WO2021201284A1 - 蛍光標識剤、及び蛍光色素 - Google Patents

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fluorescent
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梨乃 横倉
竜太郎 山本
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    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the embodiment of the present invention relates to a fluorescent labeling agent and a fluorescent dye used in the fluorescent labeling agent.
  • Bioimaging is a technique for visualizing proteins, cells, tissues, etc. in a living body. Bioimaging is widely used in the fields of biology and medicine, such as elucidation of the functions of molecules and cells in a living body and research on drug discovery. Among them, the fluorescence bioimaging method is an imaging method capable of dynamic observation of phenomena, multicolor observation, and high-sensitivity observation. In recent years, the fluorescence bioimaging method has been attracting attention as a non-invasive imaging method, and is expected to be applied in clinical practice such as image diagnosis with less burden on patients and real-time diagnosis during surgery. ..
  • the fluorescence bioimaging method is a method of visualizing a target using a binding type that specifically binds to a target substance or an integrated type fluorescent dye that accumulates at a target site.
  • the fluorescence emitted when the fluorescent dye is irradiated with light in the ultraviolet region to the near infrared region is detected.
  • the integrated fluorescence bioimaging using accumulation at the target site is simpler and faster than the binding fluorescence bioimaging using specific binding to the target substance. Further, since the integrated fluorescence bioimaging does not require a specific bond with the target substance, there are advantages that there is no waiting time until the fluorescence intensity stabilizes and the influence on the target substance is minimized. ..
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 disclose an integrated fluorescent dye characterized by accumulating in phospholipids forming a cell membrane.
  • Phospholipids form the surface of various biological substances such as cells, liposomes, and extracellular vesicles.
  • DDS drug delivery systems
  • Exosome imaging described in Non-Patent Document 1.
  • the fluorescent dyes disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2 are used for such in vitro and in vivo imaging, the fluorescence intensity is said to be low. There was a challenge.
  • the embodiment of the present invention is a fluorescent dye having excellent accumulation in phospholipids and exhibiting high fluorescence intensity, particularly in vivo and in vivo.
  • a fluorescent dye having a fluorescence intensity suitable for a fluorescent labeling agent used for imaging is provided.
  • the present inventors have found an excellent fluorescent dye and completed the present invention. That is, the embodiment of the present invention relates to the following. However, the present invention is not limited to the following embodiments, and includes various embodiments.
  • One embodiment relates to a fluorescent labeling agent containing a fluorescent dye represented by the following general formula (1).
  • Q represents a residue of the fluorescent dye.
  • Z represents a direct bond, substituted or unsubstituted alkylene group, or substituted or unsubstituted arylene group.
  • R 2 consists of one group selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkylene group, a substituted or unsubstituted arylene group, and a substituted or unsubstituted heterocyclic group, or a combination thereof. Represents a group.
  • R 4 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted alkoxy group, a substituted or unsubstituted aryloxy group, or a substituted or unsubstituted.
  • R 5 and R 6 independently represent a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, respectively.
  • R 7 to R 11 independently represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted aryl group, respectively.
  • M 1 , M 2 , M 3 and M 4 each independently represent a hydrogen atom or a monovalent cation.
  • the fluorescent labeling agent is preferably a phospholipid-accumulating fluorescent labeling agent.
  • the fluorescent dye preferably contains a phthalocyanine dye represented by the following general formula (2).
  • X 1 to X 16 are independently each of -Z-R 1- R 2- R 3 , hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or unsubstituted.
  • A represents a Group 16 element.
  • B represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • M 5 and M 6 each independently represent a monovalent cation.
  • adjacent substituents may be linked to each other to form a ring.
  • X 18 and X 19 are independently hydrogen atom, hydroxyl group, substituted or unsubstituted alkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or unsubstituted alkoxy group, substituted or unsubstituted aryloxy, respectively.
  • X 20 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • X 21 represents a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • X 22 to X 24 independently represent a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • Y represents a divalent to pentavalent metal atom, and k is an integer. When Y is a divalent metal atom, k is 0, when Y is a trivalent metal atom, k is 1, and when Y is a tetravalent or pentavalent metal atom, k is. It is 2. However, in the above, at least one of X 1 to X 17 is -Z-R 1- R 2- R 3 .
  • the fluorescent labeling agent preferably contains a fluorescent dye in which X 17 of the general formula (2) is -Z-R 1- R 2- R 3.
  • X 1 to X 16 are independently each of -Z-R 1- R 2- R 3 , hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or unsubstituted.
  • A represents a Group 16 element.
  • B represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • M 5 and M 6 each independently represent a monovalent cation.
  • adjacent substituents may be linked to each other to form a ring.
  • X 18 and X 19 are independently hydrogen atom, hydroxyl group, substituted or unsubstituted alkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or unsubstituted alkoxy group, substituted or unsubstituted aryloxy, respectively.
  • X 20 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • X 21 represents a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • X 22 to X 24 independently represent a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • Y represents a divalent to pentavalent metal atom, and k is an integer. When Y is a divalent metal atom, k is 0, when Y is a trivalent metal atom, k is 1, and when Y is a tetravalent or pentavalent metal atom, k is. It is 2. However, in the above, at least one of X 1 to X 17 is -Z-R 1- R 2- R 3 and is as follows.
  • Z represents a direct bond, substituted or unsubstituted alkylene group, or substituted or unsubstituted arylene group.
  • R 2 consists of one group selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkylene group, a substituted or unsubstituted arylene group, and a substituted or unsubstituted heterocyclic group, or a combination thereof.
  • R 4 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted alkoxy group, a substituted or unsubstituted aryloxy group, or a substituted or unsubstituted.
  • R 5 and R 6 independently represent a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, respectively.
  • R 7 to R 11 independently represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted aryl group, respectively.
  • M 1 , M 2 , M 3 and M 4 each independently represent a hydrogen atom or a monovalent cation.
  • fluorescence suitable for a fluorescent labeling agent used for in vitro and in vivo imaging by introducing a functional group having high accumulation in phospholipids. It has become possible to provide a strong fluorescent dye.
  • FIG. 1 is a graph showing the evaluation results of the fluorescence intensities of the fluorescent labeling agents 1, 15, 19, 24, 25, 68, and 75.
  • FIG. 2 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 1.
  • FIG. 3 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 15.
  • FIG. 4 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 19.
  • FIG. 5 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 24.
  • FIG. 6 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 25.
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 68.
  • FIG. 8 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 75.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 42.
  • FIG. 10 is a fluorescence micrograph of cells labeled with the fluorescent labeling agent 53.
  • the fluorescent labeling agent according to an embodiment of the present invention contains a compound represented by the following general formula (1).
  • the compound represented by the following general formula (1) is a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye is a dye that fluoresces when irradiated with light in the ultraviolet region to the near infrared region (for example, light having a wavelength of 560 to 900 nm), and may be a known compound.
  • the fluorescent dye is not particularly limited, but for example, fluorescein, rhodamine, coumarin, cyanine, phthalocyanine, diketopyrrolopyrrole, borondipyrromethene (BODIPY), xanthene, pyrene, merocyanine, etc.
  • the compound (fluorescent dye) represented by the general formula (1) may have, for example, the skeleton of the above-exemplified dye as the residue Q of the fluorescent dye. That is, the compound represented by the general formula (1) has at least one substituent (functional group) represented by -Z-R 1- R 2- R 3 with respect to the skeleton of the above-exemplified dye. It may be a compound having an introduced structure.
  • the fluorescent dye is preferably phthalocyanines from the viewpoint of stability and fluorescence wavelength.
  • the compound (phthalocyanine dye) represented by the following general formula (2) can be preferably used as the fluorescent dye.
  • the fluorescent dye constituting the fluorescent labeling agent contains a compound represented by the following general formula (2), it is possible to easily obtain a fluorescent labeling agent having excellent durability derived from the skeleton of the phthalocyanine dye. can.
  • the skeleton of the phthalocyanine pigment it is possible to easily obtain light emission at a wavelength (for example, 650 to 900 nm) suitable for bioimaging in in vitro and in vivo.
  • "-Z-R 1- R 2- R 3 " is a substituent having a hydrophilic group, and the phospholipid is subjected to an electrostatic interaction with the hydrophilic group to deal with the phospholipid.
  • the accumulation of fluorescent dyes can be enhanced.
  • the specific configuration of the above-mentioned substituent is as follows.
  • Z represents a directly bonded, substituted or unsubstituted alkylene group, or a substituted or unsubstituted arylene group. In one embodiment, Z is preferably a direct bond.
  • R 2 consists of one group selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted alkylene group, a substituted or unsubstituted arylene group, and a substituted or unsubstituted heterocyclic group, or a combination thereof. Represents a group.
  • R 2 is preferably a substituted or unsubstituted alkylene group, or a substituted or unsubstituted arylene group, or more preferably a substituted or unsubstituted alkylene group.
  • R 2 is preferably an alkylene group.
  • the main chain of the alkylene group preferably has 1 to 10 carbon atoms.
  • R 4 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted alkoxy group, a substituted or unsubstituted aryloxy group, or a substituted or unsubstituted. Represents a substituted heterocyclic group.
  • R 4 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, preferably a substituted or unsubstituted alkyl group, or an unsubstituted aryl group.
  • R 5 and R 6 independently represent a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, respectively.
  • R 5 and R 6 are preferably substituted or unsubstituted alkyl groups or unsubstituted aryl groups, respectively.
  • the alkyl group is more preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • R 7 to R 11 independently represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted aryl group, respectively.
  • R 7 to R 11 are preferably hydrogen atoms or substituted or unsubstituted alkyl groups, respectively.
  • the alkyl group is more preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • M 1 , M 2 , M 3 and M 4 each independently represent a hydrogen atom or a monovalent cation.
  • the monovalent cation include alkali metals and quaternary amines.
  • the alkali metal include lithium, sodium, potassium, rubidium, cesium and the like.
  • M 1 , M 2 , M 3 and M 4 are each preferably a hydrogen atom.
  • X 1 to X 16 are independently hydrogen atoms or -Z-R 1- R 2- R 3 , substituted or unsubstituted alkyl groups, substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted cyclos, respectively.
  • M 5 and M 6 each independently represent a monovalent cation.
  • the monovalent cation include alkali metals and quaternary amines.
  • alkali metal include lithium, sodium, potassium, rubidium, cesium and the like.
  • At least one, preferably four or more of X 1 to X 16 is preferably the above-mentioned substituent.
  • the substituents on the dye skeleton are preferably substituted or unsubstituted alkyl groups, substituted or unsubstituted aryl groups, or -AB, respectively.
  • A represents a Group 16 element.
  • the Group 16 element include oxygen, sulfur, selenium, tellurium and the like.
  • A is preferably oxygen, sulfur, or selenium.
  • Oxygen or sulfur is more preferable from the viewpoint of ease of synthesis and stability. Oxygen is more preferred in terms of fluorescence intensity.
  • B represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group, respectively, as described above. Is.
  • B is preferably a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted aryl group. Therefore, in one embodiment, -AB is preferably -OR, -OAr, -SR, or -SAr. Here, R represents an alkyl group and Ar represents an aryl group. Twice
  • Y represents a divalent to pentavalent metal atom, and k is an integer.
  • k is 0, when Y is a trivalent metal atom, k is 1, and when Y is a tetravalent or pentavalent metal atom, k is. It is 2.
  • the divalent metal atom include Mg, Cu, Zn and the like.
  • the trivalent metal atom include Al, Ga, In and the like.
  • Examples of the tetravalent metal atom include Si, Mn, Sn, Cr, Zr and the like.
  • the pentavalent metal atom include P and the like. From the viewpoint of fluorescence intensity, Y is preferably Al, Si, or P, and Al is more preferable. From the viewpoint of light resistance, Y is preferably Al or Si.
  • X 1 to X 16 may have adjacent substituents linked to each other to form a ring.
  • the structure of the ring may be any of cycloalkyl, cycloalkene, aryl, and heteroaryl, and forms a fused ring with the aromatic ring in the phthalocyanine skeleton.
  • the structure of the ring may further have a substituent or may be unsubstituted.
  • the number of carbon atoms forming the ring structure may be 2 to 30, preferably in the range of 4 to 6.
  • the ring is preferably a 5-membered ring or a 6-membered ring. In one embodiment, it is preferred that adjacent substituents are linked to each other to form a phenylene group.
  • naphthalene structure binds to the aromatic ring in the phthalocyanine skeleton to form a naphthalene structure.
  • adjacent substituents may be linked to each other to form a ring containing a nitrogen atom.
  • it binds to an aromatic ring in the phthalocyanine skeleton to form, for example, an imidazole structure.
  • the ring structure such as the naphthalene structure or the imidazole structure may further have a substituent such as an alkyl group or an aryl group.
  • X 17 is preferably -Z-R 1- R 2- R 3 or a hydroxyl group. Z, R 1 , R 2 , and R 3 are as described above.
  • X 18 and X 19 are independently hydrogen atom, hydroxyl group, substituted or unsubstituted alkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or unsubstituted alkoxy group, substituted or unsubstituted aryloxy, respectively.
  • X 20 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • X 21 represents a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • X 22 to X 24 independently represent a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic group.
  • the alkyl groups in R 4 to R 11 and X 1 to X 24 are independently selected.
  • the alkyl group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the alkyl group include a linear or branched alkyl group. Specific examples include methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl group, hexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, dodecyl group, octadecyl group, isopropyl group, isobutyl group and isopentyl group.
  • Examples thereof include 2-ethylhexyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, sec-pentyl group, tert-pentyl group, tert-octyl group, neopentyl group and the like.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is preferably in the range of 1 to 30.
  • the carbon number is more preferably in the range of 1 to 20, and further preferably in the range of 1 to 10.
  • substituent in the above alkyl group examples include halogen atoms such as fluorine, chlorine and bromine, hydroxyl groups, amino groups, nitro groups, formyl groups, cyano groups, carboxyl groups and the like, as well as the above-mentioned alkyl groups, aryl groups and cyclos described later. Examples thereof include an alkyl group and a heterocyclic group.
  • a part of the structure is replaced with an amide bond (-NHCO-), an ester bond (-COO-), an ether bond (-O-), a urea bond (-NHCONH-), or a urethane bond (-NHCOO-). If so, the substituent is also considered as a "substituent".
  • the substituted alkyl group means an alkyl group substituted with the above-mentioned substituent.
  • the substituted alkyl group may be an alkyl group substituted with one or more substituents.
  • specific examples of the alkyl group substituted with the halogen atom include a trifluoromethyl group, a 2,2,2-trifluoroethyl group,-(CF 2 ) 4 CF 3 ,-(CF 2 ) 5 CF 3 , and so on.
  • -(CF 2 ) 6 CF 3 ,-(CF 2 ) 7 CF 3 ,-(CF 2 ) 8 CF 3 trichloromethyl group, 2,2-dibromoethyl group and the like can be mentioned.
  • alkyl group substituted with an amide bond -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NHCO -CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH (-CH 3) -CH 2 -NHCO-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NHCO-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NHCO-CH 2 -CH (CH 2 -CH 3) -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3, - (CH 2) 5 -NHCO- (CH 2) 11 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -C (-NHCO-CH 2 -CH 3) 3rd grade can be mentioned.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group substituted with the amide bond is preferably in the range of 2 to 30.
  • the carbon number is more preferably in the range of 2 to 10, and even more preferably in the range of 2 to 5.
  • alkyl group substituted by an ester bond -CH 2 -CH 2 -CH 2 -COO -CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH (-CH 3) -CH 2 -COO-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -OCO-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -COO-CH 2 -CH (CH 2 -CH 3) -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3, - (CH 2) 5 -COO- (CH 2) 11 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH- (COO-CH 2 -CH 3) 2nd grade can be mentioned.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group substituted with the ester bond is preferably in the range of 2 to 30.
  • the carbon number is more preferably in the range of 2 to 10, and even more preferably in the range of 2 to 5.
  • alkyl group substituted with an ether bond -CH 2 -O-CH 3, -CH 2 -CH 2 -O-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -O- CH 2- CH 3 ,-(CH 2- CH 2- O) n- CH 3 (where n is an integer from 1 to 8),-(CH 2- CH 2- CH 2- O) m- CH 3 (where m is an integer from 1 5), - CH 2 -CH (CH 3) -O-CH 2 -CH 3 -, - CH 2 -CH- (OCH 3) be exemplified 2 like Yes, but not limited to these.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group substituted with the ether bond is preferably in the range of 2 to 30.
  • the carbon number is more preferably in the range of 2 to 10, and even more preferably in the range of 2 to 5.
  • alkyl group substituted with a urea bond is, -CH 2 -NHCONH-CH 3, -CH 2 -CH 2 -NHCONH-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 - CH 2 -NHCONH-CH 2 -CH 3 , - (CH 2 -CH 2 -NHCONH) n -CH 3 ( here n is an integer from 1 to 8), - (CH 2 -CH 2 -CH 2 - NHCONH) m -CH 3 (wherein m is an integer from 1 5), - CH 2 -CH (CH 3) -NHCONH-CH 2 -CH 3 -, - CH 2 -CH- (NHCONHCH 3) 2 Etc., but are not limited to these.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group substituted with the ether bond is preferably in the range of 2 to 30. The carbon number is more preferably in the range of 2 to 10, and even
  • alkyl group substituted with a urethane bond -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NHCOO -CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH (-CH 3) -CH 2 -NHCOO-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NHCOO-CH 2 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NHCOO-CH 2 -CH (CH 2 -CH 3) -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 - (CH 2) 5 -NHCOO- (CH 2) 11 -CH 3, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH- (NHCOO-CH 2 -CH 3) 2nd grade can be mentioned.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group substituted with the ester bond is preferably in the range of 2 to 30.
  • the carbon number is more preferably in the range of 2 to 10, and even more preferably in the range
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is preferably in the range of 3 to 30.
  • the carbon number is more preferably in the range of 3 to 10, and even more preferably in the range of 3 to 5.
  • the aryl groups in R 4 to R 11 and X 1 to X 24 are independently selected.
  • the aryl group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the aryl group include a monocyclic or condensed polycyclic aryl group.
  • the aryl group preferably has 6 to 18 carbon atoms.
  • the carbon number is more preferably in the range of 6 to 10.
  • the substituent of the substituted aryl group may be the same as the substituent exemplified as the substituent in the above alkyl group.
  • the cycloalkyl groups in X 1 to X 16 are independently selected.
  • the cycloalkyl group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the cycloalkyl group include a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a 2,5-dimethylcyclopentyl group, a 4-tert-butylcyclohexyl group and the like.
  • the number of carbon atoms of the cycloalkyl group is preferably in the range of 3 to 12.
  • the carbon number is more preferably in the range of 3 to 6.
  • the substituent of the substituted cycloalkyl group may be the same as the substituent exemplified as the substituent in the above alkyl group.
  • the alkenyl groups in X 1 to X 16 are independently selected.
  • the alkenyl group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the alkenyl group include a linear or branched alkenyl group.
  • An alkenyl group generally refers to a group having one double bond in its structure, but as used herein, an alkenyl group may have a plurality of double bonds in its structure.
  • alkenyl group examples include a vinyl group, a 1-propenyl group, an allyl group, a 2-butenyl group, a 3-butenyl group, an isopropenyl group, an isobutenyl group, a 1-pentenyl group, a 2-pentenyl group and a 3-pentenyl group.
  • the carbon number of the alkenyl group is preferably in the range of 2 to 18.
  • the number of carbon atoms is more preferably 2 to 10, and even more preferably 2 to 5.
  • the substituent of the substituted alkenyl group may be the same as the substituent exemplified as the substituent in the above alkyl group.
  • the heterocyclic groups in R 2 , R 4 to R 11 , and X 1 to X 24 are independently selected.
  • the heterocyclic group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the heterocyclic group include an aliphatic heterocyclic group and an aromatic heterocyclic group. Specific examples include a pyridyl group, a pyrazil group, a piperidino group, a pyranyl group, a morpholino group, an acridinyl group and the like.
  • a group represented by the following structural formula can also be mentioned.
  • the number of carbon atoms of the heterocyclic group (the number of carbon atoms constituting the ring) is preferably 4 to 12.
  • the number of ring members is preferably 5 to 13.
  • the substituent of the substituted heterocyclic group may be the same as the substituent exemplified as the substituent in the above alkyl group.
  • Examples of the substituted heterocyclic group include a heterocyclic group 3-methylpyridyl group, an N-methylpiperidyl group, an N-methylpyrrolyl group and the like.
  • Alkoxy group in the above R 4, X 18, and X 19 are each independently selected.
  • the alkoxy group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the alkoxy group include a linear or branched-chain alkoxyl group. Specific examples include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, tert-butoxy group, neopentyloxy group, 2,3-dimethyl-3-pentyloxy group, n-. Examples thereof include a hexyloxy group, an n-octyloxy group, a stearyloxy group, a 2-ethylhexyloxy group and the like.
  • the number of carbon atoms of the alkoxyl group is preferably in the range of 1 to 6.
  • the substituent of the substituted alkoxyl group may be the same as the substituent exemplified as the substituent in the above
  • the substituent of the substituted alkoxy group may be the same as the substituent exemplified as the substituent in the above alkyl group.
  • Specific examples of the substituted alkoxy group include trichloromethoxy group, trifluoromethoxy group, 2,2,2-trifluoroethoxy group, 2,2,3,3-tetrafluoropropoxy group and 2,2-bis (trifluoro).
  • Methyl) propoxy group, 2-ethoxyethoxy group, 2-butoxyethoxy group, 2-nitropropoxy group, benzyloxy group and the like can be mentioned.
  • Aryloxy group represented by R 4, X 18, and X 19 are each independently selected.
  • the aryloxy group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the aryloxy group include a monocyclic or condensed polycyclic aryloxy group. Specific examples include a phenoxy group, a p-methylphenoxy group, a naphthyloxy group, an anthryloxy group and the like.
  • the aryloxy group is preferably a monocyclic aryloxy group. Further, an aryloxy group having 6 to 12 carbon atoms is preferable.
  • the substituent of the substituted aryloxy group may be the same as the substituent exemplified as the substituent in the above aryl group.
  • Examples of the substituted aryloxy group include a p-nitrophenoxy group, a p-methoxyphenoxy group, a 2,4-dichlorophenoxy group, a pentafluorophenoxy group, a 2-methyl-4-chlorophenoxy group and the like.
  • the alkylene groups in Z and R 2 are independently selected.
  • the alkylene group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the alkylene group include a divalent group obtained by removing one hydrogen atom from the above alkyl group.
  • Specific examples of the substituted or unsubstituted alkylene group -CH 2 -CH 2 -, - CH 2 -CH 2 -CH 2 -NHCO-CH 2 -CH 2 -, - CH 2 -CH 2 -CH 2 - OCO-CH 2 -CH 2 -, - CH 2 -CH 2 -CH 2 -O-CH 2 -CH 2 - and the like.
  • the arylene groups in Z and R 2 are independently selected.
  • the arylene group may have a substituent or may be unsubstituted.
  • Examples of the arylene group include a divalent group obtained by removing one hydrogen atom from an aryl group.
  • the arylene group preferably has 6 to 10 carbon atoms.
  • the arylene group may be a phenylene group or a naphthylene group.
  • Specific examples of the substituted or unsubstituted arylene group include a group represented by the following structural formula.
  • One embodiment of the present invention relates to a fluorescent labeling agent containing the above fluorescent dye.
  • This fluorescent labeling agent can be applied for fluorescent labeling in bioimaging in a wide range of fields from biochemical research to medical diagnosis. For example, it can be used for fluorescent labeling and the like in fields such as genetic diagnosis field, immunodiagnosis field, medical development field, regenerative medicine field, environmental test field, biotechnology field, and fluorescence test.
  • the structure (substituent) represented by -Z-R 1- R 2- R 3 in the fluorescent dye has a function of interacting with phospholipids. There is. Therefore, it can be suitably used as a phospholipid-accumulated fluorescent labeling agent.
  • Phospholipid-accumulating fluorescent labeling agents can be suitably used as fluorescent labeling agents in cell membrane staining, exosome tracking, liposome imaging for drug delivery systems (DDS), and the like.
  • the concentration of the fluorescent dye is not particularly limited.
  • the concentration of the fluorescent dye when handling cells, it is preferable that the concentration of the fluorescent dye is low in consideration of the influence on cell dysfunction, growth inhibition, and the like.
  • the concentration of the fluorescent dye for 10,000 cells / well cells seeded on a 96-well plate is preferably 100 ⁇ M or less.
  • the above concentration is more preferably 50 ⁇ M or less, and further preferably 10 ⁇ M or less.
  • due to its excellent accumulation in phospholipids even a low concentration fluorescent dye can be imaged with high fluorescence intensity. Therefore, even if the concentration is as low as 2 ⁇ M or less, more accurate detection can be performed.
  • the fluorescent labeling agent of the above embodiment may contain the fluorescent dye of the above embodiment, but may contain other components as needed.
  • Other components may be components well known in the art. For example, a solvent, an amphipathic substance, and the like can be mentioned.
  • the solvent may be water or an organic solvent, and water is more preferable. Considering the solubility of the fluorescent dye, water and an organic solvent may be mixed and used.
  • the organic solvent is preferably ethanol or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • Amphiphile is a general term for compounds that have a hydrophilic group and a hydrophobic group in one molecule. Specific examples include surfactants and phospholipids. As the amphipathic substance, only one kind may be used, or two or more kinds may be mixed and used. In the fluorescent labeling agent of the above embodiment, the amphipathic substance is not particularly limited, and any compound may be used as long as a water-insoluble fluorescent dye that fluoresces in the near infrared region can be solubilized in water. Specific examples of amphipathic substances that can be used are listed below, although not particularly limited.
  • surfactant examples include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and polymer surfactants.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as Tween (registered trademark) 20, Tween (registered trademark) 40, Tween (registered trademark) 60, and Tween (registered trademark) 80, and Cremophor.
  • Polyoxyethylene castor oil derivatives such as EL and Cremophor® RH60, 12-hydroxystearic acid-polyethylene glycol copolymers such as Solutol® HS15, and Triton® X- 100 and octylphenol ethoxylates such as Triton® X-114 and the like can be mentioned.
  • cationic surfactant examples include alkyltrimethylammonium salts such as stearyltrimethylammonium chloride and lauryltrimethylammonium chloride, alkylpyridinium salts such as cetylpyridinium chloride, distearyldimethylammonium chloride, dialkyldimethylammonium salt, and polychloride (poly).
  • alkyltrimethylammonium salts such as stearyltrimethylammonium chloride and lauryltrimethylammonium chloride
  • alkylpyridinium salts such as cetylpyridinium chloride, distearyldimethylammonium chloride, dialkyldimethylammonium salt
  • polychloride polychloride
  • anionic surfactant examples include sodium dodecyl sulfate, dodecylbenzene sulfonate, decylbenzene sulfonate, undecylbenzene sulfonate, tridecylbenzene sulfonate, and nonylbenzene sulfonate, and sodium, potassium and ammonium salts thereof. ..
  • polymer surfactant examples include polyvinyl alcohol, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyethylene glycol-polyalkyl, polyethylene glycol-polylactic acid, polyethylene glycol-polycaprolactone, polyethylene glycol-polyglycolic acid, and polyethylene glycol-poly.
  • Block copolymers such as (lactide-glycolide) can be mentioned.
  • the fluorescent labeling agent of the above embodiment may contain one or more of the above-exemplified compounds as amphipathic substances.
  • the fluorescent labeling agent of the above embodiment since the fluorescent labeling agent of the above embodiment has excellent accumulation on a target site such as a phospholipid, it can be detected with high sensitivity without requiring an amphipathic substance.
  • the fluorescent dye preferably contains a phthalocyanine dye.
  • the method for synthesizing the phthalocyanine pigment is not particularly limited. For example, first, a dye having a phthalocyanine skeleton (phthalocyanine metal complex) is synthesized by a known method using a phthalonitrile derivative as a raw material. Next, a component having a substituent (-Z-R 1- R 2- R 3 ) is added to the above dye, and these are reacted in a dimethyl sulfoxide solvent with heating and stirring. By such a reaction, a desired fluorescent dye can be obtained.
  • the component having the above-mentioned substituent for example, an acidic compound or a compound shown as an axial ligand in the examples described later can be used.
  • phthalocyanine derivative As a raw material has an asymmetric structure, phthalocyanine is obtained as a mixture of isomers having different positions of substituents.
  • phthalocyanine structure is shown in the present specification, isomers having different positions of substituents are not excluded.
  • fluorescent dye according to the embodiment of the present invention include the following.
  • the fluorescent dye according to the present invention is not limited to these.
  • the fluorescent dyes 1 to 37 are fluorescent dyes each having a phthalocyanine dye skeleton (dye residue).
  • the fluorescent dye 38 is a fluorescent dye having a skeleton of a diketopyrrolopyrrole dye.
  • Fluorescent dyes 39 and 40 are fluorescent dyes having a skeleton of a xanthene dye.
  • the fluorescent dye 41 is a fluorescent dye having a skeleton (dye residue) of a borondipyrromethene dye having the following structure.
  • the fluorescent dyes 42 to 59 are fluorescent dyes each having a skeleton of a phthalocyanine dye.
  • the fluorescent dye 60 is a fluorescent dye having a skeleton of a diketopyrrolopyrrole dye.
  • the fluorescent dye 61 is a fluorescent dye having a skeleton of a xanthene dye.
  • the fluorescent dye 62 is a fluorescent dye having a skeleton of a cyanine dye.
  • the fluorescent dye 63 is a fluorescent dye having a skeleton of a boron dipyrromethene dye.
  • the fluorescent labeling agent preferably contains a fluorescent dye having a phthalocyanine dye skeleton from the viewpoint of stability such as durability.
  • Mass spectrometry Analysis was performed by a mass spectrometer (TOF-MS: autoflexII manufactured by Bruker Daltonics Co., Ltd.).
  • Table 2 is the same as in the production of compound A-1, except that the 3-ethoxyphthalonitrile and anhydrous aluminum chloride used in the method for producing compound A-1 were changed to the phthalonitrile derivatives and metal sources shown in Table 2.
  • Compounds A-2 to A-10 shown in the above were produced, respectively.
  • the phthalonitrile derivative and the metal source were used in the same molar amount as 3-ethoxyphthalonitrile and anhydrous aluminum chloride in the production of compound A-1.
  • Phthalocyanines C-2 to C-4 shown in Table 4 were prepared in the same manner as in the production of Compound C-1, except that the anhydrous aluminum chloride used in the method for producing Compound C-1 was changed to the metal source shown in Table 4. Each was manufactured. The metal source used was the same molar amount as anhydrous aluminum chloride in the production of compound C-1.
  • Example 19 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 19> 0.5 part of fluorescent dye 1, 0.8 part of methyl iodide, and 0.8 part of potassium carbonate were dissolved in 50 parts of tetrahydrofuran, and this solution was reacted at 25 ° C. for 5 hours. After removing tetrahydrofuran from the reaction solution using an evaporator, 20 parts of tetrahydrofuran and 60 parts of water were added. Next, the precipitated solid was collected by filtration, and the solid was washed with 60 parts of water. The washed solid was dried at 80 ° C. to obtain 0.21 parts of the fluorescent dye 19 shown in Table 1 (yield 33.3%).
  • Example 20 to 23 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dyes 20 to 23>
  • the fluorescent dyes shown in Table 1 were obtained in the same manner as in the production of the fluorescent dye 19 except that the methyl iodide and the fluorescent dye 1 used in the method for producing the fluorescent dye 19 were changed to the iodide compounds and amines shown in Table 8. 20 to 23 were produced respectively.
  • the iodide compound and amines were used in the same molar amount as the methyl iodide and the fluorescent dye 1 in the production of the fluorescent dye 19.
  • the structures of the obtained fluorescent dyes 20 to 23 were identified by mass spectrometry, and it was confirmed that they had the structures shown in Table 1.
  • Table 11 shows the analysis results of the mass spectrum.
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • the obtained purified product was dried at 80 ° C. to obtain 0.72 parts of the fluorescent dye 31 shown in Table 1 (yield 60.1%).
  • Example 38 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 38> 1.0 part of PigmentRED255 (manufactured by Tokyo Kasei), which is a diketopyrrolopyrrole dye, 0.6 part of 4-bromobutyric acid, and 0.1 part of sodium hydride (60%), N, N-dimethyl. It was dissolved in 50 parts of formamide and the solution was reacted at 90 ° C. for 4 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, 100 parts of water was added. Next, the precipitated solid was collected by filtration, and the solid was washed with 50 parts of water. The washed solid (crude product) was purified using a medium pressure preparative liquid chromatograph (Smart Flash AKROS manufactured by Yamazen Corporation).
  • a medium pressure preparative liquid chromatograph Smart Flash AKROS manufactured by Yamazen Corporation.
  • the obtained purified product was dried at 80 ° C. to obtain 0.70 parts of the fluorescent dye 38 shown in Table 1 (yield 53.9%).
  • Example 39 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 39> 1.0 part of 5-carboxyfluorescein (manufactured by Tokyo Kasei), 0.3 part of N, N-dimethyl-1,3-propanediamine and 0.1 part of paratoluenesulfonic acid are dissolved in 50 parts of xylene. , This solution was reacted at 140 ° C. for 24 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, xylene was removed from the reaction solution using an evaporator, and 50 parts of petroleum ether was added. Then, after removing the insoluble matter by suction filtration, petroleum ether was removed using an evaporator to obtain a solid. The solid was dried at 80 ° C.
  • Example 40 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 40> 1.0 part of RhodaminB (manufactured by Tokyo Kasei), 0.2 part of N, N-dimethyl-1,3-propanediamine and 0.1 part of paratoluenesulfonic acid are dissolved in 50 parts of xylene, and this solution is used. Was reacted at 140 ° C. for 24 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, xylene was removed from the reaction solution using an evaporator, and 50 parts of petroleum ether was added. Then, after removing the insoluble matter by suction filtration, petroleum ether was removed using an evaporator to obtain a solid. This solid was dried at 80 ° C.
  • Example 41 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 41> 1.0 part of BDP FL (manufactured by Tokyo Kasei), which is a BODIPY dye, and 0.3 part of N, N-dimethyl-1,3-propanediamine were dissolved in 50 parts of xylene, and this solution was dissolved at 140 ° C. It was allowed to react for 24 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, xylene was removed from the reaction solution using an evaporator, and 50 parts of petroleum ether was added. Then, after removing the insoluble matter by suction filtration, petroleum ether was removed using an evaporator to obtain a solid. This solid was dried at 80 ° C.
  • BDP FL manufactured by Tokyo Kasei
  • Table 12 shows the same as in the production of compound A-11, except that the 3,6-bis (phenylthio) phthalonitrile used in the method for producing compound A-11 was changed to the phthalonitrile derivative shown in Table 12.
  • Compounds A-12 and A-13 were produced, respectively.
  • the phthalonitrile derivative was used in the same molar amount as 3,6-bis (phenylthio) phthalonitrile in the production of compound A-11.
  • Example 43-55 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 43-55> The same as in the production of the fluorescent dye 6, except that the compounds A-1 and 1,2-ethylenediphosphonic acid used in the method for producing the fluorescent dye 1 were changed to the compound A and the axial ligand shown in Table 13.
  • the fluorescent dyes 2 to 14 shown in Table 1 were produced, respectively.
  • the compound A and the axial ligand were used in the same molar amount as the compounds A-1 and 1,2-ethylenediphosphonic acid in the production of the fluorescent dye 1.
  • the structures of the obtained fluorescent dyes 2 to 14 were identified by analysis using a mass spectrometer, and it was confirmed that they had the structures shown in Table 1. Table 3 shows the analysis results of the mass spectrum.
  • Example 59 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 59> Similar to the production of the fluorescent dye 58, except that the compounds C-3 and 1,2-hexylene diphosphonic acid used in the method for producing the fluorescent dye 58 were changed to the compound C-4 and the ring substituent shown in Table 16.
  • the fluorescent dye 59 shown in Table 1 was produced.
  • the compound C-4 was used in the same molar amount as the compound C-3 in the production of the fluorescent dye 17.
  • the structure of the obtained fluorescent dye 59 was identified by analysis using a mass spectrometer, and it was confirmed that the fluorescent dye 59 had the structure shown in Table 1. Table 16 shows the analysis results of the mass spectrum.
  • Example 60 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 60> PigmentRED255 (Tokyo Kasei), which is a diketopyrrolopyrrole dye, 1.0 part, 3-aminopropylphosphonic acid 0.6 part, and sodium hydride (60% dispersion) 0.1 part N, N- It was dissolved in 50 parts of dimethylformamide and the solution was reacted at 90 ° C. for 4 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, 100 parts of water was added. Next, the precipitated solid was collected by filtration, and the solid was washed with 50 parts of water. The washed solid (crude product) was purified using a medium pressure preparative liquid chromatograph (Smart Flash AKROS manufactured by Yamazen Corporation).
  • the obtained purified product was dried at 80 ° C. to obtain 0.65 parts of the fluorescent dye 60 shown in Table 1 (yield 45.5%).
  • Example 61 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 61> 1.0 part of 5-carboxyfluorescein (Tokyo Kasei), 0.7 part of 3-aminopropylphosphonic acid and 0.1 part of paratoluenesulfonic acid were dissolved in 50 parts of xylene, and this solution was dissolved at 140 ° C. It was allowed to react for 24 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, xylene was removed from the reaction solution using an evaporator, and 50 parts of petroleum ether was added. Then, after removing the insoluble matter by suction filtration, petroleum ether was removed using an evaporator to obtain a solid. This solid was dried at 80 ° C.
  • Example 63 ⁇ Manufacturing method of fluorescent dye 63> 1.0 part of BDP FL (manufactured by Tokyo Kasei), which is a BODIPY dye, and 0.3 part of 3-aminopropanol were dissolved in 50 parts of xylene, and this solution was reacted at 140 ° C. for 24 hours. After cooling the reaction solution to room temperature, xylene was removed from the reaction solution using an evaporator, and 50 parts of petroleum ether was added. Then, after removing the precipitated insoluble matter by suction filtration, petroleum ether was removed from the reaction solution using an evaporator to obtain a solid. This solid was dried at 80 ° C.
  • BDP FL manufactured by Tokyo Kasei
  • 3-aminopropanol 3-aminopropanol
  • Comparative compounds 3 to 11 shown in Table 17 were produced in Comparative Examples 3 to 11 described later.
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • Comparative Example 12 As the comparative compound 12, XenoLight DIR (manufactured by Sumisho Pharma Co., Ltd.), which is a cyanine pigment, was used. This compound corresponds to a conventional fluorescent labeling agent having a long chain alkylene group and accumulates in a phospholipid via a hydrophobic interaction.
  • Dye solutions 2 to 63 were prepared in the same manner as in the preparation of the dye solution 1 except that the fluorescent dye 1 and dimethyl sulfoxide used in the preparation of the dye solution 1 were changed to the fluorescent dye and the solvent shown in Table 20. However, each fluorescent dye was used in the same molar amount as the fluorescent dye 1, and the solvent was used in the same volume as dimethyl sulfoxide.
  • Dye solutions 64 to 76 were prepared in the same manner as in the preparation of the dye solution 1 except that the fluorescent dye 1 and dimethyl sulfoxide used in the preparation of the dye solution 1 were changed to the fluorescent dye and the solvent shown in Table 20. However, each fluorescent dye was used in the same molar amount as the fluorescent dye 1, and the solvent was used in the same volume as dimethyl sulfoxide.
  • fluorescent labeling agent 1 1.696 mg of fluorescent dye 1 was dissolved in 10 ml of dimethyl sulfoxide. After filtering through a nylon membrane filter having a pore size of 0.2 ⁇ m, the fluorescent labeling agent 1 of the fluorescent dye 1 was prepared by diluting 100 times with RPMI1640 medium.
  • fluorescent labeling agents 2 to 63 were used in the same manner as in the preparation of fluorescent labeling agent 1, except that the fluorescent dye 1 and dimethyl sulfoxide used in the preparation of the fluorescent labeling agent 1 were changed to the fluorescent dye and the solvent shown in Table 21. Prepared. However, each fluorescent dye was used in the same molar amount as the fluorescent dye 1, and the solvent was used in the same volume as dimethyl sulfoxide.
  • Fluorescent labeling agents 64 to 76 were used in the same manner as in the preparation of fluorescent labeling agent 1, except that the fluorescent dye 1 and dimethyl sulfoxide used in the preparation of the fluorescent labeling agent 1 were changed to the fluorescent dye and the solvent shown in Table 21. Prepared. However, each fluorescent dye was used in the same molar amount as the fluorescent dye 1, and the solvent was used in the same volume as dimethyl sulfoxide.
  • the medium was removed, and the fluorescent labeling agents prepared in Examples 83 to 123 and Comparative Examples 25 to 37 and RPMI1640 medium (DMSO medium solution) containing 1% dimethyl sulfoxide were added. These were allowed to stand in an incubator for 1 hour and then washed with RPMI 1640 medium. 10 ⁇ L of Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) was added to each well, and the mixture was allowed to stand in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 containing Air, humidified environment) for 1 hour. Then, the absorbance at 450 nm was measured using a plate reader (STARK, manufactured by TECAN).
  • a plate reader STARK, manufactured by TECAN
  • FIG. 1 shows the fluorescence intensity evaluation results of the fluorescent labeling agents 1, 15, 19, 24, 25, 68, and 75.
  • the fluorescent labeling agents 1, 15, 19, 24, and 25 according to the embodiment of the present invention have higher fluorescence intensities than the fluorescent labeling agents 68 and 75 (Comparative Examples) prepared using the comparative compound. It was confirmed that
  • Human epithelioid cancer cells A431 were seeded on 96-well plates (1 ⁇ 10 4 cell / well). The above A431 was cultured for 24 hours in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 containing Air, humidified environment) using RPMI1640 medium containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin. After the above culture, the medium was removed, the fluorescent labeling agents prepared in Examples 127 to 189 and Comparative Examples 25 to 37 were added, and the cells were allowed to stand in an incubator for 1 hour. It was then washed with RPMI 1640 medium.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the visibility evaluation results of the cells labeled with the fluorescent labeling agents 42 and 53 are shown in FIGS. 9 and 10 in order (magnification: 40 times, fluorescence uptake time: 1 second).
  • the fluorescent labeling agent according to the embodiment of the present invention has a specific substituent. It was observed that it showed higher fluorescence intensity due to its origin. As described above, it can be seen that the fluorescent labeling agent (Example) according to the embodiment of the present invention is excellent in cell accumulation as compared with the comparative compound, so that more excellent visibility can be obtained. From the above, it was clarified that the fluorescent labeling agent according to the embodiment of the present invention has excellent properties as a fluorescent labeling agent.

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Abstract

下記一般式（１）で表される蛍光色素を含む蛍光標識剤。　一般式（１）：　Ｑ－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３ （式中、Ｑは、蛍光色素の残基を表す。Ｚは、直接結合、アルキレン基、又はアリーレン基を表す。Ｒ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ４－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ５Ｒ６－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。Ｒ２は、アルキレン基、アリーレン基、及び複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。Ｒ３は、ＣＯＯＭ１、ＮＲ７Ｒ８、又はＮ＋Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１を表す。ここで、Ｒ４は、水素原子、水酸基、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、又は複素環基を表す。Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、又は複素環基を表す。Ｒ７～Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アリール基を表す。Ｍ１は、１価のカチオンを表す。）

Description

蛍光標識剤、及び蛍光色素
　本発明の実施形態は、蛍光標識剤、及び蛍光標識剤に用いられる蛍光色素に関する。
　バイオイメージングは、生体内のタンパク質、細胞、及び組織等を可視化する技術である。バイオイメージングは、例えば、生体内の分子及び細胞の機能の解明、並びに創薬の研究等といった生物学及び医学の研究領域で幅広く活用されている。
　なかでも、蛍光バイオイメージング法は、現象の動的な観察、多色観察、及び高感度観察が可能なイメージング法である。近年、蛍光バイオイメージング法は、非侵襲的に診断可能なイメージング法としても注目されており、患者への負担が少ない画像診断、及び手術中のリアルタイム診断など、臨床現場における応用が期待されている。
　蛍光バイオイメージング法は、標的物質と特異的に結合する結合型か、あるいは、標的部位に集積する集積型の蛍光色素を用いて標的を可視化する方法である。上記方法では、上記蛍光色素に紫外領域から近赤外領域の光を照射した際に発する蛍光を検出する。
　標的部位への集積を用いた集積型の蛍光バイオイメージングは、標的物質との特異的な結合を用いた結合型の蛍光バイオイメージングに比べて、標識方法が単純かつ迅速である。また、上記集積型の蛍光バイオイメージングは、標的物質との特異的な結合を必要としないため、蛍光強度が安定するまでの待機時間がない、標的物質に対する影響が最小限であるといった利点がある。
　特許文献１及び特許文献２では、細胞膜を形成しているリン脂質に集積することを特徴とした集積型の蛍光色素が開示されている。
　リン脂質は、細胞、リポソーム、及び細胞外小胞等といった様々な生体物質の表面を形成している。近年、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）のためのリポソームイメージング、及び非特許文献１に記載されたエクソソームイメージング等のように、リン脂質を有する微小物質のイメージングに注目が集まっている。このようなイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのイメージングを行うために、特許文献１及び特許文献２で開示されている蛍光色素を使用した場合、蛍光強度が低いといった課題があった。
特開２００９－５２４５８０号公報 特開２００８－２０９３６１号公報
Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　第２９巻、第２号、２０１４年３月２５日発行、ｐ．１１６－１２４
　上述の状況に鑑み、本発明の実施形態は、リン脂質への集積性に優れ、高い蛍光強度を示す蛍光色素であって、特にイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのイメージングに用いる蛍光標識剤に適した蛍光強度を有する、蛍光色素を提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、優れた蛍光色素を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の実施形態は以下に関する。但し、本発明は、以下の実施形態に限定されず、様々な実施形態を含む。
　一実施形態は、下記一般式（１）で表される蛍光色素を含む蛍光標識剤に関する。
　　　一般式（１）：　
 
　　　　　　Ｑ－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３

　式中、Ｑは、蛍光色素の残基を表す。
　Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
　Ｒ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ４－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ５Ｒ６－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
　Ｒ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び、置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
　Ｒ３は、ＣＯＯＭ１、ＮＲ７Ｒ８、Ｎ＋Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
　上記において、Ｒ４は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｒ７～Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、又は、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
　Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。
　一実施形態において、上記蛍光標識剤は、リン脂質集積型蛍光標識剤であることが好ましい。
　一実施形態において、上記蛍光色素は、下記一般式（２）で表されるフタロシアニン色素を含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　　
　式中、Ｘ１～Ｘ１６は、それぞれ独立に、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、置換もしくは無置換のアルケニル基、置換もしくは無置換の複素環基、－ＡＢ、－ＳＯ３Ｍ５、又は－ＣＯＯＭ６を表す。
　上記において、Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。Ｍ５及びＭ６は、それぞれ独立に、１価のカチオンを表す。　
　Ｘ１～Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
　Ｘ１７は、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水酸基、ハロゲン元素、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリールオキシ基、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、－ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、又は－ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。
　上記において、Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２０は、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２１は、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２２～Ｘ２４は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｙは、２価～５価の金属原子を表し、ｋは整数である。Ｙが２価の金属原子である場合のｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合のｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合のｋは２である。
　但し、上記において、Ｘ１～Ｘ１７の少なくとも１つは、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３である。
　一実施形態において、上記蛍光標識剤は、上記一般式（２）のＸ１７が－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３である蛍光色素を含むことが好ましい。
　一実施形態は、下記一般式（３）で表される化合物に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　　　
　式中、Ｘ１～Ｘ１６は、それぞれ独立に、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、置換もしくは無置換のアルケニル基、置換もしくは無置換の複素環基、－ＡＢ、－ＳＯ３Ｍ５、又は－ＣＯＯＭ６を表す。
　上記において、Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。Ｍ５及びＭ６は、それぞれ独立に、１価のカチオンを表す。
　Ｘ１～Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
　Ｘ１７は、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水酸基、ハロゲン元素、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリールオキシ基、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、－ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、又は－ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。
　上記において、Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２０は、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２１は、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２２～Ｘ２４は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｙは、２価～５価の金属原子を表し、ｋは整数である。Ｙが２価の金属原子である場合のｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合のｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合のｋは２である。
　但し、上記において、Ｘ１～Ｘ１７の少なくとも１つは、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３であり、以下のとおりである。
　Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
　Ｒ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ４－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ５Ｒ６－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
　Ｒ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び、置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
　Ｒ３は、ＣＯＯＭ１、ＮＲ７Ｒ８、Ｎ＋Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
　上記において、Ｒ４は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。Ｒ７～Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、又は、置換もしくは無置換のアリール基を表す。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。
　本願の開示は、２０２０年４月２日に出願された特願２０２０－０６６９２４号に記載の主題と関連しており、その全ての開示内容は引用によりここに援用される。　
　本発明の実施形態によれば、リン脂質への集積性が高い官能基の導入によって、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのイメージングに用いる蛍光標識剤に適した蛍光強度を有する蛍光色素を提供することが可能となった。
図１は、蛍光標識剤１、１５、１９、２４、２５、６８、７５の蛍光強度の評価結果を示すグラフである。 図２は、蛍光標識剤１で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図３は、蛍光標識剤１５で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図４は、蛍光標識剤１９で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図５は、蛍光標識剤２４で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図６は、蛍光標識剤２５で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図７は、蛍光標識剤６８で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図８は、蛍光標識剤７５で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図９は、蛍光標識剤４２で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図１０は、蛍光標識剤５３で標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。但し、本発明の実施形態は、以下の記載に限定されず様々な実施形態を含む。
　本発明の一実施形態である蛍光標識剤は、下記一般式（１）で表される化合物を含む。下記一般式（１）で表される化合物は、蛍光色素である。
　一般式（１）：

　　　　Ｑ－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３
 
　式中、Ｑは、蛍光色素の残基を表す。本明細書において蛍光色素とは、紫外領域から近赤外領域の光（例えば、波長５６０～９００ｎｍの光）を照射した際に蛍光を発する色素であり、公知の化合物であってよい。蛍光色素としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、シアニン類、フタロシアニン類、ジケトピロロピロール類、ボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）類、キサンテン類、ピレン類、メロシアニン類、ぺリレン類、アクリジン類、スチルベン類、ピロメテン類、アクリジン類、及びウンべリフェロン類等の色素が挙げられる。
　一実施形態において、上記一般式（１）で表される化合物（蛍光色素）は、蛍光色素の残基Ｑとして、例えば、上記例示の色素の骨格を有してよい。すなわち、上記一般式（１）で表される化合物は、上記例示の色素の骨格に対して、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３で表される置換基（官能基）が少なくとも１つ導入された構造を有する化合物であってよい。
　一実施形態において、蛍光色素は、安定性、及び蛍光波長の観点から、フタロシアニン類が好ましい。一実施形態において、下記一般式（２）で表される化合物（フタロシアニン色素）を蛍光色素として好適に使用することができる。但し、式中、Ｘ１～Ｘ１７の少なくとも１つは、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３で表される置換基であることを前提とする。
　上記蛍光標識剤を構成する蛍光色素が、下記一般式（２）で表される化合物を含む場合、フタロシアニン色素の骨格に由来して、優れた耐久性を有する蛍光標識剤を容易に得ることができる。また、フタロシアニン色素の骨格に由来して、イン・ビトロ及びイン・ビボでのバイオイメージングに適した波長（例えば、６５０～９００ｎｍ）での発光を容易に得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　　　
　上記実施形態の蛍光色素において、「－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３」は、親水基を有する置換基であり、リン脂質における親水基との静電的な相互作用によって、リン脂質に対する蛍光色素の集積性を高めることができる。上記置換基の具体的な構成は以下のとおりである。
　Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。一実施形態において、Ｚは、直接結合であることが好ましい。
　Ｒ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ４－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ５Ｒ６－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。一実施形態において、Ｒ１は、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ４－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、又は－ＯＳｉＲ５Ｒ６－であることが好ましい。
　Ｒ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び、置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。一実施形態において、Ｒ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基であることが好ましく、又は、置換もしくは無置換のアルキレン基であることがより好ましい。一実施形態において、Ｒ２は、アルキレン基であることが好ましい。アルキレン基の主鎖の炭素数は１～１０であることが好ましい。
　Ｒ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ７Ｒ８、又は－Ｎ＋Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１を表す。また、Ｒ３は、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。一実施形態において、Ｒ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ７Ｒ８、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４であることが好ましい。
　上記において、Ｒ４は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。一実施形態において、Ｒ４は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、又は無置換のアリール基であることが好ましい。
　Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。一実施形態において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、又は無置換のアリール基であることが好ましい。上記アルキル基は、炭素数１～５の直鎖又は分岐のアルキル基であることがより好ましい。
　Ｒ７～Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、又は、置換もしくは無置換のアリール基を表す。一実施形態において、Ｒ７～Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、又は置換もしくは無置換のアルキル基であることが好ましい。アルキル基は、炭素数１～５の直鎖又は分岐のアルキル基であることがより好ましい。
　Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。１価のカチオンとしては、例えば、アルカリ金属、及び４級アミン等が挙げられる。アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、及びセシウム等が挙げられる。一実施形態において、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ、水素原子であることが好ましい。
　Ｘ１～Ｘ１６は、それぞれ独立に、水素原子、又は、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、置換もしくは無置換のアルケニル基、置換もしくは無置換の複素環基、－ＡＢ、－ＳＯ３Ｍ５、－ＣＯＯＭ６からなる群から選択される置換基を表す。
　上記において、Ｍ５及びＭ６は、それぞれ独立に、１価のカチオンを表す。１価のカチオンとしては、例えば、アルカリ金属、及び４級アミン等が挙げられる。アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、及びセシウム等が挙げられる。
　一実施形態において、Ｘ１～Ｘ１６の少なくとも１つ、好ましくは４つ以上は、上記置換基であることが好ましい。一実施形態において、色素骨格に対する上記置換基は、それぞれ独立して、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は－ＡＢであることが好ましい。
　上記式－ＡＢにおいて、Ａは、第１６族元素を表す。第１６族元素としては、酸素、硫黄、セレン、及びテルル等が挙げられる。一実施形態において、Ａは、酸素、硫黄、又はセレンであることが好ましい。合成の容易さ、及び安定性の点から、酸素、又は硫黄がより好ましい。蛍光強度の点から、酸素がさらに好ましい。Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表し、それぞれ先に説明したとおりである。一実施形態において、Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、又は置換もしくは無置換のアリール基であることが好ましい。したがって、一実施形態において、－ＡＢは、－ＯＲ、－ＯＡｒ、－ＳＲ、又は－ＳＡｒであることが好ましい。ここで、Ｒはアルキル基を表し、Ａｒはアリール基を表す。　
　Ｙは、２価～５価の金属原子を表し、ｋは整数である。Ｙが２価の金属原子である場合のｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合のｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合のｋは２である。２価の金属原子としては、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｚｎ等が挙げられる。３価の金属原子としては、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ等が挙げられる。４価の金属原子としては、Ｓｉ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｃｒ、Ｚｒ等が挙げられる。５価の金属原子としては、Ｐ等が挙げられる。蛍光強度の観点からは、Ｙは、Ａｌ、Ｓｉ、又はＰであることが好ましく、Ａｌがより好ましい。耐光性の観点からは、Ｙは、Ａｌ、又はＳｉが好ましい。
　一実施形態において、Ｘ１～Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。上記環の構造は、シクロアルキル、シクロアルケン、アリール、ヘテロアリールのいずれであってもよく、フタロシアニン骨格における芳香環との縮合環を形成する。上記環の構造は、さらに置換基を有してもよく、非置換であってもよい。環の構造を形成する炭素数は、２～３０であってよく、４～６の範囲が好ましい。環は、５員環又は６員環であることが好ましい。
　一実施形態において、隣接する置換基同士が互いに連結してフェニレン基を形成することが好ましい。この場合、フタロシアニン骨格における芳香環と結合し、ナフタレン構造が形成される。他の実施形態において、隣接する置換基同士が互いに連結して窒素原子を含む環を形成してもよい。この場合、フタロシアニン骨格における芳香環と結合し、例えば、イミダゾール構造が形成される。上記ナフタレン構造又はイミダゾール構造などの環構造は、さらにアルキル基又はアリール基などの置換基を有してもよい。
　Ｘ１７は、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水酸基、ハロゲン元素、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリールオキシ基、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、－ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、－ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。一実施形態において、Ｘ１７は、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、又は水酸基であることが好ましい。Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、先に説明したとおりである。
　上記において、Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２０は、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２１は、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　Ｘ２２～Ｘ２４は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
　ここで、上記Ｒ４～Ｒ１１、及びＸ１～Ｘ２４におけるアルキル基は、それぞれ独立して選択される。アルキル基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
　アルキル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、２－エチルヘキシル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－オクチル基、及びネオペンチル基等を挙げることができる。アルキル基の炭素数は、１～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、１～２０の範囲がより好ましく、１～１０の範囲がさらに好ましい。　
　上記アルキル基における置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、カルボキシル基等の他、上述したアルキル基、後述するアリール基、シクロアルキル基、複素環基が挙げられる。また、構造の一部が、アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、エーテル結合（－Ｏ－）、ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）、又はウレタン結合（－ＮＨＣＯＯ－）で置換されている場合、その置換部分も「置換基」とみなす。
　したがって、置換アルキル基としては、上記の置換基で置換されたアルキル基を意味する。置換アルキル基は、一つ又は二つ以上の置換基で置換されたアルキル基であってもよい。例えば、ハロゲン原子で置換されたアルキル基の具体例としては、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、－（ＣＦ２）４ＣＦ３、－（ＣＦ２）５ＣＦ３、－（ＣＦ２）６ＣＦ３、－（ＣＦ２）７ＣＦ３、－（ＣＦ２）８ＣＦ３、トリクロロメチル基、２，２－ジブロモエチル基等を挙げることができる。
　アミド結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ（－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２）５－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）１１－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３）　３等を挙げることができる。アミド結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
　エステル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ（－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２）５－ＣＯＯ－（ＣＨ２）１１－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ－（ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３）　２等を挙げることができる。エステル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
　エーテル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３（ここでｎは１から８の整数である）、－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－ＣＨ３（ここでｍは１から５の整数である）、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３－、－ＣＨ２－ＣＨ－（ＯＣＨ３）２等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。エーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
　ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ）ｎ－ＣＨ３（ここでｎは１から８の整数である）、－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ）ｍ－ＣＨ３（ここでｍは１から５の整数である）、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ３－、－ＣＨ２－ＣＨ－（ＮＨＣＯＮＨＣＨ３）２等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。エーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
　ウレタン結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ（－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２）５－ＮＨＣＯＯ－（ＣＨ２）１１－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ－（ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３）　２等を挙げることができる。エステル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
　アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、およびエーテル結合（－Ｏ－）、ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）、ウレタン結合（－ＮＨＣＯＯ－）のうち２種以上の置換基で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ―ＣＨ２（ＯＣＯ－ＣＨ２）－ＣＨ２－を挙げることができる。アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、エーテル結合（－Ｏ－）、ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）、およびウレタン結合（－ＮＨＣＯＯ－）のうち２種以上の置換基で置換されたアルキル基の炭素数は、３～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、３～１０の範囲がより好ましく、３～５の範囲がさらに好ましい。
　上記Ｒ４～Ｒ１１、及びＸ１～Ｘ２４におけるアリール基は、それぞれ独立して選択される。アリール基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
　アリール基としては、単環、又は縮合多環のアリール基が挙げられる。例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、ｐ－ビフェニル基、ｍ－ビフェニル基、２－アントリル基、９－アントリル基、２－フェナントリル基、３－フェナントリル基、９－フェナントリル基、２－フルオレニル基、３－フルオレニル基、９－フルオレニル基、１－ピレニル基、２－ピレニル基、３－ペリレニル基、ｏ－トリル基、ｍ－トリル基、ｐ－トリル基、４－メチルビフェニル基、ターフェニル基、４－メチル－１－ナフチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチル－１－ナフチル基、４－ナフチル－１－ナフチル基、６－フェニル－２－ナフチル基、１０－フェニル－９－アントリル基、スピロフルオレニル基、２－ベンゾシクロブテニル基等が挙げられる。アリール基の炭素数は６～１８の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、６～１０の範囲がより好ましい。
　置換アリール基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
　Ｘ１～Ｘ１６におけるシクロアルキル基は、それぞれ独立して選択される。シクロアルキル基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロへキシル基、２，５－ジメチルシクロペンチル基、４－ｔｅｒｔ－プチルシクロヘキシル基等が挙げられる。また、シクロアルキル基の炭素数は３～１２の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は３～６の範囲内であることがより好ましい。置換シクロアルキル基の置換基は、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
　Ｘ１～Ｘ１６におけるアルケニル基は、それぞれ独立して選択される。アルケニル基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アルケニル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基が挙げられる。アルケニル基は、一般的に、その構造内に一つの二重結合を有する基を指すが、本明細書において、アルケニル基は、その構造内に複数の二重結合を有してもよい。アルケニル基の具体例としては、ビニル基、１－プロペニル基、アリル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、イソプロペニル基、イソブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基、２－ヘキセニル基、３－ヘキセニル基、４－ヘキセニル基、１，３－ブタジエニル基等を挙げることができる。アルケニル基の炭素数は、２～１８の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０であることがより好ましく、２～５であることがさらに好ましい。置換アルケニル基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
　上記Ｒ２、Ｒ４～Ｒ１１、及びＸ１～Ｘ２４における複素環基は、それぞれ独立して選択される。複素環基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
　複素環基としては、脂肪族複素環基や芳香族複素環基が挙げられる。具体例としては、ピリジル基、ピラジル基、ピペリジノ基、ピラニル基、モルホリノ基、アクリジニル基等が挙げられる。また、下記構造式で表される基も挙げられる。複素環基の炭素数（環を構成する炭素数）は、４～１２であることが好ましい。環員数は、５～１３であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　　　　　　　　　　　
　置換複素環基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。置換複素環基は、例えば、複素環基３－メチルピリジル基、Ｎ－メチルピペリジル基、Ｎ－メチルピローリル基等が挙げられる。
　上記Ｒ４、Ｘ１８、及びＸ１９におけるアルコキシ基は、それぞれ独立して選択される。アルコキシ基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
　アルコキシ基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルコキシル基が挙げられる。具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、２，３－ジメチル－３－ペンチルオキシ基、ｎ－へキシルオキシ基、ｎ－オクチルオキシ基、ステアリルオキシ基、２－エチルへキシルオキシ基等が挙げられる。アルコキシル基の炭素数は１～６の範囲内であることが好ましい。
　置換アルコキシル基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
　置換アルコキシ基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。置換アルコキシ基の具体例としては、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、２，２，３，３－テトラフルオロプロポキシ基、２，２－ビス（トリフルオロメチル）プロポキシ基、２－エトキシエトキシ基、２－ブトキシエトキシ基、２－ニトロプロポキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
　上記Ｒ４、Ｘ１８、及びＸ１９におけるアリールオキシ基は、それぞれ独立して選択される。アリールオキシ基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
　アリールオキシ基としては、単環または縮合多環のアリールオキシ基が挙げられる。具体例としては、フェノキシ基、ｐ－メチルフェノキシ基、ナフチルオキシ基、アンスリルオキシ基等が挙げられる。アリールオキシ基は、単環のアリールオキシ基が好ましい。また、炭素数６～１２のアリールオキシ基が好ましい。
　置換アリールオキシ基の置換基としては、上記アリール基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。置換アリールオキシ基として、例えば、ｐ－ニトロフェノキシ基、ｐ－メトキシフェノキシ基、２，４－ジクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２－メチル－４－クロロフェノキシ基等が挙げられる。
　上記Ｚ、及びＲ２におけるアルキレン基は、それぞれ独立して選択される。アルキレン基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アルキレン基としては、上記アルキル基から一つの水素原子を除いた二価の基が挙げられる。置換もしくは無置換のアルキレン基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－等が挙げられる。
　上記Ｚ、及びＲ２におけるアリーレン基は、それぞれ独立して選択される。アリーレン基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アリーレン基としては、アリール基から一つの水素原子を除いた二価の基が挙げられる。アリーレン基は、炭素数６～１０の範囲であることが好ましい。一実施形態において、アリーレン基は、フェニレン基、またはナフチレン基であってよい。置換もしくは無置換のアリーレン基の具体例としては、下記構造式で表される基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　　　　
　本発明の一実施形態は、上記蛍光色素を含む蛍光標識剤に関する。この蛍光標識剤は、生化学研究から医療診断までの幅広い分野において、バイオイメージングでの蛍光標識のために応用可能である。例えば、遺伝子診断分野、免疫診断分野、医療開発分野、再生医療分野、環境試験分野、バイオテクノロジー分野、及び蛍光検査等の分野において、蛍光標識等の用途で使用することができる。
　なかでも、上記実施形態の蛍光標識剤は、蛍光色素における、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３で表される構造（置換基）が、リン脂質に対して相互作用する機能を担っている。そのため、リン脂質集積型の蛍光標識剤として好適に使用できる。リン脂質集積型蛍光標識剤は、細胞膜の染色、エクソソームの追跡、及びドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）のためのリポソームイメージングなどにおいて、蛍光標識剤として好適に使用できる。
　上記実施形態の蛍光標識剤において、蛍光色素の濃度は特に限定されない。例えば、細胞を取り扱う場合、細胞の機能障害、及び増殖阻害等への影響を考慮すると、蛍光色素の濃度は低い方が好ましい。一実施形態において、例えば、９６ウェルプレートに播種した１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞に対する上記蛍光色素の濃度は、１００μＭ以下であることが好ましい。上記濃度は、５０μＭ以下であることがより好ましく、１０μＭ以下であることがさらに好ましい。上記実施形態の蛍光標識剤によれば、リン脂質への優れた集積性によって、低濃度の蛍光色素であっても高い蛍光強度でイメージングできる。そのため、例えば２μＭ以下の低濃度であっても、より高精度な検出を行うことができる。
　上記実施形態の蛍光標識剤は、上記実施形態の蛍光色素を含有していればよいが、必要に応じて、その他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、当技術分野で周知の成分であってよい。例えば、溶剤、及び両親媒性物質等が挙げられる。
　溶剤は、水、又は有機溶剤であってよく、水がより好ましい。蛍光色素の溶解性を考慮し、水と有機溶剤とを混合して使用してもよい。例えば、有機溶剤は、エタノール、又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましい。
　両親媒性物質とは、一つの分子内に親水基と疎水基とを有する化合物の総称である。具体例として、界面活性剤、又はリン脂質等が挙げられる。両親媒性物質は、１類のみを使用しても、又は２種以上を混合して使用してもよい。上記実施形態の蛍光標識剤において、両親媒性物質は、特に限定されず、近赤外領域で蛍光を発する非水溶性の蛍光色素を水に可溶化できれば、いかなる化合物でもよい。特に限定するものではないが、使用できる両親媒性物質の具体例を以下に挙げる。
　界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び高分子界面活性剤などを挙げることができる。
　非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８０等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、及びＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ６０等のポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ　１５等の１２－ヒドロキシステアリン酸－ポリエチレングリコールコポリマー、並びに、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４等のオクチルフェノールエトキシレート、などを挙げることができる。
　カチオン性界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、及び塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３，５－メチレンピペリジニウム）等のアルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウム、などを挙げることができる。
　アニオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、及びノニルベンゼンスルホネート、並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩などが挙げられる。
　高分子界面活性剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコール－ポリアルキル、ポリエチレングリコール－ポリ乳酸、ポリエチレングリコール－ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール－ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール－ポリ（ラクチド－グリコリド）等のブロック共重合体を挙げることができる。
　一実施形態において、上記実施形態の蛍光標識剤は、両親媒性物質として上記例示した化合物の１種又は２種以上を含んでよい。しかし、上記実施形態の蛍光標識剤は、リン脂質などの標的部位に対する集積性に優れるため、両親媒性物質を必要とすることなく、高い感度での検出が可能である。
　上記実施形態の蛍光標識剤において、蛍光色素は、フタロシアニン色素を含むことが好ましい。フタロシアニン色素の合成方法は、特に限定されない。例えば、先ず、フタロニトリル誘導体を原料として公知の方法でフタロシアニン骨格を有する色素（フタロシアニン金属錯体）を合成する。次いで、上記色素に、置換基（－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３）を有する成分を加え、これらをジメチルスルホキシド溶媒中で加熱撹拌しながら反応させる。このような反応によって、所望とする蛍光色素を得ることができる。上記置換基を有する成分として、例えば、後述の実施例において酸性化合物、又は軸配位子として示す化合物を使用することができる。
　原料であるフタロニトリル誘導体が非対称の構造である場合、フタロシアニンは、置換基の位置が異なる異性体の混合物として得られる。以下、本明細書においては、フタロシアニン構造の一例のみを示すが、置換基の位置が異なる異性体を排除するものではない。
　本発明の一実施形態である蛍光色素の具体例としては、以下が挙げられる。但し、本発明による蛍光色素は、これらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記例示した蛍光色素において、蛍光色素１～３７は、それぞれフタロシアニン色素の骨格（色素の残基）を有する蛍光色素である。蛍光色素３８は、ジケトピロロピロール色素の骨格を有する蛍光色素である。蛍光色素３９及び４０は、キサンテン色素の骨格を有する蛍光色素である。
　蛍光色素４１は、下記構造を有するボロンジピロメテン色素の骨格（色素の残基）を有する蛍光色素である。例えば、蛍光色素４１における置換基「－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３」は、Ｚが－Ｃ２Ｈ４－、Ｒ１が－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、Ｒ２が－Ｃ３Ｈ６－、Ｒ３が－Ｎ（ＣＨ３）２である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
　上記例示した蛍光色素において、蛍光色素４２～５９は、それぞれフタロシアニン色素の骨格を有する蛍光色素である。蛍光色素６０は、ジケトピロロピロール色素の骨格を有する蛍光色素である。蛍光色素６１は、キサンテン色素の骨格を有する蛍光色素である。蛍光色素６２は、シアニン色素の骨格を有する蛍光色素である。蛍光色素６３は、ボロンジピロメテン色素の骨格を有する蛍光色素である。
　特に限定するものではないが、一実施形態において、蛍光標識剤は、耐久性などの安定性の観点から、フタロシアニン色素の骨格を有する蛍光色素を含むことが好ましい。
　以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、実施例中「部」とは、「質量部」を表す。
（質量分析）
　質量分析装置（ＴＯＦ－ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製　ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した。
＜Ｉ＞蛍光色素
［製造例１］
＜化合物Ａ－１の製造方法＞
　キノリン５０部と無水塩化アルミニウム１部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－エトキシフタロニトリルを５部添加し、これらを１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部、及び１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、４．７部の表２に示す化合物Ａ－１を得た（収率８８．４％）。
［製造例２～１１］
＜化合物Ａ－２～Ａ－１０の製造方法＞
　化合物Ａ－１の製造方法で使用した３－エトキシフタロニトリルと無水塩化アルミニウムを、表２に示すフタロニトリル誘導体と金属源に変更した以外は、化合物Ａ－１の製造と同様にして、表２に示す化合物Ａ－２～Ａ－１０をそれぞれ製造した。なお、フタロニトリル誘導体、及び金属源は、化合物Ａ－１の製造における３－エトキシフタロニトリル、及び無水塩化アルミニウムと同じモル量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
  
［製造例１１］
＜化合物Ｂ－１の製造方法＞
　化合物Ａ－１を３部、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）１０部に溶解させた溶液に対して、水酸化カリウム０．４５部を水１部に溶解させた水溶液を全量添加した。これらを１１０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水１００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、２．９部の表３に示す化合物Ｂ－１を得た（収率９９．２％）。
［製造例１２～１５］
＜化合物Ｂ－２～Ｂ－５の製造方法＞
　化合物Ｂ－１の製造方法で使用した化合物Ａ－１を表３に示す化合物Ａに変更した以外は、化合物Ｂ－１の製造と同様にして、表３に示す化合物Ｂ－２～Ｂ－５をそれぞれ製造した。なお、化合物Ａは、化合物Ｂ－１の製造における化合物Ａ－１と同じモル量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
［製造例１６］
＜化合物Ｃ－１の製造方法＞
　キノリン５０部と無水塩化アルミニウム１部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－エトキシフタロニトリルを３．８部と４―フルオロフタロニトリルを１．１部添加した。これらを１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体（粗製物）を、中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ　Ｆｌａｓｈ　ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、１．６部の表４に示す化合物Ｃ－１を得た（収率３０．５％）。
［製造例１７～１９］
＜化合物Ｃ－２～Ｃ－４の製造方法＞
　化合物Ｃ－１の製造方法で使用した無水塩化アルミニウムを表４に示す金属源に変更した以外は、化合物Ｃ－１の製造と同様にして、表４に示すフタロシアニンＣ－２～Ｃ－４をそれぞれ製造した。なお、金属源は、化合物Ｃ－１の製造における無水塩化アルミニウムと同じモル量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
［実施例１］
＜蛍光色素１の製造方法＞
　化合物Ｂ－１を１部と、３－アミノプロピルジメチルエトキシシラン０．６部とをピリジンに溶解させ、この溶液を１１５℃で３時間還流して反応液を得た。エバポレーターを用いて反応液からピリジンを除去した後、エタノール１０部と水５０部の混合溶液を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．３９部の表１に示す蛍光色素１を得た（収率３３．７％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝８４８．６４（理論値８４７．９９）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素１の構造を有することが同定された。
［実施例２～５］
＜蛍光色素２～５の製造方法＞
　蛍光色素１の製造方法で使用した化合物Ｂ－１を表５に示す化合物Ｂに変更した以外は、蛍光色素１の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素２～５をそれぞれ製造した。なお、化合物Ｂは、蛍光色素１の製造における化合物Ｂ－１と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素２～５の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１１にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［実施例６］
＜蛍光色素６の製造方法＞
　化合物Ａ－１を０．７部と、４－（３－アミノプロピル）ベンゼンスルホン酸０．４部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、さらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．３部を添加し、これらを９０℃で５時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．３６部の表１に示す蛍光色素６を得た（収率４１．６％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９１６．５７（理論値９１５．９６）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素６の構造を有することが同定された。
［実施例７～１４］
＜蛍光色素７～１４の製造方法＞
　蛍光色素６の製造方法で使用した化合物Ａ－１と４－（３－アミノプロピル）ベンゼンスルホン酸を、表６に示す化合物Ａと酸性化合物に変更した以外は、蛍光色素６の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素７～１４をそれぞれ製造した。なお、化合物Ａ及び酸性化合物は、蛍光色素６の製造における化合物Ａ－１及び４－（３－アミノプロピル）ベンゼンスルホン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素７～１４の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１１にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
［実施例１５］
＜蛍光色素１５の製造方法＞
　化合物Ａ－１を０．５部と、（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸０．２９部とをジメチルスルホキシド２０部に溶解させ、この溶液を８０℃で８時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水５０部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．４６部の表１に示す蛍光色素１５を得た（収率７４．４％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９２９．４６（理論値９２８．８８）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素１５の構造を有することが同定された。
［実施例１６～１８］
＜蛍光色素１６～１８の製造方法＞
　蛍光色素１５の製造方法で使用した化合物Ａ－１と（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸を、表７に示す化合物Ａと酸性化合物に変更した以外は、蛍光色素１５の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素１６～１８をそれぞれ製造した。なお、化合物Ａ及び酸性化合物は、蛍光色素１５の製造における化合物Ａ－１及び（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素１６～１８の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１１にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
［実施例１９］
＜蛍光色素１９の製造方法＞
　蛍光色素１を０．５部と、ヨウ化メチルを０．８部と、炭酸カリウム０．８部とをテトラヒドロフラン５０部に溶解させ、この溶液を２５℃で５時間反応させた。エバポレーターを用いて反応液からテトラヒドロフランを除去した後、テトラヒドロフラン２０部と水６０部を加えた。次いで、析出物した固体をろ取し、水６０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．２１部の表１に示す蛍光色素１９を得た（収率３３．３％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝８９２．２５（理論値８９１．０８）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素１９の構造を有することが同定された。
［実施例２０～２３］
＜蛍光色素２０～２３の製造方法＞
　蛍光色素１９の製造方法で使用したヨウ化メチルと蛍光色素１を、表８に示すヨウ化化合物とアミン類に変更した以外は、蛍光色素１９の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素２０～２３をそれぞれ製造した。なお、ヨウ化化合物及びアミン類は、蛍光色素１９の製造におけるヨウ化メチル及び蛍光色素１と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素２０～２３の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１１にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
［実施例２４］
＜蛍光色素２４の製造方法＞
　蛍光色素１を０．０６部と、無水コハク酸０．００７部とを、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）５部に溶解させ、この溶液を９０℃で４時間反応させた。遠心エバポレーターを用いて反応液からＮＭＰを除去した後、水５部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．０４１部の表１に示す蛍光色素２４を得た（収率６１．１％）。質量分析の結果、／ｚ＝９４９．０７（理論値９４８．０６）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素２４の構造を有することが同定された。
［実施例２５～３０］
＜蛍光色素２５～３０の製造方法＞
　蛍光色素２４の製造方法で使用した無水コハク酸と蛍光色素１を、表９に示す無水コハク酸誘導体とアミン類に変更した以外は、蛍光色素２４の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素２５～３０をそれぞれ製造した。なお、無水コハク酸誘導体及びアミン類は、蛍光色素２４の製造における無水コハク酸及び蛍光色素１と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素２５～３０の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１１にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
［実施例３１］
＜蛍光色素３１の製造方法＞
　化合物Ｃ－１を１．０部と、（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸０．６部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、さらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．４部を添加した後、この溶液を９０℃で８時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。得られた固体（粗製物）を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ　Ｆｌａｓｈ　ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、０．７２部の表１に示す蛍光色素３１を得た（収率６０．１％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９０１．４６（理論値９００．８２）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素３１の構造を有することが同定された。
［実施例３２～３７］
＜蛍光色素３２～３７の製造方法＞
　蛍光色素３１の製造方法で使用した化合物Ｃ－１と（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸を、表１０に示す化合物Ｃと酸性化合物に変更した以外は、蛍光色素３１の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素３２～３７をそれぞれ製造した。なお、化合物Ｃ及び酸性化合物は、蛍光色素３１の製造における化合物Ｃ－１及び（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素３２～３７の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１１にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
［実施例３８］
＜蛍光色素３８の製造方法＞
　ジケトピロロピロール系色素であるＰｉｇｍｅｎｔＲＥＤ２５５（東京化成製）を１．０部と、４－ブロモ酪酸０．６部と、水素化ナトリウム（６０％）０．１部とを、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５０部に溶解させ、この溶液を９０℃で４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体（粗製物）を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ　Ｆｌａｓｈ　ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、０．７０部の表１に示す蛍光色素３８を得た（収率５３．９％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝３７５．２８（理論値３７４．４０）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素３８の構造を有することが同定された。
［実施例３９］
＜蛍光色素３９の製造方法＞
　５－カルボキシフルオレセイン（東京化成製）を１．０部と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン０．３部と、パラトルエンスルホン酸０．１部とをキシレン５０部に溶解させ、この溶液を１４０℃で２４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、エバポレーターを用いて反応液からキシレンを除去し、石油エーテルを５０部加えた。次いで、不溶物を吸引ろ過によって除去した後、エバポレーターを用いて石油エーテルを除去し、固体を得た。この固体を８０℃で乾燥させ、０．５７部の表１に示す蛍光色素３９を得た（収率４６．６％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝４６１．３７（理論値４６０．４９）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素３９の構造を有することが同定された。
［実施例４０］
＜蛍光色素４０の製造方法＞
　ＲｈｏｄａｍｉｎＢ（東京化成製）を１．０部と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン０．２部と、パラトルエンスルホン酸０．１部とをキシレン５０部に溶解させ、この溶液を１４０℃で２４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、エバポレーターを用いて反応液からキシレンを除去し、石油エーテルを５０部加えた。次いで、不溶物を吸引ろ過によって除去した後、エバポレーターを用いて石油エーテルを除去し、固体を得た。この固体を８０℃で乾燥させ、０．４６部の表１に示す蛍光色素４０を得た（収率３９．１％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝５６４．０２（理論値５６３．１８）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素４０の構造を有することが同定された。
［実施例４１］
＜蛍光色素４１の製造方法＞
　ＢＯＤＩＰＹ系色素であるＢＤＰ　ＦＬ（東京化成製）を１．０部と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン０．３部とをキシレン５０部に溶解させ、この溶液を１４０℃で２４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、エバポレーターを用いて反応液からキシレンを除去し、石油エーテルを５０部加えた。次いで、不溶物を吸引ろ過によって除去した後、エバポレーターを用いて石油エーテルを除去し、固体を得た。この固体を８０℃で乾燥させ、０．３８部の表１に示す蛍光色素４１を得た（収率２９．３％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝３７９．１１（理論値３７８．２７）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素４１の構造を有することが同定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
［製造例２０］
＜化合物Ａ－１１の製造方法＞
　キノリン５０部と、無水塩化アルミニウム１部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３、６－ビス（フェニルチオ）フタロニトリルを５部添加し、これらを１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、表１２に示す化合物Ａ－１１を得た（収率７２．８％）。
［製造例２１、２２］
＜化合物Ａ－１２、Ａ－１３の製造方法＞
　化合物Ａ－１１の製造方法で使用した３、６－ビス（フェニルチオ）フタロニトリルを、表１２に示すフタロニトリル誘導体に変更した以外は、化合物Ａ－１１の製造と同様にして、表１２に示す化合物Ａ－１２及びＡ－１３をそれぞれ製造した。なお、フタロニトリル誘導体は、化合物Ａ－１１の製造における３、６－ビス（フェニルチオ）フタロニトリルと同じモル量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
［実施例４２］
＜蛍光色素４２の製造方法＞
　化合物Ａ－１を０．７部と、１，２－エチレンジホスホン酸０．４部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、さらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．３部を添加した後、この溶液を９０℃で５時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．４２部の表１に示す蛍光色素１を得た（収率５０．６％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９０５．３５（理論値９０５．２１）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素１の構造を有することが同定された。
［実施例４３－５５］
＜蛍光色素４３－５５の製造方法＞
　蛍光色素１の製造方法で使用した化合物Ａ－１と１，２－エチレンジホスホン酸を表１３に示す化合物Ａと軸配位子に変更した以外は、蛍光色素６の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素２～１４をそれぞれ製造した。なお、化合物Ａ及び軸配位子は、蛍光色素１の製造における化合物Ａ－１及び１，２－エチレンジホスホン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素２～１４の構造は、質量分析装置を用いた分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表３にマススペクトルの分析結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
  
［製造例２３］
＜化合物Ｄ－１の製造＞
　スルホラン２００部、及び１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）１５．７部に、４－ブチルチオ－１，３－ジイミノイソインドリン５部、及び四塩化ケイ素８．８部を加え、これらを１６０～１７０℃で８時間にわたって加熱撹拌した。次いで、反応液を室温（２５℃）まで冷却し、メタノール２００部を加えた。次いで、析出した沈澱物（固体）を濾別して、メタノール：水（質量比４：１）の混合溶液で固体を洗浄後、乾燥して、２．６部の表１４に示す化合物Ｄ－１を得た（収率６３．６％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７５１．６５（理論値７５１．２４）に分子イオンピークが検出され、表１４に示す化合物Ｄ－１の構造を有することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
  
［実施例５６］
＜蛍光色素５６の製造方法＞
　化合物Ｂ－５を１．０部と１，２－エチレンジホスホン酸０．５部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、さらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．３部を添加し、これらを９０℃で５時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．５２部の表１に示す蛍光色素１を得た（収率４２．３％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９２３．４７（理論値９２３．２１）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素５６の構造を有することが同定された。
［製造例５７］
＜蛍光色素５７の製造方法＞
　蛍光色素１の製造方法で使用した化合物Ｂ－５をＤ－１に変更した以外は、蛍光色素５６の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素５７を製造した。尚、化合物Ｄ－１は、蛍光色素５６の製造における化合物Ｂ－５と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素５７の構造は、質量分析装置を用いた分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１５にマススペクトルの分析結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
  
［実施例５８］
＜蛍光色素５８の製造方法＞
　化合物Ｃ－３を０．７部と１，２－ヘキシレンジホスホン酸０．７部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、この溶液にさらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．３部を添加し、これらを９０℃で５時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．３９部の表１に示す蛍光色素１を得た（収率４２．３％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９１３．６６（理論値９１３．２４）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素５８の構造を有することが同定された。
［実施例５９］
＜蛍光色素５９の製造方法＞
　蛍光色素５８の製造方法で使用した化合物Ｃ－３及び１，２－ヘキシレンジホスホン酸を、表１６に示す化合物Ｃ－４及び環置換基に変更した以外は、蛍光色素５８の製造と同様にして、表１に示す蛍光色素５９を製造した。なお、化合物Ｃ－４は、蛍光色素１７の製造における化合物Ｃ－３と同じモル量で使用した。得られた蛍光色素５９の構造は、質量分析装置を用いた分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表１６にマススペクトルの分析結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
  
［実施例６０］
＜蛍光色素６０の製造方法＞
　ジケトピロロピロール系色素であるＰｉｇｍｅｎｔＲＥＤ２５５（東京化成）を１．０部と、３－アミノプロピルホスホン酸０．６部と、水素化ナトリウム（６０％　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）０．１部とをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５０部に溶解させ、この溶液を９０℃で４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体（粗製物）を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ　Ｆｌａｓｈ　ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、０．６５部の表１に示す蛍光色素６０を得た（収率４５．５％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝４１１．５２（理論値４１１．１０）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素６０の構造を有することが同定された。
［実施例６１］
＜蛍光色素６１の製造方法＞
　５－カルボキシフルオレセイン（東京化成）を１．０部と、３－アミノプロピルホスホン酸０．７部と、パラトルエンスルホン酸０．１部とをキシレン５０部に溶解させ、この溶液を１４０℃で２４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、エバポレーターを用いて反応液からキシレンを除去し、石油エーテルを５０部加えた。次いで、不溶物を吸引ろ過によって除去した後、エバポレーターを用いて石油エーテルを除去し、固体を得た。この固体を８０℃で乾燥させ、０．７５部の表１に示す蛍光色素６１を得た（収率５１．２％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝５５１．０２（理論値５５１．１８）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素６１の構造を有することが同定された。
［実施例６２］
＜蛍光色素６２の製造方法＞
　Ｃｙ５－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ（フナコシ）１．０部と、３－アミノプロパノール０．５部と、トリエチルアミン０．５部とをＤＭＦ５０部に溶解させ、この溶液を室温で１２時間反応させた。この反応液に水５０部を加え、析出した沈殿物（固体）を濾過し、さらに水で固体を洗浄した。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．７０部の表１に示す蛍光色素６２を得た（収率８６．４％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝５４１．１８（理論値５４１．３６）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素６２の構造を有することが同定された。
［実施例６３］
＜蛍光色素６３の製造方法＞
　ＢＯＤＩＰＹ系色素であるＢＤＰ　ＦＬ（東京化成製）を１．０部と、３－アミノプロパノール０．３部とをキシレン５０部に溶解させ、この溶液を１４０℃で２４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、エバポレーターを用いて反応液からキシレンを除去し、石油エーテルを５０部加えた。次いで、析出した不溶物を吸引ろ過によって除去した後、エバポレーターを用いて反応液から石油エーテルを除去し、固体を得た。この固体を８０℃で乾燥させ、０．６４部の表１に示す蛍光色素６３を得た（収率７０．６％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝３５０．０１（理論値３５０．１８）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光色素６３の構造を有することが同定された。　
［比較例１］
　比較化合物１として、化合物Ａ－１を用いた。
［比較例２］
　比較化合物２として、化合物Ａ－９を用いた。
　後述する比較例３～１１において、表１７に示す比較化合物３～１１を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　［比較例３］
＜比較化合物３の製造方法＞
　塩化アルミニウム７．０部と、尿素３９部と、モリブデン酸アンモニウム０．２部と、無水トリメリット酸２５部とをＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）４０部に溶解させ、この溶液を１３９℃で９時間攪拌した。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、１４．５部の表１７に示す比較化合物３を得た（収率５９．３％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７５１．８４（理論値７５１．００）に分子イオンピークが検出され、表１７に示す比較化合物３の構造を有することが同定された。
［比較例４］
＜比較化合物４の製造方法＞
　キノリン３０部と、無水塩化アルミニウム０．７部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－エトキシフタロニトリルを１．５部と４―オクタデシルオキシフタロニトリルを２．１部添加し、この溶液を１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄した固体（粗製物）を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ　Ｆｌａｓｈ　ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、０．３６部の表１７に示す比較化合物４を得た（収率１２．６％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９７６．４４（理論値９７５．６１）に分子イオンピークが検出され、表１７に示す比較化合物４の構造を有することが同定された。
［比較例５］
＜比較化合物５の製造方法＞
　化合物Ａ－９を１．０部と、トリフェニルシラノール０．３５部とをジメチルスルホキシド２０部に溶解させ、この溶液を８０℃で８時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水５０部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、１．００部の表１７に示す比較化合物５を得た（収率８０．５％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝１２８２．５３（理論値１２７１．６７）に分子イオンピークが検出され、表１７に示す比較化合物５の構造を有することが同定された。
［比較例６～９］
＜比較化合物６～９の製造方法＞
　比較化合物５の製造方法で使用した化合物Ａ－９とトリフェニルシラノールを、表１８に示すハロゲン類と酸性化合物に変更した以外は、比較化合物５の製造と同様にして、表１７に示す比較化合物６～９をそれぞれ製造した。なお、ハロゲン類及び酸性化合物は、比較化合物５の製造における化合物Ａ－９及びトリフェニルシラノールと同じモル量で使用した。得られた比較化合物６～９の構造は、質量分析によって同定し、表１７に示した構造を有することが確認された。表１９にマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　［比較例１０］
＜比較化合物１０の製造方法＞
　化合物Ａ－９を２．０部と、パラトルエンスルホン酸１．０部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、この溶液にさらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．３部を添加した、これらを９０℃で５時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、１．３５部の表１７に示す比較化合物１０を得た（収率６０．０％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９３３．６７（理論値９３２．７４）に分子イオンピークが検出され、表１７に示す比較化合物１０の構造を有することが同定された。
［比較例１１］
＜比較化合物１１の製造方法＞
　濃硫酸９．２部と、２５％発煙硫酸５．５部との混合溶液に、化合物Ａ－１を１部加え、この溶液を５０℃で４時間加熱撹拌した。この反応液を冷却後、８０部の氷に添加し、析出した沈澱物（固体）を濾別した。さらに、濾別した固体をテトラヒドロフラン５０部に懸濁させ、再度沈澱を濾別した。濾別した固体をテトラヒドロフラン５０部で洗浄し、洗浄後の固体を乾燥して、０．５部の粗製物を得た。粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ　Ｆｌａｓｈ　ＡＫＲＯＳ）を用いて精製し、０．２部の比較化合物１１を得た（収率１６．０％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９３９．６５（理論値９４０．７５）に分子イオンピークが検出され、表１７に示す比較化合物１１の構造を有することが同定された。
　比較例３～１１で製造した比較化合物３～１１のマススペクトルの分析結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
［比較例１２］
　比較化合物１２として、シアニン系色素であるＸｅｎｏＬｉｇｈｔ　ＤＩＲ（住商ファーマ製）を用いた。この化合物は、長鎖アルキレン基を有する従来の蛍光標識剤に相当し、疎水相互作用を介してリン脂質に集積する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
［比較例１３］
　比較化合物１３として、ローダミンＢ（東京化成製）を用いた。
＜ＩＩ＞色素溶液
［実施例６４］
＜色素溶液１の調製＞
　ジメチルスルホキシド１０ｍｌに蛍光色素１を１．６９６ｍｇ溶解した。この溶液を孔径０．２μｍのナイロン製メンブレンフィルターを用いてろ過した後、ジメチルスルホキシドで１００倍希釈することによって、蛍光色素１の色素溶液１を調製した。
［実施例６５～１２６］
＜色素溶液２～６３の調製＞
　色素溶液１の調製で使用した蛍光色素１とジメチルスルホキシドを、表２０に示す蛍光色素と溶剤に変更した以外は、色素溶液１の調製と同様にして、色素溶液２～６３をそれぞれ調製した。但し、各蛍光色素は蛍光色素１と同じモル量、溶剤はジメチルスルホキシドと同じ体積量で使用した。
［比較例１２～２４］
＜色素溶液６４～７６の調製＞
　色素溶液１の調製で使用した蛍光色素１とジメチルスルホキシドを、表２０に示す蛍光色素と溶剤に変更した以外は、色素溶液１の調製と同様にして、色素溶液６４～７６をそれぞれ調製した。但し、各蛍光色素は蛍光色素１と同じモル量、溶剤はジメチルスルホキシドと同じ体積量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
  
＜色素溶液の蛍光強度評価＞
　各々の色素溶液について、蛍光光度計（日本分光株式会社製、ＦＰ－６５００）を用いて蛍光スペクトルを測定した。さらに、得られた測定値に、表２２に示す蛍光波長の範囲内での蛍光強度を足し合わせることで蛍光強度を求めた。また、この時の励起光は色素の最も長波長側の吸収極大波長に相当する波長を用いた。
＜ＩＩＩ＞蛍光標識剤
［実施例１２７］
＜蛍光標識剤１の調製＞
　ジメチルスルホキシド１０ｍｌに蛍光色素１を１．６９６ｍｇ溶解した。孔径０．２μｍのナイロン製メンブレンフィルターでろ過した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１００倍希釈することで蛍光色素１の蛍光標識剤１を調製した。
［実施例１２８～１８９］
＜蛍光標識剤２～６３の調製＞
　蛍光標識剤１の調製で使用した蛍光色素１とジメチルスルホキシドを、表２１に示す蛍光色素と溶剤に変更した以外は、蛍光標識剤１の調製と同様にして、蛍光標識剤２～６３をそれぞれ調製した。但し、各蛍光色素は蛍光色素１と同じモル量、溶剤はジメチルスルホキシドと同じ体積量で使用した。
［比較例２５～３７］
＜蛍光標識剤６４～７６の調製＞
　蛍光標識剤１の調製で使用した蛍光色素１とジメチルスルホキシドを、表２１に示す蛍光色素と溶剤に変更した以外は、蛍光標識剤１の調製と同様にして、蛍光標識剤６４～７６をそれぞれ調製した。但し、各蛍光色素は蛍光色素１と同じモル量、溶剤はジメチルスルホキシドと同じ体積量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
  
＜蛍光標識剤の細胞毒性評価＞
　ヒト類上皮がん細胞Ａ４３１を９６ウェルプレートに播種（１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した。次いで、１０％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で、上記Ａ４３１を２４時間培養した。ＲＰＭＩ１６４０培地には、シグマアルドリッチ製のＲＰＭｌ－１６４－　Ｍｅｄｉｕｍを使用した。
　上記培養の後、培地を取り除き、実施例８３～１２３、及び比較例２５～３７にて調製した蛍光標識剤と、１％ジメチルスルホキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＤＭＳＯ培地溶液）とを添加した。これらをインキュベーター内に１時間静置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。各ｗｅｌｌにセルカウンティングキット－８（同仁化学製）を１０μＬずつ添加し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で１時間静置した。次いで、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
　ＤＭＳＯ培地溶液を添加したｗｅｌｌの吸光度を１とした時の、各々の蛍光標識剤の吸光度の相対値を算出し、下記の基準に基づいて評価した。評価が「Ｐ」であれば細胞毒性を示さないといえる。なお、蛍光標識剤の吸光度の相対値を算出する際には、測定した吸光度からセルカウンティングキット－８（同仁化学製）添加前の吸光度を差し引いた値を用いた。評価結果を表２２に示す。
（評価基準）
　　Ｐ（合格）：０．８以上
　　Ｆ（不合格）：０．８未満
＜蛍光標識剤の蛍光強度評価＞
　ヒト類上皮がん細胞Ａ４３１を９６ウェルプレートに播種（１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した。次いで、１０％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で、上記Ａ４３１を２４時間培養した。
　上記培養の後、培地を取り除き、実施例１２７～１６７、及び比較例２５～３７にて調製した蛍光標識剤を添加し、インキュベーター内に１時間静置した。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて、表２２に示す蛍光波長の範囲内で蛍光強度評価を行った。
　図１に蛍光標識剤１、１５、１９、２４、２５、６８、及び７５の蛍光強度評価結果を示す。本発明の実施形態である蛍光標識剤１、１５、１９、２４、及び２５（実施例）は、比較化合物を用いて調製した蛍光標識剤６８及び７５（比較例）に比べて、高い蛍光強度を示すことが確認できた。
＜蛍光色素のリン脂質集積性評価＞
　表２２に示す、色素溶液の蛍光スペクトルにより求めた蛍光強度積分値と、蛍光標識剤の蛍光強度より得た蛍光強度から、式（１）を用いて各色素のリン脂質集積性を算出した。比較化合物１２のリン脂質集積性を１とした時の、各々の蛍光標識剤のリン脂質集積性の相対値を算出し、下記の基準に基づいて評価した。評価が３以上である場合、各蛍光色素はリン脂質集積性が良好であるといえる。
（評価基準）
　４：リン脂質集積性　４以上
　３：リン脂質集積性　２以上、４未満
　２：リン脂質集積性　１以上、２未満
　１：リン脂質集積性　１未満
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000045
　リン脂質集積性の評価結果を表２２に示す。
　本発明の実施形態である蛍光標識剤（実施例）は、比較化合物を用いて調製した蛍光標識剤（比較例）に比べて、高いリン脂質集積性を示すことが確認できた。
＜細胞の視認性評価＞
　ヒト類上皮がん細胞Ａ４３１を９６ウェルプレートに播種（１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した。１０％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で、上記Ａ４３１を２４時間培養した。
　上記培養の後、培地を取り除き、実施例１２７～１８９、及び比較例２５～３７にて調製した蛍光標識剤を添加し、インキュベーター内に１時間静置した。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。適切な波長の励起フィルター及び蛍光フィルターを設置した蛍光顕微鏡（キーエンス社製、ＢＺ－Ｘ８００）を用いて、細胞の暗視野像と蛍光像を観察し、下記の基準に基づいて評価した。評価結果を表２２に示す。
（評価基準）
　Ｐ（合格）：明瞭
　Ｆ（不合格）：不明瞭
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
  
　蛍光標識剤１、１５、１９、２４、２５、６８、及び７５で標識した細胞の視認性評価結果を、順に、図２～８に示す（倍率：１０倍、蛍光取り込み時間：１秒）。
　蛍光標識剤４２、及び５３で標識した細胞の視認性評価結果を、順に、図９及び図１０に示す（倍率：４０倍、蛍光取り込み時間：１秒）。
　比較例に対応する図７及び８と、実施例に対応する図２～６、９及び１０との対比から明らかなように、本発明の実施形態による蛍光標識剤によれば、特定の置換基に由来して、より高い蛍光強度を示すことが観察された。このように、本発明の実施形態による蛍光標識剤（実施例）は、比較化合物に比べて細胞集積性に優れることによって、より優れた視認性が得られることが分かる。以上のことから、本発明の実施形態による蛍光標識剤は、蛍光標識剤として優れた特性を有することが明らかとなった。

Claims (5)

  1. 　下記一般式（１）で表される蛍光色素を含む蛍光標識剤。
    　　　一般式（１）：

    　　　　　　Ｑ－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３

    （式中、Ｑは、蛍光色素の残基を表す。
    　Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
    　Ｒ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ４－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ５Ｒ６－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
    　Ｒ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
    　Ｒ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ７Ｒ８、－Ｎ＋Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
    　前記Ｒ４は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｒ７～Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
    　前記Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。）
  2. 　リン脂質集積型蛍光標識剤である、請求項１に記載の蛍光標識剤。
  3. 　前記蛍光色素が、下記一般式（２）で表されるフタロシアニン色素を含む、請求項１又は２に記載の蛍光標識剤。　　　　
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、Ｘ１～Ｘ１６は、それぞれ独立に、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、置換もしくは無置換のアルケニル基、置換もしくは無置換の複素環基、－ＡＢ、－ＳＯ３Ｍ５、又は－ＣＯＯＭ６を表す。
    　前記－ＡＢにおいて、Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｍ５、及びＭ６は、それぞれ独立に、１価のカチオンを表す。
    　Ｘ１～Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
    　Ｘ１７は、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水酸基、ハロゲン元素、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリールオキシ基、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、－ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、又は－ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。
    　前記Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｘ２０は、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｘ２１は、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｘ２２～Ｘ２４は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　Ｙは、２価～５価の金属原子を表し、ｋは整数である。Ｙが２価の金属原子である場合のｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合のｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合のｋは２である。
    　但し、Ｘ１～Ｘ１７の少なくとも１つは、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３である。）
  4. 　前記一般式（２）のＸ１７が、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３である、請求項３に記載の蛍光標識剤。
  5. 　下記一般式（３）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （式中、Ｘ１～Ｘ１６は、それぞれ独立に、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、置換もしくは無置換のアルケニル基、置換もしくは無置換の複素環基、－ＡＢ、－ＳＯ３Ｍ５、又は－ＣＯＯＭ６を表す。
    　前記－ＡＢにおいて、Ａは、１６族元素を表す。Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｍ５、Ｍ６は、それぞれ独立に、１価のカチオンを表す。
    　前記Ｘ１～Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。
    　Ｘ１７は、－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３、水酸基、ハロゲン元素、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリールオキシ基、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｘ１８Ｘ１９、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ２０、－ＯＳ（＝Ｏ）２Ｘ２１、又は－ＯＳｉＸ２２Ｘ２３Ｘ２４を表す。
    　前記Ｘ１８及びＸ１９は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｘ２０は、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｘ２１は、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｘ２２～Ｘ２４は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　Ｙは、２価～５価の金属原子を表し、ｋは整数である。Ｙが２価の金属原子である場合のｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合のｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合のｋは２である。
    　但し、Ｘ１～Ｘ１７の少なくとも１つは－Ｚ－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３である。
    　式中、Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
    　Ｒ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ４－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ５Ｒ６－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
    　Ｒ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び、置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
    　Ｒ３は、ＣＯＯＭ１、ＮＲ７Ｒ８、Ｎ＋Ｒ９Ｒ１０Ｒ１１、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
    　前記Ｒ４は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
    　前記Ｒ７～Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
    　前記Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。）
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