WO2007126052A1

WO2007126052A1 - 蛍光性化合物及びそれから成る標識剤

Info

Publication number: WO2007126052A1
Application number: PCT/JP2007/059168
Authority: WO
Inventors: Koji Suzuki; Keitaro Umezawa; Hiroshi Makino; Daniel Citterio
Original assignee: Keio University
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2007-11-08
Also published as: US20090176313A1; EP2022794B1; JP5177427B2; US8193350B2; EP2022794A4; EP2022794A1; JPWO2007126052A1

Description

蛍光性化合物及びそれから成る標識剤

技術分野

[0001] 本発明は、蛍光性化合物及びそれから成る標識剤に関する。

背景技術

[0002] 蛍光色素は、試料を可視化する目的で用いられ、生物および生化学分野においては標識材料 (ラベル化色素)や染色色素、生体関連物質の認識プローブ、光線力学療法 (PDT)などに広く用いられる。また、長波長とりわけ近赤外領域 (具体的には 650

900nm)に吸収および蛍光を有する蛍光色素は、生体組織や血液、脂質や水といつた生体物質の存在下でもこれらの光学的妨害を受けることなく測定できる。さらに低エネルギーかつ高、光浸透性と、つた利点から、生体深部組織のイメージングへの応用が期待される。

[0003] また、長波長の蛍光色素は生物や生化学分野に限らず化学系およびその他の分野でも用いられる。例えば赤色の表示材料や色素レーザー、光学記録材料などに頻繁に用いられる。このように、長波長の蛍光色素は生物分野のみならず、幅広い分野で求められている。

[0004] 優れた長波長蛍光色素、たとえば生体物質の標識材料を目的とした蛍光色素として求められる特性は、以下のような項目がある。

1) 長波長の蛍光

2) 高いモル吸光係数

3) 高い蛍光量子収率

4) 鋭い吸収スペクトル

5) 非環境応答性 (溶媒に対する応答が小さいこと）

6) 波長の多様性 (さまざまな波長の色素が合成できること）

[0005] 現在、上記の条件の一部を満たす分子として、下記構造式で示されるボロンジピロメアン霄格 (4,4— difluoro— 4— bora— 3a,4a— diaza— s— indacenes)力ある。

[0006] [化 1]

[0007] ボロンジピロメテン骨格は、高、光耐久性、高!、蛍光量子収率、鋭、吸収スぺタトルをもつ優れた色素であるが、基本骨格の蛍光波長はおおよそ 500 nm前後であるため、近赤外蛍光色素としての十分な機能を持っていない。そこでボロンジピロメテンの長波長化に関する研究がいくつか行われてきた。その手法としては、 1)強い電子供与基の導入、 2)骨格の堅牢化、 3)共役系の拡張などが挙げられる。

[0008] 1)に関しては、例えば特許文献 1や非特許文献 1に代表されるように、 R¹と R⁷に強い電子供与基を導入することで長波長化は達成できるが、モル吸光係数の向上は達成できていない。また導入する官能基の電子供与性が強くなるほど、光誘起電子移動 (PET)が起こり易くなるため、蛍光量子収率の低下が起こるとともに、溶媒極性に対する蛍光量子収率の依存性が強くなる。具体的には、水やメタノールなどの極性溶媒中においては、これらの分子の蛍光量子収率は著しく低下するため、バイオ分析などには適してヽなヽ。

[0009] 2)は、例えば非特許文献 2に代表されるように、ボロンジピロメテンの R¹および R⁷に導入された電子供与基を、 R²および R⁶と適切なメチレン鎖な、しはへテロ原子で架橋することで長波長化している報告例である力モル吸光係数の向上は達成しておらず、合成法も煩雑であるためノリエーシヨンは限定される。

[0010] 3)は、例えばシァニン系色素のようにォレフィンなどの共役二重結合を拡張することにより長波長化するというものである力これはシァニン系色素などでしばしば報告されているようなォレフインの光異性化に由来する光安定性や蛍光量子収率の低下が懸念されるため、有効は手法とはいえない。また、例えば特許文献 2および特許文献 3に代表されるように、芳香環を R², R³および R⁵, R⁶に縮合することで長波長化を達成することができるが、モル吸光係数の向上は達成できていない。また、報告されている合成法では、縮合できる環も芳香環に限定され、色素のバリエーションも限られる。 [0011] 特許文献 1 :米国特許第 5,248,782号

特許文献 2：米国特許第 5,433,896号

特許文献 3 :米国特許第 6,005,113号

非特許文献 1 :A. Burghart et. al. J. Org. Chem. 1999, 64, 7813.

非特許文献 2 : J. Chen et. al. J. Org. Chem. 2000, 65, 2900.

非特許文献 3 : Current Medicinal Chemistry 2005, 12, 795-895.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0012] 従って、本発明の目的は、高い光耐久性、高い蛍光量子収率、鋭い吸収スぺタトルを持ち、かつ、長波長領域の蛍光を発し、モル吸光係数が高い新規な蛍光性ィ匕合物及び標識剤としてのその用途を提供することである。

課題を解決するための手段

[0013] 本発明らは、鋭意研究の結果、上記したボロンジピロメテン骨格において、 R¹と R²、及び/又は、 R⁶と R⁷で特定のへテロ環を形成することにより、ボロンジピロメテン骨格を含む蛍光色素が有する高!ヽ光耐久性、高!ヽ蛍光量子収率及び f ヽ吸収スぺタトルと、う優れた特性を維持したまま、蛍光の長波長化及びモル吸光係数の向上が達成されることを見出し、本発明を完成した。

[0014] すなわち、本発明は、下記一般式 [I]

[0015] [化 2]

[ I ]

[0016] (ただし、式中、

R¹と R²は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンカも成る群より選ばれる少なくとも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ環を形成しない場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表し、

R⁶と R⁷は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンカも成る群より選ばれる少なくとも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ環を形成しない場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表し、

(l)R¹と R²、及び、（2)R⁶と R⁷、の少なくともいずれか一方は上記へテロ環を形成し、

Qは炭素原子又は窒素原子を表し、

R⁴及び R⁵は互いに独立に水素原子又は前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表し (ただし、 Qが窒素原子の場合には R⁴は存在しない）、

R⁸及び R⁹は互いに独立にハロゲン原子、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、ァリール基又はへテロアリール基を示す）

で示される構造を有する蛍光性化合物を提供する。

[0017] また、本発明は、上記本発明の蛍光性化合物から成る標識剤を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法を提供する。

発明の効果

[0018] 本発明によれば、ボロンジピロメテン骨格を含む蛍光色素が有する高、光耐久性、高ヽ蛍光量子収率及び鋭、吸収スペクトルとヽぅ優れた特性を維持したまま、長波長の蛍光を発し、高いモル吸光係数を有する新規な蛍光性ィヒ合物が提供された。本発明の蛍光性化合物は、蛍光波長が長いので、これを標識剤として用いた場合、生体組織や血液、脂質や水と!ヽつた生体物質の存在下でもこれらの光学的妨害を受けることなく測定できる。さらに低エネルギーかつ高い光浸透性といった利点から、生体深部組織のイメージングへの応用が可能である。また、赤色の表示材料や色素レーザ一、光学記録材料、光線力学治療 (PDT)などに用いることもできる。さらに、本発明の蛍光性化合物は、蛍光量子収率及びモル吸光係数が高いので、これを標識剤として用いることにより、高感度の測定が可能になる。

図面の簡単な説明 [0019] [図 1]本発明の蛍光性ィ匕合物旦と、市販の蛍光性ィ匕合物 Cy7 (商品名）の吸光度の経時変化を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 上記の通り、本発明の蛍光性化合物は、上記一般式 [I]で表される化学構造を有する。一般式 [I]中、 R¹と R²は互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンから成る群より選ばれる少なくとも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ環を形成しな、場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表し、同様に、 R⁶と R⁷も互いに協働して、ィォゥ、酸素、窒素及びリンカ成る群より選ばれる少なくとも 1個のへテロ原子を含む 5員若しくは 6員のへテロ環を形成するか又は該ヘテロ環を形成しな、場合には互いに独立に水素原子若しくは前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表わす。そして、 ( R¹と R²、及び、（2)R⁶と R⁷、の少なくともいずれか一方は上記へテロ環を形成する。このへテロ環により、蛍光が長波長化される。

[0021] 上記へテロ環としては、下記式のいずれかで表される化学構造を有するものが好ましい。上記へテロ環が 2個形成される場合には、互いに独立である。

[0022] [化 3]

ただし、これらの式中、 X、 Y及び Zは、互いに独立にィォゥ、酸素、窒素又はリン原子を示し、 R^1Qないし R¹⁷は互いに独立に水素原子又は本発明の蛍光性ィ匕合物の蛍光を阻害しない任意の基を表す。なお、これらの式中、左側の 2本の波線は、各へテロ環が結合している、本発明の化合物の一部分を模式的に表すものである。好ましいへテロ環を示す上記各式から明らかなように、ヘテロ環は、最も好ましくは 5員環である。また、ヘテロ原子として、酸素原子又はィォゥ原子を有するものが好ましい。上記各式で表されるヘテロ環の中でも、特に下記式のいずれかで表される化学構造を有するものが特に好ましい。

[0024] [化 4]

[0025] 上記各式中、 R^1Qないし R¹⁷は互いに独立に水素原子又は本発明の蛍光性化合物の蛍光を阻害しな!、任意の基を表す (本発明の蛍光性化合物の蛍光を阻害しなヽ任意の基については、 R³ないし R⁵の説明の項で併せて後述する）力 R^1Qないし R¹⁷として、電子供与性基を有するものが、蛍光の波長がより長波長になるので好ましい。特に、電子供与性が高い基ほど、蛍光の波長がより長波長になるので好ましい。 R^1Qないし R¹⁷が 1つのへテロ環上に 2個存在する場合には、少なくともいずれか一方が電子供与性基を有するものが好まし、。

[0026] 電子供与性基の例としては、アルキル基、フ二ル基、 P-アルコキシフ二ル基、 P- ジアルキルアミノフヱ-ル基、 2-チェ-ル基、 2-フリル基、ジアルコキシフヱ-ル基（好ましくは 3,6-ジアルコキシフエ-ル基）等を挙げることができる。これらのうち、アルキル基又はアルキル部分を含む基のアルキル部分の炭素数は、特に限定されなヽ力 1〜10程度が好ましい。これらの電子供与性基のうち、特に炭素数 1〜10のアルキル基又はアルキル部分の炭素数が 1〜10のアルコキシフエ-ル基が好ましい。

[0027] 上記一般式 [I]中、 Qは炭素原子又は窒素原子を表す。 Qが窒素原子の場合には、 Qが炭素原子の場合に比べて蛍光が長波長化される。なお、 Qが炭素原子の場合、 R⁴に電子吸引性の置換基 (例えば-トロ基、シァノ基、トリフルォロメチル基等）を導入することにより Qが窒素原子の場合と同様、蛍光が長波長化される。

[0028] R³、R⁴及び R⁵は互いに独立に水素原子又は本発明の蛍光性ィ匕合物の蛍光を阻害しない任意の基を表す。ただし、 Qが窒素原子の場合には R⁴は存在しない。

[0029] 上記一般式 [I]中の R³ないし R⁵、ヘテロ環を形成しない場合の R¹と R²又は R⁶と R⁷や上記した好ましいヘテロ環中の R^1Qないし R¹⁷が表す、本発明の蛍光性化合物の蛍光を阻害しない任意の基としては、次のものを挙げることができる。なお、ここで、「蛍光を阻害しない」とは、蛍光の波長を短くしたり、モル吸光係数を低下させたり、蛍光量子係数を低下させたりすることが全く又はほとんどない (好ましくは、その置換基を有さない化合物の値の 95%以上を有する）ことを意味する。なお、蛍光を阻害しない任意の基が、後述する標的イオンや標的化合物の認識部位である場合には、標的との結合の有無により蛍光が変化するが、標的と結合した場合及び結合していない場合の少なくとも、ずれかにお!/、て、蛍光を阻害しな!、ことを意味する。

[0030] ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、アルコキシカルボ-ル基、ァシル基、ハロゲノアシル基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルキルチオ基、ァルキルカルボ-ルアミド基、アルキルアミドカルボ-ル基、モノアルキルシリル基、ジアルキルシリル基、トリアルキルシリル基、モノアルコキシシリル基、ジアルコキシシリル基、トリアルコキシシリル基、アルキルスルフォ-ル基、ハロゲノスルフォ-ル基、ァリール基及びへテロアリール基。

[0031] これらの置換基中、「アルキル基」は、炭素数 1〜20のものが好ましぐ直鎖状、分岐状及び環状 (すなわち、シクロアルキル基）のいずれであってもよい。この場合、アルキル基に含まれる水素原子はすべて置換されて!、な、か、ある、はそのうち 1つ以上力ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、ァリール基及びへテロアリール基力成る群より選ばれる少なくとも 1種で置換されていてもよい。また、上記置換基中のアルコキシ基、アルキルチオ基等の、アルキル基部分を含む基中のアルキル基についても同様である。なお、アルキル基上の上記した置換基は特に必要ではない。

[0032] また、上記各置換基中、「ァルケ-ル基」は、炭素数 2〜20のものが好ましぐ直鎖状、分岐状及び環状 (すなわち、シクロアルケ-ル基）のいずれであってもよい。この場合、ァルケ-ル基に含まれる水素原子はすべて置換されていないか、あるいはそのうち 1つ以上が、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チォール基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、ァリール基及びへテロアリール基力成る群より選ばれる少なくとも 1種で置換されていてもよい。もっとも、ァルケ-ル基上のこれらの置換基は特に必要ではない。

[0033] また、上記各置換基中、「アルキ-ル基」は、炭素数 2〜20のものが好ましぐ直鎖状、分岐状及び環状 (すなわち、シクロアルキ-ル基）のいずれであってもよい。この場合、アルキニル基に含まれる水素原子はすべて置換されていないか、あるいはそのうち 1つ以上が、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チォール基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、ァリール基及びへテロアリール基力成る群より選ばれる少なくとも 1種で置換されていてもよい。もっとも、アルキ-ル基上のこれらの置換基は特に必要ではない。

[0034] また、上記各置換基（上記したアルキル基、ァルケ-ル基、アルキニル基上に置換しているものも包含する）中、ァリール基としては、芳香環数 1〜4で構成される芳香環ないしは縮合多環が好ましぐ例えばフエニル基、 1-または 2_ナフチル基、 1-, 2-または 9-アントラニル基、 1-, 2-または 4-ピレニル基などが好ましい。この場合、芳香環に含まれる水素原子はすべて置換されて、な、か、あるいはそのうち 1つ以上がハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、ァリール基、ヘテロァリール基、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、アルコキシカルボ-ル基、ァシル基、ハロゲノアシル基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルキルチオ基、アルキルカルボ-ルアミド基、アルキルアミドカルボ-ル基、モノアルキルシリル基、ジアルキルシリル基、トリアルキルシリル基、モノアルコキシシリル基、ジアルコキシシリル基、トリアルコキシシリル基、アルキルスルフォ-ル基及びノヽロゲノスルフォニル基カゝら成る群より選ばれる少なくとも 1種で置換されていてもよい。もっとも、ァリール基上のこれらの置換基は特に必要ではない。

[0035] また、上記各置換基（上記したアルキル基、ァルケ-ル基、アルキニル基上に置換しているものも包含する）中、ヘテロァリール基としては、ヘテロ原子を 1〜3つ含む芳香環 (5員環または 6員環)あるいは、ヘテロ芳香環に芳香環力〜 2っ縮合されたものが好ましい。ここでいうへテロ原子は、酸素、窒素又はィォゥが好ましぐこれらの組み合わせは限定されない。たとえば 2-, 3-フリル基、 2-, 3-チェ-ル基、 Ν-, 2-, 3-ピ口リル基、 2-, 3-ベンゾフラ-ル基、 2-, 3-ベンゾチェ-ル基、 N- , 2-, 3-インドリル基、 N-, 1-, 2-イソインドリル基、 2-, 3-, 4-ピリジル基、 2-, 3-, 4-キノリル基、 1-, 3-, 4- イソキノリル基、 2-, 4-, 5-(1,3-ォキサゾリル)基、 2-ベンゾキサゾリル基、 2-, 4-, 5-(1, 3-チアゾリル)基、 2-ベンゾチアゾリル基、 N-, 2-, 4-イミダゾリル基、 N- , 2-ベンズイミダゾリル基、 1-, 2-ナフトフラ-ル基、 1-, 2-ナフトチェ-ル基、 Ν-, 2-, 3-ベンズインドリル基などである。この場合、ヘテロ芳香環に含まれる水素原子はすべて置換されていないか、あるいはそのうち 1つ以上がハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン酸基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、ァリール基、ヘテロァリール基、アルキル基、ァルケニル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、アルコキシカルボ-ル基、ァシル基、ハロゲノァシル基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルキルチオ基、アルキル力ルボニルアミド基、アルキルアミドカルボ-ル基、モノアルキルシリル基、ジアルキルシリル基、トリアルキルシリル基、モノアルコキシシリル基、ジアルコキシシリル基、トリアルコキシシリル基、アルキルスルフォ-ル基及びハロゲノスルフォ-ル基から成る群より選ばれる少なくとも 1種で置換されていてもよい。もっとも、ヘテロァリール基上のこれらの置換基は特に必要ではな!/、。

[0036] 上記一般式 [I]中、 R⁸及び R⁹は互いに独立にハロゲン原子、アルキル基、ァルケ- ル基、アルキニル基、アルコキシ基、ァリール基又はへテロアリール基を表す。ここで、アルキル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、アルコキシ基、ァリール基又はへテロアリール基については、上記した R³〜R⁵及び R^1Q〜R¹⁷により表されるこれらの基についての説明がそのまま当てはまる。 R⁸及び R⁹は互いに独立にハロゲン原子であることが好ましぐ特に両者ともフッ素原子であることが好ましい。

[0037] 本発明の蛍光性ィ匕合物はまた、上記した本発明の蛍光性ィ匕合物の蛍光を阻害しない任意の基として、以下 (1)〜(6)の機能性基を 1個又は複数有していてもよい。なお、上記した蛍光を阻害しな!、任意の置換基がァリール基又はへテロアリール基の場合に、該ァリール基又はへテロアリール基上に以下の 1個又は複数の機能性基を置換してちょい。

[0038] (1) 結合性基

本発明の蛍光性ィ匕合物は、少なくとも 1つ、結合性基を有することが好ましい。ここで、結合性基は、他の化合物に結合させるために利用できる基を意味する。蛍光標識剤は、タンパク質、ポリペプチド、糖等の生体関連物質に結合されることが多いため、結合性基としては、これらの生体関連物質との結合に好都合な、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフイド基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、スクシンィミジルエステル基、ペンタフルオロフェ-ルエステル基、マレイミド基等を好ましい例としてあげることができる。なお、これらの基は、他の化合物との結合のために用いることができればよ、ので、これらの基の少なくとも！/、ずれかを含む任意の基 (例えば、アミノアルキル基等)も結合性基として利用することができる。なお、結合性基は、 1つあれば足り、また、結合部位を 1つに特定するためにも 1つであることが通常好ましいが、 2個以上の結合性基を含んでいてもよい。また、後述する嵩高基の一部に上記したアミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基等を結合させて結合性基と嵩高基を兼用することも可能である。

[0039] (2) 嵩高基

合成の収率を上げるために、本発明の蛍光性化合物は、少なくとも 1つ、嵩高基を有していることが好ましい。本発明の化学発光性ィ匕合物は、ボロンジピロメテン骨格部分の平面性が高ぐまた、化学発光基も平面性が高い場合が多いので、化合物が全体として平面的になる場合が多い。このような場合、平面的な化合物が積層され、それぞれの芳香環の π結合間で生じて各分子同士が π— π結合され（ π— πスタツキング)て凝集が生じ、収率が低下することがある。このような事態を避け、合成収率が低下しないように、 π— πスタッキングを防止する嵩高な基を一般式 [I]中の一般式中の R〜R 、あるいはァリール基やへテロァリール基へ導入する置換基として、少な

1 17

くとも 1つ有していることが好ましい。ここで、嵩高基は、少なくとも直鎖状のアルキル基よりも厚さ方向（ボロンジピロメテン骨格を平面として、該平面に垂直な方向）に厚みのある基であり、好ましくは炭素数 10以上、さらには炭素数 10〜20の分枝アルキル基ゃ分枝アルコキシル基が好まし、。

[0040] (3) 脂溶性又は水溶性調整基

さらに、必要に応じ、少なくとも 1つ、溶解性 (脂溶性又は水溶性)を調整する基を含ませてもよい。蛍光標識剤は、水系で用いられることが多いので、蛍光性化合物の親水性を高めて水系中での溶解性を向上させることが望まれる場合には、少なくとも 1 つ親水性基を含ませてもよい。このような親水性基としては、水酸基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、スルホン酸基、エーテル結合等の親水性の基を 1個又は複数含むアルキル基やアルコキシル基 (炭素数は 1〜6が好まし、）等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。また、このような親水性の基は上記した嵩高基、結合性基と兼用させてもよい。また、脂溶性を増大させたい場合には、好ましくは炭素数 10以上、さらには炭素数 10〜20のアルキル基ゃァリール基、又はこれらの両者を含む基等を含ませてもよい。なお、下記実施例で合成した本発明の蛍光性ィ匕合物 2〜は、脂溶性を増大させる基として、下記の化学構造を有する基を R⁴として有している。

[0041] [化 5]

[0042] なお、この基にぉ、て、エーテル部分は、合成を容易にするために含まれて、る。

また、ベンゼン環上の 2つのメチル基は、この置換基の回転運動を阻害し、この置換基の回転運動に起因する蛍光量子収率の低下を防止するものである。

[0043] (4) 化学発光基

化学発光基は、化学反応により発光する構造を有する基である。本発明の蛍光性化合物に化学発光基を導入することにより、該化学発光基が発する光により蛍光色素部分が蛍光を発し、この蛍光が測定される。したがって、化学発光基は、必ずしも可視光を発光するものである必要はなぐ蛍光色素部分を励起して蛍光を発せさせることができる光を発するものであればいずれのものをも採用することができる。このような化学発光基としては、この分野にぉ、て標識剤として用いられて、るものであればいずれのものをも用いることができ、種々のものが公知ないしは周知である。好ましい例として、フタルカルバジド誘導体、ジォキセタン誘導体、口フィン誘導体、アタリジン誘導体、インドール誘導体、シユウ酸誘導体、ジフヱノィル誘導体又はルシフェリン誘導体を挙げることができ、これらはいずれもこの分野において周知である。これらの化学発光基は、それぞれ以下の一般式で示されるものである。

[0044] [化 6]

フタルヒドラジド誘体

[0045] [化 7]

ジォキセタン誘導体

[0046] [化 8]

ロフィン ¾体

[0047] [化 9]

ァクリジン誘導体 [0048] [化 10]

〇〇

R_〇 ^{11 11} 〇_R

ジォキセタン誘導体

[0049] [化 11]

ジフ Iノィル誘導体

(X = -0-, —0—0—)

[0050] [化 12]

ルシフ Iリン誘導体

[0051] (5) ポリマーへの重合部位 (末端に不飽和二重結合を有する分子）

本発明の蛍光性ィ匕合物は、少なくとも 1つ、重合部位を有することが好ましい。ここで、重合部位は、有機高分子に共重合させる部位を示す。一般に、有機高分子に色素を導入することで、蛍光強度やモル吸光係数が増加し、検出感度が上がることが知られている。また、共重合させることで色素が溶媒にリークしない（流出しない）ので、有機高分子膜による連続測定などにも適している。重合部位としては、ビニル基を有するものであればかまわない。具体的には、ビュルアルキル基、ビュルアルコキシ基、ビュルアルコキシカルボ-ル基、ビュルァリール基、ビュルへテロアリール基などであるが、これらに限定されない。

[0052] (6) 標的イオンや標的化合物の認識部位 (クラウンエーテルなどのように特定のィォンゃ物質を選択的に捕捉する基）

ベンゾクラウン、ァザクラウン、 N-ァリールァザクラウンなどのイオンや分子を認識する基や、 P-ジメチルァミノフエ-ル基などの周囲の溶媒極性 (pHや溶媒極性）に応答する基を導入することで、特定の物質や環境を認識し、光学情報へ変換する蛍光プローブとしての機能をもたせることもできる。この際、標的 (ターゲット)の認識前後で認識部位の電子供与性が変化するため、色素の光学特性も変化する。最も好ましいのは上記した R⁴、 R^1Q、 R¹²、 R¹⁵又は R¹⁶に認識部位を導入することであるが、これに限定されない。なお、ここで、認識部位とは、標的のイオンや標的化合物を捕捉する部位のことを示す。一般に、蛍光化合物に認識部位を持たせ、特定の物質を測定する際には、認識前後で光学応答が変化することが望ましい。例えば、認識前後で蛍光量子収率が変化したり、吸収あるいは蛍光極大波長が変化したりすることで、特定の物質の測定が可能となる。

[0053] 本発明の蛍光性ィ匕合物は、例えば次のようにして製造することができる。すなわち、任意の位置にホルミル基を有するヘテロァリール環にアジド酢酸ェチルを加えてアジド化合物を合成後、トルエン中で加熱還流し、ヘテロァリール環にピロールを縮環する。ピロールの α位のカルボン酸ェチルエステルを脱保護後、強塩基存在下で加熱して α位のカルボン酸を脱炭酸する。このピロール環をホルミル基を有する芳香環と縮合し、ジピロメテンィ匕合物を合成する。ジピロメテンィ匕合物を合成する方法はこれに限らず、例えばピロール環同士をオルトギ酸トリアルキルおよび酸触媒存在下で反応させることや、ホルミル基を有するヘテロピロール環と酸存在下で反応させることでも得られる。また、ヘテロピロール環を亜硝酸ナトリウムにて-トロソィ匕することで、架橋部分に窒素原子を有するジピロァザメテン化合物を合成することができる。得られたジピロメテンィ匕合物およびジピロァゾメテン化合物を、トリェチルァミンおよび三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体存在下で反応させれば、目的とする化合物が得られる。また、ヘテロァリール環にハロゲン原子ないしはボロン酸を有するものであれば、鈴木カップリングにより任意のァリール環やへテロァリール環を直結することが可能であり、さまざまな波長の色素を提供することが可能となる。

[0054] すなわち、例えば、上記のようにして先に R¹と R²、及び/又は R⁶と R⁷で形成されるへテロ環とピロール環との縮合環を合成し、 2個の縮合環をジクロロメタンにより、 1個の炭素原子を介して結合させ、 BF等を反応させて BR⁸R⁹部分を結合させることにより本

3

発明の蛍光性ィ匕合物を合成することができる。置換基を有する場合には、さらに置換基を結合させることができる。ただし、 R⁴として置換基を有する場合には、上記したジクロロメタンと同時に該置換基含有ィ匕合物を反応させることにより、前記縮合環がジクロロメタンで結合されるのと同時に該ジクロロメタンの炭素原子に該置換基を結合させることができる。複数の本発明の蛍光性化合物の詳細な合成方法が下記実施例に記載されているので、当業者であればそれらを参照して本発明の蛍光性ィ匕合物を容易に製造することができる。

[0055] 本発明の蛍光性化合物は、蛍光標識剤として用いることができる。蛍光標識剤自体は周知であり、本発明の蛍光性ィ匕合物も従来の蛍光標識剤と同様にして用いることができる。すなわち、本発明の蛍光性化合物を、標識すべき被標識物質に結合させることにより被標識物質を標識する。本発明の蛍光性ィ匕合物が上記した結合性基を有する場合には、常法により上記結合性基を介して本発明の蛍光性化合物を被標識物質に結合する。結合性基を有さない場合には、常法により結合性基を導入した中間体を調製し、これを被標識物質と結合することができる。

[0056] 蛍光標識剤の使用の態様は従来と全く同様であり、上記のように被標識物質を標識した後、標識した物質 (本明細書において「標識物質」という）を反応に供し、必要に応じて洗浄工程等を行なった後、標識に励起光を当て、蛍光を発光させ、該蛍光を測定する。ここで、反応とは、例えば免疫測定の場合には抗原抗体反応、核酸の検出の場合には、核酸同士のハイブリダィゼーシヨン等を意味するがこれらに限定されるものではない。例えば、蛍光標識剤が広く用いられている免疫測定の場合、次のようにして標識剤を利用することができる。例えば、サンドイッチ法により被検試料中の標的抗原を免疫測定する場合、標的抗原に対する一次抗体を固相に結合し、これを被検試料と反応させて、被検試料中の標的抗原を固相化一次抗体に結合させる。洗浄後、蛍光標識剤で標識した第二抗体を反応させる。洗浄後、標的抗原に結合した第二抗体の蛍光標識剤を、常法に従い励起光により蛍光発光させ、蛍光を測定する。最適な励起光の波長は、各蛍光性化合物について吸収極大波長を測定することにより容易に設定することができる、通常、 570ηπ！〜 680nm程度、好ましくは 66 Οηπ！〜 680nm程度である。なお、本明細書及び特許請求の範囲において「測定」には検出、定量、半定量のいずれもが包含される。 [0057] また、蛍光標識剤は、上記したサンドイッチ法のみならず、免疫糸且織化学等の他の免疫測定法においても広く用いられている。さらに、核酸を蛍光標識剤で標識し、特定の塩基配列を有する核酸を検出することも広く行なわれており、これらの用途にも本発明の蛍光標識剤を従来の蛍光標識剤と同様に用いることができる。

[0058] さらに、本発明の蛍光性化合物は、標識剤以外にも、赤色の蛍光色素として、赤色の表示材料や色素レーザー、光学記録材料などの種々の分野にお!、て用いることができる。

[0059] 本発明の蛍光性化合物は、蛍光波長のピークが 580ηπ！〜 700nm程度の橙〜近赤外の長波長領域にある。これを標識剤として用いた場合、生体組織や血液、脂質や水といった生体物質の存在下でもこれらの光学的妨害を受けることなく測定できる。さらに低エネルギーかつ高ヽ光浸透性とヽつた利点から、生体深部組織のイメージングへの応用が可能である。例えば、動物内の特定の臓器や腫瘍細胞に特異的に集積するようなポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ペプチド鎖、糖鎖などに標識し、動物内に注入することで、特定の臓器や腫瘍細胞に標識剤が集積する。したがって、動物を CCDカメラなどで撮像することにより、特定の臓器や腫瘍細胞を可視化することが可能となる。もっとも、生体イメージングの例はこれに限定されるものではない。また、赤色の表示材料や色素レーザー、光学記録材料、光線力学療法 (PDT)などに用いることもできる。さらに、本発明の蛍光性ィ匕合物は、蛍光量子収率及びモル吸光係数が高いので、これを標識剤として用いることにより、高感度の測定が可能になる。

[0060] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1

[0061] 本発明の蛍光性化合物丄の合成

下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性ィ匕合物 1を合成した。なお、反応スキーム中（後述の反応スキームにおいても同じ）、「r上」は室温を意味する。

[0062] [化 13] 、COOEt

0。C， 3 h rsflux

蛍光性化合物 _

[0063] [化 14]

COOEt

0°C, 3 h ₂

[0064] Ar気流下、 0°Cにて 5-メチル -2-チォフェンカルバルデヒド 1 (3.67 g, 29.1 mmol, 1.0 eq.)とアジド酢酸ェチル（7.51 g, 58.2 mmol, 2.0 eq.)のエタノール溶液（100 mL) に、ナトリウムエトキシド 20%エタノール溶液 (19.9 g, 58.3 mmol, 2.0 eq.)をエタノール (50 mL)で希釈した溶液をゆっくり滴下した。 3時間撹拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液を加え pHを中性にし、析出した黄色い沈殿をろ別し、沈殿を水で洗浄後、真空乾燥した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)により分離精製し、薄黄色液体 2 (3.61 g)を得た。

TLC (シリカ)： R = 0.8 (シリカゲル，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)

f

[0065] [化 15]

2 reflux

3 [0066] 2のトルエン溶液 (60 ml)を 30分還流撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)により分離精製し、薄肌色固体 3 (1.82 g, 25.0%)を得た。

TLC (シリカ)： Rf = 0.3 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)

[0067] [化 16]

[0068] 3 (1.82 g, 8.70 mmol, 1 eq.)のエタノール溶液 (100 ml)に水酸化ナトリウム (5.35 g , 134 mmol, 15.4 eq.)の水溶液（50 ml)を加え、 30分還流撹拌した。放冷後、 6N塩酸水溶液を加えた。発生した沈殿をろ過後、ろ物を水で洗浄、真空乾燥し、白色固体 4 (1.41 g, 89.5%)を得た。

TLC (シリカ)： Rf = 0.2 (へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1)

[0069] [化 17]

140°C "

[0070] 4 (571 mg, 3.15 mmol, 1 eq.)のエチレングリコール溶液 (20 ml)に水酸化ナトリウム（1.34 g, 33.5 mmol, 10.6 eq.)を加え、 Ar気流下、 140°Cで 4時間撹拌した。放冷後、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた茶色オイル状の粗生成物をカラムクロマトグラフィー

(シリカ，へキサン:酢酸ェチル =4： 1)により分離精製し、茶色液体 5 (303 mg, 70.1

%)を得た。

[0071] [化 18]

[0072] 5 (56.8 mg, 0.414 mmol, 2 eq.)の塩化メチレン溶液 (5 ml)にオルトギ酸トリェチル (1.00 mL, 6.21 mmol, 30 eq.)を加え、 Ar気流下、室温にて撹拌した。トリフルォロ酢酸 1滴を加え、さらに室温にて 90分攪拌した。多量の水を加えて反応を終了させ、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 1回、水で 1回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アルミナ，クロ口ホルム:酢酸ェチル =3： 1)により分離精製し、紫色固体 6 (57.5 mg)を得た。

[0073] [化 19]

蛍光性化合物丄

[0074] 6 (57.5 mg, 0.201 mmol, 1 eq.)をトルエン（10 ml)に溶解し、トリェチルァミン（0.3 m 1, 2.08 mmol, 10 eq.),三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体（0.40 mL, 3.11 mmol, 15 eq.)を加え、 1時間加熱還流した。放冷後、不溶物をシリカゲルクロマトグラフィーにて分離し、溶出液を減圧濃縮した。得られた組成生物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，トルエン）により分離精製し、光沢のある緑色固体の形態にある蛍光性化合物 1 (5.8 mg, 8.46%, 2工程）を得た。

[0075] TLC (silica) R = 0.6 (toluene)

f

^JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) σ 2.59 (s, 6H), 6.89 (s, 2H), 6.95 (s, 2H), 7.24 (s, 1H)

3

実施例 2

[0076] 蛍光性化合物の合成

下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性ィ匕合物を合成した。なお、反応スキーム中（後述の反応スキームにおいても同じ）、「DDQ」は 2,3-ジシァノ- 5,6-ジクロロ- p-ベンゾキノン (酸化剤の一種)を意味する。

[0077] [化 20]

[0079] Ar気流下、 0°Cにて 5-メチル -2-フルアルデヒド 7 (1.80 g, 16.3 mmol, 1 eq)とアジド酢酸ェチル (2.80 g, 32.7 mmol, 2 eq)のエタノール溶液（90 ml)に、ナトリウムェトキシド 20%エタノール溶液 (11.1 ml, 32.7 mmol, 2 eq)をエタノール (30 ml)で希釈した溶液をゆっくり滴下した。 2時間撹拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液を加え pHを中性にし、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)により分離精製し、薄黄色液体 8 (1.26 g, 34.8 %)を得た。

TLC (シリカ)： R = 0.42 (シリカゲル，へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)

f

[0080] [化 22]

8 9

[0081] 8 (1.257 g, 5.68 mmol)のトルエン溶液 (30 ml)を 1時間還流撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1 )により分離精製し、薄肌色固体 9 (979 mg, 89.3 %)を得た。

TLC (シリカ)： Rf = 0.13 (へキサン：酢酸ェチル = 9 : 1)

[0082] [化 23]

9 10

[0083] 9 (287 mg, 1.49 mmol, 1 eq)のエタノール溶液（10 ml)に水酸化ナトリウム（868 mg , 21.7 mmol, 15 eq)の水溶液 (5 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。放冷後、 6N塩酸水溶液を加えた。発生した沈殿をろ過後、ろ物を水で洗浄、真空乾燥し、灰色固体 1 0 (205 mg, 83.7%)を得た。

TLC (シリカ)： Rf = 0.14 (へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1)

'H-NMRCCDCI ): δ = 2.37 (s, 3H), 6.14 (s, 1H), 6.63 (s, 1H)

[0084] [化 24]

[0085] 10 (200 mg, 1.21 mmol, 1 eq)のエチレングリコール溶液（5 ml)に水酸化ナトリウム

(484 mg, 12.1 mmol, 10 eq)を加え、 Ar気流下、 140°Cで 3時間撹拌した。放冷後、酢酸ェチルを加え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた茶色オイル状の粗生成物をカラムクロマトグラフィー (シリカ， 9:1 hexane/ethylacetate)により分離精製し、茶色液体 11 (68.0 mg, 45.5 %) を得た。 TLC (シリカ)： R = 0.62 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)

f

1H-NMR(CDC1 ): δ = 2.39 (s, 3H), 6.07 (s, 1H), 6.12 (d, 1H, J = 2.9 Hz), 6.67 (t

3

1H, J = 2.9 Hz), 7.65 (bs, 1H)

[0086] [化 25]

[0087] 11 (60 mg, 0.5 mmol, 2 eq)の塩化メチレン溶液 (25 ml)に 4- (1-ブチルペンチロキシ)- 2,6-ジメチルベンズアルデヒド（69 mg, 0.25 mmol, 1 eq)を加え、減圧脱気し、完全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 3滴をカ卩え、室温で 24時間撹拌後、 P-クロラニル (6 2 mg, 0.25 mmol, 1 eq)を加えた。室温で 1時間撹拌後、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（アルミナ、クロ口ホルム)で不溶物を分離し、ろ液を濃縮して紫色固体 12を得た。 12は精製せずそのまま次の反応に用いた。

[0088] [化 26]

蛍光性化合物

[0089] 12をトルエン（10 ml)、トリェチルァミン（0.2 ml)、三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体 (0.3 ml)を加えた。室温で 1時間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、トルエンで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)により分離精製し、蛍光性化合物 2 (22.0 mg, 18.2 %、 11からの総収率）を得た。

TLC (シリカ)： R = 0.50 (4:1 hexane/ethylacetate)

f

'H-NMRCCDCl ): δ = 0.85-0.96 (m, 6Η), 1.22-1.29 (m, 8H), 1.42—1.68 (m, 4H), 2

3

.15 (s, 6H), 2.44 (s, 6H), 4.25 (m, 1H), 5.97 (s, 2H), 6.34 (s, 2H), 6.63 (s, 2H) 実施例 3

[0090] 蛍光性化合物 2の合成

下記の反応スキームに従ヽ、本発明の蛍光性化合物 2を合成した。

[0091] [化 27]

¾光性化合物

[0092] [化 28]

[0093] 5は実施例 2と同様にして合成した。 5 (150 mg, 1.09 mmol, 2 eq.)の塩化メチレン溶液（50 ml)に 4- (1-ブチルペンチ口キシ) -2, 6-ジメチルベンズアルデヒド（151 mg, 0 .547 mmol, 1 eq.)を加え、減圧脱気し、完全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 1滴をカロえ、室温で 24時間撹拌後、 2,3-ジクロロ- 5,6-ジシァノベンゾキノン（151 mg, 0.547 m mol, 1 eq.)を加えた。室温で 30分撹拌後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 4回、飽和食塩水で 1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アルミナ， 9： 1へキサン：酢酸ェチル）により分離精製し、赤色固体 13 (82.0 mg, 28.3%)を得た。

TLC (silica) R = 0.8 m— hexane： ethyl acetate = 90： 10)

f

[0094] [化 29]

蛍光性化合物

13 (82.0 mg)をトルエン（10 ml)溶液に溶かし、トリエチルァミン (0.2 ml)、三フッ化ホウ素エーテル錯体 (0.3 ml)を加えた。室温で 1時間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、トルエンで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリ力，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)により分離精製し、 Compound 3 (22.0 mg, 18.2 % )を得た。

[0096] 1H-NMR (300 MHz, CDCl ) σ 0.94 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 1.35—1.45 (m, 8H), 1.65—1.

3

72 (m, 4H), 2.15 (s, 6H), 2.58 (s, 6H), 4.25 (quant, 1H, J = 5.9 Hz), 6.57 (s, 2H), 6. 64 (s, 2H), 6.93 (s, 2H)

実施例 4

[0097] 蛍光性化合物 4の合成

下記の反応スキームに従ヽ、本発明の蛍光性化合物 4を合成した。

[0098] [化 30]

s光性化合物 A

[0099] [化 31]

[0100] Ar気流下、 0°Cにてチォフェン- 3-カルバルデヒド 14 (550 mg, 4.90 mmol, 1.0 eq.) とアジド酢酸ェチル（1.40 g, 10.8 mmol, 2.2 eq.)のエタノール溶液（30 ml)に、ナトリゥムエトキシド 20%エタノール溶液 (3.33 g, 9.81 mmol, 2.0 eq.)をエタノール (20 ml) で希釈した溶液をゆっくり滴下した。 6時間撹拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液をカロえ pHを中性にし、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、薄黄色液体 15を得た。 15は精製せず、次の反応に用いた。

f

[0101] [化 32]

15 16

[0102] 15のトルエン溶液 (20 ml)を 30時間還流撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン:酢酸ェチル = 3 : 1)により分離精製し、薄肌色固体 16 (295 mg, 30.8%)を得た。

TLC (シリカ)： Rf = 0.5 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)

[0103] [化 33]

16 17

[0104] 16 (226 mg, 1.16 mmol, 1 eq.)のエタノール溶液（10 ml)に水酸化ナトリウム（740 mg, 18.5 mmol, 15.9 eq.)の水溶液（5 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。放冷後、 6N 塩酸水溶液を加えた。反応系に酢酸ェチルを加え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1 回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、灰色固体 17 (190 mg, 97.7% )を得た。

TLC (シリカ)： Rf = 0.4 (へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1)

[0105] [化 34]

17 [0106] 17 (190 mg, 1.14 mmol, 1 eq.)のエチレングリコール溶液（5 ml)に水酸化ナトリウム（340 mg, 8.49 mmol, 7.4 eq.)を加え、 Ar気流下、 140°Cで 2時間撹拌した。放冷後、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた茶色オイル状の粗生成物をカラムクロマトグラフィー (シリカ， 9:1 hexane/ethylacetate)により分離精製し、茶色液体 18 (99.3 mg, 70.9 %) を得た。

TLC (シリカ)： Rf = 0.62 (へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)

[0107] [化 35]

19

[0108] 18 (93.0 mg, 0.755 mmol, 2 eq.)の塩化メチレン溶液 (50 ml)に 4- (1-ブチルペンチ口キシ) -2, 6-ジメチルベンズアルデヒド（102 mg, 0.377 mmol, 1 eq.) を加え、減圧脱気し、完全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 1滴を加え、室温で 24時間撹拌後、 P-クロラ-ル（120 mg, 0.488 mmol, 1.3 eq.)を加えた。室温で 30分撹拌後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 4回、飽和食塩水で 1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（アルミナ，クロ口ホルム）により分離精製し、赤色固体 19 (68.4 mg, 36.0%)を得た。

[0109] [化 36]

蛍光性化合物 Λ

[0110] 19 (38.4 mg, 0.0764 mmol, 1 eq.)をトルエン（5 ml)溶液に溶かし、トリェチルァミン

(0.20 mL, 1.38 mmol, 18 eq.),三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体（0.30 mL, 2.3 0 mmol, 30 eq.)を加えた。室温で 1時間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をカロえて洗浄し、トルエンで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，へキサン：酢酸ェチル = 4 : 1)およびゲル浸透クロマトグラフィー（クロ口ホルム）により分離精製し、蛍光性ィ匕合物 4(7.4 mg, 17.7 %)を得た。

[0111] Tし C (silica) R = 0.6 (toluene)

f

^JH-NMR (300 MHz, CDC1 ) σ 0.94 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 1.34—1.44 (m, 8H), 1.65—1.

3

72 (m, 4H), 2.16 (s, 6H), 2.58 (s, 6H), 4.27 (quant, 1H, J = 5.9 Hz), 6.65 (s, 2H), 6. 66 (s, 2H), 6.77 (d, 2H, J = 5.3 Hz), 6.97 (d, 2H, J = 5.3 Hz)

実施例 5

[0112] 蛍光性化合物の合成

下記の反応スキームに従ヽ、本発明の蛍光性化合物を合成した。

[0113] [化 37]

21

2-フランボロン酸 20 (6.00 g, 53.5 mmol, 1 eq)の 5:1トルエン/メタノール溶液（320 ml)に p-ブロモア-ソール（10.0 g, 53.5 mmol, 1 eq)および 2M炭酸ナトリウム水溶液（53 ml)を加え、減圧脱気し、完全に Ar置換した。テトラキス (トリフエ-ルホスフィン )パラジウム (0) (619 mg, 0.535 mmol, 0.01 eq)を加え、 80°Cで 3時間撹拌した。放冷後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をカ卩えて洗浄し、酢酸ェチルで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ， 2:1へキサン:塩化メチレン）により分離精製し、橙色固体 21 (4.42 g, 78.2 %)を得た。

[0116] TLC (シリカ)： R = 0.66 (4:1 hexane/ethvlacetate)

f

'H-NMRCCDCl ): δ = 3.84 (s, 3Η), 6.45 (t, IH, J = 1.6 Hz ), 6.51 (d, IH, J = 3.4

3

Hz), 6.92 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.43 (d, IH, J = 1.2 Hz), 7.60 (d, IH, J = 8.8 Hz)

[0117] [化 39]

21 9?

[0118] 21 (700 mg, 4.0 mmol, 1 eq)の 1,2-ジクロロェタン溶液（20 ml)に塩化ホスホリス（0 .72 ml, 8.0 mmol, 2 eq)を加え、室温で 5分間撹拌した。 Ν,Ν-ジメチルホルムアミド（0 .62 ml, 8.0 mmol, 2 eq)を加え、 80°Cで 30分間撹拌した。放冷後、 0°Cで 5N水酸化ナトリウム水溶液を滴下した。水を加え、塩化メチレンで 5回抽出し、飽和食塩水で 1 回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムク口マトグラフィー（シリカ， 4:1 hexane/ethylacetate)により分離精製し、橙色液体 22 (6 67.3 mg, 82.9 %)を得た。

[0119] TLC (シリカ)： R = 0.40 (4:1 hexane/ethylacetate) NMR(CDC1 ): δ = 3.87 (s, 3Η f 3

), 6.72 (d, IH, J = 3.9 Hz), 6.97 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.31 (d, IH, J = 3.7 Hz), 7.77 ( d, 2H, J = 9.0 Hz), 9.60 (s, IH)

[0120] [化 40]

[0121] Ar気流下、 0°Cで、 22 (202 mg, 1.0 mmol, 1 eq)とアジド酢酸ェチル (516 mg, 4.0 mmol, 4 eq)のエタノール溶液（10 ml)に、ナトリウムエトキシド 20%エタノール溶液（1. 4 ml, 4 mmol, 4 eq)をエタノール (2 ml)で希釈した溶液をゆっくり滴下した。 2時間撹拌後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液をカ卩ぇ pHを中性にし、酢酸ェチルを加え、水で 2 回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ， 9: 1 hexane/ethylacetate)により分離精製し、橙色固体 23 (273 mg, 87.5 %)を得た。

[0122] Tし C (シリカ): R = 0.39 (9:1 hexane/ethylacetate) NMR(CDC1 ): δ = 1.39 (t, 3Η

f 3

, J = 7.1 Hz), 3.87 (s, 3H), 4.35 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.67 (d, IH, J = 3.7 Hz), 6.92 ( s, IH), 6.93 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.18 (d, IH, J = 3.4 Hz), 7.65 (d, 2H, J = 8.3 Hz) [0123] [化 41]

[0124] 23 (273 mg, 0.875 mmol)のトルエン溶液（5 ml)を 5時間還流撹拌した。減圧濃縮後、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ， chloroform)により分離精製し、茶色固体 24 (117 mg, 46.9 %)を得た。

[0125] Tし C (シリカ): R = 0.35 (4:1 hexane/ethylacetate) NMR(CDC1 ): δ = 1.38 (t, 3Η

f 3

, J = 7.2 Hz), 3.84 (s, 3H), 4.35 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.57 (s, IH), 6.80 (s, IH), 6.94 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.66 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 8.78 (bs, IH)

[0126] [化 42]

[0127] 24 (71.0 mg, 0.25 mmol, 1 eq)のエタノール溶液（10 ml)に水酸化ナトリウム（150 mg, 3.75 mmol, 15 eq)の水溶液 (5 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。放冷後、 6N塩酸水溶液をカ卩えた。酢酸ェチルをカ卩ぇ水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥し、緑色固体 25 (60.0 mg, 93.0%)を得た。

TLC (シリカ)： R = 0.38 (ethvlacetate)

f

[0128] [化 43]

[0129] 25 (140 mg, 0.55 mmol, 1 eq)のエチレングリコール溶液（4 ml)に水酸化ナトリウム

(200 mg, 5 mmol, 9 eq)を加え、 Ar気流下、 160°Cで 2時間撹拌した。放冷後、酢酸ェチルをカ卩え、水で 2回洗浄、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、茶色液体 26 (138 mg)を得た。 26は精製せずにそのまま次の反応に用いた。

TLC (シリカ)： R = 0.23 (4:1 hexane/ethylacetate)

f

[0130] [化 44]

[0131] 26 (67.0 mg, 0.31 mmol, 2 eq)の 1,2-ジクロロェタン溶液（30 ml)に 4- (1-ブチルぺンチロキシ) -2,6-ジメチルベンズアルデヒド (42 mg, 0.15 mmol, 1 eq)を加え、減圧脱気し、完全に Ar置換した。トリフルォロ酢酸 1滴を加え、 2時間加熱還流した。放冷後、溶媒を減圧濃縮し、青緑色の固体 27を得た。 27は分離精製せず、次の反応に用いた。

[0132] [化 45]

[0133] 27をトルエン（5 ml)溶液に溶かし、トリエチルァミン (0.20 mL)、三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体 (0.30 mL)を加えた。室温で 30分間撹拌後、飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液を加えて洗浄し、クロ口ホルムで 3回抽出、飽和食塩水で 1回洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー (シリカ， chloroform)により分離精製し、蛍光性化合物 (0.9 mg, 0.5 %, 2工程）を得た。

[0134] TLC (シリカ)： R = 0.23 (1:1 toluene/chloroform) NMR(CDC1 ): δ = 0.85—0.97 ( f 3

m, 6H), 1.25-1.42 (m, 8H), 1.57—1.68 (m, 4H), 2.19 (s, 6H), 3.87 (s, 6H), 4.28 (m, 1H), 6.04 (s, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.85 (s, 2H), 6.97 (d, 4H, J = 9.0 Hz), 7.75 (d, 4H, J = 9.0 Hz)

実施例 6

[0135] 光学特性

実施例 2、 3及び 5で合成した本発明の蛍光性ィ匕合物 2、及びの吸収スペクトル及び蛍光発光スペクトルを測定した。吸収スペクトルは、市販の分光光度計 (U-2001 、日立製作所)を用い、測定波長 300〜750nm、測定波長間隔 lnmで測定した。蛍光発光スペクトルは、市販の蛍光光度計 (F-4500、日立製作所)を用い、最大吸収波長の励起光を用いて以下の条件で測定した。

[0136] ·測定波長：蛍光性化合物及び ; 550-700 nm

蛍光性化合物； 600-750 nm

ペリレン； 520-700 nm

•測定波長間隔: 0.2 nm

'スキャンスピード： 60 nm/min

'レスポンス： AUTO

•スリット幅：励起側 2.5 nm

受光側 2.5 nm

•フォトマルチプライヤー： 700 V

[0137] 測定されたスペクトルから、モル吸光係数 ε (M^cm"¹),蛍光量子収率 Φ、半値幅 1 hm(full width at half maximum heightXnm)を算出しに。結果を下己表 1にす。 [0138] [表 1]

[0139] 蛍光量子収率 Φは、 Ν,Ν'-ビス（1-へキシルヘプチル) -3,4:9,10-ペリレンビス（ジカルボキシイミド）（Φ= 1.00、 CH C1中)をレファレンスとし、 A = A = 0.1、 Φ = 1.00、

2 2 ref ref n = 1.46 (CH CI )、 n = 1.484 (CHCl )、 1.407 (THF)ゝ 1.3284 (MeOH)を代入し、 Fに ref 2 2 3

は A = 0.1の波長で励起し検出された蛍光強度面積の積算値を代入して求めた。なお、蛍光量子収率 Φは、次の式で算出される。

Φ = Φ X (A X FX n²)/(A X F X n ²)

ref ref ref ref

(ただし、 Aは吸光度、 Fは蛍光スペクトルの波数積分値、 nは溶媒の屈折率を示し、 re fは参照色素（リファレンス）を示す)。

[0140] 蛍光性化合物 2、 _2の光学特性について

蛍光性化合物 2、 2の極大吸収波長は 581 nm, 586 nmとであり、ボロンジピロメテン (R = R = R = R = Me)に比べ約 80 nmほど長波長シフトした。分子設計どおり、縮

1 3 5 7

合環の導入による _π共役系の拡張によりボロンジピロメテンの蛍光が長波長化した。蛍光性化合物、は蛍光極大波長 588 nmと 596 nmに強く鋭い蛍光を発し、シヤープなスペクトル形状をしている。表 1の数値を見ると、半値幅 I hmは約 20 nmと小さく、スペクトルがきわめてシャープであることがわかる。これらの結果から，蛍光性化合物 2, 3はボロンジピロメテン骨格と同等の骨格の堅さを有したまま、長波長シフトしていることがわ力る。蛍光性化合物 2は高極性の MeOH中においても、低極性の THF中にぉ、ても高、蛍光量子収率を示した。これは蛍光性ィ匕合物 2がボロンジピロメテン本来のきわめて低、環境応答性を有して、ることを表す。さらに極性の高、水系溶媒においても同様の蛍光を発すると考えられ、バイオ計測への応用のために必要不可欠な特性を有して、ると、える。

[0141] 蛍光性ィ匕合物の光学特性について

蛍光性化合物の極大吸収波長は 673 nmとボロンジピロメテン (R^R^R^R^Me)に比べ約 170 nmほど、蛍光性化合物に比べて約 90 nmほど長波長シフトした。分子設計どおり、縮合環の導入と電子供与性置換基の導入によりボロンジピロメテン骨格に比べて長波長化し、近赤外領域に極大吸収波長を持たせることに成功した。また、蛍光性化合物は蛍光極大波長 685 nmに強く鋭い蛍光を発し、シャープなスぺタトル形状をしている。表 1の数値を見ると、半値幅 I hmは約 30 nmと小さく、スペクトルがきわめてシャープであることがわかる。これらの結果から、蛍光性ィ匕合物は P-メトキシフエ二ル基を導入したにもかかわらず、蛍光性ィ匕合物 2と同等の骨格の堅さを有していることがわ力る。蛍光性化合物は高極性の MeOH中においても、低極性の TH F中にぉ、ても高、蛍光量子収率を示した。これは蛍光性ィ匕合物がボロンジピロメテン本来のきわめて低、環境応答性を有して、ることを表す。さらに極性の高、水系溶媒にお!、ても同様の蛍光を発すると考えられ、近赤外光を用いたバイオ計測への応用のために必要不可欠な特性を有して、ると、える。

[0142] 以上のことより、蛍光性化合物ま近赤外領域に極大吸収を持ち、その波長域にお V、ても強く鋭、蛍光を発することがわ力つた。蛍光性ィ匕合物≤の光学特性は既存の近赤外蛍光色素の中でも最も優れたものの中の一つであると、える。

[0143] 比較例 1

広く用いられている市販の蛍光色素である Cy5 (商品名、 1-[3-(4-モノメトキシトリチ口キシ)プロピル] -1'-[3-[(2-シァノエチル) - (Ν,Ν-ジイソプロピル)フォスフォロアミジチル]プロピル] -3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシァニンク口リド)について、実施例 6と同様に光学特性を調べた。結果を下記表 2に示す。なお、表 2には、対比のため、実施例 5で合成した本発明の蛍光性化合物の光学特性も併せて示す。

[0144] [表 2] 蛍光性化 'し abs flu ΐ 半値幅合物溶媒 [nm] [nm] [M— — Φ [nm]

Me OH 664 679 200 , 000 0. 6 3 29

Cy5 Me OH 648 670 2 50, 000 0. 2 7^a 29 a:Amersham Biosciences社から得た PBS中の値

[0145] 表 2に示すように、同程度の吸収'蛍光極大波長を持つ市販の近赤外蛍光色素 Cy 5 (商品名）と比べると、本発明の蛍光性ィ匕合物はモル吸光係数ではほぼ同等の値を示し、蛍光量子収率でははるかに高い値を示した。したがって、蛍光性化合物≤は既存の近赤外蛍光色素に代わってより高感度なバイオ計測のために汎用的に利用される可能性を持つことが示された。

[0146] 比較例 2〜4

特許文献 1に記載されてヽる化合物（比較化合物 1)、特許文献 2に記載されてヽる化合物 (比較ィ匕合物 2)、及び上記一般式 [I]において、 R¹と R²、 R⁶と R⁷がそれぞれ芳香環を形成するが、芳香環中にヘテロ原子を含まない化合物 (比較ィ匕合物 3)を合成し、実施例 6と同様にして光学特性を測定した。比較化合物 1〜3の構造を以下に示す

[0147] [化 46]

比較化合物 1

[0148] [化 47]

比較化合物 2

[0149] [化 48]

比較化合物 3

[0150] 結果を下記表 3に示す。なお、表 3には、対比のため、実施例 5で合成した本発明の蛍光性化合物の光学特性も併せて示す。

[0151] [表 3]

a:フルォレツセイン (Φ =0.92, 0.1M NaOH中）をレファレンスとして用いた。

b:ナイルブルー（Φ =0.25, MeOH中）をレファレンスとして用いた。

c:測定せず

[0152] 表 3に示されるように、本発明の蛍光性化合物は、比較例 2〜4の化合物と比較してモル吸光係数が顕著に高ぐまた、蛍光量子収率も高かった。

実施例 7 [0153] 本発明の蛍光性ィ匕合物旦の合成

下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性ィ匕合物を合成した

[0154] [化 49]

48.6 %

CH(OEt)₃

3.5 % (3 step)) 蛍光性化合物

[0155] ル)-フラン- 2-カルボアルデヒド (2)の合成

[0156]

80°C， 14h

(1 ) (²)

[0157] Ar気流下， 500mL三口フラスコに 4-メトキシフエ-ルボロン酸（1) (2.99 g , 19.7 mmo 1 , 1.0 eq)を入れ，トルエン (120 ml)に溶解し、 [1,1 '-ビス（ジフエ-ルホスフイノ)-フエ口セン]パラジウム（II)ジクロリドジクロロメタン複合体 (1：1)(100 mg)、エタノール (30 ml)、 5-ブロモ -2-フラルデヒド（3.46 g, 19.8 mmol, 1.0 eq)および 2M炭酸ナトリウム水溶液 (20 ml)を加え、 80°Cで 14時間撹拌した。

[0158] 反応終了後、有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた粗生成物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 19/1→4/1)で分離精製し、目的化合物（2) (3.39 g, 84.8 %)を薄黄色液体として得た。

[0159] TLC (シリカ)： R = 0.31 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 4/1)

f

'H-NMRCCDCl ): δ = 3.86 (s, 3H), 6.72 (d, 1H, J = 3.6 Hz ), 6.96 (d, 2H, J = 9.0

3

Hz), 7.30 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 7.77 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 9.60 (s, 1H)

[0160] 2-アジド -3-[5-(4-メトキシフエ-ル)-フラン- 2-ィル] -アクリル酸ェチルエステル (3)の合成

[0161] [化 51]

(2) (3)

[0162] lOOOmL三口フラスコに Ar気流下， 5-(4-メトキシフエ-ル)-フラン- 2-カルボアルデヒド (2X3.39 g, 16.8 mmol, 1.0 eq)とアジド酢酸ェチル (8.65 g, 67.0 mmol, 4.0 eq)をエタノール (300 ml)に溶解し、次いで 20%ナトリウムエトキシドエタノール溶液（22.8 g, 67.0 mmol, 4.0 eq)を 0°C氷浴中でゆっくり滴下し， 2時間撹拌した。

[0163] 反応終了後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液をカロえ pHを弱酸性にし、水をカ卩えて吸引ろ過を行い、得られたろ物を乾燥し、黄色固体 (3) (3.31 g)を得た。得られた化合物 (3)は精製せずにそのまま次の反応に用いた。

[0164] TLC (シリカ)： R = 0.38 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 9/1)

f

[0165] 2-(4-メトキシフヱ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸ェチルエステル (4)の合成

[0166] [化 52]

(3) (4)

[0167] 200mLナスフラスコに化合物 (3) (3.31 g,10.6 mmol.l eq)を入れ、トルエン（60 ml)に溶解し、 1.5時間還流撹拌した。

[0168] 減圧濃縮後、得られた粗生成物を再結晶 (溶液；へキサン，酢酸ェチル)を行った後に吸引ろ過し、得られたろ物を乾燥し、目的化合物 (4X2.32 g, 48.6% (2工程)）を茶色結晶として得た。

[0169] TLC (シリカ)： R = 0.32 (溶離液；クロ口ホルム）

f

^-NMRCCDCl ): δ = 1.38 (t, 3H), 3.85 (s, 3H), 4.35 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 6.58 (s,

3

IH), 6.80 (s, IH), 6.94 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.67(d, 2H, J = 9.0 Hz), 8.72(s, IH)

[0170] 2- (4-メトキシフヱ-ル)- 4H-フロ [3,2- b]ピロール- 5-カルボン酸 (5)の合成

[0171] [化 53]

(4) (5)

[0172] 300mLフラスコに 2- (4-メトキシフエ-ル)- 4H-フロ [3,2- b]ピロール- 5-カルボン酸ェチルエステル (4) (1.90 g, 6.66 mmol, 1 eq)を入れ、エタノール（60 ml)に溶解し、 sod ium hydroxide (3.90 g, 97.5 mmol, 14.6 eq)エタノール溶液（30 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。

[0173] 放冷後、 6N HC1水溶液を加え、溶液を酸性にし、水を加えて吸引ろ過を行い、得られたろ物を真空乾燥し、目的化合物（5) ( 1.56 g, 91.0 %)を薄緑灰色固体として得た

[0174] TLC (シリカ)： R = 0.40 (溶離液；酢酸ェチル）

f

'H-NMRCCDCl ): δ = 3.86 (s, 3H), 6.60 (s, IH ), 6.83 (s, IH ), 6.95(d, 2H, J = 9.0

3

Hz) ,7.28 (s , IH) , 7.68 (d, 2H, J = 9.0 Hz)

[0175] [化 54]

[0176] 30mL二口フラスコに 2-(4-メトキシフエ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸 (5) (101 mg, 0.391 mmol, 2 eq) 、 TFA (1 ml)、 1,2—ジクロロェタン (2 ml)を人れ、 Ar 気流下、 30 °Cで 30分間撹拌した。次いで、 1,2-ジクロロエタン (6 ml)を加え、窒素でパブリングを行った後、オルトギ酸トリェチル (49.8 mg, 0.336 mmol, 1.7 eq) を加え、室温で 1時間撹拌した。

[0177] 反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をアルミナク口マトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)でおおまかに分離し、黒色固体（6) (46.4 mg )を得た。化合物 (6)は精製せずにそのまま次の反応に用いた。

[0178] TLC (アルミナ)： R = 0.82 (溶離液；クロ口ホルム/酢酸ェチル = 10/1)

f

[0179] 蛍光性化合物の合成

[0180] [化 55]

蛍光性化合物

[0181] 化合物（6) (19.9 mg)が入った lOOmLフラスコに、 1,2-ジクロロエタン (15 ml)、三フッ化ホウ素ジェチルエーチル錯体 (0.1ml)、 TEA (0.8ml)をカ卩え、 60°Cで 40分間撹拌した。

[0182] 反応終了後、酢酸ェチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を抽出、洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)でおおまかに分離し、緑色固体を得た.これをメタノールおよびアセトンで洗浄し、得られた固体を真空乾燥し、蛍光性ィ匕合物 (3.5 mg, 8.5%, 3工程）を緑色結晶として得た。

[0183] TLC (シリカ)： R = 0.24 (溶離液；クロ口ホルム）実施例 8

[0184] 本発明の蛍光性化合物 Zの合成

下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性化合物 Zを合成した

[0185] [化 56]

82 %

1 ) N₃CH₂COOEt

60°C , 5min 0.2 % (3 step)

蛍光性化合物 2

[0186] 5-(2，5-ジメトキシフヱニル) -フラン- 2-カルボアルデヒド (9)の合成

[0187] [化 57]

S0°C， 3h

(8)

(9)

[0188] Ar気流下、 500mL三口フラスコに 2,5-ジメトキシフエ二ルボロン酸（8) (3.64 g， 20.0 mmol, 1.0 eq)を入れ、トルエン (120 ml)に溶解し、 [1，1，-ビス（ジフエニルホスフイノ)- フエ口セン]パラジウム (II)ジクロリドジクロロメタン複合体 (1:1) (110 mg)、エタノーノレ（ 30 ml)、 5-ブロモ -2-フロアルデヒド（3.50 g, 20.0 mmol, 1.0 eq)および 2M炭酸ナトリゥム水溶液 (20 ml)を加え、 80°Cで 3時間撹拌した。

[0189] 反応終了後、有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；トルエン/酢酸ェチル = 20/1)で分離精製し、目的化合物（9) (3 .82 g, 82.2 %)を薄黄色液体として得た。

[0190] TLC (シリカ)： R = 0.23 (溶離液；トルエン/酢酸ェチル = 20/1)

f

'H-NMRCCDCl ): δ = 3.85 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 6.93 (d, 2H, J = 1.7 Hz), 7.17(d, 1

3

H, J = 3.7 Hz) , 7.33 (d, 1H, J = 3.7 Hz), 7.56 (t, 1H, J = 1.7 Hz), 9.65 (s, 1H)

[0191] 2-アジド -3-[5-(2, 5-ジメトキシフエ-ル)-フラン- 2-ィル] -アクリル酸ェチルエステル (1 0)の合成

[0192] [化 58]

(9) (10)

[0193] lOOOmL三口フラスコに Ar気流下、 5-(2,5-ジメトキシフエ-ル)-フラン -2-カルボアルデヒド (9X3.82 g, 16.4 mmol, 1.0 eq)とアジド酢酸ェチル (8.50 g, 65.7 mmol, 4.0 e q)をエタノール (300 ml)に溶解し、次いで 20%ナトリウムエトキシドエタノール溶液（ 22 .8 g, 65.7 mmol, 4.0 eq)を 0°C氷浴中でゆっくり滴下し、 3時間撹拌した。

[0194] 反応終了後、飽和塩ィ匕アンモ-ゥム水溶液をカロえ pHを弱酸性にし、水をカ卩えて吸引ろ過を行い、得られたろ物を乾燥し、黄色固体 (10X3.30 g)を得た。（10)は精製せずにそのまま次の反応に用、た。

[0195] TLC (シリカ)： R = 0.61 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 4/1)

f

[0196] 2-(2,5-ジメトキシフヱ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸ェチル (11)の合成 [0197] [化 59]

(10) (ⁿ) [0198] 200mLナスフラスコに化合物 (10) (3.30 g, 9.61mmol, 1 eq)を入れ、トルエン（60 ml) に溶解し、 1時間還流撹拌した。

[0199] 減圧濃縮後、得られた粗生成物を再結晶 (溶液；へキサン、酢酸ェチル)を行った後に吸引ろ過し、得られたろ物を乾燥し、目的化合物 (11X2.70 g, 52.1%, 2工程）を茶色結晶として得た。

[0200] TLC (シリカ)： R = 0.26 (溶離液；クロ口ホルム）

f

^-NMRCCDCl ): δ =1.39(t , 3H, J = 7.2 Hz) , 3.86 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 4.36(qua

3

nt. , 2H J = 7.2 Hz) , 6.80 - 6.84 (m, 2H), 6.90(d, 1H, J = 9.0 Hz) , 7.09 (s, 1H), 7. 52 (d, 1H, J = 3.3 Hz), 8.71(s, 1H)

[0201] 2-(2,5-ジメトキシフヱ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸 (12)の合成

[0202] [化 60]

(11) (12)

[0203] 500mLフラスコに 2-(2 ,5-ジメトキシフエ-ル) -4H-フロ [3 , 2-b]ピロール- 5-カルボン酸ェチル (11) (2.67 g, 8.47 mmol, 1 eq)を入れ、エタノール（100 ml)に溶解し、水酸化ナトリウム（5.08 g, 127mmol, 15 eq)水溶液 (50 ml)を加え、 1時間還流撹拌した。

[0204] 放冷後、 6N HC1水溶液を加え、溶液を酸性にして 30分間攪拌した後、水を加えて吸引ろ過を行い、得られたろ物を真空乾燥し、目的化合物（12) ( 1.90 g, 78.1 %)を緑灰色固体として得た。

[0205] TLC (シリカ)： R = 0.37 (溶離液；酢酸ェチル）

f

'H-NMR CDCl ): δ =3.86 (s， 3H)， 3.92 (s， 3H)， 6.84 (dd, 1H， J = 8.8 Hz, J = 2.9

3 1 2

Hz), 6.93— 6.89(m， 2H)， 7.11 (s， 1H)， 7.52 (d， 1H， J = 2.9 Hz), 8.88(s, 1H)

2

[0206] [化 61]

(12) (13) [0207] 30mL二口フラスコに 2-(2,5-ジメトキシフエ-ル) -4H-フロ [3,2-b]ピロール- 5-カルボン酸 (12) (97.0 mg, 0.338 mmol, 2 eq)、 TFA (1 ml)、 1,2—ジクロロェタン (2 ml)を人れ、 Ar気流下、 40°Cで 35分間撹拌した。次いで、オルソギ酸トリメチル (65.1 mg, 0.439 mmol, 2.6 eq) を加え、室温で 40分間撹拌した。

[0208] 反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をアルミナク口マトグラフィー（溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 1/1)でおおまかに分離し、紫色固体（13X20.0 mg)を得た。化合物（13)は精製せずにそのまま次の反応に用いた。

[0209] TLC (アルミナ)： R = 0.90 (溶離液；クロ口ホルム/酢酸ェチル = 10/1)

f

[0210] [化 62]

60°C . 5min

(13) 蛍光性化合物ェ

[0211] ィ匕合物 (13X20.0 mg)が入った 50mLフラスコに、 1,2-ジクロロエタン (15 ml)、三フッ化ホウ素ジェチルエーテル複合体（約 0.1ml)、 TEA (約 0.8ml)をカ卩え、室温で 25分間攪拌後、 60°Cで 5分間撹拌した。

[0212] 反応終了後、酢酸ェチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を抽出、洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をシリカクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)、ゲル浸透クロマトグラフィ一 (溶離液；特級クロ口ホルム)および分取用薄層シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)で分離精製し、蛍光性化合物 Z(0.9 mg, 0.49 %(3 step))を緑色結晶として得た。

[0213] TLC (シリカ)： R = 0.85 (溶離液；クロ口ホルム/酢酸ェチル = 10/1)

f

'H-NMRCCDCl ): δ =3.86 (s, 6H), 3.97 (s, 6H), 6.47 (s, 2H), 6.95 (d, 4H, J = 1.8

3

Hz) , 7.08 (s, 1H), 7.33(s, 2H), 7.51 (t, 2H, J = 1.8 Hz)

実施例 9

[0214] 本発明の蛍光性ィ匕合物 Sの合成下記の反応スキームに従い、本発明の蛍光性化合物 Sを合成した

[0215] [化 63]

80°C， 14h

S4.S %

1 ) N₃CH₂COOEt

20% EtONa

EtOH, 0°C, 2h

2) toluene

reflux, 1.5 h

48.6 %

蛍光性化合物 _a

[0216] 30mL三口フラスコに 2- (4-メトキシフエ二ル)- 4H-フロ [3,2- b]ピロール- 5-カルボン酸（5) (98.5 mg, 0.38 mmol, 2 eq)、 TFA (5 ml)を入れ、 Ar気流下、 50 °Cで 15分間撹拌後、放冷し、氷浴中で 0°Cに冷やした。次いで、亜硝酸ナトリウム (14.2 mg, 0.206 m mol, 1.1 eq)を加え、 0 °Cで 10分間撹拌後、 TFAA(2 ml)をカ卩えて室温で 10分攪拌し、ついで 60°Cで 1時間攪拌した。

[0217] 反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および氷をカ卩え、溶液を中和し、酢酸ェチルをカ卩え、有機相を抽出した。有機相を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をアルミナクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)でおおまかに分離し、青緑色固体（15X11.5 mg)を得た。化合物 (15)は精製せずにそのまま次の反応に用いた。

[0218] TLC (アルミナ)： R = 0.63 (溶離液；クロ口ホルム）

f [0219] [化 64]

(15) 蛍光性化合物

[0220] 化合物（15) (11.5 mg)が入った 50 mLフラスコに、 1,2-ジクロロエタン (20 ml)、三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体 (0.1ml)、 TEA (0.08ml)をカ卩え、 40°Cで 30分間撹拌した。

[0221] 反応終了後、塩化メチレンと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機相を抽出、洗浄した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；クロ口ホルム)でおおまかに分離し、減圧濃縮した後、アセトンを加えて吸引ろ過を行い、得られたろ物を真空乾燥し、蛍光性化合物 (9.2 mg,4.4 %(3工程)）を緑色結晶として得た。

[0222] TLC (シリカ)： R = 0.50 (溶離液；クロ口ホルム）

f

^-NMRCCDCl ): δ = 3.90 (s, 6H), 6.73 (quant, 2H, J = 2.2 Hz), 6.82 (s, 2H), 7.00

3

(d, 4H, J = 8.8 Hz) , 7.80 (d, 4H, J = 9.0 Hz)

1⁹F-NMR(CDC1 ): δ = -54.32 (s, 3F), 149.02(quant, 2F)

3

[0223] なお、上記実施例及び比較例にお!、て、試薬は分析級試薬ある!、は最上級品位のものを用いた。また、すべての 1H-NMR ^ベクトルはテトラメチルシランを内部標準物質とし、 r. t.で測定された。機器は、 JOEL JNM- GSX300、 JOEL JMM-LA300 FT- NMRを用いた。

[0224] また、上記実施例及び比較例において用いた略号は以下のとおりである。

Me: メチル基

Et: ェチノレ基

DDQ: 2, 3-ジクロロ- 5, 6-ジシァノ -p-ベンゾキノン

TEA:卜リエチノレアミン

TFA:トリフロロ酢酸

TFAA:トリフロロ無水酢酸 MeOH:メタノーノレ

r.t.:室温

mm:分

h:時間

実施例 10

[0225] 実施例 7〜9で合成した本発明の蛍光性ィ匕合物、 Z及び Sの光学特性を実施例 6 と同様にして測定した。結果を下記表 4に示す。

[0226] [表 4] 蛍光性化 ^Aabs i ε ^a Φ a

半値幅溶媒

合物 (nm) (nm) (M- W (nm)

6 CHC1₃ 673 683 240, 000 0. 69 24

THF 665 674 n. d. 0. 63 24

MeOH 659 672 n. d. 0. 58 26

7 CHClj 678 688 n. d. 0. 51 24

MeOH 662 674 n. d. 0. 54 28

8 CHCI3 722 737 240, 000 0. 58 31

h /レエン 724 735 n. d. 0. 53 27

THF 721 735 n. d. 0. 42 32

MeCN 713 733 n. d. 0. 51 37

MeOH 712 732 n. d. 0. 40 35 a誤差 10%含む

b測定せず (not determined)

[0227] 蛍光性化合物 βおよひの蛍光量子収率 Φは、 3,3'-ジェチル -ジチアジカルボシァニン（Φ =0.33、 MeOH中）をリファレンスとし、 A = A = 0.079, Φ = 0.33, η = 1 ref ref ref ref

.329(MeOH), n = 1.445 (CHCl), 1.407 (THF:テトラヒドロフラン)， 1.329 (Me〇H)を代

3

入し、 Fには 650應の励起光で励起し検出された蛍光強度面積の積算値を代入して求めた。

Φ = Φ X(A XFXn²)/ (AXF Xn ²) (ただし、 Aは吸光度、 Fは蛍光スペクトルの波数積分値、 nは溶媒の屈折率を示し、 re fは参照色素（リファレンス）を示す）

[0228] 蛍光性化合物 Sの蛍光量子収率 Φは、異なる濃度の溶液を準備し、縦軸を蛍光強度面積の積分値 F (励起光 : 690 横軸を吸光度 Aとしたグラフを作成し、その傾き Grad (=F/A)を算出し、さらに各溶媒の屈折 n = 1.496 (トルエン)， 1.445 (CHC1 ), 1.4

3

07 (THF), 1.344(MeCN), 1.329 (MeOH)を代入しそれぞれの値を次の式に代入することで求めた。このとき、参照化合物 1 (下記）（Φ = 0.36、 CHC1中）をリファレンスと ref 3

した。

Φ = Φ X (Grad X n²)/ (Grad X n ²)

ref ref ref

(ただし、 Gradは縦軸に蛍光スペクトルの波数積分値、横軸に吸光度としたグラフの傾き、 nは溶媒の屈折率を示し、 refは参照色素（リファレンス）を示す）

[0229] 蛍光性化合物、 Zの蛍光極大波長はクロ口ホルム中で 683 nm、 688 nmとなり、ボロンジピロメテン（R = R = R = R = Me)に比べて約 170 nmほど、蛍光性化合物 2に比

1 3 5 7 一ベ約 90 nmシフトした。このことから、特定の部位に電子供与基を導入することで長波長化することが確かめられた。また、蛍光性化合物、 Zは、それぞれ半値幅が非常に小さぐ鋭い蛍光スペクトルを示している。このこと力、ボロンジピロメテン骨格と同様の骨格の堅さを維持したまま長波長シフトしたことがわかる。さらに、蛍光性化合物ぉよび Zを比較すると、導入した基の電子供与性が高ヽほど蛍光が長波長化することが確かめられた。

[0230] [化 65]

参照化合物 1

[0231] 蛍光性ィ匕合物 Sの蛍光極大波長はクロ口ホルム中で 737 nmとなり、蛍光性ィ匕合物に比べ約 54 nmシフトした。このことから、特定の部位に電子吸引基を導入することでさらなる長波長シフトが達成できることがわかる。また、また、蛍光性ィ匕合物 Sは、半値幅が 31 nm程度と非常に小さぐ鋭い蛍光スペクトルを示している。このこと力、ボロンジピロメテン骨格と同様の骨格の堅さを維持したまま長波長シフトしたことがわかる実施例 11

[0232] 蛍光性化合物 Sと、 Cy7 (商品名、 1-[3-(4-モノメトキシトリチロキシ)プロピル] -1'-[3- [(2-シァノエチル) - (Ν,Ν-ジイソプロピル)フォスフォロアミジチル]プロピル] -3,3,3',3'- テトラメチルインドトリカルボシァニンク口リド)の光に対する耐久性を確かめる実験を行った。

[0233] 蛍光性ィ匕合物 Sと Cy7 (商品名）を、それぞれァセトニトリル中に溶解し、吸光度が 0.

1になる濃度に調整し、遮光せず同条件下 (具体的には日常生活光の下)で放置し、 1日（ないしは 2日おき）に吸光度を測定した。そして縦軸に相対吸光度 (放置前の吸光度を 100%とする）を、横軸に日数をとり、経時変化をグラフに示した。

[0234] 結果を図 1に示す。蛍光性ィヒ合物 Sは、一週間後でも吸光度は 95%以上保持されている一方、 Cy7 (商品名）は吸光度が 10%以下まで減少した。この結果より、 Cy7 ( 商品名）の光に対する耐久性は著しく乏しいが、蛍光性ィ匕合物 Sは光に対する耐久性が極めて高いことがわ力つた。この結果より、従来の色素では不可能であった、長時間の分析試薬、または高耐久性の新規表示色素材料、光学材料としての応用が可能となると考えられる。

[0235] Cy7に代表されるシァニン系色素は、 0010段落でも述べたように、化学的に柔軟な結合であるォレフィン (ポリメチン)鎖が長ぐこの部位が光異性ィ匕などを起こし、そのため耐久性の低下を招いたと考えられる。また、この現象は Cy7のみならず、一般的にォレフイン (ポリメチン)構造を有する色素にお、ては起こりうることであり、ォレフイン (ポリメチン)鎖が長くなるほど、耐久性が低下すると考えられる。もっとも、この現象は非特許文献 3をはじめ、多くの文献で報告されている事実である。

[0236] 一方、蛍光性ィ匕合物 Sは、化学的に堅牢な分子構造であるため、飛躍的に光耐久性が向上したと考えられる。したがって、蛍光性ィ匕合物は、柔軟なォレフィン構造を有する色素、特に Cy7に代表されるようなシァニン系色素に対して、光耐久性の面でも有意な利点を見出せる。もっとも、この事象は蛍光性ィ匕合物旦に限定されず、本発明による蛍光性化合物全般に共通する特性である。

Claims

請求の範囲

下記一般式 [I]

[ I ]

(ただし、式中、

Qは炭素原子又は窒素原子を表し、

で示される構造を有する蛍光性化合物。

[2] 前記 R¹と R²、及び/又は R⁶と R⁷により形成される前記へテロ環が、互いに独立に、下 3式

[化 2]

(ただし、これらの式中、 X、 Y及び Zは、互いに独立にィォゥ、酸素、窒素又はリン原子を示し、 R^1Qないし R¹⁷は互いに独立に水素原子又は前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表す）

で表されるいずれかの構造を有する請求項 1記載の化合物。

[3] 前記へテロ環が、

[化 3]

(ただし、これらの式中、 X、 Y及び Zは、互いに独立にィォゥ、酸素、窒素又はリン原子を示し、 R^1Qないし R¹³は互いに独立に水素原子又は前記化合物の蛍光を阻害しない任意の基を表す）

で表されるいずれかの構造を有する請求項 2記載の化合物。

[4] 前記 R^1Qないし R¹⁷が互いに独立に水素原子又は電子供与性基である請求項 2又は 3記載の化合物。

[5] 前記電子供与性基がアルキル基、フヱニル基、 P-アルコキシフヱニル基、 P-ジアルキルアミノフヱ-ル基、 2_チェ-ル基、 2_フリル基又はジアルコキシフ -ル基である請求項 4記載の化合物。

[6] 前記電子供与性基が炭素数 1〜10のアルキル基、アルキル部分の炭素数が 1〜1 0のアルコキシフエ-ル基若しくはアルキル部分の炭素数がそれぞれ 1〜10のジァルコキシフエニル基である請求項 5記載の化合物。

[7] 前記一般式 [I]中、 R⁸及び R⁹が互いに独立にハロゲン原子である請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の化合物。

[8] 前記一般式 [I]中、 R⁸及び R⁹がフッ素原子である請求項 7記載の化合物。

[9] 請求項 1な!、し 8の、ずれか 1項に記載の化合物から成る標識剤。

[10] 請求項 9記載の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法。