KR101334779B1

KR101334779B1 - 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치

Info

Publication number: KR101334779B1
Application number: KR1020120019807A
Authority: KR
Inventors: 김윤경; 정혜연; 정봉현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-27
Publication date: 2013-11-29
Also published as: KR20120098512A

Abstract

본 발명은 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형광물질 및 광변색 물질이 도입된 실리카 나노입자는, 한쪽 말단에 실란기가 도입된 광변색 물질 및 형광물질을 사용하여 실리카 나노입자의 내부 및 표면에 형광물질과 광변색 물질이 고르게 도입되어 FRET을 극대화함으로써 높은 대비(contrast)로 on-off 스위칭할 수 있고, 실리카 나노입자 표면의 아민기를 모두 카르복실레이트로 전환하여 생체적합성을 향상시킴으로써, 생체 이미징 시스템의 진단 시약으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치{Highly monodisperse silica nanoparticles as reversible internal light switch for living biological systems}

본 발명은 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치에 관한 것이다.

생체 내에서 실시간으로 일어나는 현상을 분자 수준에서 직접 관찰할 수 있다면 질병의 원인과 경과를 빠르고 정확하게 판단할 수 있게 된다. 현재에도 생체 내에 존재하는 암세포에 발광체나 방사능 표지를 해서 이미지 영상을 얻는 방법이 사용되고 있지만 널리 이용되지는 않고 있다.

미국 국립 공학회는 자동차, 컴퓨터 등과 함께 이미징 기술(특히 의학용 이미징 기술)을 20세기의 가장 위대한 공학적 성취라고 평가했다. 생의학용 이미징 기술의 발전으로 형광을 이용해서 생체 조직에서 분자 수준의 변화들을 관찰할 수 있게 되었다. 이는 생물학적 시료에 적용 가능하고 특수하게 반응하는 표지자와 단백질들의 발견과 매우 민감한 이미징 기술에 토대를 두고 있다. 더 나아가 표면에서 뿐 아니라 조직내부까지 그리고 더욱 작은 부분까지 미량의 시료에 대한 이미징 기술의 발전이 요구되고 있다.

분자 이미징을 질환 진단기술로서 이용하기 위한 키포인트는 질환의 상황을 보다 정확하고 안정적으로 진단할 수 있는 분자 프로브를 개발하는 것이다. 분자 프로브는 체내 진단약으로 분류되어 임상 개발이 필요하여, 현재 기업이 주체가 되어 임상 개발을 진행하고 있는 분자 프로브는 전 세계에서 약 30개 정도이다. 미국과 유럽에서 개발의 90% 이상을 차지하고 있으며, 한국은 분자 프로브 임상 개발에서 뒤쳐져 있는 상황이다.

실리카 재료는 다양한 기능을 가진 소재로서 여러 산업 분야에 걸쳐 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 다공성 구형 실리카는 무기소재 매트리스 소재로서 넓고 큰 표면적을 가졌고 pH의 변화에 따라서 부풀지 않고 그 형태가 변화하지 않는다. 이러한 특성으로 다공성 구형 실리카는 담지체로 사용이 가능하며, 생체 소재로서의 응용 또한 가능하여 약물전달체계, 화장품, 생체소재와 같은 다양한 응용 분야에서 널리 사용되고 있다.

형광물질이 포함된 실리카 나노입자를 세포내에 주입하여 이미징에 사용하는 응용기술의 개발이 현재 활발히 진행되고 있다. 그 예로, 미국 아리조나 대학 연구진이 실리카 나노 입자의 표면을 poly(lipid)로 코팅하는 방법을 개발하였다(M. D. Senarath-Yaoa, et al., Langmuir 2007, 23, 12624-12633). 이 코팅은 두 가지 주요 기능을 하는데 첫째는 비특이적 결합을 줄이는 것이고, 다른 하나가 반응성이 있는 지질의 코팅으로 입자에 기능성 부여가 가능해지는 것이다. 또한, Ru(bpy)3 염료가 도핑된 실리카 나노입자를 키토산 막에 삽입된 전기적으로 화학발광(chemiluminescence) 센서가 개발되었다(L. Zhang, et al., Anal. Chem. 2006, 78, 5119-5123).

특히, 비교적 사이즈가 작은(직경 20 nm 정도 이하) 형광 표지된 실리카 나노입자가 세포 내로 들어가기에 더 유리하고 입자의 크기 분포가 균일하면 생물학적 성질도 비교적 일정하게 나온다(P. N. Prasad, et al., ACS Nano. 2008, 2, 449-456).

광변색 현상은 자외선 혹은 가시광선에 노출될 경우, 색이 변하는 화합물 또는 이러한 화합물을 함유한 제품의 색상이 빛에 의해 가역적으로 변하는 현상을 지칭한다. 광변색 화합물은 흡수 특성, 굴절성 등과 같은 서로 다른 물리적인 성질을 가지는 적어도 두개의 이성질체형(isomeric form)을 가지는 화합물이며, 특정 파장의 빛 조사(irradiation)에 의해 한 형태에서 다른 형태로 변화될 수 있는 화합물이다.

광에 의한 색의 변화가 가역적으로 일어날 수 있는 광변색 소재는 광기록, 광스위치, 모듈레이터 등 다양한 분야에 응용성을 가진다. 그 예로 디아릴에텐계 화합물은 자외선에 노출시 색이 변하고, 이어서 다른 가시광 영역의 파장의 빛을 조사하면 화합물의 본래의 색으로 되돌아오는 광변색 화합물로서, 1985년에 처음으로 합성된 이래 빛 조사 후 열에 의한 변색이 일어나지 않는 안정한 광변색성 화합물로 알려져 왔다. 아울러 다양한 유도체들이 합성되었고, 그 중 불소로 치환된 디아릴에텐 화합물은 안정성이 더욱 높을 뿐만 아니라, 광변색 속도가 매우 빠른 것으로 알려져 있다 (M. Takeshita, et al., Chem. Commun. 1996, 1807-1808; M. Irie, Chem. Rev. 2000, 100, 1685-1716).

한편, 디아릴에텐계 화합물은 대부분 유기용매에서는 용해되나, 물에서는 용해가 잘 되지 않아 수용액 상을 기반으로 하는 바이오 분야에는 극히 제한적으로 적용되어있다. 다만, 최근 디아릴에텐계 화합물에 올리고 에틸렌글리콜을 도입함으로써 수용성 물질로 전환이 가능하다는 보고가 있었다(T. Hirose, et al., J. Org, Chem. 2006, 71, 7499-7508). 아울러 일본공개특허공보 제2003-246776호에서는 생체기능성 분자를 가역적으로 구조변화시킨 가교성 광변색성 분자와 기계적 에너지를 생산할 수 있는 생체기능성 분자 유도화합물을 제공하기 위해, 광변색성 분자와 티올기를 가지는 생체분자를 말레이미드기로 가교 결합시키는 방법을 개시하고 있으나, 수용성 광변색성 분자를 이용한 것이 아니므로, 바이오 분야의 적용은 어려웠다.

따라서, 특정 파장의 빛에 의해 그 색상이 가역적으로 변하는 광변색 화합물을 이용하여 UV-Vis 분광기 등으로 쉽게 신호를 검출하고, 원치않는 배경신호를 감소시켜 검출감도를 크게 향상시킬 수 있는 생체분자 검출기술의 개발이 시급한 실정이다.

pcFRET(photochromic FRET)은 아조벤젠(azobenzene), 디아릴에텐(diarylethene), 스파이로파이란(spiropyran), 펄가이드(fulgide) 등의 광변색 화합물을 스위치로 하여 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의해 인근(FRET 반응이 가능한 거리 이내) 형광물질의 형광을 가역적으로 온-오프(on-off)하는 것을 의미한다(M. Irie et al., Chem. Commun. 2007, 5206-5208). 이러한 pcFRET을 가장 효과적으로 수행하기에 적합한 광변색 화합물은 디아릴에텐인데, 그 이유는 이 계열의 물질이 일반적으로 높은 열안정성, 높은 내구성, 높은 감도 및 빠른 감응속도의 성질을 갖기 때문이다.

이에, 본 발명자는 검출감도를 크게 향상시킬 수 있는 생체분자 검출용 시약을 연구하던 중, 실란계 화합물과 한쪽 말단에 실란기가 도입된 광변색 물질 및 형광물질을 함께 합성하여 실리카 나노입자의 내부 및 표면에 형광물질과 광변색 물질이 도입되어 고대비(high contrast)로 온-오프(on-off) 스위칭할 수 있을 뿐만 아니라, 실리카 나노입자 표면의 특성을 나타내는 아민기를 카르복실레이트로 변환시켜 생체적합성을 향상시킬 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치를 제공한다.

또한, 본 발명은 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형광물질 및 광변색 물질이 도입된 실리카 나노입자는, 한쪽 말단에 실란기가 도입된 광변색 물질 및 형광물질을 사용하여 실리카 나노입자의 내부 및 표면에 형광물질과 광변색 물질이 고르게 도입되어 FRET을 극대화함으로써 높은 대비(contrast)로 온-오프(on-off) 스위칭할 수 있고, 실리카 나노입자 표면의 독성을 나타내는 아민기를 모두 카르복실레이트로 전환하여 생체적합성을 향상시킴으로써, 생체 이미징 시스템의 진단 시약으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 디아릴에텐(3)의 구조 및 형광물질(4)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 생체적합성 표면개질반응으로 표면이 아민기의 양이온성 표면을 갖는 실리카 나노입자(2)로부터 표면이 카르복실기의 음이온성 표면을 갖는 생체적합성 실리카 나노입자(1)를 제조하는 과정 및 하나의 실리카 나노입자에 치환된 디아릴에텐(3) 및 형광물질(4)에 의해 UV 및 Vis광을 교대로 조사하여 가역적 포토스위칭을 하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 실리카 나노입자 1(a) 및 2(b)의 TEM 사진을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 실리카 나노입자 1(100 μg/mL)에 대한 가역적 포토스위칭 실험결과(a: 정제수, b: PBS 버퍼)를 형광 스펙트럼으로 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 실리카 나노입자 1의 HeLa 세포(a) 및 hADS 세포(b)에 대한 독성 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 실리카 나노입자 1을 가한 HeLa 세포를 각 시간만큼 배양한 뒤 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면(최종농도 a: 5 μg/mL, b: 50 μg/mL)이다(Scale bars: 20 μm).
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 실리카 나노입자 1을 가한 hADS 세포를 각 시간만큼 배양한 뒤 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면(최종농도 a: 5 μg/mL, b: 50 μg/mL)이다(Scale bars: 20 μm).
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 실리카 나노입자 1을 살아있는 HeLa 세포(a,b) 및 살아있는 hADS 세포(c,d)에 적용하여 포토스위칭 실험한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 입자크기가 균일한 실리카 나노입자의 표면 및 내부에 광스위치 역할을 수행하는 광변색 물질이 공유결합되고, 적어도 하나의 형광물질이 상기 광변색 물질과 형광공명에너지전이(FRET)를 수행할 수 있는 거리 이내에 위치되도록 상기 실리카 나노 입자의 표면 및 내부에 공유결합되는 구조를 갖는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치를 제공한다.

상기 광변색 물질은 아조벤젠(azobenzene) 유도체, 스파이로파이란(spiropyran) 유도체, 디아릴에텐(diarylethene) 유도체, 펄가이드(fulgide) 유도체 등을 사용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 광변색 물질은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나의 디아릴에텐 유도체일 수 있다:

,

,

,

,

,

,

,

,

,

또는

(여기서, 상기 R¹은 수소 또는 메틸이고; R² 및 R³는수소, C₁~C₆의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 비치환 또는 치환된 C₅~C₇의 아릴 또는 헤테로 아릴이고, 상기 R² 및 R³는 서로 동일 또는 상이할 수 있다).

상기 디아릴에텐 유도체는 하기 화학식 3과 같이 한쪽 말단이 실란인 것이 바람직하다.

[화학식 3]

또한, 상기 형광물질은 시아닌(Cyanine, 이하 Cy) 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피(BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민 유도체(rhodamine derivatives), 플루오레신 유도체(fluorescein derivatives), 쿠마린 유도체(coumarin derivatives) 등이 될 수 있고, Cy 시리즈인 것이 바람직하며 Cy 시리즈 중 Cy3인 것, 특히 하기 화학식 4와 같이 한쪽 말단이 실란인 것이 더욱 바람직하다. 여기서 광스위치 역할을 하는 상기 광변색 물질인 디아릴에텐 유도체에 의해 Cy3의 형광이 켜지고 꺼지게 된다.

[화학식 4]

나아가, 본 발명에 따른 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 실리카 나노입자의 내부 및 표면에 형광물질과 광변색 물질이 고르게 도입된 형태로 존재한다. 이러한 형태는 광변색 물질 및 형광물질이 실리카 나노입자의 표면에만 존재하는 경우보다 FRET에 의해 형광을 훨씬 더 효과적으로 끌 수 있게 되어 형광이 켜졌을 때와의 대비가 더욱 뚜렷해지는 이점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 FRET 원리에 따라 가역적 형광 스위칭이 수행될 수 있다. 이때, 상기 광변색 물질인 디아릴에텐이 FRET 받개(acceptor)로 사용되고 형광물질이 FRET 주개(donor)로 사용되어 가시광 영역의 빛이 조사되었을 때 형광이 켜지고, 자외선 영역의 빛이 조사되었을 때 형광이 꺼져 가역적 스위칭을 가능하게 한다.

나아가, 상기 실리카 나노입자는 20 내지 30 nm의 균일한 크기 분포를 가질 수 있고, 독성을 나타내는 아민기가 표면에 노출되는 것을 방지하기 위해 실리카 나노입자에 말단기로 남은 아민기를 음이온성 잔기를 갖도록 개질시키는 것이 바람직하다. 이때, 상기 음이온성 잔기는 카르복실레이트인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 고대비 영상(high-contrast imaging)이 유리한 기타의 생체 내 질병진단 영상화 방법과 결합하여 복합모드 영상을 얻을 목적으로 사용될 수 있고, 상기 기타의 생체 내 질병진단 영상화 방법은 자기공명영상화 방법(MRI), 컴퓨터 단층촬영 방법(CT), 양전자 방출 단층촬영 방법(PET), 단일 광자 방출 전산화 단층촬영 방법(SPECT) 등일 수 있으며 이를 이용한 약물 표적화를 통해 질병진단 및 치료에 적용할 수도 있다.

나아가, 본 발명은 상기 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 VTES, DETA 등의 몇 가지 실란기 모노머, FRET 반응시 FRET 받개의 역할을 수행하는 광변색 물질 및 FRET 반응시 FRET 주개의 역할을 수행하는 형광물질을 동시에 넣고 원-포트(one-pot) 합성방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 제조방법을 비닐트리에톡시실란을 기반으로 하는 실리카 나노입자의 제조방법을 예로 하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일실시형태에 따른 실리카 나노입자(2)는 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,

실리카 나노입자의 기반이 되는 비닐트리에톡시실란(VTES)(12) 및 N'-[3-(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(DETA)(13), 광변색 물질인 디아릴에텐(3) 및 형광물질인 Cy3(4)를 동시에 넣고 용매 및 공중합하여 표면이 아민기인 실리카 나노입자(2)를 제조할 수 있다.

[반응식 1]

또한, 본 발명의 일실시형태에 있어서, 하기 반응식 2와 같이, 표면이 아민인 실리카 나노입자(2)에 숙신산 무수물(14)을 반응시켜 음이온 표면을 갖는 실리카 나노입자(1)를 제조할 수 있다.

[반응식 2]

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 모노-아미드 링커(6)의 제조

메탄올(5 mL)에 녹인 출발물질로 사용한 화학식 5의 화합물 용액(680 mg, 1.62 mmol)에 0 ℃에서 천천히 NH₄OH(5 mL)를 가하였다. 상기 반응 혼합물을 서서히 상온으로 온도를 올리면서 12시간 동안 교반하고, 1N의 HCl 수용액을 0 ℃에서 가하여 반응을 마무리한 후, 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 추출하고 MgSO₄로 건조시키고 감압하에서 농축하였다. 상기 크루드 생성물은 실리카겔 크로마토그래피(10:1 CH₂Cl₂/MeOH)로 정제하고 진공상태에서 건조시켜 450 mg의 목적 화합물(6)을 수득하였다(1.11 mmol, 69%).

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.81 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H₃), 7.34 (d, 2H, J = 8.0 Hz, H₂), 7.23 (brs, 2H, H₁₃), 4.19 (t, 2H, J = 4.9 Hz, H₄), 3.98 (s, 2H, H₁₂), 3.72-3.57 (m, 14H, H₅, H₆, H₇, H₈, H₉, H₁₀, and H₁₁), 2.45 (s, 3H, H₁);

¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 173.2, 145.0, 140.0, 130.1, 128.2, 71.4, 71.1, 70.7, 70.6 (70.635), 70.6 (70.625), 70.6 (70.596), 70.3, 69.5, 69.0, 21.9;

HRMS (ESI) Calcd for C₁₇H₂₇NO₈SNa (M + Na)⁺: 428.1350, Found: 428.1351.

< 실시예 1> 광변색 화합물(3, 이하 " DAE - TES )의 제조

단계 1: 화학식 8의 화합물의 제조

화학식 7의 화합물(518 mg, 0.937 mmol)과 상기 제조예 1에서 출발물질로 사용된 화학식 5의 화합물(472 mg, 1.12 mmol)을 아세토나이트릴(20 mL)에 녹인 용액에 오븐에서 건조된 K₂CO₃(389 mg, 2.81 mmol)를 가하였다. 상기 반응 혼합물을 80 ℃에서 12시간 동안 교반하고 상온으로 식힌 후, 감압하에서 농축시켰다. 상기 크루드 생성물을 실라카겔 크로마토그래피(4:1:1 hexane/CH₂Cl₂/acetone)로 정제하여 목적 화합물(8)을 117 mg 수득하였다(0.146 mmol, 16%).

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃, ring-open isomer) δ 7.43 (d, 2H, J = 8.8 Hz, H_3o), 7.39 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H_3o _′), 7.13 (7.134) (s, 1H, H_2o or H_2o _′), 7.13 (7.125) (s, 1H, H_2o or H_2o _′), 6.90 (d, 2H, J = 9.1 Hz, H_4o), 6.85 (d, 2H, J = 8.6 Hz, H_4o _′), 4.16 (s, 2H, H₁₃), 4.13 (t, 2H, J = 4.7 Hz, H₅), 3.86 (t, 2H, J = 4.9 Hz, H₆), 3.74 (s, 3H, H₁₄), 3.73-3.66 (m, 12H, H₇, H₈, H₉, H₁₀, H₁₁, and H₁₂), 1.95 (s, 3H, H_1o or H_1o _′), 1.94 (s, 3H, H_1o or H_1o _′);

¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃, ring-open isomer) δ 171.2, 158.9, 156.1, 142.3, 142.2, 140.5, 140.4, 139.2, 136.3, 127.3, 127.1, 126.6, 126.3, 126.0, 125.9, 121.6, 121.5, 116.1, 115.3, 110.8, 71.1, 71.0, 70.9, 70.8 (70.836), 70.8 (70.812), 69.9, 68.8, 67.8, 52.0, 14.7;

HRMS (ESI) Calcd for C₃₈H₃₈F₆O₈S₂Na (M + Na)⁺: 823.1805, Found: 823.1805.

단계 2: 화학식 9의 화합물의 제조

DMF(10 mL)에 녹인 상기 단계 1에서 수득한 화학식 8의 화합물(117 mg, 0.146 mmol) 및 상기 제조예 1에서 수득한 화학식 6의 화합물(118 mg, 0.291 mmol) 용액에 오븐 건조된 K₂CO₃(81 mg, 0.59 mmol)를 가하였다. 상기 반응 혼합물을 100 ℃에서 12시간 동안 교반하고 상온으로 식힌 후, 감압하에서 농축하였다. 상기 크루드 생성물을 실리카겔 크로마토그래피(1:1 CH₂Cl₂/acetone)로 정제하여 목적 화합물(9)을 126 mg 수득하였다(0.122 mmol, 84%).

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃, ring-open isomer) δ 7.44 (7.444) (d, 2H, J = 8.7 Hz, H_3o or H_3o _′), 7.44 (7.437) (d, 2H, J = 8.8 Hz, H_3o or H_3o _′), 7.14, 7.13 (s each, 2H, H_2o and H_2o _′), 6.96 (d, 2H, J = 8.8 Hz, H_4o or H_4o _′), 6.95 (d, 2H, J = 9.0 Hz, H_4o or H_4o _′), 4.24, 4.21 (m each, 4H, H₅ and H₅ _′), 4.20 (s, 2H, H₁₃), 3.99 (s, 2H, H₁₃ _′), 3.95, 3.89 (m each, 4H, H₆ and H₆ _′), 3.85-3.64 (m, 24H, H₇, H_7′, H₈, H₈ _′, H₉, H₉ _′, H₁₀, H₁₀ _′, H₁₁, H₁₁ _′, H₁₂, and H₁₂ _′), 3.77 (s, 3H, H₁₄), 1.96, 1.95 (s each, 6H, H₁ and H₁ _′);

HRMS (ESI) Calcd for C₄₈H₅₇F₆NO₁₃S₂Na (M + Na)⁺: 1056.3068, Found: 1056.3068.

단계 3: 화학식 10의 화합물의 제조

THF(4 mL) 및 MeOH(1 mL)의 혼합용액에 녹인 상기 단계 2에서 얻은 화학식 9의 화합물(119 mg, 0.115 mmol)에 0 ℃에서 1N LiOH 수용액(0.58 mL)을 천천히 가하였다. 상기 반응 혼합물을 50 ℃에서 1시간 동안 교반하고 상온으로 식혔다. 0 ℃에서, 상기 반응은 1N HCl 수용액을 가하여 반응을 마무리하고 에틸아세테이트로 추출한 후 MgSO₄로 건조시키고 감압하에서 농축하였다. 상기 크루드 화합물을 SEC 컬럼((Sephadex LH-20, H 10 cm x O.D. 3 cm)에 로딩하여 메탄올을 용매로 사용하여 정제하였다. 상기 푸른빛의 컬럼 분획을 합치고 감압하에서 농축시킨 후 진공하에서 건조시켜 목적 화합물(10)을 102 mg 수득하였다(0.100 mmol, 87%).

¹H NMR (600 MHz, CDCl₃, ring-open isomer) δ 7.44 (d, 2H, J = 8.8 Hz, H_3oor H_3o _′), 7.43 (d, 2H, J = 9.1 Hz, H_3o or H_3o _′), 7.13 (s, 2H, H_2o and H_2o _′), 6.94 (d, 2H, J = 9.0 Hz, H_4o or H_4o _′), 6.92 (d, 2H, J = 8.8 Hz, H_4o or H_4o _′), 4.19 (t, 2H, J = 4.8 Hz, H₅ or H₅ _′), 4.15 (m, 2H, H₅ or H₅ _′), 4.08 (s, 2H, H₁₃), 3.98 (s, 2H, H₁₃ _′), 3.88-3.85 (m, 4H, H₆ and H₆ _′), 3.76-3.64 (m, 24H, H₇, H₇ _′, H₈, H₈ _′, H₉, H₉ _′, H₁₀, H₁₀ _′, H₁₁, H₁₁ _′, H₁₂, and H₁₂ _′), 1.96 (s, 6H, H₁ and H₁ _′);

¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃, ring-open isomer) δ 174.0, 173.1, 158.9, 158.8, 142.3, 140.5, 138.5, 136.3, 127.1, 126.6, 125.9, 121.8, 121.6, 115.3, 71.5, 71.2, 71.1, 71.0, 70.9, 70.7 (70.748), 70.7 (70.670), 70.6 (70.588), 70.6 (70.562), 70.5 (70.508), 70.5 (70.470), 70.5 (70.454), 70.4, 70.2, 69.9 (69.899), 69.9 (69.852), 67.8, 67.7, 14.7;

HRMS (ESI) Calcd for C₄₇H₅₄F₆NO₁₃S₂ (M H): 1018.2946, Found: 1018.2948.

단계 4: 광변색 화합물(3, 이하 " DAE - TES ")의 제조

DMF(2 mL)에 녹인 상기 단계 3에서 수득한 화학식 10의 화합물 용액(16 mg, 16 μmol)에 N-하이드록시석신이미드(NHS, 1.8 mg, 15 μmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노)프로필카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC, 3.6 mg, 19 μmol)를 가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, 4.4 μL, 19 μmol) 및 트리에틸아민(7.9 μL, 57 μmol)을 상기 혼합물에 가하고, 상온에서 12시간 동안 교반시킨 후 진공 하에서 농축하였다. 광변색 화합물(3)을 포함하는 상기 크루드 반응 혼합물을 별도의 정제없이 다음 단계인 실리카 나노입자(2)를 제조하는 단계에서 사용하였다.

HRMS (ESI) Calcd for C₅₆H₇₇F₆N₂O₁₅S₂Si (M + H)⁺: 1223.4439, Found: 1223.4427.

< 실시예 2> 형광물질(4, 이하 " Cy3 - TES ")의 제조

DMSO-d₆(100 μL)에 녹인 Cy3 모노 NHS 에스터(2 mg, 80.43% reactive chromophore content, 2.1 μmol)용액에 APTES(0.6 μL, 2.5 μmol) 및 트리에틸아민(1.0 μL, 7.2 μmol)을 가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 17시간 동안 교반시키고 진공 하에서 농축시켰다. 형광물질(4)을 포함하는 상기 크루드 반응 혼합물은 별도의 정제없이 다음 단계인 실리카 나노입자(2)를 제조하는 단계에서 사용하였다.

< 실시예 3> 실리카 나노입자(1) 제조

단계 1: 양이온성 표면을 갖는 실리카 나노입자(2)의 제조

상기 실시예 1 및 2에서 얻은 광변색 물질인 DAE-TES(3), 형광물질인 Cy3-TES(4), 비닐트리에톡시실란(VTES), N'-[3-(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(DETA)을 공중합하였다. 구체적으로, 3.76 mL의 Tween-80 용액, 6.0 mL의 1-부탄올, 및 2.0 mL의 DMSO를 200 mL의 정제수에 가하고 교반하여 수중유형 마이크로에멀젼(oil-in-water microemulsion)을 만들었다. 이후, 건조된 상기 크루드 반응 혼합물 3(7.7 μmol, 약 100%의 수율 가정시) 및 4(1.1 μmol 약 100%의 수율 가정시)를 취하여 하나의 vial에서 2.0 mL의 DMSO-d₆에 완전히 용해시키고 즉시 상기 마이크로에멀젼에 가한 후, 이어서 VTES(2.0 mL)를 가하였다. 상기 반응 혼합물은 1시간 동안 교반하고, 200 μL의 NH₄OH 수용액, 그리고 200 μL의 DETA를 상기 혼합물에 차례대로 가하여 고분자 반응을 개시하였다. 상기 반응은 빛이 차단된 상태에서 실시되었고 상온에서 밤새도록 교반시켰다. 이후, 상기 반응 혼합물을 순서대로 DMSO(x 2, 각각 2 시간), 메탄올(2 시간), 및 정제수(x 2, 각 2시간 및 밤샘)에서 교반하며 투석(Spectra/Por Biotech Regenerated Cellulose (RC) membrane, MWCO 15000, Spectrum Laboratories)하였다. 상기 반응 혼합물을 동결건조시켜 물을 제거하고 4 ℃에 보관하였다. 이 중 일부의 상기 반응 혼합물을 정제수에 재분산시키고 microfuge membrane-filter (NANOSEP 100K OMEGA, Pall corporation)에서 13200 rpm으로 10분씩 4회 원심분리하여, Tween-80을 실리카 나노입자(2)로부터 제거하였다. 상기 방법으로 정제하여 membrane-filter에 채집된 실리카 나노입자(2)를 정제수에 재분산하고, 멸균여과(pore size: 0.45 μm) 후 동결건조하여 고체형태의 실리카 나노입자(2)로 수득하였다.

단계 2: 음이온성 표면을 갖는 실리카 나노입자(1)의 제조

상기 정제된 화학식 2의 실리카 나노입자(229 mg)를 10 mL의 DMSO에 분산시키고, 여기에 201 mg의 석신산 무수물(2.00 mmol)과 트리에틸아민(10.0 μL, 71.7 μmol)을 가하였다. 빛이 차단된 상태에서 반응을 진행하였고 상온에서 17시간 동안 교반하였다. 이어, 상기 반응 혼합물을 순서대로 DMSO(x 2, 각각 2 시간), 메탄올(2 시간), 및 정제수(x 3, 각 2시간)에서 교반하며 투석(Spectra/Por Biotech RC membrane, MWCO 15000, Spectrum Laboratories)하였다. 투석된 생성물은 멸균여과하고(pore size: 0.45 μm) 동결건조하여 반응식 2에 나타낸 실리카 나노입자(1)를 고체상태로 수득하였다.

< 실험예 1> 투과전자현미경( TEM ) 영상

실리카 나노입자 1 및 2를 정제수에 희석하여 1 mg/mL의 샘플 용액을 제조하였다. 각 희석액 2 μL를 200 메쉬 탄소가 코팅된 구리 그리드(Ted Pella)에 떨어뜨리고 대기 건조시키는 작업을 10번 반복하였다(총 20 μL 사용). 과량의 용액은 여과지로 제거하고 JEM-2100F 전계 방출 투과전자현미경(Field-Emission Transmission Electron Microscope, FE-TEM)을 사용하여 TEM 영상을 200 kV에서 얻었고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

< 실험예 2> 세포 배양

HeLa(Human epithelial cervical cancer) 세포 및 hADS(human adipose-derived stem) 세포는 ATCC 및 Hanson biotech에서 각각 구입하였고, 이 세포들은 37 ℃의 5%의 이산화탄소가 함유된 대기 하의 10% FBS(fetal bovine serum), 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium, Gibco)에서 배양하였다.

< 실험예 3> 세포 독성 측정( Cytotoxicity Assays )

정제수에 분산시킨 실리카 나노입자 1의 모액(5 mg/mL)을 제조하였다. 무혈청 DMEM 용액을 사용하여 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 및 100 μg/mL의 농도로 단계적으로 희석된 샘플을 준비하였다. HeLa 또는 hADS 세포는 37 ℃에서 평평한 바닥의 96-웰 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA)의 웰당 1×10³ 세포의 밀도로 24시간 동안 배양하여 세포를 바닥에 붙였다. 세포는 각 웰당 100 μL의 상기 희석액 또는 100 μL의 무혈청 DMEM(대조군)으로 처리하고 37 ℃에서 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 상기 제제는 5 mg/mL 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 녹인 무혈청 DMEM 용액으로 교체하고 세포를 추가로 4시간 동안 배양하였다. MTT를 흡입제거하고 DMSO(100 μL)를 각 웰에 가하여 포르마잔(formazan) 크리스탈을 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, BioRad사 제조)를 이용하여 570 nm에서 측정하였고 그 결과는 도 5에 나타내었다. 상기 분석은 각각 4번씩 반복측정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 실리카 나노입자 1은 HeLa 세포에서 100 μg/mL의 농도일 때 72시간이 지난 후에도 60% 이상의 세포가 생존하였고 hADS 세포에서는 100 μg/mL의 농도일 때 72시간이 지난 후에도 75% 이상의 세포가 생존함을 확인할 수 있다.

< 실험예 4> 세포 흡수 측정( Cellular Uptake Studies )

HeLa 또는 hADS 세포는 μ-Slide 8-웰 현미경 샘플 챔버(ibidi)에서 각 웰당 1×10⁴ 세포의 밀도로 배양하였다. 실리카 나노입자 1의 모액(5 mg/mL)을 무혈청 DMEM으로 희석하여 5 및 50 μg/mL의 농도의 용액을 제조하였다. 세포에 각 웰당 200 μL의 희석액을 가하고 각각 5, 15, 30, 45, 60, 120, 및 180분 동안 배양되었다. 동일한 수의 세포를 가진 200 μL의 무혈청 DMEM을 가한 웰을 동시에 대조군으로 준비하였다. 세포는 PBS로 세 번 씻어내고 4%의 파라포름알데하이드(PFA)를 처리하여 20분 동안 상온에서 고정화시켰다. 그 뒤에 PBS로 세 번 씻어내어 PFA를 제거하고, PBS에 녹인 2 mg/mL의 4'6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 5분간 처리한 후, PBS로 세 번 씻어내었다. 실리카 나노입자 1이 세포내로 들어가는 양상은(internalization profiles)은 RD-TR-PE (λ_ex 555 ± 14 nm, λ_em 617 ± 36.5 nm) 및/또는 DAPI (λ_ex 360 ± 20 nm, λ_em 457 ± 25 nm) 필터 세트가 장착된 DeltaVision RT 이미징 시스템(Applied Precision)을 이용하여 얻었고 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 일반적으로 실리카 나노입자 1은 시간이 흐를수록 세포 내로 더 많이 들어가는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 5> 용액샘플을 이용한 포토스위칭 실험( Photoswitching experiments )

실리카 나노입자 1(100 μg/mL)을 각각 정제수 또는 PBS 1.0 mL 씩에 분산하여 표준 1회용 큐벳(10 mm path length, 4.5 mL nominal capacity, 4 optical sides, polymethylmethacrylate, Kartell)에 담았다. 샘플 용액을 포함한 상기 큐벳을 샘플 홀더에 고정시키고, 상기 용액을 2분간 2 cm 떨어진 거리에서 자외선(UV) 램프(365 nm, 2.60 mW/cm² at 2 cm, Spectroline)로 조사하였다. 형광스펙트럼을 얻기 위하여 상기 UV 조사된 샘플 용액을 즉시 석영(quartz) Suprasil macro/semi-micro cell(4 mm × 4 mm light path, 0.5 mL cell volume, Perkin Elmer)로 빛이 차단된 상태에서 옮기고 Varian Cary Eclipse 형광 스펙트로포토미터를 이용하여 스캔하였다(500-700 nm scan range, irradiated at 510 nm, 5 nm excitation slit, 2.5 nm emission slit). 그 후, 상기 샘플 용액을 표준 1회용 큐벳(Kartell)으로 빛이 차단된 상태에서 다시 옮기고 590 nm 레이져빔(250-255 mW at 590 nm as measured through a magnifier lens at 25 °C, Sail Laser)으로 30분간 4 cm 떨어진 거리에서 조사하였다. 590 nm의 빛으로 조사시, 샘플 용액과 레이져 빔 중간지점에 확대 렌즈를 두어 샘플 용액의 전 면적에 균일하게 조사되도록 하였다. 590 nm 빛에 의해 조사된 상기 샘플 용액의 형광스펙트럼은 동일한 방법에 의해 얻어졌다. 자외선(365 nm)으로 2분간 조사 후 이어 가시광선(590 nm)로 30분간 조사하는 것을 한 과정으로 하는 포토스위칭 사이클을 5회 반복하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실리카 나노입자 1은 정제수에서보다 PBS 용액에서 포토스위칭이 조금 더 효율적임을 알 수 있었고, 자외선을 쬐었을 때는 형광세기가 대폭 감소하고 가시광선을 쬐었을 때 형광이 다시 원래의 세기로 돌아옴을 확인할 수 있었다.

< 실험예 6> 살아있는 세포에서의 포토스위칭 실험

HeLa 또는 hADS 세포는 μ-Slide 8-웰 현미경 샘플 챔버(ibidi)에서 각 웰당 1×10⁴ 세포의 밀도로 배양하였다. 실리카 나노입자 1의 모액(5 mg/mL)을 무혈청 DMEM으로 희석하여 50 μg/mL의 용액을 제조하였다. PBS로 세번 상기 세포를 씻고, 각 웰당 세포에 실리카 나노입자(1) 50 μg/mL 용액(200 μL per well)을 가한 후 37 ℃에서 30분간 배양하였다. 상기 제제는 PBS로 세번 씻어내 제거하고 상기 세포에 200 μL의 무혈청 DMEM을 가하였다. 살아있는 세포의 형광 이미지는 RD-TR-PE (λ_ex 555 ± 14 nm, λ_em 617 ± 36.5 nm) 필터 세트가 장착된 DeltaVision 이미징 시스템(Applied Precision)을 이용하여 얻었다. 상기와 같이 처리된 세포를 포함하는 선택된 웰의 전면적에 UV 램프(365 nm, Spectroline)로 2분간 조사한 뒤, DeltaVision RT 시스템으로 형광 이미지를 얻었다. 그리고, 이어서 선택된 웰의 전체 면적에 대해 중간에 확대렌즈를 통해 590 nm의 레이져 빔(Sail Laser)으로 30분간 조사하였다. 상기 살아있는 세포에 UV 및 590 nm 레이져 빔으로 조사된 샘플은 DeltaVision RT 이미징 시스템으로 형광 이미지를 얻었다. 살아있는 세포에 자외선(365 nm)으로 2분간 조사 후 이어 가시광선(590 nm)로 30분간 조사하는 것을 한 과정으로 하는 포토스위칭 사이클을 10회 반복하여 그 결과를 도 8에 나타내었다. 상기 포토스위칭 실험은 모두 빛이 차단된 곳에서 수행되었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실리카 나노입자 1은 세포 내로 들어가 형광을 나타내고, 자외선 및 가시광선의 교대 조사에 따라 형광이 거의 꺼지거나 다시 켜지는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

실리카 나노입자의 기반이 되는, 비닐트리알콕시실란(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다);
광스위치 역할을 수행하는, 일말단에 트리 알콕시실릴기(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다)가 도입된 광변색 물질; 및
상기 광변색 물질과 형광공명에너지전이(FRET)를 수행하는, 일말단에 트리알콕시실릴기(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다)가 도입된 형광물질;을 동시에 혼합하는 원포트(one-pot) 공정으로 실리카 나노입자를 제조하여, 상기 광변색 물질 및 형광물질이 형광공명에너지전이(FRET)를 수행할 수 있는 거리 이내에 위치되도록 상기 실리카 나노입자의 표면 및 내부 모두에 공유결합되는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 균일한 입자크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치이되,
상기 광변색 물질은 일말단에 트리알콕시실릴기(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다)가 도입되는 것을 특징으로 하는 아조벤젠(azobenzene), 스파이로파이란(spiropyran), 디아릴에텐(diarylethene) 유도체 및 펄가이드(fulgide)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 여기서 상기 디아릴에텐 유도체는 하기 화합물군으로부터 선택되는 어느 하나이고:

,
,
,
,
,
,
,
,
,
및

(여기서, 상기 R¹은 수소 또는 메틸이고; R²및 R³는수소, C₁~C₆의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C₅~C₆의 아릴, 또는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로원자를 하나 이상 포함하는 5-6원자 헤테로아릴이고, 상기 R² 및 R³는 서로 동일 또는 상이할 수 있다);
상기 형광물질은 일말단에 트리알콕시실릴기(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다)가 도입되는 것을 특징으로 하는 시아닌(cyanine, Cy) 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피(BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민(rhodamine), 플루오레신(fluorescein) 및 쿠마린(coumarin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 균일한 입자크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 디아릴에텐 유도체는 하기 화학식 3과 같이 한쪽 말단이 트리에톡시실릴기인 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치:
[화학식 3]

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삭제
제1항에 있어서, 상기 형광물질은 일말단에 트리알콕시실릴기(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다)가 도입되는 것을 특징으로 하는 시아닌(cyanine, Cy) 시리즈인 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
제6항에 있어서, 상기 형광물질은 하기 화학식 4와 같이 한쪽 말단이 트리에톡시실릴기인 Cy3(cyanine 3)인 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치:
[화학식 4]

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제1항에 있어서, 상기 실리카 나노입자는 20 내지 30 nm의 균일한 크기 분포를 가지는 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
제1항에 있어서, 상기 실리카 나노입자는 독성을 나타내는 아민기가 표면에 노출되는 것을 방지하기 위해 실리카 나노입자에 말단기로 남은 아민기를 음이온성 잔기를 갖도록 개질시키는 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
제9항에 있어서, 상기 음이온성 잔기는 카르복실레이트인 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
제1항에 있어서, 상기 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치는 생체 내 질병진단 영상화 방법과 결합하여 복합모드 영상을 얻을 목적으로 사용하되,
상기 생체 내 질병진단 영상화 방법은 자기공명영상화 방법(MRI), 컴퓨터 단층촬영 방법(CT), 양전자 방출 단층 촬영 방법(PET) 또는 단일 광자 방출 전산화 단층촬영 방법(SPECT)인 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치.
삭제
실리카 나노입자의 기반이 되는, 비닐트리알콕시실란(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다);
광스위치 역할을 수행하는, 일말단에 트리알콕시실릴기(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다)가 도입된 광변색 물질; 및
상기 광변색 물질과 형광공명에너지전이(FRET)를 수행하는, 일말단에 트리알콕시실릴기(여기서, 상기 알콕시는 C_1-3의 알콕시이다)가 도입된 형광물질;을 동시에 혼합하는 원포트(one-pot) 공정인 것을 특징으로 하는 제1항의 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치의 제조방법.