクロロシラン、トリクロロビニルシラン、３-クロロプロピルトリクロロシラン、トリクロロ(１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ-ヘプタデカフルオロデシル）シラン、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−トリデカフルオロ−ｎ−オクチル）シラン、ブチルトリクロロシラン、シクロヘキシルトリクロロシラン、デシルトリクロロシラン、ドデシルトリクロロシラン、エチルトリクロロシラン、ｎ−オクチルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシラン、トリクロロ−２−シアノエチルシラン、トリクロロヘキシルシラン、トリクロロ（メチル）シラン、トリクロロオクタデシルシラン、トリクロロ（プロピル)シラン、トリクロロテトラデシルシラン等が挙げられる。
上記官能基シランは、例えば東京化成工業株式会社製の市販品を用いることができる。また、官能基シランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
次に、必要に応じて、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子に、細胞表面結合物質を結合させる。具体的には、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子の水溶液に細胞表面結合物質の水溶液を加えて、４〜５０℃の温度で、１〜２４時間撹拌することで反応させる。例えば、細胞表面結合物質として葉酸をポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子に結合させてもよい。ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子表面の官能基と結合する官能基で修飾された細胞表面結合物質を用いる。例えば、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体を形成した官能基シランが３-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン及び(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン等のチオール基を有する場合、葉酸としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の両末端にそれぞれマレイミド基及び葉酸が結合したものを用いることができる。
上記反応において、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子の葉酸と共有結合する官能基と、葉酸を修飾し、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体と共有結合する官能基のモル比（ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子の葉酸と共有結合する官能基：葉酸を修飾した官能基）は、１：１〜３：１であることが好ましく、１：１〜２：１であることがより好ましく、１：１であることがさらに好ましい。なお、本発明のフローサイトメトリー用蛍光プローブが、ポルフィリンに加えて蛍光色素ｂを含む場合、葉酸と同時に蛍光色素ｂをポリシロキサンとポルフィリンの複合体に結合させてもよい。
ポルフィリンとしてＴＣＰＰを用いた場合、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体において、ＴＣＰＰのカルボキシル基はアミド結合を形成して存在することが好ましく、ＴＣＰＰはアミド結合によりシロキサンネットワーク（ポリシロキサンの主鎖）中に組み込まれていることがより好ましい。本発明において、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体等の蛍光プローブの構造は、後述するように、フーリエ変換赤外分光法で解析することができる。
前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、特に限定されないが、フローサイトメーターによるフローサイトメトリー分析に好適である観点から、ポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）を１質量％以上含むことが好ましく、より好ましくは５〜９０質量％含む。本発明において、後述するように、シロキサンとポルフィリンからなるナノ粒子等の蛍光プローブの熱重量・示差熱分析により、ポルフィリン等の蛍光色素やシリカポリマーなどの担体分子の含有量を測定することができる。
前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、特に限定されないが、細胞を標識しやすい観点から、平均粒子径が３〜２５０ｎｍであることが好ましく、１０〜８０ｎｍであることがより好ましい。本発明において、平均粒子径は、動的光散乱法で測定する。
（蛍光標識細胞の選別方法）
本発明の蛍光標識細胞の選別方法は、細胞を前記フローサイトメトリー用蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、フローサイトメトリー用蛍光プローブによって標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーターによって選別する工程を含む。
まず、細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する。細胞の標識は、フローサイトメトリー用蛍光プローブを細胞表面に結合させること、あるいは、フローサイトメトリー用蛍光プローブを細胞内に取り込ませることで行うことができる。蛍光プローブを細胞表面に結合させる場合、蛍光プローブは細胞表面結合物質を有する。例えば、蛍光プローブが葉酸を有する場合、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞やヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞等の癌細胞の表面に結合してこれらの癌細胞を標識することができる。具体的には、細胞を蛍光プローブ入りの細胞培養培地で培養することで、細胞を蛍光プローブで標識することができる。細胞としては、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等が挙げられる。
次に、フローサイトメトリー用蛍光プローブによって標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーターによって選別する。フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別は、蛍光標識操作を行った後の細胞に３５０〜６５０ｎｍの励起光を照射し、蛍光を検出することで行う。具体的には、フローサイトメトリー用蛍光プローブによって蛍光標識操作を行った後の細胞をフローサイトメーターに供給し、所定の励起波長及び蛍光波長、例えば３５０〜６５０ｎｍの励起波長、４００〜８００ｎｍの蛍光波長でフローサイトメトリー分析を行うことで、フローサイトメトリー用蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞を選別することができる。フローサイトメーターとしては、特に限定されず、あらゆるフローサイトメーターを用いることができる。
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
（試薬）
テトラキス（４-カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、（３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、葉酸とマレイミド基が両末端に結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量３４００、以下において、単に「ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ」とも記す。）、マレイミド基が結合したインドシアニングリーン（分子量８５３、以下において、単に「ＩＣＧ-Ｍａｌ」とも記す。）は、いずれも、東京化成工業株式会社から入手した。ＭＰＴＭＳ、ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ、ＩＣＧ-Ｍａｌの構造式を下記に示した。
（実施例１）
（蛍光プローブの作製）
＜担体分子とポルフィリンの複合体の作製＞
（１）ＴＣＰＰをＤＭＦに溶解させたＴＣＰＰのＤＭＦ溶液（３．８ｍＭ：３２ｍＬ）にＡＰＴＥＳ（４６２μｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ´−ジプロピルカルボジイミド（４８０μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４８０μｍｏｌ）を加え、５０℃で２４時間撹拌した。
（２）上記で得られたポルフィリン‐シランのＤＭＦ溶液２００μＬ（ポルフィリン‐シラン０．７５μｍｏｌ）を、ＭＰＴＭＳ５μＬ（０．０２７ｍｍｏｌ）と混合した。得られた混合液に、ＤＭＦを５００μＬとアンモニア水（濃度：２８質量％、ｐＨ１１）を３００μＬ加えて、８０℃で２４時間反応を行った。
（３）２４時間後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、生成物を水とエタノールで数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分解させた。
（４）得られた物質は、ポリシロキサンを担体分子とし、ポルフィリンを蛍光色素とするポリシロキサンにポルフィリンが共有結合したポリシロキサンとポルフィリンの複合体であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約４０ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。
＜担体分子とポルフィリンの複合体に蛍光色素ｂを結合させる工程＞
（１）上記で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水分散液１ｍＬに、ＩＣＧ-Ｍａｌの水溶液を６３μＬ(濃度：２ｍｇ/ｍＬ、ＩＣＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ)添加し、３０℃で３時間撹拌して反応させた。
（２）反応後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、水で数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（３）得られた物質は、ポリシロキサンにポルフィリン及びインドシアニングリーン（蛍光色素ｂ）が共有結合した複合体（蛍光プローブ）であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約５０ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。
（実施例２）
（蛍光プローブの作製）
＜担体分子とポルフィリンの複合体の作製＞
実施例１と同様にして、ＰＰＳ ＨＮＰｓを得た。
＜担体分子とポルフィリンの複合体に蛍光色素ｂ及び細胞表面結合物質を結合させる工程＞
（１）上記で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水分散液１ｍＬに、ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌの水溶液を２５１μＬ（濃度：２ｍｇ／ｍＬ、ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ）と、ＩＣＧ-Ｍａｌの水溶液（濃度：２ｍｇ／ｍＬ、ＩＣＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ）を６３μＬ添加し、３０℃で３時間撹拌した。
（２）反応後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、水で数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（３）得られた物質は、ポリシロキサンにポルフィリン、インドシアニングリーン（蛍光色素ｂ）及び葉酸（細胞表面結合物質）が共有結合した複合体（蛍光プローブ）であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約６５ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。
（フーリエ変換赤外分光法による確認）
実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓと、原料として用いたＴＣＰＰをフーリエ変換赤外分光光度計（Ｎｉｃｏｌｅｔ社製「ＮＥＸＵＳ４７０」）で解析し、ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＴＣＰＰのＦＴ-ＩＲスペクトルを図１に示した。図１のＦＴ-ＩＲスペクトルから、どちらとも３４３０〜３２５０ｃｍ-1にピロール環に由来するピークを示すことが分かった。ＰＰＳ ＨＮＰｓにおいて、ＴＣＰＰの１８００〜１６４０ｃｍ-1のカルボン酸（カルボキシル基）のピークが消失し、１７４０〜１６２０ｃｍ-1のアミド由来のピークが現れたことから、ＴＣＰＰのカルボキシル基がアミド結合を形成してシロキサンと共有結合した（ポルフィリン‐シランとＭＰＴＭＳの加水分解・縮合により形成された）ポリシロキサンとポルフィリンの複合体が確実に合成されていることが確認された。また、ＰＰＳ ＨＮＰｓの１２６０〜１０１０ｃｍ-1（νＳｉ−Ｏ−Ｓｉ）、８７０〜７４０ｃｍ-1（νＳｉ−Ｏ−Ｓｉ）、５４０〜４１０ｃｍ-1（σＳｉ−Ｏ−Ｓｉ）にシロキサン結合に由来するピークが現れていた。すなわち、ＰＰＳ ＨＮＰｓでは、ポルフィリン−シラン及びＭＰＴＭＳ（官能基を有するシラン）にてシロキサンネットワークが形成され、ポルフィリンはアミド結合によりシロキサンネットワーク中に組み込まれていることが確認された。
実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓを29Ｓｉ固体ＮＭＲで構造解析し、ＰＰＳ ＨＮＰｓの29Ｓｉ固体ＮＭＲスペクトルを図２に示した。図２から、−５８及び−６９ｐｐｍにピークが現れることが確認された。−５８ｐｐｍのピークは、下記の化学式で表されるＴ2構造を示し、−６９ｐｐｍのピークは、下記の化学式で表されるＴ3構造を示していると推測される。この結果より、ＰＰＳ ＨＮＰｓには、一部Ｔ2構造のＳｉが存在するものの、ほとんどのＭＰＴＭＳとポルフィリンシランが加水分解、重縮合を受けていることが確認された。シロキサンにポルフィリンが共有結合して複合体を形成していることになる。
（熱重量・示差熱分析）
熱分析計（リガク製、ＴＧ８１２０）を用いてＰＰＳ ＨＮＰｓに対して熱重量・示差熱分析（ＴＧ-ＤＴＡ）を行った。図３にＰＰＳ ＨＮＰｓのＴＧ（熱重量）及びＤＴＡ（示唆熱）曲線を示した。解析の結果、１００℃における重量減少は吸着水によるもの、３００℃における重量減少はアミノプロピル部分及びメルカプトプロピル部分の燃焼によるもの、３００〜４００℃における重量減少はポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）の分解によるものであり、残りの部分がシロキサン部分と推測される。具体的には、ＰＰＳ ＨＮＰｓ中には７重量％の吸着水、２９重量％のアミノプロピル部分及びメルカプトプロピル部分、１７重量％のポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）、４７重量％のポリシロキサン部分が含まれていると推測される。
（ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＦＡ-ＰＥＧ及びＩＣＧの定量）
ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＦＡ-ＰＥＧ及びＩＣＧの量を求めるために、実施例２において、反応終了後の上澄み液（１ｍＬ）の吸収スペクトルを分光光度計（日本分光社製「Ｖ−５７０」）にて測定し、未反応のＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ、ＩＣＧ-Ｍａｌ量を計算した。図４Ａに、上澄み液の吸収スペクトルを示した。ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌは葉酸の水溶液中の吸光係数が不明であったため、葉酸のピーク波長３７７ｎｍにおける検量線を作成し、そこから濃度を算出した。図４Ｂに葉酸の検量線を示した。図４Ａにおいて３７７ｎｍの吸光度は０．０３２であり、これより求められる上澄み中の葉酸の濃度は１２ｎｍｏｌ／ｍＬである。使用したＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ量は１４８ｎｍｏｌであるため、９２％のＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌが反応したことが確認された。次にＩＣＧ-Ｍａｌについては、ＩＣＧの水溶液中の８００ｎｍにおけるモル吸光係数ε８００＝１４７０００Ｌ/ｍｏｌ・ｃｍを用いてランベルト・ベールの式Ａ800＝ε800ｃＬから上澄み中の濃度を計算した結果、０．０９４ｎｍｏｌ/ｍＬであった。使用したＩＣＧ−Ｍａｌ量は１４８ｎｍｏｌであるため、９９．９％のＩＣＧ-Ｍａｌが反応したと見積もることができる。以上の計算結果より９２％のＦＡ-ＰＥＧ、ほぼ１００％のＩＣＧがＰＰＳ ＨＮＰｓに結合していると判断した。同様に、実施例１において、ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＩＣＧの量を求めたところ、ほぼ１００％のＩＣＧがＰＰＳ ＨＮＰｓに結合していることが確認された。
（分光法による吸収スペクトルの確認）
実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水分散液（水溶液とも称される。）及び実施例２で得られたＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液の吸収スペクトルを分光光度計（日本分光社製「Ｖ−５７０」）にて測定し、その結果を下記図５に示した。図５のＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ−ＰＥＧ／ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの吸収スペクトルから、ＰＰＳ ＨＮＰｓにＩＣＧが結合することにより、波長７００〜９００ｎｍあたりにＩＣＧに由来するピークが現れることが確認された。また、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓにおいて、ポルフィリンに由来する３８０〜６５０ｎｍあたりのピークにはほとんど変化がないことが確認された。
（蛍光プローブの波長特性確認）
実施例２で得られたＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液を用い、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの励起波長スペクトル及び蛍光波長スペクトルを、日本分光社製の分光蛍光光度計ＦＰ−６６００にて解析した。その結果を図６に示した。図６Ａはインビトロ蛍光イメージングに用いる短波長側の波長特性を示し、図６Ｂはインビボ蛍光イメージングに用いる長波長側の波長特性を示している。図６Ａ及び図６Ｂのから、最大励起波長４２５ｎｍ、最大蛍光波長６５５ｎｍの短波長側と、最大励起波長６５０ｎｍ、最大蛍光波長９０５ｎｍの長波長側のどちらにおいてもストークスシフトが大きいことが分かった。ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓは、いずれも、担体分子（ポリシロキサン）に結合したポルフィリンとＩＣＧ（蛍光色素ｂ）を有し、且つ２つの蛍光色素の間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光プローブであることが確認された。
（蛍光顕微鏡による解析）
（１）細胞
マウスと同種の細胞であるマウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞、マウスと異種の細胞であるヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞とヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞を用いた。実施例において、細胞及び細胞培養用培地は、シグマーアルドリッチ社から入手した。細胞培養ディッシュは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のものを用いた。
（２）細胞の蛍光プローブ標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径３５ｍｍ）中の細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に播種（０．３ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を蛍光プローブ（５０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、２４時間培養を行った。このとき、ＲＡＷ２６４．７細胞は、蛍光プローブＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換し、ＨｅＬａ Ｓ３細胞とＨＣＴ１１６細胞は、蛍光プローブＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換した。
（ｃ）上清を捨て、培養細胞を２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、和光純薬「Ｄ−ＰＢＳ（−）（０４５−２９７９５）」）で洗浄した。
（ｄ）上清を捨て、培養細胞に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を２ｍＬ添加し、３０分間室温（２０±５℃）で静置した。
（ｅ）上清を捨て、培養細胞に１×ＰＢＳを１ｍＬ加えた。この工程を３回繰り返した。
（３）蛍光顕微鏡による観察
ライフテクノロジーズ社の蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて蛍光プローブで標識した蛍光標識細胞を観察した。いずれの細胞も、励起波長は４２２ｎｍ、蛍光波長は６５５ｎｍで観察を行った。その結果を図７に示した。
図７Ａには、ＲＡＷ２６４．７細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ（蛍光プローブ）による蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ａの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＲＡＷ２６４．７細胞において、蛍光プローブによる蛍光は、細胞質にて多く観察され、核は蛍光していないことがわかった。この結果からＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ（蛍光プローブ）が細胞内に取り込まれて、細胞質で留まっていることが確認された。ＲＡＷ２６４．７細胞は、マクロファージ細胞であり、貪食能により蛍光プローブを細胞内に取込み、細胞質に蛍光プローブが集まったと考えられる。
図７Ｂには、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩを使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブによる蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ｂの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光プローブの蛍光は、細胞核も含めて細胞全体が蛍光していることがわかった。この結果から蛍光プローブが細胞表面に結合しており、細胞全体が光って観測されていることが明らかになった。がん細胞は細胞表面に葉酸を結合させる受容体を持っており、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）が葉酸を介してがん細胞であるＨｅＬａ Ｓ３細胞の表面に結合したと考えられる。
図７Ｃには、ＨＣＴ１１６細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩを使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブによる蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ｃの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＨＣＴ１１６細胞の蛍光プローブの蛍光は、細胞核も含めて細胞全体が蛍光していることがわかった。この結果から蛍光プローブが細胞表面に結合しており、細胞全体が光って観測されていることが明らかになった。がん細胞は細胞表面に葉酸を結合させる受容体を持っており、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）が葉酸を介してがん細胞であるＨＣＴ１１６細胞の表面に結合したと考えられる。
（フローサイトメーターによる解析）
（１）細胞
マウスと同種の細胞であるマウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞、及びマウスと異種の細胞であるヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞とヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞を用いた。
（２）細胞の蛍光プローブ標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径３５ｍｍ）中の細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に下記表１に示す播種量で播種し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を下記表１に示す蛍光プローブ（５０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、さらに４８時間培養を行った。
（ｃ）細胞培養ディッシュから細胞を回収した。このとき、ＨｅＬａ Ｓ３細胞及びＨＣＴ１１６細胞の回収には０．２５％トリプシン/ＥＤＴＡ溶液を使用した。
（ｄ）回収液を１０００回転にて５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を４００μＬの細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に懸濁した。
（ｅ）懸濁液を１０００回転、５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞に４％ＰＦＡを１ｍＬ添加し、３０分間室温（２０±５℃）で静置した。
（ｆ）再懸濁液を１０００回転、５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞に１ｘＰＢＳを１ｍＬ加えた。この工程を３回繰り返した。
（３）フローサイトメーターによる観察
ＢＤ社のフローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ−２０を用いて蛍光プルーブで標識を行った細胞を観察した。
図８に、励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍで観察した結果を示した。図８ＡはＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞、図８ＢはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞、図８ＣはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞を用いた結果である。
図９に、励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７１０ｎｍで観察した結果を示した。図９ＡはＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞、図９ＢはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞、図９ＣはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞を用いた結果である。
図１０に、励起波長４０５ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍで観察した結果を示した。図１０ＡはＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞、図１０ＢはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞、図１０ＣはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞を用いた結果である。
図１１に、励起波長６４０ｎｍ、蛍光波長７８０ｎｍで観察した結果を示した。図１１ＡはＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞、図１１ＢはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞、図１１ＣはＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞を用いた結果である。
図８〜１１から分かるように、いずれの励起波長及び蛍光波長において、全ての細胞サンプルで蛍光標識されている細胞と蛍光標識されていない細胞とを分離して観察することができた。光強度としては、１００〜１００００倍ほどの差があった。細胞に対して蛍光プローブによる標識を行った後、蛍光標識された細胞と蛍光標識されていない細胞を明確に判別し、分離することができた。フローサイトメーターを用いることで、蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞のみを選別することができる。

Claims (10)

  1. フローサイトメトリー用蛍光プローブであって、
    担体分子と、前記担体分子に結合しているポルフィリンを含み、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲であることを特徴とするフローサイトメトリー用蛍光プローブ。
  2. 前記担体分子は、ポリシロキサンである請求項１に記載のフローサイトメトリー用蛍光プローブ。
  3. 細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識する請求項１又は２に記載のフローサイトメトリー用蛍光プローブ。
  4. 細胞内部に取り込まれることで細胞を標識する請求項１又は２に記載のフローサイトメトリー用蛍光プローブ。
  5. 前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、蛍光波長が４００〜８００ｎｍの範囲である請求項１〜４のいずれか１項に記載のフローサイトメトリー用蛍光プローブ。
  6. フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別方法であって、
    細胞をフローサイトメトリー用蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、
    フローサイトメトリー用蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーターによって選別する工程を含み、
    前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合しているポルフィリンを含み、励起波長が３５０〜６５０ｎｍの範囲であり、前記フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別は、蛍光標識細胞に波長が３５０〜６５０ｎｍの励起光を照射し、蛍光を検出することで行うことを特徴とする蛍光標識細胞の選別方法。
  7. 前記担体分子は、ポリシロキサンである請求項６に記載の蛍光標識細胞の選別方法。
  8. 前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識する請求項６又は７に記載の蛍光標識細胞の選別方法。
  9. 前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、細胞内部に取り込まれることで細胞を標識する請求項６又は７に記載の蛍光標識細胞の選別方法。
  10. 前記フローサイトメトリー用蛍光プローブは、蛍光波長が４００〜８００ｎｍの範囲である請求項６〜９のいずれか１項に記載の蛍光標識細胞の選別方法。
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