JP2021138938A - 蛍光標識剤、及びフタロシアニン - Google Patents

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Abstract

【課題】６５０ｎｍ以上の波長領域における蛍光標識剤に適した蛍光強度、耐光性、耐久性に優れた特性を有するフタロシアニンを提供する。【解決手段】下式で表されるフタロシアニンを含むことを特徴とする蛍光標識剤。Ｘ１〜Ｘ１７の少なくとも１つは−Ｒ１−Ｚ；Ｒ１は直接結合、−Ｏ−、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ２−等を表す。【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光標識剤と、それに用いられるフタロシアニンに関する。
バイオイメージングは、タンパク質や細胞、組織などを可視化する技術であり、生体内分子・細胞機能の解明や創薬の研究等、生物学、医学の研究領域で幅広く活用されている。
中でも蛍光バイオイメージング法は、現象の動的な観察、多色観察、高感度観察が可能なイメージング法である。さらに、近年では、蛍光バイオイメージング法は非侵襲的に診断可能なイメージング法として注目されており、患者への負担が少ない画像診断や手術中のリアルタイム診断など臨床現場における応用が期待されている。
蛍光バイオイメージング法は、主に標的部位に吸着、あるいは、標的部位でのみ発光する蛍光色素を用い、その蛍光色素に紫外〜近赤外領域の光を照射した際に色素が発する蛍光を検出することにより、標的を可視化する方法である。
蛍光バイオイメージング用の色素（蛍光標識剤）の多くは、可視光領域に吸収を有するものであるが、可視光はエネルギーが強いため、光の照射によって色素が劣化し易いという問題があった。また、可視光領域に吸収や蛍光を示す色素は、色素に由来する蛍光だけではなく、生体の内在物質からの蛍光（自家蛍光）も検出されてしまうため、良好な画質が得られないという問題があった。加えて、可視光はヘモグロビンなどの身体を構成する物質によっても吸収されてしまうため、体内の深部まで光が到達せず、生体が生きている状態で血管や臓器を観察することは困難であるという問題があった。
これに対して、６５０〜１８００ｎｍの波長領域は、生体の窓と呼ばれる生体透過性の高い領域と言われている。現在は、生体の第１光学窓と言われる波長６５０〜９００ｎｍに蛍光を発するインドシアニングリーンやＩＲｄｙｅ８００が、蛍光バイオイメージングの蛍光標識剤として用いられている。しかし、インドシアニングリーンやＩＲｄｙｅ８００のようなシアニン色素を用いた蛍光標識剤は、耐光性や耐久性が低いため、光の照射によって蛍光標識剤が劣化し易く、長時間の観察ができないという問題があった（非特許文献１、２）。
一方、フタロシアニン色素は、優れた光学特性、高い蛍光強度、高い耐光性を有する色素として知られている。例えば、特許文献１には、フタロシアニン色素を含む蛍光標識剤が開示されている。しかし、蛍光標識剤として用いるには蛍光強度が低いといった課題があった。
国際公開第２００４／０３８３７８号
会澤英樹、外３名、「診断試薬用シリカナノ粒子の開発」、古河電工時報、古河電気工業株式会社、平成２０年３月、第１２１号、ｐ．１７ ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ 第３４巻、第１号、通算３９４号、２０１７年１月１２日発行 シーエムシー出版、ｐ．２９
本発明が解決しようとする課題は、６５０ｎｍ以上の波長領域において、蛍光標識剤に適した蛍光強度、耐光性、耐久性に優れた特性を有するフタロシアニンを提供することである。
本発明者らは、前記諸問題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、上記課題を解決するための優れた特性を有するフタロシアニンを見出し、本発明をなしたものである。
すなわち、本発明は、一般式（１）で表されるフタロシアニンを含むことを特徴とする蛍光標識剤に関する。

一般式（１）：
Figure 2021138938

Ｘ１〜Ｘ１６は、それぞれ独立に、−Ｒ１−Ｚ、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルケニル基、複素環基、−ＡＢ、−ＳＯ３Ｍ１、または−ＣＯＯＭ２を表す。Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、または複素環基を表す。Ｍ１、Ｍ２はそれぞれ独立に、水素原子または１価のカチオンを表す。
Ｘ１〜Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
Ｘ１７は、−Ｒ１−Ｚ、水酸基、ハロゲン元素、アルコキシ基、アリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、または−ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。Ｘ２０は、水素原子、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２１は、水酸基、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２２〜Ｘ２４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
Ｙは、２価〜５価の金属原子を表し、Ｙが２価の金属原子である場合はｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合はｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合はｋは２である。
ただし、Ｘ１〜Ｘ１７の少なくとも１つは−Ｒ１−Ｚであり，
Ｒ１は、直接結合、−Ｏ−、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ２−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＳ（＝Ｏ）２−、−ＯＳｉＲ３Ｒ４−、−Ｃ（＝Ｏ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を表す。
Ｚは、−（Ｌ）−（Ｗ）または−（Ｌ）−（Ｑ）を表し、（Ｌ）はリンカー、（Ｗ）は標的物質を認識する物質とフタロシアニンとを結合させるための反応性基、（Ｑ）は標的物質を認識する物質を表す。
Ｒ２は、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。
Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
また、本発明は、標的物質の標識方法が抗原抗体反応である、前記蛍光標識剤に関する。
また、本発明は、一般式（１）で表されるフタロシアニン化合物に関する。
一般式（１）：
Figure 2021138938
Ｘ１〜Ｘ１６は、それぞれ独立に、−Ｒ１−Ｚ、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルケニル基、複素環基、−ＡＢ、−ＳＯ３Ｍ１、または−ＣＯＯＭ２を表す。Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、または複素環基を表す。Ｍ１、Ｍ２はそれぞれ独立に、水素原子または１価のカチオンを表す。
Ｘ１〜Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
Ｘ１７は、−Ｒ１−Ｚ、水酸基、ハロゲン元素、アルコキシ基、アリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、または−ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。Ｘ２０は、水素原子、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２１は、水酸基、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２２〜Ｘ２４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
Ｙは、２価〜５価の金属原子を表し、Ｙが２価の金属原子である場合はｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合はｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合はｋは２である。
ただし、Ｘ１〜Ｘ１７の少なくとも１つは−Ｒ１−Ｚであり，
Ｒ１は、直接結合、−Ｏ−、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ３−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＳ（＝Ｏ）２−、−ＯＳｉＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を表す。
Ｚは、−（Ｌ）−（Ｗ）または−（Ｌ）−（Ｑ）を表し、（Ｌ）はリンカー、（Ｗ）は標的物質を認識する物質とフタロシアニンとを結合させるための反応性基、（Ｑ）は標的物質を認識する物質を表す。
Ｒ２は、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。
Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
本発明によって、６５０ｎｍ以上の長波長の波長領域において、蛍光標識剤に適した蛍光強度、耐光性、耐久性に優れた特性を有するフタロシアニンを提供することが可能となった。
図１は、蛍光標識剤１の蛍光強度評価での蛍光スペクトルである。 図２は、蛍光標識剤２の蛍光強度評価での蛍光スペクトルである。 図３は、蛍光標識剤１０の蛍光強度評価での蛍光スペクトルである。 図４は、蛍光標識剤２２の蛍光強度評価での蛍光スペクトルである。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の蛍光標識剤に用いられるフタロシアニンは、一般式（１）で表される構造を有する。
アルキル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、２−エチルヘキシル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、ネオペンチル基等を挙げることができる。アルキル基の炭素数は１〜３０の範囲内であることが好ましい。
アルキル基は置換基を有する置換アルキル基または無置換のアルキル基であってよく、置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、カルボキシル基等の他、上述したアルキル基、後述するアリール基、シクロアルキル基、複素環基が挙げられる。また、構造の一部が、アミド結合（−ＮＨＣＯ−）やエステル結合（−ＣＯＯ−）、エーテル結合（−Ｏ−）で置換されている場合、その置換部分も「置換基」として含めるものとする。
したがって、置換アルキル基としては、上記の置換基で置換されたアルキル基を意味する。一つ又は二つ以上の置換基で置換されたものであっても良い。例えば、ハロゲン原子で置換されたアルキル基の具体例としては、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、−（ＣＦ２）４ＣＦ３、−（ＣＦ２）５ＣＦ３、−（ＣＦ２）６ＣＦ３、−（ＣＦ２）７ＣＦ３、−（ＣＦ２）８ＣＦ３、トリクロロメチル基２，２−ジブロモエチル基等を挙げることができる。
また、アミド結合で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ（−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）５−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）１１−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ３） ２−等を挙げることができる。アミド結
合で置換されたアルキル基の炭素数は、２〜３０の範囲内であることが好ましい。
また、エステル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ（−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−（ＣＨ２）５−ＣＯＯ−（ＣＨ２）１１−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ−（ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ３） ２等を挙げることができる。エステル結合で置換されたア
ルキル基の炭素数は、２〜３０の範囲内であることが好ましい。
また、エーテル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ３（ここでｎは１から８の整数である）、−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−ＣＨ３（ここでｍは１から５の整数である）、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３−、−ＣＨ２−ＣＨ−（ＯＣＨ３）２等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。エーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２〜３０の範囲内であることが好ましい。
また、アミド結合（−ＮＨＣＯ−）、エステル結合（−ＣＯＯ−）、およびエーテル結合（−Ｏ−）のうち２種以上の置換基で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ２−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３を挙げることができる。アミド結合（−ＮＨＣＯ−）、エステル結合（−ＣＯＯ−）、およびエーテル結合（−Ｏ−）のうち２種以上の置換基で置換されたアルキル基の炭素数は、３〜３０の範囲内であることが好ましい。
シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロへキシル基、２，５−ジメチルシクロペンチル基、４−ｔｅｒｔ−プチルシクロヘキシル基等が挙げられる。また、シクロアルキル基の炭素数は５〜１２の範囲内であることが好ましい。シクロアルキル基は置換シクロアルキル基であってもよく、置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。
アルケニル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基が挙げられる。アルケニル基はその構造中に一つの二重結合を一般的に指すが、本明細書においては複数の二重結合を有するものもアルケニル基に含めるものとする。具体例としては、ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、イソプロペニル基、イソブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、１，３−ブタジエニル基等を挙げることができる。アルケニル基の炭素数は２〜１８の範囲内であることが好ましい。アルケニル基は置換アルケニル基であってもよく、置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。
アリール基としては、単環または縮合多環のアリール基が挙げられる。例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−ビフェニル基、ｍ−ビフェニル基、２−アントリル基、９−アントリル基、２−フェナントリル基、３−フェナントリル基、９−フェナントリル基、２−フルオレニル基、３−フルオレニル基、９−フルオレニル基、１−ピレニル基、２−ピレニル基、３−ペリレニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、４−メチルビフェニル基、ターフェニル基、４−メチル−１−ナフチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ナフチル基、４−ナフチル−１−ナフチル基、６−フェニル−２−ナフチル基、１０−フェニル−９−アントリル基、スピロフルオレニル基、２−ベンゾシクロブテニル基等が挙げられる。アリール基の炭素数は６〜１８の範囲内であることが好ましい。
アリール基は置換アリール基であってもよく、の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。
複素環基としては、脂肪族複素環基や芳香族複素環基が挙げられる。具体例としては、ピリジル基、ピラジル基、ピペリジノ基、ピラニル基、モルホリノ基、アクリジニル基等が挙げられる。また、下記構造式で表される基も挙げられる。複素環基の炭素数は、４〜１２であることが好ましい。環員数は、５〜１３であることが好ましい。
Figure 2021138938
複素環基は置換複素環基であってもよく、置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。例えば、複素環基３−メチルピリジル基、Ｎ−メチルピペリジル基、Ｎ−メチルピローリル基等が挙げられる。
アルコキシ基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルコキシル基が挙げられる。具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、２，３−ジメチル−３−ペンチルオキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ステアリルオキシ基、２−エチルへキシルオキシ基等が挙げられる。アルコキシル基の炭素数は１〜６の範囲内であることが好ましい。アルコキシ基は置換アルコキシル基であってもよく、置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。
置換アルコキシ基の置換基の具体例としては、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基、２，２，３，３−テトラフルオロプロポキシ基、２，２−ビス（トリフルオロメチル）プロポキシ基、２−エトキシエトキシ基、２−ブトキシエトキシ基、２−ニトロプロポキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
アリールオキシ基としては、単環または縮合多環のアリールオキシ基が挙げられる。具体例としては、フェノキシ基、ｐ−メチルフェノキシ基、ナフチルオキシ基、アンスリルオキシ基等が挙げられる。アリールオキシ基は、単環のアリールオキシ基が好ましい。また、炭素数６〜１２のアリールオキシ基が好ましい。
アリールオキシ基は置換アリールオキシ基であってもよく、置換基としては、上述したアリール基における置換基と同じ置換基が挙げられる。例えば、ｐ−ニトロフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、２，４−ジクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２−メチル−４−クロロフェノキシ基等が挙げられる。
アルキレン基としては、アルキル基から一つの水素原子を除いた二価の基が挙げられる。
アルキレン基は置換もしくは無置換のアルキレン基であってよく、その具体例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−等が挙げられる。
アリーレン基としては、アリール基から一つの水素原子を除いた二価の基が挙げられる。アリーレン基は置換もしくは無置換のアリーレン基であってよく、その具体例としては、下記構造式で表される基が挙げられる。
Figure 2021138938

第１６族元素としては、酸素、硫黄、セレン、テルル等が挙げられる。この内、酸素、硫黄、セレンが好ましく、合成の容易さや安全性の点で酸素、硫黄がより好ましい。
Ｘ１〜Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよく、好ましい具体例としてはナフタロシアニン構造等が挙げられる。
Ｙの２価の金属としてはＭｇ、Ｃｕ、Ｚｎ等が挙げられる。３価の金属原子としては、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ等が挙げられる。４価の金属原子としては、Ｓｉ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｃｒ、Ｚｒ等が挙げられる。５価の金属原子としては、Ｐ等が挙げられる。耐光性の観点からは、Ａｌ、Ｓｉが好ましく、蛍光強度の観点から、Ａｌがより好ましい。
Ｍ１、Ｍ２の１価のカチオンとしては、アルカリ金属イオン、４級アンモニウムカチオン等が挙げられる。アルカリ金属イオンとしては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等が挙げられる。
（蛍光標識剤）
本発明の蛍光標識剤は、生化学研究から医療診断までの幅広い分野におけるバイオイメージング用蛍光標識として応用可能であり、例えば、遺伝子診断分野、免疫診断分野、医療開発分野、再生医療分野、環境試験分野、バイオテクノロジー分野、蛍光検査等における蛍光標識等として使用することができる。
本発明の蛍光標識剤の用途は特に限定されないが、例えば、細胞、タンパク質や生体内の低分子化合物を蛍光ラベルすることで、生体内での挙動を可視化することが挙げられる。また、本発明の好ましい形態として、抗原抗体反応により標的物質を標識するための蛍光標識剤が挙げられる。
フタロシアニンに−Ｒ１−Ｚを導入することで、上記用途に好適な蛍光標識剤を得ることができる。また、−Ｒ１−Ｚ以外のＸ１〜Ｘ１７を導入することにより、６５０ｎｍ以上の波長領域において、蛍光標識剤に適した蛍光強度、耐光性、耐久性に優れた特性を得ることが可能となる。
抗原抗体反応により標的物質を標識する場合、本発明のフタロシアニンに対して標的物質と結合する物質をラベル化することが好ましく、すなわち、−Ｒ１−Ｚにおいて、Ｚが−（Ｌ）−（Ｑ）であることが好ましい。
標的物質を認識する物質（Ｑ）とフタロシアニンとを結合するリンカー（Ｌ）は、直接結合、またはＣ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、およびＳの中から選択される１〜６０の原子を有する直鎖または分岐、環式または複素環式、飽和または不飽和である分子鎖が挙げられるが、これに限定されるものではない。
標的物質を認識する物質とフタロシアニンとを結合させるための反応性基（Ｗ）としては、反応性アミノ基、反応性チオール基、ＮＨＳエステル等の活性化エステル、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、無水物、カルボン酸、カルボジイミド、カルボナート、カルバメート、ハロアセトアミド（例えばヨードアセトアミド）、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホン酸エステルおよびチオシアナートなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
標的物質（標的生体物質）を認識する物質（Ｑ）としては、タンパク質等を特異的に認識しうる抗体（がん抗体を含む）、ペプチド、タンパク質受容体や当該タンパク質に結合しうる低分子化合物等を挙げることができる 。例えば、標的生体物質が癌等の疾患部位、または細胞において特異的に発現する種々のタンパク質またはペプチドである場合、標的生体物質を認識する物質としては、これらに対する抗体（セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ等のがん抗体、内皮細胞マーカー抗体、組織特異的抗体、リン酸化タンパク抗体など）またはその親和性物質、ビオチン、葉酸、トランスフェリン、トランスフェリン結合型ペプチドなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
標的生体物質を認識する物質とフタロシアニンを連結する方法としては、反応性官能基を介した共有結合の形成が挙げられるがこれに限定されない。標的生体物質にチオール、ヒドロキシル、カルボキシル、またはアミノ基がある場合、フタロシアニンに導入する反応性官能基としては、反応性アミノ基、反応性チオール基、ＮＨＳエステル等の活性化エステル、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、無水物、カルボン酸、カルボジイミド、カルボナート、カルバメート、ハロアセトアミド（例えばヨードアセトアミド）、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スルホン酸エステルおよびチオシアナートなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の蛍光標識剤をリン脂質に集積させることで、細胞膜やエクソソーム、リポソームを蛍光ラベル化することができる。このような用途の場合、本発明のフタロシアニンの軸置換基がリン脂質への集積性に優れるためであると考えられる。
本発明のフタロシアニンの濃度は特に限定されないが、例えば、細胞を扱う場合、細胞の機能障害や増殖阻害等への影響を考量すると、濃度は低い方が好ましく、本発明のフタロシアニンの濃度は１００μＭ以下であることが好ましい。
本発明における蛍光標識剤は、本発明のフタロシアニンを含有していれば、必要に応じてその他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、例えば、水や有機溶剤、両親媒性物質等が挙げられる。
本発明のフタロシアニンの合成方法としては特に限定されないが、例えば、フタロニトリル誘導体を原料として公知の方法で金属フタロシアニンを合成した後、対応する軸成分とジメチルスルホキシド溶媒中で加熱撹拌することで得ることができる。
原料であるフタロニトリル誘導体が非対称の構造である場合、得られるフタロシアニンは置換基の位置が異なる異性体の混合物として得られる。本明細書においては、異性体の構造のうち一例を示す。
本発明のフタロシアニンの具体例としては、以下のフタロシアニンが挙げられるが、本発明のフタロシアニンはこれらに限定されない。以下、Ｅｔとはエチル基を示す。
Figure 2021138938
Figure 2021138938
Figure 2021138938
本発明のフタロシアニンは、近赤外吸収材として保護眼鏡、近赤外線吸収フィルター、農業用フィルム、光ガード等の近赤外吸収材料に使用することができる。また、着色材として印刷インキ、ＩＪインキ、プラスチック、塗料、繊維、文具、筆記具、化粧品等の着色に使用することができる。
以下に、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、実施例中「部」とは、「質量部」を表す。
＜フタロシアニンＡ−１の製造方法＞
キノリン５０部および無水塩化アルミニウム１部の溶液にアンモニアガスを導入し、３−エトキシフタロニトリルを５部添加した。１８０℃で７時間反応させた。これを室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加え、析出した固体をろ取し、水２００部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率８８．４％で４．７部の表２に示すフタロシアニンＡ−１を得た。
＜フタロシアニンＡ−２〜Ａ−９の製造方法＞
フタロシアニンＡ−１の製造方法で使用した３−エトキシフタロニトリルを表２に示すフ
タロニトリル誘導体に変更した以外は、フタロシアニンＡ−１の製造と同様にして、表２
に示すフタロシアニンＡ−２〜Ａ−９をそれぞれ製造した。尚、フタロニトリル誘導体は、フタロシアニンＡ−１の製造における３−エトキシフタロニトリルと同モル量使用した。
Figure 2021138938
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＢ−１の製造方法＞
フタロシアニンＡ−１を３部Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）１０部に溶解させ、水酸化カリウム０．４５部を水１部に溶解させた水溶液を全量添加した。１１０℃で７時間反応させた。これを室温まで冷却した後、水１００部を加え、析出した固体をろ取し、水１００部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率９９．２％で２．９部の表３に示すフタロシアニンＢ−１を得た。
＜フタロシアニンＢ−２〜Ｂ−４の製造方法＞
フタロシアニンＢ−１の製造方法で使用したフタロシアニンＡ−１を表３に示すフタロシアニンＡに変更した以外は、フタロシアニンＢ−１の製造と同様にして、表３に示すフタロシアニンＢ−２〜Ｂ−４をそれぞれ製造した。尚、フタロシアニンＡは、フタロシアニンＢ−１の製造におけるフタロシアニンＡ−１と同モル量使用した。
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＣ−１の製造方法＞
フタロシアニンＢ−１を１部と３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン０．６部をピ
リジンに溶解させ、１１５℃で３時間還流した。エバポレーターでピリジンを除去した後、エタノール１０部と水５０部の混合溶液を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率３３．７％で０．３９部の表４に示すフタロシアニンＣ−１を得た。
＜フタロシアニンＣ−２〜Ｃ−４の製造方法＞
フタロシアニンＣ−１の製造方法で使用したフタロシアニンＢ−１を表４に示すフタロシアニンＢに変更した以外は、フタロシアニンＣ−１の製造と同様にして、表４に示すフタロシアニンＣ−２〜Ｃ−４をそれぞれ製造した。尚、フタロシアニンＢは、フタロシアニンＣ−１の製造におけるフタロシアニンＢ−１と同モル量使用した。
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＣ−５の製造方法＞
フタロシアニンＡ−１を０．７部と４−（３−アミノプロピル）ベンゼンスルホン酸０．
４部をジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン０．３部を添加した後、９０℃で５時間反応させた。これを室温まで冷却した後、水１００部と食塩１０部を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率４１．６％で０．３６部の表５に示すフタロシアニンＣ−５を得た。
＜フタロシアニンＣ−６〜Ｃ−８の製造方法＞
フタロシアニンＣ−５の製造方法で使用したフタロシアニンＡ−１を表５に示すフタロシアニンＡに変更した以外は、フタロシアニンＣ−５の製造と同様にして、表５に示すフタロシアニンＣ−６〜Ｃ−８をそれぞれ製造した。尚、フタロシアニンＡは、フタロシアニンＣ−５の製造におけるフタロシアニンＡ−１と同モル量使用した。
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＤ−１の製造方法＞
フタロシアニンＣ−１を０．０６部と無水コハク酸０．００７部をＮ−メチル−２−ピロ
リドン（ＮＭＰ）５部に溶解させ、９０℃で４時間反応させた。遠心エバポレーターでＮＭＰを除去した後、水５部を加え、析出した固体をろ取し、水５部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率６１．１％で０．０４１部の表１に示すフタロシアニンＤ−１を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝９４９．３７（理論値９４８．０６）に分子イオンピークが検出され、表１に示すフタロシアニンＤ−１の構造を有することが同定された。
＜フタロシアニンＤ−２〜Ｄ−９の製造方法＞
フタロシアニンＤ−１の製造方法で使用したフタロシアニンＣ−１と無水コハク酸を表６に示すフタロシアニンＣと無水コハク酸誘導体に変更した以外は、フタロシアニンＤ−１の製造と同様にして、表１に示すフタロシアニンＤ−２〜Ｄ−９をそれぞれ製造した。尚、フタロシアニンＣおよび無水コハク酸誘導体は、フタロシアニンＤ−１の製造におけるフタロシアニンＣ−１および無水コハク酸と同モル量使用した。得られたフタロシアニンＤ−２〜Ｄ−９の構造は、質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表８に示した構造を有することが確認された。表９にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＤ−１０の製造方法＞
フタロシアニンＡ−１を０．５部と（２−カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸０．
２９部をジメチルスルホキシド２０部に溶解させ、８０℃で８時間反応させた。これを室温まで冷却した後、水５０部と食塩１０部を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率７４．４％で０．４６部の表１に示すフタロシアニンＤ−１０を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔ
ｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝９２９．９８（理論値９２８．８８）に分子イオンピークが検出され、表８に示すフタロシアニンＤ−１０の構造を有することが同
定された。
＜フタロシアニンＤ−１１〜Ｄ−１４の製造方法＞
フタロシアニンＤ−１０の製造方法で使用した（２−カルボキシエチル）フェニルホスフ
ィン酸を表７に示すＸに変更した以外は、フタロシアニンＤ−１０の製造と同様にして、表１に示すフタロシアニンＤ−１１〜Ｄ−１４をそれぞれ製造した。尚、Ｘは、フタロシアニンＤ−１０の製造における（２−カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸と同モル量使用した。得られたフタロシアニンＤ−１１〜Ｄ−１４の構造は、質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）によって同定し、表８に示した構造を有することが確認された。表９にマススペクトルの分析結果を示す。
＜フタロシアニンＤ−１５の製造方法＞
フタロシアニンＡ−１を１部とテレフタル酸０．４部をジメチルスルホキシド５０部に溶
解させ、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン０．４部を添加した後、９０℃で５時間反応させた。これを室温まで冷却した後、水１００部と食塩１０部を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率４４．４％で０．５２部の表１に示すフタロシアニンＤ−１５を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝８８１．４５（理論値８８０．８５）に分子イオンピークが検出され、表８に示すフタロシアニンＤ−１５の構造を有することが同定された。
＜フタロシアニンＤ−１６〜Ｄ−１８の製造方法＞
フタロシアニンＤ−１５の製造方法で使用したフタロシアニンＡ−１とテレフタル酸を表７に示すフタロシアニンＡとＸに変更した以外は、フタロシアニンＤ−１５の製造と同様にして、表１に示すフタロシアニンＤ−１６〜Ｄ−１８をそれぞれ製造した。尚、フタロシアニンＡおよびＸは、フタロシアニンＤ−１５の製造におけるフタロシアニンＡ−１およびテレフタル酸と同モル量使用した。得られたフタロシアニンＤ−１６〜Ｄ−１８の構造は、質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）によって同定し、表８に示した構造を有することが確認された。表９にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure 2021138938
Figure 2021138938
Figure 2021138938
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＥ−１の製造方法＞
キノリン５０部および無水塩化アルミニウム１部の溶液にアンモニアガスを導入し、６−ｔｅｒｔ−アミルナフタレン−２，３−ジカルボニトリルを５．６部と４―フルオロフタロニトリルを１．１部添加した。１８０℃で７時間反応させた。これを室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加え、析出した固体をろ取し、水２００部で洗浄を行った。粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。８０℃で乾燥させ、収率３０．５％で表１０に示す化合物Ｅ−１を得た。
＜フタロシアニンＥ−２の製造方法＞
フタロシアニンＥ−１の製造方法で使用した６−ｔｅｒｔ−アミルナフタレン−２，３−ジカルボニトリルを表１０に示す３−エトキシフタロニトリルに変更した以外は、フタロシアニンＥ−１の製造と同様にして、表１０に示すフタロシアニンＥ−２を製造した。尚、３−エトキシフタロニトリルは、フタロシアニンＥ−１の製造における６−ｔｅｒｔ−アミルナフタレン−２，３−ジカルボニトリルと同モル量使用した。
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＦ−１の製造方法＞
フタロシアニンＥ−１を１．０部とアジピン酸０．６部をジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン０．４部を添加した後、９０℃で８時間反応させた。これを室温まで冷却した後、水１００部を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した後、８０℃で乾燥させ、収率５５．０％で表１に示すフタロシアニンＦ−１を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝１０７９．５２（理論値１０７９．６８）に分子イオンピークが検出され、表１１に示すフタロシアニンＦ−１の構造を有することが同定された。
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＧ−１の製造方法＞
フタロシアニンＥ−２を１．０部とエタノールアミン０．５部をジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン０．３部を添加した後、９０℃で８時間反応させた。これを室温まで冷却した後、水１００部を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した後、８０℃で乾燥させ、収率６４．２％で表１２に示すフタロシアニンＧ−１を得た。
＜フタロシアニンＧ−２の製造方法＞
フタロシアニンＧ−１を１部と無水コハク酸０．２６部をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）５０部に溶解させ、９０℃で４時間反応させた。遠心エバポレーターでＮＭＰを除去した後、水５部を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率６５．９％で表１２に示すフタロシアニンＧ−２を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝８６７．１６（理論値８６６．２７）に分子イオンピークが検出され、表１２に示すフタロシアニンＧ−２の構造を有することが同定された。
Figure 2021138938
＜フタロシアニンＨ−１の製造方法＞
スルホラン２００部、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）１５．７部に４−エチルチオ−１，３−ジイミノイソインドリン５部および四塩化ケイ素８．８部を加え、１６０〜１７０℃で８時間加熱撹拌後、室温（２５℃）まで冷却した。メタノール２００部を加え、析出した沈澱を濾別して、メタノール：水（質量比４：１）混合溶液で洗浄後、乾燥して、収率７１．４％で表１３に示すフタロシアニンＨ−１を得た。
＜フタロシアニンＨ−２の製造方法＞
フタロシアニンＨ−１を１部と３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン０．２部をピ
リジンに溶解させ、１１５℃で３時間還流した。エバポレーターでピリジンを除去した後、エタノール１０部と水５０部の混合溶液を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率５０．６％で表１３に示すフタロシアニンＨ−２を得た。
＜フタロシアニンＨ−３の製造方法＞
フタロシアニンＨ−２を１部と無水コハク酸０．２６部をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）５０部に溶解させ、９０℃で４時間反応させた。遠心エバポレーターでＮＭＰを除去した後、水５部を加え、析出した固体をろ取し、水５０部で洗浄を行った。８０℃で乾燥させ、収率６５．９％で表１３に示すフタロシアニンＨ−３を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝１０３１．１９（理論値１０３０．４２）に分子イオンピークが検出され、表１３に示すフタロシアニンＨ−３の構造を有することが同定された。
Figure 2021138938
［実施例１］
＜色素溶液１の作製＞
ジメチルスルホキシド１０００部にフタロシアニンＤ−１を１．８９６部溶解した。０
．２μｍナイロン製メンブレンフィルターでろ過してフタロシアニンＤ−１の色素溶液１を作製した。
［実施例２〜２１］
＜色素溶液２〜２１の作製＞
色素溶液１の作製で使用したフタロシアニンＤ−１のかわりに、表１４に示すフタロシアニンに変更した以外は、色素溶液１の作製と同様にして、色素溶液２〜２１をそれぞれ作製した。ただし、各フタロシアニンは、フタロシアニンＤ−１と同モル量使用した。
［比較例１〜３］
＜色素溶液２２の作製＞
色素溶液１の作製で使用したフタロシアニンＤ−１のかわりに、インドシアニングリーン（東京化成）に変更した以外は、色素溶液１の作製と同様にして、色素溶液２２を作製した。ただし、各色素は、フタロシアニンＤ−１と同モル量使用した。
＜蛍光強度評価＞
各々の色素溶液について、蛍光光度計（日本分光株式会社製、ＦＰ−６５００）を用いて蛍光スペクトルを測定し、蛍光波長７８０〜８４０ｎｍの範囲内での蛍光強度積分値を求めた。また、この時の励起光は色素の最も長波長側の吸収極大波長に相当する波長を用いた。比較例１の色素溶液２１の蛍光強度積分値を１とした時の、各々の蛍光標識剤の蛍光強度積分値の相対値を算出し、下記の基準に基づいて評価した。評価が３以上である場合、各フタロシアニンは蛍光標識剤として用いた場合の特性が良好であるといえる。（実用レベルは３以上）

４：蛍光強度積分値 ２．５以上
３：蛍光強度積分値 ２以上、２．５未満
２：蛍光強度積分値 １．５以上、２未満
１：蛍光強度積分値 １．５未満
＜耐光性評価＞
各々の色素溶液について、色素の最も長波長側の吸収極大波長に相当する波長を、蛍光分光光度計（日本分光社製ＦＰ―６５００、励起波長のスリット幅２０ｎｍ）で２時間照射した際の吸収スペクトルの変化を分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ−４１００）を用いてそれぞれ測定した。光照射前の最大吸収波長の吸光度をＩ０、光照射後の最大吸収波長の吸光度をＩ１を記録し、Ｉ１／Ｉ０値を耐光性の指標とした。評価基準は以下の通りである。（実用レベルは３以上）

４：相対強度 ９０％以上
３：相対強度 ８５％以上、９０％未満
２：相対強度 ８０％以上、８５％未満
１：相対強度 ８０％未満
＜耐久性評価＞
各々の色素溶液について、４０℃で７日間保存した際の吸収スペクトルの変化を分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ−４１００）を用いてそれぞれ測定した。光照射前の最大吸収波長の吸光度をＩ０、光照射後の最大吸収波長の吸光度をＩ１を記録し、Ｉ１／Ｉ０値を耐光性の指標とした。
評価基準は以下の通りである。（実用レベルは３以上）

４：相対強度 ９０％以上
３：相対強度 ８５％以上、９０％未満
２：相対強度 ８０％以上、８５％未満
１：相対強度 ８０％未満
以下、評価結果を表１４に示す。図に色素溶液１、２、１０、２２の蛍光スペクトルを示す。
Figure 2021138938
 ［実施例２２］
＜フタロシアニンＩ−１の製造方法＞
フタロシアニンＤ−１を１部とＮ−ヒドロキシスクシイミド０．１２部をＮ，Ｎ−ジメチルスルホキシド２０部に溶解させた。そこに、ジシクロヘキシルカルボジイミド０．２２部をジメチルスルホキシド１５部に溶解させた溶液を滴下した後、２５℃で１２時間反応させた。遠心エバポレーターを用いてジメチルスルホキシドを除去した後、ジエチルエーテル５０部で洗浄することで表１に示すフタロシアニンＩ−１を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝１０４６．３５（理論値１０４５．１３）に分子イオンピークが検出され、表１に示すフタロシアニンＩ−１の構造を有することが同定された。
［実施例２３〜４２］
＜フタロシアニンＩ−２〜Ｉ−２１の製造方法＞
フタロシアニンＩ−１の製造方法で使用したフタロシアニンＤ−１を表１５に示すフタロシアニンに変更した以外は、フタロシアニンＩ−１の製造と同様にして、表１に示すフタロシアニンＩ−２〜Ｉ−２１をそれぞれ製造した。尚、フタロシアニンは、フタロシアニンＩ−１の製造におけるフタロシアニンＤ−１と同モル量使用した。得られたフタロシアニンＩ−２〜Ｉ−２１の構造は、質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１５にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure 2021138938


フタロシアニンＤ−１〜Ｄ−１８およびＦ−１、Ｇ−２、Ｈ−３は、抗体との反応可能な置換基を導入することが可能であった。このことから、本発明のフタロシアニンは抗原抗体反応を用いた標的物質の蛍光標識に利用することができる。
本発明のフタロシアニンを用いて作製した色素溶液１〜２１（実施例２２〜４２
）は、色素溶液２２（比較例１）よりも蛍光強度、耐光性、耐久性が良好であった。このことから、本発明のフタロシアニンは、優れた蛍光標識剤としての性能を有することが明らかになった。
［実施例４３］
＜ｐａｎ−Ｉ−１の合成＞
パニツムマブ（１ｍｇ、６．８ｎｍｏｌ）を０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液（ｐＨ ８．５）に溶解させた。フタロシアニンＩ−１（３５．７ μｇ、３４．２ ｎｍｏｌ）を１５０μＬのＤＭＳＯ溶液に溶解させた後に、上記で調製したパニツムマブ水溶液に添加し、室温で１時間インキュベートした。反応混合物をセファデックスＧ５０カラム（ＰＤ−１０、Ｃｙｔｉｂａ）で精製した後に、溶出液をＰＢＳ溶液（ＧＩＢＣＯ）でｐＨ７．４に調整し、ｐａｎ−Ｉ−１を得た。タンパク質濃度はクーマシープラスタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用し、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより算出した。またフタロシアニンＩ−１の濃度は、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて極大吸収波長である７１５ｎｍにおける吸光度を測定することにより算出した。算出したタンパク質濃度とフタロシアニンＩ−１の濃度比からパニツムマブに結合したフタロシアニンＩ−１の数を決定した。
［実施例４４〜６３］
＜ｐａｎ−Ｉ−２〜Ｉ−７、ｃｅｔ−Ｉ−８〜Ｉ−１４、ｔｒａ−Ｉ−１５〜Ｉ−２１の合成＞
ｐａｎ−Ｉ−１の製造方法で使用したフタロシアニンＩ−１及びパニツムマブを表１６に示すフタロシアニンと抗体に変更した以外は、ｐａｎ−Ｉ−１の製造と同様にして、表１６に示すｐａｎ−Ｉ−２〜Ｉ−７、ｃｅｔ−Ｉ−８〜Ｉ−１４、ｔｒａ−Ｉ−１５〜Ｉ−２１をそれぞれ製造した。尚、フタロシアニンＩ及び抗体は、ｐａｎ−Ｉ−１の製造におけるフタロシアニンＩ−１及びパニツムマブと同モル量使用した。
［比較例２〜７］
＜ＩＲ Ｄｙｅ ７００及びＩＲ Ｄｙｅ ８００の抗体導入体の合成＞
ｐａｎ−Ｉ−１の製造方法で使用したフタロシアニンＩ−１をＩＲ Ｄｙｅ ７００またはＩＲ Ｄｙｅ ８００（いずれもＬＩ−ＣＯＲ社）に、パニツムマブを表１６に示す抗体に変更した以外は、ｐａｎ−Ｉ−１の製造と同様にして、表１６に示すｐａｎ−ＩＲ Ｄｙｅ ７００、ｐａｎ−ＩＲ Ｄｙｅ ８００、ｃｅｔ−ＩＲ Ｄｙｅ ７００、ｃｅｔ−ＩＲ Ｄｙｅ ８００、ｔｒａ−ＩＲ Ｄｙｅ ７００、ｔｒａ−ＩＲ Ｄｙｅ ８００をそれぞれ製造した。尚、色素及び抗体は、ｐａｎ−Ｉ−１の製造におけるフタロシアニンＩ−１及びパニツムマブと同モル量使用した。
Figure 2021138938
［実施例６４］
＜ｐａｎ−Ｉ−１の細胞染色＞
ヒト類上皮がん細胞Ａ４３１細胞を９６ウェルプレートに播種（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で２４時間培養した。その後、培地を取り除き、１０μｇ／ｍｌのｐａｎ−Ｆ−１を添加し、インキュベーター内で６時間静置した。色素をＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて、励起波長７１５±１０ｎｍ、蛍光波長７９０±１０ｎｍの範囲で蛍光強度測定を行った。
［実施例６５〜８４、比較例８〜１３］
＜ｐａｎ−Ｉ−１の細胞染色＞で使用したｐａｎ−Ｉ−１及びＡ４３１細胞を表１７に示す抗体導入色素と細胞種（ヒト乳腺がん由来細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ヒト気管支上皮がん由来細胞Ｃａｌｕ−３）に変更した以外は、＜ｐａｎ−Ｉ−１の細胞染色＞と同様にして細胞染色を行った。尚、抗体導入色素は＜ｐａｎ−Ｉ−１の細胞染色＞におけるｐａｎ−Ｉ−１と同モル量使用した。染色後、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて、励起波長７１５±１０ｎｍ、蛍光波長７９０±１０ｎｍの範囲で蛍光強度測定を行い、下記の基準に基づいて評価した。

４：蛍光強度が２０００以上
３：蛍光強度が１０００以上〜２０００未満
２：蛍光強度が２００以上〜１０００未満
１：蛍光強度が２００未満
Figure 2021138938
以上の結果より、本発明のフタロシアニンは抗体への修飾が可能であることを確認した。また、抗体を導入した色素を使用することで、抗原抗体反応を用いた細胞染色が可能であり、比較例よりも高い蛍光強度で染色できることを確認した。本発明の蛍光標識剤を用いることで、高感度に生体組織を染色することが可能となる。

Claims (3)

  1. 一般式（１）で表されるフタロシアニンを含むことを特徴とする蛍光標識剤。

    一般式（１）：
    Figure 2021138938


    Ｘ１〜Ｘ１６は、それぞれ独立に、−Ｒ１−Ｚ、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルケニル基、複素環基、−ＡＢ、−ＳＯ３Ｍ１、または−ＣＯＯＭ２を表す。Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、または複素環基を表す。Ｍ１、Ｍ２はそれぞれ独立に、水素原子または１価のカチオンを表す。
    Ｘ１〜Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
    Ｘ１７は、−Ｒ１−Ｚ、水酸基、ハロゲン元素、アルコキシ基、アリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、または−ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。Ｘ２０は、水素原子、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２１は、水酸基、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２２〜Ｘ２４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
    Ｙは、２価〜５価の金属原子を表し、Ｙが２価の金属原子である場合はｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合はｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合はｋは２である。
    ただし、Ｘ１〜Ｘ１７の少なくとも１つは−Ｒ１−Ｚであり，
    Ｒ１は、直接結合、−Ｏ−、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ２−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＳ（＝Ｏ）２−、−ＯＳｉＲ３Ｒ４−、−Ｃ（＝Ｏ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を表す。
    Ｚは、−（Ｌ）−（Ｗ）または−（Ｌ）−（Ｑ）を表し、（Ｌ）はリンカー、（Ｗ）は標的物質を認識する物質とフタロシアニンとを結合させるための反応性基、（Ｑ）は標的物質を認識する物質を表す。
    Ｒ２は、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。
    Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
  2. 標的物質の標識方法が抗原抗体反応である、請求項１記載の蛍光標識剤。
  3. 一般式（１）で表されるフタロシアニン化合物。

    一般式（１）：
    Figure 2021138938
    Ｘ１〜Ｘ１６は、それぞれ独立に、−Ｒ１−Ｚ、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、アルケニル基、複素環基、−ＡＢ、−ＳＯ３Ｍ１、または−ＣＯＯＭ２を表す。Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基、または複素環基を表す。Ｍ１、Ｍ２はそれぞれ独立に、水素原子または１価のカチオンを表す。
    Ｘ１〜Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
    Ｘ１７は、−Ｒ１−Ｚ、水酸基、ハロゲン元素、アルコキシ基、アリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、または−ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。Ｘ２０は、水素原子、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２１は、水酸基、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。Ｘ２２〜Ｘ２４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
    Ｙは、２価〜５価の金属原子を表し、Ｙが２価の金属原子である場合はｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合はｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合はｋは２である。
    ただし、Ｘ１〜Ｘ１７の少なくとも１つは−Ｒ１−Ｚであり，
    Ｒ１は、直接結合、−Ｏ−、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ２−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＳ（＝Ｏ）２−、−ＯＳｉＲ３Ｒ４−、−Ｃ（＝Ｏ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を表す。
    Ｚは、−（Ｌ）−（Ｗ）または−（Ｌ）−（Ｑ）を表し、（Ｌ）はリンカー、（Ｗ）は標的物質を認識する物質とフタロシアニンとを結合させるための反応性基、（Ｑ）は標的物質を認識する物質を表す。
    Ｒ２は、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、または複素環基を表す。
    Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114660001A (zh) * 2022-03-21 2022-06-24 厦门大学 一种以四磺基金属酞菁测定长链阳离子表面活性剂的方法
WO2023098309A1 (zh) * 2021-11-30 2023-06-08 厦门大学 一种以空壳酞菁为分子探针测定锂离子的荧光分析法

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