CN102993763A

CN102993763A - 一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料及其应用

Info

Publication number: CN102993763A
Application number: CN2012105252635A
Authority: CN
Inventors: 彭孝军; 张思; 樊江莉; 王静云; 吴彤; 李志勇
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2012-12-09
Filing date: 2012-12-09
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2032-12-09
Also published as: CN102993763B

Abstract

本发明公开一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料及其应用，所述荧光染料具有通式I结构。通式I中：R₁选自C_1-18烷基；R₂选自H、甲基、取代或未取代苯基，取代或未取代噻唑基；R₃和R₄各自独立地选自H、甲基、取代或未取代苯基、取代或未取代噻唑基，取代或未取代苯乙烯基；所述的取代苯基、取代噻唑基或取代苯乙烯基由以下基团任意取代：CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、卤素或C_1-6卤代烷基；Y^-为卤素负离子。本发明的荧光染料可以选择性的定位于活细胞的线粒体，实现活细胞中线粒体荧光成像。

Description

一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料及其应用

技术领域

本发明涉及精细化工领域中的一类新的荧光染料、制备方法及其应用，特别是涉及一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川（BDP）荧光染料、其制备方法，以及利用该荧光染料在生物染色方面的应用。

背景技术

荧光染料作为功能性染料在科学技术的各个领域取得了广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究成为热点。线粒体不仅是人体中提供能量的主要场所，而且其参与的生理过程与很多疾病如糖尿病、癌症、老年痴呆症等相关。因此，对线粒体及其功能的研究备受关注。目前，广泛应用的线粒体成像的商品化染料主要分为2大类：花菁类（MitoTracker FM）和罗丹明类（MitoTracker Ros）。但是这些染料也存在一些不足：如稳定性差、荧光强度受pH影响等。因此，开发稳定性好、不受pH干扰、毒性小的新型荧光染料具有重要意义。

在众多荧光染料中，氟化硼络合二吡咯甲川（BDP）荧光染料具有较高的摩尔消光系数、荧光量子产率高、稳定的光谱性质、高的光热及化学稳定性、分子量小和较低的细胞毒性等优点，作为生物分子荧光探针和细胞器成像荧光试剂等已被广泛应用。其中，一些BDP荧光染料已应用于细胞成像中内质网和高尔基体的细胞器荧光成像定位，并取得了很好的应用。但在线粒体细胞器活细胞荧光成像定位中还少有BDP荧光染料的报道。据文献报道，线粒体是一个具有负膜电位的细胞器，带有正电荷的共轭结构的有机分子比较容易聚集于线粒体周围实现其在活细胞中的荧光成像。已广泛应用的商品化的线粒体荧光染料如Rhodamine123、Invitrogen公司的MitoTracker系列等，都是具有正电荷离域共轭体系的分子实现线粒体选择性成像。但是这些荧光染料存在稳定性差、光谱易受pH的环境因素的影响等缺点。

发明内容

因此，需要开发新的荧光染料，该染料应该具有以下特点：具有正电荷离域共轭体系，能选择性的定位于线粒体实现线粒体的荧光成像，较高的稳定性，稳定的光谱性质，不受溶剂极性及pH等周围环境的影响，具有一定的水溶性和细胞通透性以及低的细胞毒性。

本发明首先公开一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料（BDP荧光染料），具有如下通式（式I）：

通式I中：

R₁选自C_1-18烷基；

R₂选自H、甲基、取代或未取代苯基，取代或未取代噻唑基；

R₃和R₄各自独立地选自H、甲基、取代或未取代苯基、取代或未取代噻唑基，取代或未取代苯乙烯基；

所述的取代苯基、取代噻唑基或取代苯乙烯基由以下基团任意取代：CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、卤素或C_1-6卤代烷基；

Y^-为卤素负离子。

本发明的上述BDP荧光染料具有以下显著的特征：

（1）由于吡啶盐正电荷的引入，使其可以选择性的定位于活细胞的线粒体，实现活细胞中线粒体荧光成像；

（2）光谱性质稳定，对极性、pH值不敏感，同时具有光稳定性好的有点；与商品化的线粒体染料相比，本发明的BDP荧光染料有更高的光稳定性，更好的抗pH干扰的能力；

（3）光谱范围大，可实现从可见光到近红外的荧光成像；

（4）合成简便，产品易得；且细胞毒性小，在生物长时间观测方面有更大的潜在应用价值。

鉴于此，本发明的另一目的在于提供上述本发明的BDP荧光染料在制备用于活细胞染色的试剂中的应用。所述试剂尤其指选择性用于线粒体染色的试剂。

附图说明

本发明附图5幅：

图1是化合物B和商品化线粒体染料MitoTracker Green FM、MitoTracker RedCMXRos在Tric-HCl缓冲溶液（10nM,pH=7.4）中的光稳定性比照图。横坐标为光照时间(小时)，纵坐标为吸光度值保留值。所用光源为500W碘钨灯；所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda35。

图2是化合物D与商品化线粒体染料MitoTracker Red CMXRos在不同pH值下的相对荧光强度的变化图。横坐标为pH值，纵坐标为归一化的相对荧光强度。pH值的调节使用的是HCl和NaOH的水溶液。所用仪器为所用仪器为荧光分光光度计，型号：PTI-700。

图3是化合物B与中间体A的荧光细胞成像。其中图3a是化合物B在终浓度为5uM的条件下37°C细胞抚育30min后的荧光成像，图3b是中间体A在终浓度为5uM的条件下37°C细胞抚育30min后的荧光成像。所用仪器为激光共聚焦显微镜，型号LeicaTCS-SP2。

图4是化合物F与商品化线粒体染料MitoTracker Green FM的共定位荧光成像图。其中，图4a为商品化染料MitoTracker Green FM的荧光成像，图4b为化合物F的荧光成像，图4c为图4a和4b的叠加图，图4d为图4c和白光图叠加图。所用仪器为激光共聚焦显微镜，型号Olympus FV1000。

图5是化合物B的MTT细胞毒性试验。其中，横坐标为染料的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

具体实施方式

本发明提供一类具有通式I结构的单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，本申请中也称之为BDP荧光染料。

除另有说明外，本文中，包括对所述染料进行限定时，所使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基，类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

本文中使用的术语“任意取代”，是指任意基团在可取代位置的单取代或多取代，取代基之间可以相同也可以不同。

在本发明的通式I的化合物中，

优选R₁为C_1-5烷基；更优选甲基或乙基。

优选R₂为甲基、苯基或噻唑基。

R₃和R₄各自独立地选自H、甲基、取代或未取代苯基、取代或未取代噻唑基，取代或未取代苯乙烯基；其中的取代苯基、取代噻唑基或取代苯乙烯基优选由以下基团任意取代：NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6酰胺基或卤素。

更为优选地，R₃和R₄各自独立地选自甲基、苯基、噻唑基和苯乙烯基。

以上各基团的优选方案可相互组合，从而构建更多的具体的优选方案，比如：

优选方案之一：R₁为甲基或乙基；R₂为甲基、苯基或噻唑基；R₃和R₄各自独立地选自甲基、苯基、噻唑基和苯乙烯基。更为优选的方案中，R₃和R₄是相同的基团，为甲基或苯基。

针对上述本发明BDP荧光染料化合物的合成方法，申请人相信，尽管本发明所公开的一系列化合物是新的，但本领域技术人员根据现有技术的启示，完全可以设计出能够获得所述化合物的有机合成路线。本发明提供其中一种合成方法，所述方法对R₃和R₄相同或不相同条件下的两类化合物采用区别的合成方案。

1、R₃和R₄各自独立地选自H、甲基、取代或未取代苯基、取代或未取代噻唑基时，通式I化合物的合成

1）式III的化合物与式IV的化合物按照摩尔比1:2-1:4，在三氟乙酸、四氯苯醌和三氟化硼乙醚存在条件下，于室温反应10-20h，制备式II的化合物；反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、邻二氯苯或其混合物；

2）式II的化合物与化合物R₁Y按照摩尔比1:1-1:10，在10~120°C条件下反应0.5～10h制备式I的化合物，反应试剂为二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、邻二氯苯、乙二醇单甲醚或其混合物。

2、R₃和R₄各自独立地选自H、甲基、取代或未取代苯基、取代或未取代噻唑基、取代或未取代苯乙烯基，并且R₃和R₄中至少一个选自取代或未取代苯乙烯基时，通式I化合物的合成：

1）式III的化合物与式VI的化合物按照摩尔比1:2-1:4，在三氟乙酸、四氯苯醌和三氟化硼乙醚存在条件下，于室温反应10-20h，制备式Ⅴ的化合物；反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、邻二氯苯或其混合物；

2）式V的化合物与式VII的化合物按照摩尔比2:1-1:1，在哌啶为催化剂，20-150°C条件下反应4-30h制备式VIII的化合物；式V的化合物与式VII的化合物按照摩尔比1:2-1:20，在哌啶为催化剂,20-150°C条件下反应4-30h制备式IX的化合物,反应溶剂选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、邻二氯苯、乙二醇单甲醚、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其混合物；

3）式VIII或式IX的化合物与化合物R₁Y按照摩尔比1:1-1:10，在10~120°C条件下反应0.5~10h制备式I的化合物，式I中R₃和R₄至少含有一个苯乙烯基或取代苯乙烯基；反应试剂为二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、邻二氯苯、乙二醇单甲醚或其混合物。

R₆表示由以下的取代基任意取代：H、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、C1-6酰胺基、卤素或C1-6卤代烷基。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

中间体A的制备

250mL单口圆底烧瓶中，加入150mL新蒸过的DCM，减压下氮气置换数次以排净溶剂中溶解的空气；然后称取428mg(4mmol)吡啶-2-甲醛，并在搅拌下使之溶解，接着用注射器注入0.75mL(8mmol)2,4-二甲基吡咯，快速滴加数滴三氟乙酸催化，整个体系在氮气氛下进行，且快速磁力搅拌，过夜。母液旋转蒸发掉100mL溶剂，接着在搅拌下于半小时内滴加入40mL含有908mg(4mmol)2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(DDQ)的DCM溶液，母液颜色由红褐色变为黑褐，继续搅拌并逐渐滴入8mL无水三乙胺，待反应液上方白色烟雾消失后，在室温下缓慢滴加12mL三氯化硼乙醚，15分钟内加完。继续搅拌2-4小时，TLC跟踪整个反应进程。待无更多的荧光产物生成后，反应母液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，DCM萃取，饱和食盐水洗涤分液后，无水硫酸钠干燥。混合液浓缩后，硅胶柱层析分离，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯=4:1(v/v)；最终得到桔红色粉末状产品，产率35%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.81(d,J=6.1Hz,1H),7.90(t,J=7.8Hz,1H),7.50(m,2H),5.99(s,2H),2.56(s,6H),1.32(s,6H)。HR-TOF-MS C₁₈H₁₈BN₃F₂+H m/z326.1650。

实施例2

化合物B的制备

将A（0.65g,2mmol）加入100ml单口圆底烧瓶中，40ml干燥过的乙腈将其溶解，加入碘乙烷（3.12g,20mmol）滴入反应液中，氮气保护，加热回流5h。反应液冷却至室温，旋转蒸发出溶剂，中性氧化铝柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷/甲醇=50:1（v/v）,最终得到桔红色粉末状产品，产率58%。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ9.23(d,J=5.9Hz,1H),8.73(t,J=8.0Hz,1H),8.32(t,J=6.9Hz,2H),6.29(s,2H),4.68(q,J=7.5Hz,2H),2.51(s,6H),1.50(t,J=7.3Hz,3H),1.35(s,6H)；HR-TOF-MS C₂₀H₂₃BN₃F₂m/z354.1945。

实施例3

中间体C的合成

将化合物A(0.65g,2mmol)和苯甲醛(2.2mmol)装入100mL单口瓶中，加入经过干燥处理的甲苯(40mL)，催化剂哌啶(1mL)，4

分子筛3粒加入其中，加热回流，TLC监测反应终点，硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯=5:1,得到深红色固体，产率20%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.81(d,J=6.1Hz,1H),7.90(t,J=7.8Hz,1H),7.7(m,2H),7.50(m,2H),7.28-7.48(m,5H),6.60(s,1H),5.99(s,1H),2.56(s,3H),1.37(s,3H),1.33(s,3H)。TOF-LD C₂₅H₂₂BN₃F₂m/z413.1863。

实施例4

化合物D的合成

将中间体C（1mmol）加入100ml单口圆底烧瓶中，40ml干燥过的乙腈将其溶解，加入碘乙烷（1.56g,10mmol）滴入反应液中，氮气保护，加热回流5h。反应液冷却至室温，旋转蒸发出溶剂，中性氧化铝柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷/甲醇=50:1（v/v）,最终得到深红色粉末状产品，产率45%。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ952(d,J=5.9Hz,1H),8.86(t,J=8.0Hz,1H),8.62-8.48(m,2H),7.50(m,2H),7.28-7.48(m,5H),7.18(s,1h),6.39(s,1H),4.64(q,J=7.5Hz,2H),2.51(s,3H),1.48(t,J=7.3Hz,3H),1.37(s,3H),1.35(s,3H)；HR-TOF-MS C₂₇H₂₇BN₃F₂m/z442.2267。

实施例5

中间体E的合成

将吡啶-2-甲醛（107mg,1mmol）与2-苯基-4-噻吩吡咯（450mg,2mmol）溶于50ml蒸馏并除氧的二氯甲烷中。氮气保护，滴加3滴三氟乙酸后过夜搅拌反应，然后将DDQ（228mg,1mmol）加入反应液中，室温搅拌30min后，加入15ml三乙胺搅拌反应30min。在冰水浴条件下，滴加15ml三氟化硼乙醚后室温反应24h。反应完毕后，反应液水洗（50ml*3）并用无水硫酸钠干燥。溶剂真空旋干后，用硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷/乙酸乙酯=4:1(v/v),得到蓝黑色固体，产率27%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.28(d,J=4.0Hz,2H),7.75(d,J=8.0Hz,1H),7.52(d,J=4.0Hz,2H),7.23(t,J=4.0Hz,2H),6.92-6.83(m,7H),7.77-6.74(m,7H),6.52-6.49(m,1H).HR-TOF-MSC₃₄H₂₂BN₃F₂S₂+H m/z586.1441。

实施例6

化合物F的合成

将中间体E(0.1mmol)与碘甲烷（140mg,1mmol）溶于5ml甲苯中，氮气保护下加热回流反应5h。反应完毕后，溶剂旋转蒸干，硅胶柱层析分离，洗脱液为二氯甲烷/甲醇=10:1，得到绿色固体，产率89%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.36(d,J=12.0Hz,2H),8.24(d,J=4.0Hz,1H),7.95(d,J=8.0Hz,2H),7.88(d,J=8.0Hz,2H),7.83-7.79(m,1H),7.42-7.38(m,1H),7.32(t,J=4.0Hz,2H),7.08-6.94(m,12H).HR-TOF-MS C₃₅H₂₃BN₃F₂S₂ m/z600.1557。

实施例7

化合物B与商品化的线粒体染料光稳定性的比较。

将化合物B、商品化的线粒体染料MitoTracker GreenFM与MitoTracker RedCMXRos分别配成5×10^-6M的Tris-HCl（10mM,pH=7.4）缓冲溶液装入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品20cm处，通电光照，计时。每隔1小时后，测量样品光照后的吸光度值。如图1所示，经过8小时光照后，化合物B的吸收还有90%，而商品化的线粒体染料都不足40%，特别是MitoTracker Green FM，基本将为0。结果显示，化合物B相比商品化的线粒体染料，具有较强的光稳定性。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda8453。

实施例8

pH变化对化合物D荧光性质的影响。

将化合物D与商品化染料MitoTracker Red CMXRos分别配成5×10^-6M的Tris-HCl（10mM,pH=7.4）缓冲溶液20ml,用HCl和NaOH的水溶液调节缓冲液的pH值，测定在不同pH值下的染料的荧光强度变化。如图2所示，在pH=2-10范围内，化合物D的荧光强度基本保持不变，而商品化染料MitoTrackerRed CMXRos的荧光降低了很多，说明化合物D比商品化染料具有更稳定的光谱性质，不易受pH的干扰。所用仪器为荧光分光光度计，型号：PTI-700。

实施例9

中间体A与化合物B的活细胞荧光成像

首先，HeLa细胞在含10%新鲜血清的DEME培养基中，通5%CO₂，37°C条件下抚育24h。在细胞成像中，细胞先与化合物A或B抚育30min,然后用PBS冲洗3次，再加入DEME培养基，然后在激光共聚焦显微镜上进行荧光成像。如图3所示，中间体A和化合物B都具有膜通透性，都能进入活细胞，但是它们的染色情况有显著地不同，带正电荷的化合物B染色成线性和点状，中间体A成指环状，结合后面的研究我们推断因为线粒体为负的膜电位，带正电荷的化合物B更易于富集于线粒体上，而中间体A因为其较高的脂溶性，更易于在膜结构例如高尔基、内质网等位置的成像。所用仪器为激光共聚焦显微镜，型号Leica TCS-SP2。

实施例10

化合物F与商品化线粒体染料的复染实验

细胞培养如实施例9所示，然后向细胞中加入商品化染料MitoTracker Green FM，终浓度为0.5uM,抚育15min，PBS洗涤3次，加入化合物F，终浓度为0.5uM,继续抚育15min,PBS缓冲液洗涤3次，加入培养基DEME，在激光共聚焦显微镜上进行成像。如图4所示，图4a为商品化染料MitoTracker Green FM的荧光成像（绿色通道），图4b为化合物F的荧光成像（红色通道），图4c为图4a和4b的叠加图，图4d为图4c和白光图叠加图，从叠加图可以看出，化合物F和商品化线粒体染料有很好的叠加，可以进一步证明化合物F成像位置为细胞的线粒体。所用仪器：激光共聚焦显微镜，型号Olympus FV1000。

实施例11

化合物B与商品化线粒体染料MitoTraker Red CMXRos的毒性对比试验

将不同浓度（0.5uM,2uM,5uM,10uM）的化合物B与商品化染料MitoTracker RedCMXRos加入到经过细胞计数的培养皿中培养12h，然后加入MTT培养2h后倒掉，加入DMSO使用读数器计量490nm光吸收强度衡量化合物的毒性。如图5所示，在低浓度时，化合物B和商品化线粒体染料MitoTracker Red CMXRos都有较低的浓度，而当浓度高时，化合物B的细胞毒性远低于商品化线粒体染料MitoTracker RedCMXRos。

Claims

1.一类单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，具有如下通式：

通式I中：

R₁选自C_1-18烷基；

Y^-为卤素负离子。

2.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的R₁选自C_1-5烷基。

3.权利要求2所述的荧光染料，其特征在于，所述的R₁是甲基或乙基。

4.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的R₂选自甲基、苯基或噻唑基。

5.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的取代苯基、取代噻唑基或取代苯乙烯基由以下基团任意取代：NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6酰胺基或卤素。

6.权利要求3、4或5所述的荧光染料，其特征在于，所述的R₃和R₄各自独立地选自甲基、苯基、噻唑基和苯乙烯基。

7.权利要求1所述的单电荷氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料在制备用于活细胞染色的试剂中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的试剂选择性用于线粒体染色。