WO2017187717A1 - 蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法 - Google Patents

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fluorescence
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林幸壱朗
坂本渉
余語利信
丸岡弘規
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国立大学法人名古屋大学
倉敷紡績株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent probe containing two types of fluorescent dyes, a fluorescence detection method, and a method of using the fluorescent probe.
  • Fluorescence imaging analysis is used to analyze information such as where cells such as stem cells such as iPS cells and ES cells transplanted into mice, disease-related cells such as cancer cells and liver cirrhosis cells differentiate, grow, and metastasize after transplantation. Is a major technique.
  • a technique using fluorescence imaging analysis which is positioned as an especially important analysis technique.
  • Fluorescence image analysis of transplanted cells in vivo is usually performed by in vitro labeling the cells with a fluorescent probe in advance before transplantation, transplanting the cells into a living body such as a mouse, and in vivo (in vivo) fluorescence. This is done by observing with an imaging device.
  • Patent Document 1 describes that a porphyrin-containing complex obtained by binding an anionic porphyrin, a cationic organoalkoxysilane, and a noncationic silane is used as a near-infrared fluorescent probe for living body observation.
  • a fluorescent probe when a predetermined amount of cells are labeled with a fluorescent probe, usually all cells are not labeled with a fluorescent probe. Therefore, cells that are not bound to the fluorescent probe may be transplanted into a living body such as a mouse.
  • fluorescence cannot be detected by an in-vitro fluorescence imaging device such as a fluorescence microscope or a flow cytometer, and a fluorescent label bound to a near-infrared fluorescent probe in vitro. It is difficult to identify cells. This is because the wavelength characteristics required for the in vitro fluorescence imaging apparatus and the in vivo fluorescence imaging apparatus are different.
  • the in vitro fluorescence imaging apparatus generally performs analysis in an excitation wavelength range of 350 to 650 nm and the fluorescence wavelength range of 400 to 800 nm, and the in vivo fluorescence imaging apparatus in an excitation wavelength range of 600 to 850 nm and a fluorescence wavelength range of 650 to 920 nm. It is common to perform an analysis.
  • the present invention provides a fluorescent probe, a fluorescence detection method, and a method of using a fluorescent probe that can be used for both in vitro and in vivo fluorescence imaging analysis in order to solve the above-described conventional problems.
  • the present invention relates to a fluorescent probe comprising a carrier molecule and a fluorescent dye a and a fluorescent dye b bonded to the carrier molecule, wherein the excitation wavelength of the fluorescent dye a is different from the excitation wavelength of the fluorescent dye b.
  • the present invention relates to a fluorescent probe characterized in that no fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs between the dyes b.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the fluorescent probe is preferably a fluorescent probe for cell labeling
  • the fluorescent dye a is a fluorescent dye for in vitro fluorescent imaging
  • the fluorescent dye b is preferably a fluorescent dye for in vivo fluorescent imaging.
  • the fluorescent probe may be labeled by binding specifically to the cell surface, or may be labeled by being taken into the cell.
  • Fluorescent dye a preferably has an excitation wavelength in the range of 350 to 650 nm, and fluorescent dye b preferably has an excitation wavelength in the range of 600 to 850 nm.
  • the fluorescent dye a is preferably porphyrin. It is preferable that the fluorescent dye b is indocyanine green.
  • the carrier molecule is preferably polysiloxane.
  • the fluorescent probe may be used for selection of fluorescently labeled cells using a flow cytometer.
  • the present invention is also a fluorescence detection method for observing a target cell, the step of labeling the target cell with a fluorescent probe, and irradiating the target cell labeled with the fluorescent probe with an excitation light to emit fluorescence from the fluorescent probe.
  • the fluorescent probe includes a carrier molecule, a fluorescent dye a and a fluorescent dye b bonded to the carrier molecule, and the excitation wavelength of the fluorescent dye a is different from the excitation wavelength of the fluorescent dye b,
  • the present invention also relates to a fluorescence detection method characterized in that no fluorescence resonance energy transfer occurs between the fluorescent dye a and the fluorescent dye b.
  • the target cells labeled with the fluorescent probe may be irradiated with excitation light that excites the fluorescent dye a, and the fluorescence from the fluorescent probe may be observed by in vitro fluorescent imaging.
  • target cells labeled with a fluorescent probe are transplanted into a living body (excluding the human body), and the living body is irradiated with excitation light that excites the fluorescent dye b, and fluorescence from the fluorescent probe is observed by in vivo fluorescence imaging. May be.
  • the present invention is also a method for using the above-described fluorescent probe, comprising a step of fluorescently labeling a cell with a fluorescent probe, and a fluorescently labeled cell fluorescently labeled with a fluorescent probe being confirmed by a flow cytometer or a fluorescent microscope. And a step of transplanting the selected fluorescently labeled cells into a living body (excluding the human body), and a step of observing the fluorescently labeled cells in the living body with an in vivo fluorescence imaging apparatus. Cell sorting is performed by detecting fluorescence derived from fluorescent dye a, and observation of the in vivo fluorescence-labeled cells with an in vivo fluorescence imaging apparatus is performed by detecting fluorescence derived from fluorescent dye b.
  • the present invention relates to a method for using a fluorescent probe.
  • the present invention can perform both in vitro and in vivo fluorescence imaging analysis by using a fluorescent probe having a fluorescent dye a and a fluorescent dye b that have different excitation wavelengths and do not cause fluorescence resonance energy transfer.
  • in vitro fluorescence imaging analysis of cells can be performed with in vitro fluorescence imaging devices such as existing fluorescence microscopes and flow cytometers, and in vivo fluorescence imaging analysis in vivo with existing in vivo fluorescence imaging devices Can do.
  • fluorescent labeled cells labeled with a fluorescent probe are selected by a flow cytometer, the selected fluorescent labeled cells are transplanted into a living body such as a mouse, and the localization of the fluorescent labeled cells in a living mouse or the like is localized. Can be observed over time.
  • FIG. 1 shows Fourier transform of tetrakis (4-carboxyphenyl) porphyrin (TCPP) and hybrid nanoparticles (PPS HNPs) produced by hydrolysis and condensation of TCPP and (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane (MPTMS).
  • TCPP tetrakis (4-carboxyphenyl) porphyrin
  • PPS HNPs hybrid nanoparticles
  • MPTMS 3-mercaptopropyl) trimethoxysilane
  • FIG. 2 shows the 29 Si solid state nuclear magnetic resonance (solid state NMR) spectrum of PPS HNPs.
  • FIG. 3 shows TG and DTA curves of PPS HNPs.
  • FIG. 4A shows the absorption spectrum of the supernatant after the FA-PEG / ICG-PPS HNPs production reaction
  • FIG. 4B shows the concentration calibration curve of folic acid.
  • FIG. 5 shows absorption spectra of PPS HNPs and a complex in which indocyanine green (ICG) and folic acid (FA) are further bound to PPS HNPs (FA-PEG / ICG-PPS HNPs).
  • 6A shows the excitation spectrum and fluorescence spectrum on the short wavelength side of FA-PEG / ICG-PPSPPHNPs
  • FIG. 6B shows the excitation spectrum and fluorescence spectrum on the long wavelength side of FA-PEG / ICG-PPS HNPs.
  • FIG. 7A shows a bright-field image of RAW264.7 cells derived from mouse macrophages (Bright field), a fluorescence image (DAPI) of RAW264.7 cells stained with DAPI, PPS HNPs, and indocyanine green (ICG).
  • DAPI fluorescence image
  • PPS HNPs PPS HNPs
  • ICG indocyanine green
  • FIG. 7B shows a bright field image of HeLa ⁇ S3 cells derived from human cervical cancer (Bright field), a fluorescence image (DAPI) of HeLa S3 cells stained with DAPI, and labeled with FA-PEG / ICG-PPS HNPs.
  • a fluorescence image (FA-PEG / ICG-PPS HNPs) of the HeLa S3 cells thus prepared and an image (Merge) obtained by superimposing these three images are shown.
  • FIG. 7C shows a bright-field image of human colorectal cancer-derived HCT116 cells (Bright field), a fluorescence image (DAPI) of HCT116 cells stained with DAPI, and HCT116 labeled with FA-PEG / ICG-PPS HNPs.
  • FIG. 8 shows the result of analyzing RAW264.7 cells labeled with ICG-PPS HNPs using a flow cytometer.
  • FIG. 9 shows the results of analysis of HeLa S3 cells labeled with FA-PEG / ICG-PPS HNPs using a flow cytometer.
  • FIG. 10 shows the results of analysis of HCT116 cells labeled with FA-PEG / ICG-PPS HNPs using a flow cytometer.
  • FIG. 11 shows the results of observation of the time-dependent localization of fluorescently labeled cells in a mouse transplanted with RAW264.7 cells labeled with ICG-PPSNHNPs using a fluorescent in vivo imaging apparatus.
  • FIG. 12 shows the results of observation of the time-dependent localization of fluorescently labeled cells in a mouse transplanted with HeLaS3 cells labeled with FA-PEG / ICG-PPS HNPs using a fluorescent in vivo imaging apparatus.
  • FIG. 13 shows fluorescence images obtained by observing each organ 24 hours later in a mouse transplanted with RAW264.7 cells labeled with ICG-PPS HNPs using an in vivo fluorescence imaging apparatus.
  • FIG. 14 shows the results of analysis of each organ 24 hours later in mice transplanted with RAW264.7 cells labeled with ICG-PPS HNPs using an in vivo fluorescence imaging apparatus.
  • FIG. 15 shows fluorescence images obtained by observing each organ 24 hours later with an in vivo fluorescence imaging apparatus of a mouse transplanted with HeLa S3 cells labeled with FA-PEG / ICG-PPS HNPs.
  • FIG. 16 shows the results of analyzing each organ 24 hours later of a mouse transplanted with HeLa S3 cells labeled with FA-PEG / ICG-PPS HNPs using a fluorescent in vivo imaging apparatus.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies on fluorescent probes that can be used for both in vitro and in vivo fluorescent imaging analysis. As a result, the carrier molecules and the fluorescent dyes a and b bound to the carrier molecules are obtained.
  • the fluorescent dye a and the fluorescent dye b can be used for both in vitro and in vivo fluorescent imaging analysis by using fluorescent dyes having different excitation wavelengths and causing no fluorescence resonance energy transfer.
  • the inventors have found that a fluorescent probe that can be obtained is obtained, and have reached the present invention.
  • fluorescent probes containing two types of fluorescent dyes exist, but these fluorescent probes cause fluorescence resonance energy transfer between the two types of fluorescent dyes, and both in vitro and in vivo fluorescent imaging. It cannot be used for analysis.
  • the fluorescent probe of the present invention includes a carrier molecule and a fluorescent dye a and a fluorescent dye b bonded to the carrier molecule.
  • the fluorescent dye a and the fluorescent dye b have different excitation wavelengths, and the fluorescent dye a and the fluorescent dye b are fluorescent. No fluorescence resonance energy transfer occurs between the dyes b.
  • the fluorescent dye a and the fluorescent dye b are preferably covalently bonded to the carrier molecule.
  • the fluorescent dye a is preferably a fluorescent dye for in vitro fluorescent imaging (also referred to as a fluorescent dye for visible light fluorescent imaging), an excitation wavelength is in the range of 350 to 650 nm, and a fluorescence wavelength is in the range of 400 to 800 nm. More preferably, the excitation wavelength is in the range of 380 to 580 nm, and the fluorescence wavelength is more preferably in the range of 450 to 680 nm.
  • fluorescently labeled cells labeled with a fluorescent probe can be observed with an in vitro fluorescence imaging apparatus such as a general-purpose fluorescence microscope or a flow cytometer.
  • fluorescent dyes for in vitro fluorescent imaging such as porphyrin, fluorescein, rhodamine and the like can be used.
  • the porphyrin is not particularly limited, but a porphyrin having a carboxyl group can be used from the viewpoint of being suitable as a fluorescent dye for in vitro fluorescence imaging.
  • Porphyrin is used as a generic term for a cyclic compound in which four pyrrole rings are alternately bonded to four methine groups at the ⁇ -position and derivatives thereof.
  • Porphyrins having a carboxyl group generally have an excitation wavelength in the range of 400 to 650 nm and a fluorescence wavelength in the range of 600 to 740 nm.
  • porphyrin having a carboxyl group for example, a compound represented by the following general formula (I) can be used.
  • R 1b , R 2b , R 3b , and R 4b may be the same or different, and represent a carboxyl group (COOH), a sulfo group (SO 3 H), or a hydrogen atom (H). (Except when all are hydrogen atoms or all are sulfo groups).
  • R 1b , R 2b , R 3b , and R 4b are all carboxyl groups, or R 1b is a carboxyl group, and R 2b , R 3b , and R 4b are hydrogen atoms.
  • the porphyrin having a carboxyl group is more preferably a compound represented by the general formula (I), wherein R 1b , R 2b , R 3b and R 4b are all carboxyl groups.
  • a compound in which R 1b , R 2b , R 3b , and R 4b are all carboxyl groups is called tetrakis (4-carboxyphenyl) porphyrin (TCPP).
  • bilirubin, hemin, protoporphyrin and the like can be used as porphyrin having a carboxyl group.
  • the porphyrin having a carboxyl group used in the present invention is a known compound or can be easily produced by a known method.
  • commercially available products can be obtained from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the fluorescent dye b a fluorescent dye having an excitation wavelength different from that of the fluorescent dye a and causing no fluorescence resonance energy transfer with the fluorescent dye a is used.
  • the fluorescent dye b is preferably a fluorescent dye for in vivo fluorescent imaging (also referred to as a near infrared fluorescent imaging fluorescent dye), an excitation wavelength is in the range of 600 to 850 nm, and a fluorescence wavelength is in the range of 650 to 920 nm. More preferably, the excitation wavelength is in the range of 630 to 790 nm, and the fluorescence wavelength is more preferably in the range of 680 to 910 nm.
  • fluorescently labeled cells labeled with a fluorescent probe in a living body such as a mouse can be observed with a general-purpose in vivo fluorescence imaging apparatus.
  • fluorescent dye b for example, fluorescent dyes for in vivo fluorescent imaging such as indocyanine compounds, coumarin, rhodamine, xanthene, hematoporphyrin, and fluorescamine can be used.
  • fluorescent dyes for in vivo fluorescent imaging such as indocyanine compounds, coumarin, rhodamine, xanthene, hematoporphyrin, and fluorescamine can be used.
  • indocyanine compound indocyanine green or a derivative thereof is preferably used from the viewpoint of safety in the living body.
  • Indocyanine green generally has an excitation wavelength in the range of 740 to 790 nm and a fluorescence wavelength in the range of 810 to 860 nm.
  • An indocyanine green derivative is a compound in which the main skeleton and function of indocyanine green are maintained, and a part of the derivative is substituted with other functional groups, and the excitation wavelength is in the range of 750 to 790 nm, and the fluorescence wavelength is It is in the range of 790 to 900 nm.
  • the fluorescent dye b is affected by autofluorescence from food in a living body such as a mouse.
  • fluorescently labeled cells labeled with a fluorescent probe in a living body such as a mouse can be observed with a general-purpose in vivo fluorescence imaging apparatus.
  • fluorescently labeled cells labeled with a fluorescent probe localized in an organ in a living body such as a mouse can be observed.
  • the carrier molecule may be any one that can bind to the fluorescent dye a and the fluorescent dye b and maintain different excitation wavelengths of the fluorescent dye a and the fluorescent dye b.
  • a polymer such as an inorganic polymer such as polysilane, polygermane, polystannane, polysiloxane, polysilsesquioxane, polysilazane, polyboradylene, polyphosphazene, or an organic polymer such as polypyrrole, polyethylene glycol, or polysaccharide can be used.
  • the fluorescent dye a and the fluorescent dye b can be appropriately selected and used so that the fluorescence of the fluorescent dye a does not excite the fluorescent dye b.
  • the carrier molecule is preferably polysiloxane (hereinafter also referred to as a polymer having a siloxane bond). Polysiloxane is formed, for example, by hydrolysis and polycondensation of a silane compound, as will be described later.
  • the fluorescent probe of the present invention is preferably used as a fluorescent probe for cell labeling.
  • cells may be labeled by specifically binding to the cell surface.
  • the fluorescent probe of the present invention preferably has a cell surface binding substance that binds to a substance that specifically recognizes the cell surface.
  • the fluorescent probe specifically binds to the cell surface via a cell surface binding substance and labels the cell, it can be used as a fluorescent probe for cell labeling.
  • a substance that specifically recognizes the surface of a cell is a protein, lipid, sugar chain, and / or nucleic acid, etc. present on the surface of a specific cell. For example, there are folate receptors, transferrin receptors, antigens, etc.
  • Cancer cells can be specifically labeled by binding folic acid, transferrin, antibodies, etc. to the fluorescent probe.
  • cell surface markers membrane proteins
  • stem cells such as iPS cells and ES cells. By binding a molecule or the like that specifically binds to a cell surface marker to a fluorescent probe, stem cells such as iPS cells and ES cells can be specifically labeled.
  • the fluorescent probe of the present invention may be labeled by being incorporated into the cell.
  • examples of such cells include macrophages, dendritic cells, immune cells, cancer cells, iPS cells and the like.
  • macrophages, dendritic cells, immune cells, cancer cells, iPS cells, and the like that incorporate fluorescent probes inside the cells, the dynamics of macrophages and dendritic cells in the body can be confirmed in immune cell therapy.
  • the fluorescent probe of the present invention binds a carrier molecule and a fluorescent dye a, preferably a covalent bond to form a complex of the carrier molecule and the fluorescent dye a, and then a nanoparticle comprising a complex of the carrier molecule and the fluorescent dye a It can be produced by binding, preferably covalently binding, a fluorescent dye b to the surface to form a complex of a carrier molecule, a fluorescent dye a and a fluorescent dye b.
  • the fluorescent dye b is bound to the nanoparticles composed of the complex of the carrier molecule and the fluorescent dye a
  • the cell surface binding substance may be simultaneously bound to the nanoparticles composed of the complex of the carrier molecule and the fluorescent dye a.
  • the fluorescent probe of the present invention comprises a complex of the carrier molecule and the fluorescent dye b after binding the carrier molecule and the fluorescent dye b, preferably a covalent bond to form a complex of the carrier molecule and the fluorescent dye b.
  • the nanoparticle may be produced by binding a fluorescent dye a, preferably covalently, to form a complex of a carrier molecule, a fluorescent dye a, and a fluorescent dye b.
  • the fluorescent dye a is bound to the nanoparticles composed of the complex of the carrier molecule and the fluorescent dye b
  • the cell surface binding substance may be simultaneously bound to the nanoparticles composed of the complex of the carrier molecule and the fluorescent dye b.
  • the excitation wavelength and fluorescent wavelength of fluorescent dye a and fluorescent dye b Is preferably almost unchanged before and after binding to the carrier molecule.
  • the fluorescent dye a and the fluorescent dye b are selected from fluorescent dyes having different excitation wavelengths and the fluorescence of one fluorescent dye does not excite the other fluorescent dye, and the fluorescence in the complex of the carrier molecule, the fluorescent dye a, and the fluorescent dye b. FRET is prevented from occurring between the fluorescent dye a and the fluorescent dye b by adjusting the arrangement of the dye a and the fluorescent dye b.
  • fluorescent dye a and fluorescent dye b when the carrier molecule is polysiloxane, either fluorescent dye a or fluorescent dye b is incorporated in the siloxane network (polymer main chain), and the other is It is preferable that it is not incorporated in the siloxane network and is bonded to a functional group (functional group that does not form a siloxane network) on the surface of the nanoparticle composed of a complex of polysiloxane and one fluorescent dye. With such a structure, FRET hardly occurs between the fluorescent dye a and the fluorescent dye b.
  • a fluorescent probe can be prepared as follows.
  • a silane having an amino group and a porphyrin having a carboxyl group are reacted to obtain a silane containing porphyrin in the molecule (hereinafter also referred to as “porphyrin-silane”).
  • silane having an amino group and porphyrin having a carboxyl group are dissolved in a solvent, and a condensing agent is added to cause an amidation reaction.
  • a solvent for example, N, N-dimethylformamide (DMF) or the like can be used.
  • DMF N-dimethylformamide
  • the condensing agent for example, carbodiimide or the like can be used.
  • the carbodiimide is not particularly limited, and examples thereof include N, N′-dipropylcarbodiimide.
  • succinimide or the like may be added.
  • the succinimide is not particularly limited, and examples thereof include N-hydroxysuccinimide.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 20 to 150 ° C., and more preferably 20 to 80 ° C. from the viewpoint of synthesis cost.
  • the reaction time is not particularly limited, but is preferably 1 to 72 hours, for example, and more preferably 1 to 24 hours. After the reaction, the porphyrin-silane can be obtained by centrifuging and collecting the product as a precipitate.
  • the molar ratio of the silane containing an amino group and the porphyrin having a carboxyl group is preferably 4: 1 to 1: 1, more preferably 4 : 1 to 2: 1, more preferably 4: 1.
  • a complex of siloxane and porphyrin is obtained by hydrolysis / condensation reaction between the porphyrin-silane obtained above and a silane having one or more functional groups (hereinafter also referred to as “functional silane”).
  • porphyrin-silane and functional group silane are dissolved in a solvent, and an alkali solution is further added to react.
  • the solvent for example, DMF or the like can be used.
  • the alkaline solution for example, ammonia water having a pH of 8 or more, an aqueous solution of sodium hydroxide, or the like can be used.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 20 to 200 ° C., and more preferably 60 to 80 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, but is preferably 1 to 72 hours, for example, and more preferably 3 to 24 hours.
  • the product is recovered as a precipitate by centrifuging to obtain a complex of polysiloxane and porphyrin in which porphyrin is covalently bonded to polysiloxane.
  • the molar ratio of porphyrin-silane to functional group silane is preferably 1: 2 to 1: 100, more preferably 1:21 to 1:50. More preferably, it is 1:30 to 1:40.
  • the silane having an amino group is not particularly limited as long as it has an amino group.
  • a compound represented by the following general formula (II) can be suitably used.
  • X represents H 2 NC m H 2m —, H 2 NC n H 2n —HNC m H 2m —, or Ph—NHC m H 2m — [wherein Ph represents a phenyl group.
  • a group represented by H 2 NC m H 2m — or H 2 NC n H 2n —HNC m H 2m — is preferred.
  • m and n are the same or different and each represents an integer of 1 to 6.
  • m is preferably 1, 2, 3, or 4, and more preferably 1, 2, or 3.
  • n is preferably 1, 2, 3 or 4, and more preferably 1, 2, or 3.
  • H 2 NC m H 2m- , H 2 NC n H 2n -HNC m H 2m -and Ph-NHC m H 2m - are respectively represented by H 2 N (CH 2 ) m -and H 2 N ( CH 2 ) n —HN (CH 2 ) m — and Ph—NH (CH 2 ) m — are preferred.
  • R 1a and R 2a are the same or different and each represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group may be linear or branched, and is preferably linear. Moreover, a C1, 2, 3 or 4 alkyl group is preferable.
  • Specific examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, 1-ethylpropyl and isopentyl.
  • neopentyl n-hexyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 3,3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl, isohexyl, 3-methylpentyl and the like.
  • methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl and isobutyl are preferred.
  • I represents 1 or 2
  • j represents 0 or 1, [(4-ij) ⁇ 2]. That is, (i, j) represents (1, 0), (1, 1), or (2, 0).
  • Examples of the compound represented by the general formula (II) include 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3- (2-aminoethylamino) propyldimethoxymethylsilane, and 3- (2-aminoethylamino) propyl.
  • Examples include triethoxysilane, 3- (2-aminoethylamino) propyltrimethoxysilane, 3-aminopropyldiethoxymethylsilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, and trimethoxy [3- (phenylamino) propyl] silane. .
  • 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) and / or 3-aminopropyltrimethoxysilane are preferable.
  • silane having an amino group described above for example, a commercial product manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. can be used. Moreover, the silane which has an amino group can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • the functional group silane is not particularly limited as long as it has one or more types of functional groups, and may be a monofunctional group silane having one type of functional group, or a polyfunctional group silane having two or more types of functional groups. There may be.
  • a silane having a functional group for example, the general formula (III): Y p -Si (R 2c) q (OR 1c) (4-pq) (III)
  • the compound represented by can be used suitably.
  • Y represents a group represented by CH 2 ⁇ CH—, a group represented by CH 2 ⁇ CHCH 2 —, a group having an alkene, a group having a thiol, a group having a disulfide, and a group having an amine.
  • ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ each independently represent an integer of 1 to 6, preferably an integer of 1, 2, 3, or 4, and ⁇ is 0.
  • the alkyl group having 1 to 18 carbon atoms preferably has 1 to 12 carbon atoms, and more preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 carbon atoms.
  • it may be linear or branched, and is preferably linear.
  • R 1c represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or — (CH 2 ) ⁇ —OCH 3
  • R 2c represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a phenyl group.
  • R 1c and R 2c may be the same or different.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear or branched, and is preferably linear.
  • a C1, 2, 3 or 4 alkyl group is preferable.
  • alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, 1-ethylpropyl and isopentyl. And neopentyl, n-hexyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 3,3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl, isohexyl, 3-methylpentyl and the like. Of these, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl and isobutyl are preferred.
  • ⁇ represents an integer of 1 to 4 (preferably 1, 2 or 3).
  • P is 1, 2 or 3, q is 0, 1 or 2, provided that (4-pq) ⁇ 1. That is, (p, q) represents (1, 0), (1, 1), (1, 2), (2, 0), (2, 1) or (3, 0).
  • Z is a group represented by CH 2 ⁇ CH—, a group represented by CH 2 ⁇ CHCH 2 —, a group having an alkene, a group having a thiol, a group having a disulfide, and a group having an amine.
  • ⁇ and ⁇ each independently represent an integer of 1 to 6, preferably an integer of 1, 2, 3 or 4, ⁇ represents an integer of 0 to 8, preferably 0, 1, 2, 3 An integer of 4, 5, 6 or 7 is shown.
  • the alkyl group having 1 to 18 carbon atoms preferably has 1 to 12 carbon atoms, and more preferably 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 carbon atoms. Moreover, it may be linear or branched, and is preferably linear.
  • ClC ⁇ H 2 ⁇ -, CF 3 C ⁇ F 2 ⁇ -C ⁇ H 2 ⁇ - respectively, Cl (CH 2) ⁇ - , CF 3 (CF 2) ⁇ - (CH 2) ⁇ - is It is preferable.
  • N- [2- (N-vinylbenzylamino) ethyl] -3-aminopropyltrimethoxysilane hydrochloride may be used as the polyfunctional silane.
  • the compound represented by the general formula (III) include tetramethoxysilane, tetraethoxysilane, tetrapropoxysilane, tetrabutoxysilane, tetraisopropoxysilane, allyltriethoxysilane, allyltrimethoxysilane, di Ethoxymethylvinylsilane, dimethoxymethylvinylsilane, triethoxyvinylsilane, vinyltrimethoxysilane, vinyltris (2-methoxyethoxy) silane, (chloromethyl) triethoxysilane, 3-chloropropyldimethoxymethylsilane, 3-chloropropyltriethoxysilane, 2- (3,4-epoxycyclohexyl) ethyltrimethoxysilane, 3-mercaptopropyl (dimethoxy) methylsilane, (3-mercaptopropyl) triethoxysilane
  • Specific examples of the compound represented by the general formula (IV) include allyltrichlorosilane, trichlorovinylsilane, 3-chloropropyltrichlorosilane, and trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-heptadecafluorodecyl) silane.
  • Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluoro-n-octyl) silane butyltrichlorosilane, cyclohexyltrichlorosilane, decyltrichlorosilane, dodecyltrichlorosilane, ethyltrichlorosilane, n-octyltrichlorosilane, phenyltrichlorosilane Trichloro-2-cyanoethylsilane, trichlorohexylsilane, trichloro (methyl) silane, trichlorooctadecylsilane, trichloro (propyl) silane, trichlorotetradecylsilane and the like.
  • functional group silane for example, a commercial product manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. can be used. Moreover, functional group silane can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • a nanoparticle composed of a composite of polysiloxane and porphyrin is reacted with indocyanine green to form a composite of polysiloxane, porphyrin and indocyanine green.
  • an aqueous solution of indocyanine green is added to an aqueous solution of nanoparticles composed of a composite of polysiloxane and porphyrin, and the reaction is performed by stirring at a temperature of 4 to 50 ° C. for 1 to 24 hours.
  • a functional group on the surface of the nanoparticle composed of a complex of polysiloxane and porphyrin and indocyanine green are covalently bonded to form a complex of polysiloxane, porphyrin and indocyanine green.
  • indocyanine green indocyanine green modified with a functional group that binds to a functional group on the surface of a nanoparticle composed of a composite of polysiloxane and porphyrin is used.
  • functional group silanes forming nanoparticles composed of a composite of polysiloxane and porphyrin are 3-mercaptopropyl (dimethoxy) methylsilane, (3-mercaptopropyl) triethoxysilane, (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane, etc.
  • indocyanine green to which a maleimide group is bonded can be used.
  • a cell surface binding substance for example, Folic acid may be bound to nanoparticles composed of a composite of polysiloxane and porphyrin.
  • folic acid polyethylene glycol (PEG) having a maleimide group bonded to one end and folic acid bonded to the other end can be used.
  • a functional group covalently bonded to indocyanine green of the nanoparticle composed of a composite of polysiloxane and porphyrin and a functional group covalently bonded to the nanoparticle composed of a complex of polysiloxane and porphyrin by modifying indocyanine green.
  • the molar ratio of groups is preferably 1: 1 to 3: 1. The ratio is more preferably 1: 1 to 2: 1, and even more preferably 1: 1.
  • the carboxyl group of TCPP is present by forming an amide bond in the complex of polysiloxane and porphyrin, and TCPP is present in the siloxane network (main chain of polysiloxane) by the amide bond. More preferably, it is incorporated.
  • indocyanine green is preferably bonded to a functional group on the surface of a nanoparticle composed of a composite of polysiloxane and porphyrin (a functional group of a functional silane that forms a nanoparticle composed of a composite of polysiloxane and porphyrin).
  • FRET does not occur between porphyrin and indocyanine.
  • the structure of a complex such as a complex of polysiloxane and porphyrin or a fluorescent probe can be analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy as described later.
  • the fluorescent probe is not particularly limited, but preferably includes 1% by mass or more of fluorescent dye a and 0.1% by mass or more of fluorescent dye b from the viewpoint of being suitable for both in vitro and in vivo fluorescent imaging. More preferably, it contains 5 to 90% by mass of fluorescent dye a and 1 to 10% by mass of fluorescent dye b.
  • the fluorescent dye a is porphyrin
  • the fluorescent dye b is indocyanine green
  • the carrier molecule is polysiloxane
  • the content of the cyclic structure portion (porphine) of the four pyrroles of porphyrin is 1 in the fluorescent probe.
  • the content is preferably at least mass%
  • the indocyanine green content is preferably at least 0.1 mass%.
  • the content of the cyclic structure part (porphine) of the four pyrroles of porphyrin is 5 to 90% by mass, and the content of indocyanine green is 1 to 10% by mass.
  • a carrier molecule such as a fluorescent dye such as porphyrin or a silica polymer is measured by thermogravimetric / differential thermal analysis of a complex such as a complex of polysiloxane and porphyrin or a fluorescent probe. be able to.
  • the fluorescent probe is not particularly limited, but the average particle diameter is preferably 3 to 250 nm, more preferably 10 to 80 nm, from the viewpoint of easy labeling of cells.
  • the average particle diameter is measured by a dynamic light scattering method.
  • the fluorescence detection method of the present invention is used for observing target cells. Specifically, the method includes a step of labeling target cells with a fluorescent probe and a step of irradiating the target cells labeled with the fluorescent probe with excitation light and observing fluorescence from the fluorescent probe.
  • the fluorescent probe the above-described fluorescent probe of the present invention is used.
  • the labeling of the target cell can be performed by binding the fluorescent probe to the cell surface or by incorporating the fluorescent probe into the cell.
  • the fluorescent probe has a cell surface binding substance.
  • cancer cells such as HeLa ⁇ S3 cells derived from human cervical cancer or HCT116 cells derived from human colon cancer to label these cancer cells.
  • cells can be labeled with a fluorescent probe by culturing the cells in a cell culture medium containing a fluorescent probe.
  • target cells include stem cells such as iPS cells and ES cells, disease-related cells such as cancer cells and cirrhosis cells, and the like.
  • the fluorescent dye a is excited with excitation light having a wavelength range of 350 to 650 nm, and fluorescence in the wavelength range of 400 to 800 nm is observed.
  • the fluorescent dye a is excited with excitation light having a wavelength range of 380 to 580 nm, and fluorescence in the wavelength range of 450 to 680 nm is observed.
  • target cells labeled with a fluorescent probe are transplanted into a living body (excluding the human body), and the target cells labeled with the fluorescent probe in the living body are irradiated with excitation light that excites the fluorescent dye b, and in vivo.
  • the fluorescence from the fluorescent probe can be observed by in vivo fluorescence imaging using a fluorescence imaging apparatus.
  • the fluorescent dye b is excited with excitation light having a wavelength range of 600 to 850 nm, and fluorescence in the wavelength range of 650 to 920 nm is observed.
  • the fluorescent dye b is excited with excitation light having a wavelength range of 630 to 790 nm, and fluorescence in the wavelength range of 680 to 910 nm is observed.
  • the living body is not particularly limited as long as it is an animal that can perform fluorescence observation.
  • a mammal is preferred.
  • rodent mammals such as mice and rats.
  • the transplantation of target cells labeled with a fluorescent probe into a living body such as a mouse can be performed as described later.
  • target cells labeled with the fluorescent probe can be observed both in vitro and in vivo.
  • the method of using the fluorescent probe of the present invention comprises a step of fluorescently labeling cells with a fluorescent probe, a step of selecting and labeling fluorescently labeled cells labeled with a fluorescent probe with a flow cytometer or a fluorescent microscope, and a selected fluorescent label
  • the method includes a step of transplanting cells into a living body (excluding a human body) and a step of observing fluorescently labeled cells in the living body with an in vivo fluorescence imaging apparatus.
  • the cells are fluorescently labeled with a fluorescent probe.
  • Labeling of cells can be performed by binding a fluorescent probe to the cell surface or incorporating a fluorescent probe into the cell.
  • the fluorescent probe has a cell surface binding substance.
  • cancer cells such as HeLa ⁇ S3 cells derived from human cervical cancer or HCT116 cells derived from human colon cancer to label these cancer cells.
  • cells can be labeled with a fluorescent probe by culturing the cells in a cell culture medium containing a fluorescent probe.
  • the cells include stem cells such as iPS cells and ES cells, disease-related cells such as cancer cells and cirrhosis cells.
  • the fluorescence-labeled cells labeled with the fluorescent probe are selected with a flow cytometer. Confirmation and selection of the fluorescence-labeled cells by a flow cytometer or a fluorescence microscope is performed by detecting fluorescence derived from the fluorescent dye a. Specifically, the cells after performing the fluorescent labeling operation with the fluorescent probe are supplied to the flow cytometer, the fluorescent dye a is excited with the excitation light having the wavelength excited by the fluorescent dye a, and the excited fluorescent dye a is used. By detecting this fluorescence, it is possible to select fluorescently labeled cells fluorescently labeled with a fluorescent probe.
  • Observation with a flow cytometer can be performed, for example, under conditions of an excitation wavelength of 350 to 640 nm and a fluorescence wavelength of 630 to 780 nm.
  • the cells after the fluorescent labeling operation with the fluorescent probe are supplied to the fluorescent microscope, the fluorescent dye a is excited with the excitation light having the wavelength excited by the fluorescent dye a, and the fluorescence from the excited fluorescent dye a is detected.
  • fluorescently labeled cells that are fluorescently labeled with a fluorescent probe can be selected.
  • Observation with a fluorescence microscope can be performed, for example, under conditions of an excitation wavelength of 350 to 640 nm and a fluorescence wavelength of 630 to 780 nm.
  • the selected fluorescently labeled cells are transplanted into a living body (excluding the human body). Transplantation of the selected fluorescently labeled cells into the living body can be performed, for example, by administration from the subcutaneous, intravenous, or abdominal cavity.
  • the fluorescently labeled cells are suspended in phosphate buffered saline, and the suspension of the fluorescently labeled cells is injected into the tail vein of the mouse using a syringe, so that the fluorescently labeled cells are transplanted into the mouse body. To do.
  • the in vivo fluorescence imaging device is not particularly limited, and for example, a fluorescence in vivo imaging device “KURAVIC KV-700” manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd., IVIS Imaging System, Maestro TM manufactured by PerkinElmer, Inc. can be used.
  • Observation of fluorescently labeled cells in a living body using an in vivo fluorescence imaging apparatus is performed by detecting fluorescence derived from the fluorescent dye b. Specifically, the fluorescent dye b is excited with excitation light having a wavelength for exciting the fluorescent dye b, and fluorescence from the excited fluorescent dye b is detected.
  • Observation of fluorescently labeled cells in a living body using an in vivo fluorescence imaging apparatus can be performed, for example, under conditions of an excitation wavelength of 650 to 760 nm and a fluorescence wavelength of 760 to 850 nm.
  • stem cells such as iPS cells and ES cells transplanted in vivo such as mice
  • disease-related cells such as cancer cells and cirrhosis cells, etc.
  • Information such as where cells differentiate, grow and metastasize after transplantation can be obtained.
  • the fluorescent probe of the present invention is used.
  • a flow cytometer By selecting only fluorescently labeled cells labeled with a fluorescent probe by a flow cytometer, transplanting them into a living body such as a mouse, and observing the progress of the fluorescently labeled cells after transplantation in vivo with an in vivo fluorescent imaging device Can do.
  • Example 1 (Preparation of fluorescent probe) ⁇ Preparation of complex of carrier molecule and fluorescent dye a> (1) APTES (462 ⁇ mol) is added to a DMF solution of TCPP in which TCPP is dissolved in DMF (3.8 mM, 32 mL), followed by N, N′-dipropylcarbodiimide (480 ⁇ mol) and N-hydroxysuccinimide (480 ⁇ mol). And stirred at 50 ° C. for 24 hours. (2) 200 ⁇ L of the porphyrin-silane DMF solution obtained above (0.75 ⁇ mol of porphyrin-silane) was mixed with 5 ⁇ L of MPTMS (0.027 mmol).
  • the obtained substance is a complex of polysiloxane and porphyrin obtained by covalently bonding porphyrin to polysiloxane having polysiloxane as a carrier molecule and porphyrin as fluorescent dye a, and is obtained by a dynamic light scattering method (manufactured by Beckman Coulter).
  • a dynamic light scattering method manufactured by Beckman Coulter.
  • PPS HNPs fluorescent hybrid nanoparticles having an average particle diameter of about 40 nm
  • the obtained substance is a complex (fluorescent probe) in which porphyrin and indocyanine green are covalently bonded to polysiloxane using polysiloxane as a carrier, porphyrin as fluorescent dye a, and indocyanine green as fluorescent dye b.
  • a fluorescent hybrid nanoparticle hereinafter, also simply referred to as “ICG-PPS HNPs” having an average particle diameter of about 50 nm as measured by a dynamic light scattering method (“DelsaMax PRO” manufactured by Beckman Coulter).
  • Example 2 Preparation of fluorescent probe
  • Example 3 Preparation of complex of carrier molecule and fluorescent dye a>
  • PPS HNPs were obtained.
  • ⁇ Step of binding fluorescent dye b and cell surface binding substance to carrier molecule 251 ⁇ L of an aqueous solution of FA-PEG-Mal (concentration: 2 mg / mL, FA-PEG-Mal: 1.48 ⁇ 10 ⁇ 4 mmol) in 1 mL of the aqueous dispersion of PPS HNPs obtained above, 63 ⁇ L of an ICG-Mal aqueous solution (concentration: 2 mg / mL, ICG-Mal: 1.48 ⁇ 10 ⁇ 4 mmol) was added, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 3 hours.
  • the obtained substance has polysiloxane as a carrier molecule, porphyrin as a fluorescent dye a, indocyanine green as a fluorescent dye b, and polysiloxane having folic acid as a cell surface binding substance, porphyrin, indocyanine green and folic acid.
  • fluorescent hybrid nanoparticles having an average particle diameter of about 65 nm (hereinafter simply referred to as “FA”).
  • the PPS HNPs obtained in Example 1 and Example 2 were structurally analyzed by 29 Si solid state NMR, and the 29 Si solid state NMR spectrum of PPS HNPs was shown in FIG. From FIG. 2, it was confirmed that peaks appeared at ⁇ 58 and ⁇ 69 ppm.
  • the ⁇ 58 ppm peak indicates a T 2 structure represented by the following chemical formula, and the ⁇ 69 ppm peak is presumed to indicate a T 3 structure represented by the following chemical formula. From this result, it was confirmed that most of PTMMS and porphyrin-silane have undergone hydrolysis and polycondensation although PPS HNPs partially contains Si of T 2 structure.
  • the porphyrin is covalently bonded to the polysiloxane to form a complex.
  • Thermogravimetric / differential thermal analysis was performed on PPS HNPs using a thermal analyzer (manufactured by Rigaku, TG8120).
  • FIG. 3 shows TG (thermogravimetric) and DTA (suggested heat) curves of PPS HNPs.
  • weight loss at 100 ° C. is due to adsorbed water
  • weight loss at 300 ° C. is due to combustion of aminopropyl moiety and mercaptopropyl moiety
  • weight loss at 300 to 400 ° C. is a cyclic structure part of four pyrroles of porphyrin.
  • FIG. 4A shows the absorption spectrum of the supernatant. Since FA-PEG-Mal had an unknown extinction coefficient in an aqueous solution of folic acid, a calibration curve at a peak wavelength of 377 nm of folic acid was prepared, and the concentration was calculated therefrom.
  • FIG. 4A shows the absorption spectrum of the supernatant. Since FA-PEG-Mal had an unknown extinction coefficient in an aqueous solution of folic acid, a calibration curve at a peak wavelength of 377 nm of folic acid was prepared, and the concentration was calculated therefrom.
  • FIG. 4B shows a calibration curve for folic acid.
  • the absorbance at 377 nm is 0.032, and the concentration of folic acid in the supernatant determined from this is 12 nmol / mL. Since the amount of FA-PEG-Mal used was 148 nmol, it was confirmed that 92% of FA-PEG-Mal had reacted.
  • (B) The cultured cells were replaced with a cell culture medium (DMEM medium containing 10% FBS) containing a fluorescent probe (30 ⁇ g / mL) and cultured for 24 hours. At this time, RAW264.7 cells are replaced with cell culture medium containing fluorescent probe ICG-PPS HNPs, and HeLa S3 cells and HCT116 cells are replaced with cell culture medium containing fluorescent probe FA-PEG / ICG-PPS HNPs. Exchanged.
  • C The supernatant was discarded, and the cultured cells were washed with 2 mL of phosphate buffered saline (1 ⁇ PBS, pH 7.4, Wako Pure Chemical Industries “D-PBS ( ⁇ ) (045-29795)”).
  • FIG. 7A shows a bright-field image of RAW264.7 cells (Bright field), a fluorescence image of cell nuclei (DAPI) using a fluorescent dye DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole), ICG-PPS HNPs (fluorescence) A fluorescence imaging using a probe) and an image (Merge) obtained by superimposing these three images are shown. From the bright field image of FIG. 7A, it was found that cells were present. Moreover, the cell nucleus dye
  • RAW264.7 cells From the image of Merge, in RAW264.7 cells, it was found that a lot of fluorescence from the fluorescent probe was observed in the cytoplasm and the nucleus was not fluorescent. From this result, it was confirmed that ICG-PPS HNPs (fluorescent probe) was incorporated into the cells and remained in the cytoplasm.
  • RAW264.7 cells are macrophage cells, and it is considered that fluorescent probes were taken up into the cells by phagocytic ability, and the fluorescent probes were collected in the cytoplasm.
  • FIG. 7B shows a bright-field image of HeLa S3 cells (Bright field), a fluorescence image of cell nuclei (DAPI) using the fluorescent dye DAPI, fluorescence imaging with FA-PEG / ICG-PPS HNPs fluorescent probe, and these three images. A superimposed image (Merge) is shown. From the bright-field image of FIG. 7B, it was found that cells were present. Moreover, the cell nucleus dye
  • DAPI fluorescence imaging with FA-PEG / ICG-PPS HNPs fluorescent probe
  • FIG. 7C shows a bright-field image of HCT116 cells (Bright field), a fluorescence image of cell nuclei (DAPI) using the fluorescent dye DAPI, fluorescence imaging with FA-PEG / ICG-PPS HNPs fluorescent probe, and superimposing these three images.
  • a combined image (Merge) is shown. From the bright-field image of FIG. 7C, it was found that cells were present. Moreover, the cell nucleus dye
  • C Cells were collected from the cell culture dish. At this time, a 0.25% trypsin / EDTA solution was used for recovery of HeLa S3 cells and HCT116 cells.
  • D After the collected solution was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and the cells were suspended in 400 ⁇ L of cell culture medium (DMEM medium containing 10% FBS).
  • FIG. 8 As can be seen from FIG. 8, FIG. 9, and FIG. 10, in all cell samples, cells that were fluorescently labeled and cells that were not fluorescently labeled could be separated and observed. As the light intensity, there was a difference of about 100 to 10,000 times. After labeling the cells with a fluorescent probe, it was possible to clearly distinguish and separate fluorescently labeled cells and non-fluorescently labeled cells. By using a flow cytometer, only fluorescently labeled cells labeled with a fluorescent probe can be selected and transplanted into a living body such as a mouse. A fluorescent in vivo imaging device enables fluorescent labeled cells in a living body such as a mouse. Can be confirmed more accurately.
  • RAW264.7 cells were replaced with a cell culture medium containing fluorescent probe ICG-PPS HNPs
  • HeLa S3 cells were replaced with a cell culture medium containing fluorescent probe FA-PEG / ICG-PPS HNPs.
  • C Cells were collected from the cell culture dish. At this time, a trypsin / EDTA solution was used for recovery of HeLa S3 cells.
  • D After the collected liquid was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and the cells were suspended in 1000 ⁇ L of serum-free medium (DMEM medium).
  • DMEM medium serum-free medium
  • RAW264.7 cells labeled with a fluorescent probe (ICG-PPSNHNPs) were accumulated in the spleen and liver 24 hours later, but were distributed throughout the viscera.
  • FIGS. 15 and 16 after 24 hours, HeLa cells labeled with a fluorescent probe (FA-PEG / ICG-PPS HNPs) accumulated particularly in the liver.
  • the fluorescent probe has two fluorescent dyes with different excitation wavelengths bonded to carrier molecules such as ICG-PPS HNPs and FA-PEG / ICG-PPS HNPs, and the fluorescence between the two fluorescent dyes.
  • carrier molecules such as ICG-PPS HNPs and FA-PEG / ICG-PPS HNPs
  • the fluorescence between the two fluorescent dyes By using a fluorescent probe that does not cause fluorescence resonance energy transfer between the dye a and the fluorescent dye b, the cells labeled with the fluorescent probe can be confirmed with a fluorescent in vitro imaging apparatus such as a fluorescent microscope or a flow cytometer. The time-dependent localization of the fluorescently labeled cells in the living body transplanted with the cells labeled with can be confirmed with a fluorescent in vivo imaging apparatus.

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Abstract

本発明は、担体分子と、担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａと蛍光色素ｂは励起波長が異なり、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍ＦＲＥＴが生じない蛍光プローブに関する。本発明は、また、標的細胞を前記の蛍光プローブで標識する工程と、蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含む蛍光検出方法に関する。本発明は、また、細胞を前記の蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって選別する工程と、選別した蛍光標識細胞を生体内に移植する工程と、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含む蛍光プローブの使用方法に関する。

Description

蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法
　本発明は、二種類の蛍光色素を含む蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法に関する。
　近年、癌や発生学の研究領域において、マウス等の動物を用いた生体内の蛍光イメージング解析が広く行われている。マウスに移植したｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等の細胞が移植後、どの位置で分化、生育、転移するかと言った情報の解析は、蛍光イメージング解析がメジャーな手法である。特にマウス等の動物の生存を維持したまま、移植細胞の経過を観察するには、現状、蛍光イメージング解析を用いる手法しかなく、特に重要な解析手法として位置づけられている。
　生体内の移植細胞の蛍光イメージグ解析は、通常、移植する前に予めインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で細胞を蛍光プローブで標識し、該細胞をマウス等の生体内に移植し、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）蛍光イメージング装置で観察することで行われる。例えば、特許文献１には、アニオン性ポルフィリンとカチオン性オルガノアルコキシシラン及び非カチオン性シランを結合させたポルフィリン含有複合体を生体観察のための近赤外蛍光プローブとして用いることが記載されている。
　一方、所定量の細胞を蛍光プローブで標識した場合、通常、全ての細胞が蛍光プローブで標識されることはない。そのため、蛍光プローブと結合していない細胞もマウス等の生体内に移植されてしまうことがある。生体観察用の近赤外蛍光プローブの場合、現状、蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置で蛍光を検出することができず、インビトロで近赤外蛍光プローブと結合している蛍光標識細胞を確認することは困難である。それは、インビトロ蛍光イメージング装置とインビボ蛍光イメージング装置で求められる波長特性が異なるためである。インビトロ蛍光イメージング装置では励起波長３５０～６５０ｎｍ、蛍光波長４００～８００ｎｍの波長領域で解析を行うことが一般的であり、インビボ蛍光イメージング装置では励起波長６００～８５０ｎｍ、蛍光波長６５０～９２０ｎｍの波長領域で解析を行うことが一般的である。
特開２０１３－１３６５５５号公報
　上述したとおり、インビトロ蛍光イメージング解析とインビボ蛍光イメージング解析に適した蛍光色素の波長特性は大きく異なるため、現在のところ、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に使用できる蛍光プローブは存在しない。
　本発明は、前記従来の問題を解決するため、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に使用できる蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法を提供する。
　本発明は、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含む蛍光プローブにおいて、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じないことを特徴とする蛍光プローブに関する。
　前記蛍光プローブは、細胞標識用蛍光プローブであり、蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素であり、蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素であることが好ましい。前記蛍光プローブは、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識してもよく、細胞内部に取り込まれることで細胞を標識してもよい。
　蛍光色素ａは、励起波長が３５０～６５０ｎｍの範囲であることが好ましく、蛍光色素ｂは、励起波長が６００～８５０ｎｍの範囲であることが好ましい。蛍光色素ａがポルフィリンであることが好ましい。蛍光色素ｂがインドシアニングリーンであることが好ましい。
　前記担体分子は、ポリシロキサンであることが好ましい。
　前記蛍光プローブは、フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別に用いてもよい。
　本発明は、また、標的細胞を観察する蛍光検出方法であって、標的細胞を蛍光プローブで標識する工程と、蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含み、前記蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、且つ蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じないことを特徴とする蛍光検出方法に関する。
　蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ａを励起する励起光を照射し、インビトロ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察してもよい。また、蛍光プローブで標識された標的細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植し、該生体に蛍光色素ｂを励起する励起光を照射し、インビボ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察してもよい。
　本発明は、また、前記の蛍光プローブの使用方法であって、細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって確認して選別する工程と、選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する工程と、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含み、前記フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別は、蛍光色素ａ由来の蛍光を検出することで行い、前記生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、蛍光色素ｂ由来の蛍光を検出することで行うことを特徴とする蛍光プローブの使用方法に関する。
　本発明は、励起波長が異なり、且つ蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを有する蛍光プローブを用いることにより、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析を行うことができる。特に、既存の蛍光顕微鏡、フローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置にて、細胞のインビトロ蛍光イメージング解析を行うことができ、既存のインビボ蛍光イメージング装置にて、生体内のインビボ蛍光イメージング解析を行うことができる。また、フローサイトメーターにより蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を選別し、選別した蛍光標識細胞をマウス等の生体内に移植し、生存しているマウス等の生体内における蛍光標識細胞の局在を経時的に観察することができる。
図１は、テトラキス（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、及び、ＴＣＰＰと（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）の加水分解・縮合により生成したハイブリットナノ粒子（ＰＰＳ ＨＮＰｓ）のフーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ－ＩＲ）にて測定したＦＴ－ＩＲスペクトルを示す。 図２は、ＰＰＳ ＨＮＰｓの29Ｓｉ固体核磁気共鳴（固体ＮＭＲ）スペクトルを示す。 図３は、ＰＰＳ ＨＮＰｓのＴＧ及びＤＴＡ曲線を示す。 図４Ａは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ生成反応後の上澄み液の吸収スペクトルを示し、図４Ｂは、葉酸の濃度検量線を示す。 図５は、ＰＰＳ ＨＮＰｓ、及び、ＰＰＳ ＨＮＰｓにさらにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）及び葉酸（ＦＡ）を結合させた複合体（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）の吸収スペクトルを示す。 図６Ａは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの短波長側の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示し、図６Ｂは、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの長波長側の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。 図７Ａは、マウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＰＰＳ ＨＮＰｓにさらにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を結合させた複合体（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識したＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。図７Ｂは、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識したＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。図７Ｃは、ヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、ＤＡＰＩで染色したＨＣＴ１１６細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識したＨＣＴ１１６細胞の蛍光顕微鏡による蛍光画像（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）、及び、これら三つの画像を重ね合せた像（Ｍｅｒｇｅ）を示す。 図８は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。 図９は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。 図１０は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨＣＴ１１６細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。 図１１は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞を移植したマウス体内における蛍光標識細胞の経時的局在を蛍光インビボイメージング装置で観察した結果を示す。 図１２は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａＳ３細胞を移植したマウス体内における蛍光標識細胞の経時的局在を蛍光インビボイメージング装置で観察した結果を示す。 図１３は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器をインビボ蛍光イメージング装置で観察した蛍光画像を示す。 図１４は、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＲＡＷ２６４．７細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器をインビボ蛍光イメージング装置で解析した結果を示す。 図１５は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器をインビボ蛍光イメージング装置で観察した蛍光画像を示す。 図１６は、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓで標識を行ったＨｅＬａ Ｓ３細胞を移植したマウスの２４時間後の各臓器を蛍光インビボイメージング装置で解析した結果を示す。
　本発明の発明者らは、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に用いることができる蛍光プローブについて鋭意検討した結果、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含む蛍光プローブにおいて、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂとして、励起波長が互いに異なり、且つ、互いに蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光色素を用いることで、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に用いることができる蛍光プローブが得られることを見出し、本発明に至った。従来、二種類の蛍光色素を含む蛍光プローブが存在しているものの、これらの蛍光プローブは、二種類の蛍光色素間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じるものであって、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージング解析に用いることはできない。
　（蛍光プローブ）
　本発明の蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂは、励起波長が異なり、且つ、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じない。蛍光色素ａと蛍光色素ｂは、担体分子と共有結合することが好ましい。
　蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素（可視光線蛍光イメージング用蛍光色素とも称される。）であることが好ましく、励起波長が３５０～６５０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が４００～８００ｎｍの範囲であることがより好ましく、励起波長が３８０～５８０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が４５０～６８０ｎｍの範囲であることがさらに好ましい。励起波長と蛍光波長が上述した範囲であると、汎用の蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置にて蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。
　蛍光色素ａとしては、例えば、ポルフィリン、フルオレセイン、ローダミン等のインビトロ蛍光イメージング用蛍光色素を用いることができる。ポルフィリンは、特に限定されないが、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素として好適である観点から、カルボキシル基を有するポルフィリンを用いることができる。なお、“ポルフィリン”は、４つのピロール環がα位置で4つのメチン基と交互に結合した環状化合物とその誘導体の総称の意味で用いている。カルボキシル基を有するポルフィリンは、一般的に、励起波長が４００～６５０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が６００～７４０ｎｍの範囲である。
　カルボキシル基を有するポルフィリンとしては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　前記一般式（Ｉ）中、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bは、同一又は異なっていてもよく、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、スルホ基（ＳＯ3Ｈ）又は水素原子（Ｈ）を示す（ただし、全てが水素原子又は全てがスルホ基である場合は除く。）。好ましくは、前記一般式（Ｉ）中、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが全てカルボキシル基、又はＲ1bはカルボキシル基でＲ2b、Ｒ3b、及びＲ4bは水素原子である。カルボキシル基を有するポルフィリンは、より好ましくは、前記一般式（Ｉ）で表され、Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが、全てカルボキシル基である化合物である。Ｒ1b、Ｒ2b、Ｒ3b、及びＲ4bが全てカルボキシル基である化合物は、テトラキス（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）と呼ばれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　また、例えばビリルビン、ヘミン、プロトポルフィリン等も、カルボキシル基を有するポルフィリンとして用いることができる。
　本発明に用いるカルボキシル基を有するポルフィリンは、公知の化合物であるか、又は公知の方法により容易に製造できる。例えば東京化成工業株式会社等から市販のものを入手することができる。
　蛍光色素ｂは、蛍光色素ａと励起波長が異なり、且つ、蛍光色素ａとの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光色素を用いる。蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素である（近赤外線蛍光イメージング用蛍光色素とも称される。）ことが好ましく、励起波長が６００～８５０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が６５０～９２０ｎｍの範囲であることがより好ましく、励起波長が６３０～７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が６８０～９１０ｎｍの範囲であることがさらに好ましい。励起波長と蛍光波長が上述した範囲であると、汎用のインビボ蛍光イメージング装置にてマウス等の生体内の蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。
　蛍光色素ｂとしては、例えば、インドシアニン化合物、クマリン、ローダミン、キサンテン、ヘマトポルフィリン、及びフルオレスカミン等のインビボ蛍光イメージング用蛍光色素を用いることができる。インドシアニン化合物としては、生体内の安全性の観点から、インドシアニングリーンやその誘導体を用いることが好ましい。インドシアニングリーンは、一般的に、励起波長が７４０～７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が８１０～８６０ｎｍの範囲である。インドシアニングリーンの誘導体は、インドシアニングリーンの主要な骨格及び機能を維持しつつその一部を他の官能基等で置換した化合物をいい、励起波長が７５０～７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が７９０～９００ｎｍの範囲である。蛍光色素ｂとして、励起波長が７４０～７９０ｎｍの範囲であり、蛍光波長が７９０～９００ｎｍの範囲のインドシアニングリーンやその誘導体を用いることで、マウス等の生体におけるエサ等からの自家蛍光に影響されることなく、汎用のインビボ蛍光イメージング装置にてマウス等の生体内の蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。また、マウス等の生体内の臓器に局在する蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞を観察することができる。
　前記担体分子は、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂと結合し、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの異なる励起波長を維持することができるものであればよい。例えば、ポリシラン、ポリゲルマン、ポリスタナン、ポリシロキサン、ポリシルセスキオキサン、ポリシラザン、ポリボラジレン、ポリホスファゼン等の無機ポリマーやポリピロール、ポリエチレングリコール、多糖等の有機ポリマー等のポリマーを用いることができる。蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂとして、蛍光色素ａの蛍光が蛍光色素ｂを励起しないように、適宜選択して用いることができる。蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂのいずれか一方は、担体分子であるポリマーの主鎖構造中に組み込まれていることが好ましく、他方は同担体の表面に存在する官能基と結合することが好ましい。このような構造であると、ＦＲＥＴが生じにくい。蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの間にＦＲＥＴを生じさせない観点から、前記担体分子は、ポリシロキサン（以下において、シロキサン結合を有するポリマーとも記す。）であることが好ましい。ポリシロキサンは、例えば、後述するように、シラン化合物が加水分解、重縮合することで形成される。
　本発明の蛍光プローブは、細胞標識用蛍光プローブとして用いることが好ましい。細胞標識用蛍光プローブとして用いる場合、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識してもよい。この場合、本発明の蛍光プローブは、細胞の表面を特異的に認識する物質と結合する細胞表面結合物質を有することが好ましい。蛍光プローブが細胞表面結合物質を介して細胞表面に特異的に結合して細胞を標識することで、細胞標識用蛍光プローブとして用いることができる。細胞の表面を特異的に認識する物質とは、特定の細胞の表面に存在するタンパク質、脂質、糖鎖、及び／又は核酸等である。例えば、癌細胞の表面には、癌細胞に特異的な葉酸受容体、トランスフェリン受容体、抗原等が存在する。蛍光プローブに葉酸、トランスフェリン、抗体等を結合することにより、癌細胞を特異的に標識することができる。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞の表面には細胞表面マーカー（膜タンパク質）等が存在する。蛍光プローブに細胞表面マーカーと特異的に結合する分子等を結合することにより、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞を特異的に標識することができる。
　本発明の蛍光プローブは、また、細胞の内部に取り込まれることで細胞を標識してもよい。このような細胞としては、例えば、マクロファージ、樹状細胞、免疫細胞、癌細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。細胞内部に蛍光プローブを取り込んだマクロファージ、樹状細胞、免疫細胞、癌細胞、ｉＰＳ細胞等を用い、免疫細胞療法において、マクロファージや樹状細胞の体内での動態を確認することができる。
　本発明の蛍光プローブは、担体分子と蛍光色素ａを結合、好ましくは共有結合させて担体分子と蛍光色素ａの複合体を形成し、その後、担体分子と蛍光色素ａの複合体からなるナノ粒子表面に蛍光色素ｂを結合、好ましくは共有結合させて、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体を形成することで作製することができる。担体分子と蛍光色素ａの複合体からなるナノ粒子に蛍光色素ｂを結合させる際に、同時に、細胞表面結合物質を担体分子と蛍光色素ａの複合体からなるナノ粒子に結合させてもよい。或いは、本発明の蛍光プローブは、担体分子と蛍光色素ｂを結合、好ましくは共有結合させて担体分子と蛍光色素ｂの複合体を形成し、その後、担体分子と蛍光色素ｂの複合体からなるナノ粒子に蛍光色素ａを結合、好ましくは共有結合させて、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体を形成することで作製してもよい。担体分子と蛍光色素ｂの複合体からなるナノ粒子に蛍光色素ａを結合させる際に、同時に、細胞表面結合物質を担体分子と蛍光色素ｂの複合体からなるナノ粒子に結合させてもよい。なお、担体分子と蛍光色素ａの複合体、担体分子と蛍光色素ｂの複合体、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体において、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの励起波長及び蛍光波長は、担体分子と結合する前後でほとんど変化しないことが好ましい。
　蛍光色素ａと蛍光色素ｂとして、励起波長が異なりかつ一方の蛍光色素の蛍光が他方の蛍光色素を励起しない蛍光色素を選ぶこと、担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体中の蛍光色素ａと蛍光色素ｂの配置等を調整すること等により、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間でＦＲＥＴが生じないようにする。担体分子、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの複合体において、担体分子がポリシロキサンである場合、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂのいずれかはシロキサンネットワーク（ポリマーの主鎖）中に組み込まれ、他方は、シロキサンネットワーク中に組み込まれず、ポリシロキサンと一方の蛍光色素の複合体からなるナノ粒子表面の官能基（シロキサンネットワークを形成していない官能基）と結合することが好ましい。このような構造であると、蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂの間でＦＲＥＴが生じにくい。
　担体分子がポリシロキサンであり、蛍光色素ａがポルフィリンであり、蛍光色素ｂがインドシアニングリーンである場合、例えば下記のように蛍光プローブを作製することができる。
　まず、アミノ基を有するシランとカルボキシル基を有するポルフィリンを反応させてポルフィリンを分子内に含むシラン（以下において、「ポルフィリン‐シラン」とも記す。）を得る。具体的には、溶媒にアミノ基を有するシランとカルボキシル基を有するポルフィリンを溶解させ、縮合剤を加えアミド化反応を起こす。溶媒としては、例えば、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等を用いることができる。縮合剤としては、例えば、カルボジイミド等を使用することができる。カルボジイミドとしては、特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ´－ジプロピルカルボジイミド等が挙げられる。副生成物を減らすために、スクシンイミド等を加えてもよい。スクシンイミドとしては、特に限定されないが、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド等が挙げられる。反応温度は、特に限定されないが、合成コストの観点から、例えば、２０～１５０℃であることが好ましく、２０～８０℃であることがより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１～７２時間であることが好ましく、１～２４時間であることがより好ましい。反応後、遠心分離して生成物を沈殿として回収することで、ポルフィリン‐シランを得ることができる。
　上記反応において、アミノ基を含むシランとカルボキシル基を有するポルフィリンのモル比（アミノ基を含むシラン：カルボキシル基を有するポルフィリン）は、４：１～１：１であることが好ましく、より好ましくは４：１～２：１であり、さらに好ましくは４：１である。
　次に、上記で得られたポルフィリン‐シランと一種以上の官能基を有するシラン（以下において、「官能基シラン」とも記す。）との加水分解・縮合反応により、シロキサンとポルフィリンの複合体を得る。具体的には、溶媒にポルフィリン‐シランと官能基シランを溶解させ、さらにアルカリ溶液を加えて反応させる。溶媒としては、例えば、ＤＭＦ等を用いることができる。アルカリ溶液としては、例えば、ｐＨが８以上のアンモニア水、水酸化ナトリウムの水溶液等を用いることができる。反応温度は、特に限定されないが、合成コストの観点から、例えば、２０～２００℃であることが好ましく、６０～８０℃であることがより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、例えば、１～７２時間であることが好ましく、３～２４時間であることがより好ましい。反応後、遠心分離することにより生成物を沈殿として回収することで、ポリシロキサンにポルフィリンが共有結合したポリシロキサンとポルフィリンの複合体を得ることができる。
　上記反応において、ポルフィリン‐シランと官能基シランのモル比（ポルフィリン‐シラン：官能基シラン）は、１：２～１：１００であることが好ましく、より好ましくは１：２１～１：５０であり、さらに好ましくは１：３０～１：４０である。
　アミノ基を有するシランとしては、アミノ基を有するものであればよく、特に限定されない。例えば、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物を好適に用いることができる。
　Ｘi－Ｓｉ（Ｒ2a）j（ＯＲ1a）(4-i-j)　　（ＩＩ）
　一般式（ＩＩ）において、ＸはＨ2ＮＣmＨ2m－、Ｈ2ＮＣnＨ2n－ＨＮＣmＨ2m－、又はＰｈ－ＮＨＣmＨ2m－〔ここでＰｈはフェニル基を示す。〕で示される基を示し、中でもＨ2ＮＣmＨ2m－、又はＨ2ＮＣnＨ2n－ＨＮＣmＨ2m－で示される基が好適である。ｍ及びｎは、同一又は異なって、１～６の整数を示す。ｍは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。ｎは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。また、上記のＨ2ＮＣmＨ2m－、Ｈ2ＮＣnＨ2n－ＨＮＣmＨ2m－、Ｐｈ－ＮＨＣmＨ2m－は、それぞれ、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）m－、Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）n－ＨＮ（ＣＨ2）m－、Ｐｈ－ＮＨ（ＣＨ2）ｍ－であることが好ましい。
　また、Ｒ1a及びＲ2aは、同一又は異なって、炭素数１～６のアルキル基を示す。当該アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、１－エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、１，２，２－トリメチルプロピル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル、イソヘキシル、３－メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチルが好ましい。
　また、ｉは１又は２、ｊは０又は１、〔但し（４－ｉ－ｊ）≧２〕を示す。すなわち、（ｉ、ｊ）は（１、０）、（１、１）、又は（２、０）を示す。
　一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、例えば、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３－アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシ［３－（フェニルアミノ）プロピル］シラン等が挙げられる。中でも、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及び／又は３－アミノプロピルトリメトキシシランが好ましい。
　上述したアミノ基を有するシランは、例えば、東京化成工業株式会社製の市販品を用いることができる。また、アミノ基を有するシランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　官能基シランは、一種以上の官能基を有するものであれば特に限定されず、一種の官能基を有する単官能基シランであってもよく、二種以上の官能基を有する多官能基シランであってもよい。官能基を有するシランとして、例えば一般式（ＩＩＩ）：
　Ｙｐ－Ｓｉ（Ｒ2c）ｑ（ＯＲ1c）(4-p-q)　　　（ＩＩＩ）
で表される化合物を好適に用いることができる。
　上記一般式（ＩＩＩ）において、ＹはＣＨ2＝ＣＨ－で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2－で示される基、アルケンを有する基、チオールを有する基、ジスルフィドを有する基、アミンを有する基、エステルを有する基、アミドを有する基、カルボン酸を有する基、ウレアを有する基、チオウレアを有する基、ＯＣＮＣＨ2ＣＨ2－で示される基、ＣｌＣαＨ2α－で示される基、ＨＳＣβＨ2β－で示される基、ＣＦ3ＣγＦ2γ－ＣδＨ2δ－で示される基、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣεＨ2ε－で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＣζＨ2ζ－で示される基、ＨＮ－ＣＯＮＨ－ＣηＨ2η－で示される基、下記化学式（ａ）で示される基、下記化学式（ｂ）で示される基、炭素数１～１８のアルキル基、又はフェニル基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記において、α、β、δ、ε、ζ、η、θ及びιは、それぞれ独立して１～６の整数数を示し、好ましくは１、２、３又は４の整数を示し、γは０～８の整数を示し、好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７の整数を示す。また、炭素数１～１８のアルキル基は、炭素数１～１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣαＨ2α－、ＨＳＣβＨ2β－、ＣＦ3ＣγＦ2γ－ＣδＨ2δ－、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯＣεＨ2ε－、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯＣζＨ2ζ－、ＨＮ－ＣＯＮＨ－ＣηＨ2η－は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ2）α－、ＨＳ（ＣＨ2）β－、ＣＦ3（ＣＦ2）γ－（ＣＨ2）δ－、ＣＨ2＝Ｃ（ＣＨ3）ＣＯＯ（ＣＨ2）ε－、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2）ζ－、ＨＮ－ＣＯＮＨ－（ＣＨ2）η－であることが好ましい。
　また、Ｒ1cは、炭素数１～６のアルキル基、又は－（ＣＨ2）τ－ＯＣＨ3を示し、Ｒ2cは、炭素数１～６のアルキル基、又はフェニル基を示す。Ｒ1c及びＲ2cは同一であっても異なってもよい。Ｒ1c及びＲ2cのいずれにおいても、炭素数１～６のアルキル基は、直鎖状又は分岐状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１～６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、１－エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、１，２，２－トリメチルプロピル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル、イソヘキシル、３－メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチルが好ましい。また、τは１～４の整数（好ましくは１、２又は３）を示す。
　また、ｐは１、２又は３、ｑは０、１又は２、但し、（４－ｐ－ｑ）≧１を示す。すなわち、（ｐ、ｑ）は（１、０）、（１、１）、（１、２）、（２、０）、（２、１）又は（３、０）を示す。
　また、官能基シランとしては、例えば下記の一般式（ＩＶ）で表される化合物も好適に用いることができる。
　Ｚ－ＳｉＣｌ3　　（ＩＶ）
　上記一般式（ＩＶ）において、ＺはＣＨ2＝ＣＨ－で示される基、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2－で示される基、アルケンを有する基、チオールを有する基、ジスルフィドを有する基、アミンを有する基、エステルを有する基、アミドを有する基、カルボン酸を有する基、ウレアを有する基、チオウレアを有する基、ＣｌＣκＨ2κ－で示される基、ＣＦ3ＣλＦ2λ－ＣξＨ2ξ－で示される基、炭素数１～１８のアルキル基、フェニル基、又はシクロヘキシル基を示す。κ及びξは、それぞれ独立して１～６の整数を示し、好ましくは１、２、３又は４の整数を示し、λは０～８の整数を示し、好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７の整数を示す。また、炭素数１～１８のアルキル基は、炭素数１～１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣκＨ2κ－、ＣＦ3ＣλＦ2λ－ＣξＨ2ξ－は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ2）κ－、ＣＦ3（ＣＦ2）λ－（ＣＨ2）ξ－であることが好ましい。
　また、多官能基性シランとして、Ｎ-［２-（Ｎ-ビニルベンジルアミノ）エチル］-３－アミノプロピルトリメトキシシラン塩酸塩を用いてもよい。
　一般式（ＩＩＩ）で表される化合物としては、具体的には、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、アリルトリエトキシシラン、アリルトリメトキシシラン、ジエトキシメチルビニルシラン、ジメトキシメチルビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス(２-メトキシエトキシ)シラン、(クロロメチル)トリエトキシシラン、３-クロロプロピルジメトキシメチルシラン、３-クロロプロピルトリエトキシシラン、２-(３,４-エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン、３-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、イソシアン酸３-(トリエトキシシリル)プロピル、メタクリル酸３-(トリメトキシシリル)プロピル、トリエトキシ-１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ-トリデカフルオロ-n-オクチルシラン、アクリル酸３-(トリメトキシシリル)プロピル、３-トリメトキシシリルプロピルクロリド、１-[３-(トリメトキシシリル)プロピル]尿素、トリメトキシ(３,３,３-トリフルオロプロピル)シラン、３-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ジエトキシ(３-グリシジルオキシプロピル)メチルシラン、３-グリシジルオキシプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、３-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、2-シアノエチルトリエトキシシラン、ジアセトキシジメチルシラン、ジエトキシジメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシジフェニルシラン、ジメトキシメチルフェニルシラン、ドデシルトリエトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、オクタデシルトリエトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、n-オクチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、トリアセトキシメチルシラン、トリエトキシエチルシラン、トリメトキシ(メチル)シラン、トリメトキシフェニルシラン、トリメトキシ(プロピル)シラン等が挙げられる。中でも、３-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン等が好ましい。
　また、一般式（ＩＶ）で表される化合物としては、具体的には、アリルトリクロロシラン、トリクロロビニルシラン、３-クロロプロピルトリクロロシラン、トリクロロ(１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ-ヘプタデカフルオロデシル）シラン、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－トリデカフルオロ－ｎ－オクチル）シラン、ブチルトリクロロシラン、シクロヘキシルトリクロロシラン、デシルトリクロロシラン、ドデシルトリクロロシラン、エチルトリクロロシラン、ｎ－オクチルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシラン、トリクロロ－２－シアノエチルシラン、トリクロロヘキシルシラン、トリクロロ（メチル）シラン、トリクロロオクタデシルシラン、トリクロロ（プロピル)シラン、トリクロロテトラデシルシラン等が挙げられる。
　上記官能基シランは、例えば東京化成工業株式会社製の市販品を用いることができる。また、官能基シランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　次に、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子と、インドシアニングリーンを反応させてポリシロキサン、ポルフィリン及びインドシアニングリーンの複合体を形成する。具体的には、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子の水溶液にインドシアニングリーンの水溶液を加えて、４～５０℃の温度で、１～２４時間撹拌することで反応させる。ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子表面の官能基とインドシアニングリーンが共有結合してポリシロキサン、ポルフィリン及びインドシアニングリーンの複合体を形成する。インドシアニングリーンとして、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子表面の官能基と結合する官能基で修飾されたインドシアニングリーンを用いる。例えば、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子を形成した官能基シランが3-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(３-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン及び(３-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン等のチオール基を有する場合、マレイミド基が結合しているインドシアニングリーンを用いることができる。なお、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子とインドシアニングリーンを反応させて、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子にインドシアニングリーンを結合させると同時に、細胞表面結合物質、例えば、葉酸をポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子に結合させてもよい。葉酸としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の片末端にマレイミド基が、もう一方の片末端に葉酸が結合したものを用いることができる。
　上記反応において、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子のインドシアニングリーンと共有結合する官能基と、インドシアニングリーンを修飾し、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子と共有結合する官能基のモル比（ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子のインドシアニングリーンと共有結合する官能基：インドシアニングリーンを修飾した官能基）は、１：１～３：１であることが好ましく、１：１～２：１であることがより好ましく、１：１であることがさらに好ましい。
　ポルフィリンとしてＴＣＰＰを用いた場合、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体において、ＴＣＰＰのカルボキシル基はアミド結合を形成して存在することが好ましく、ＴＣＰＰはアミド結合によりシロキサンネットワーク（ポリシロキサンの主鎖）中に組み込まれていることがより好ましい。そして、インドシアニングリーンは、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子表面の官能基（ポリシロキサンとポルフィリンの複合体からなるナノ粒子を形成する官能基シランの官能基）と結合することが好ましい。このような構造になることで、ポルフィリンとインドシアニンの間にＦＲＥＴが生じない。本発明において、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体等の複合体や蛍光プローブの構造は、後述するように、フーリエ変換赤外分光法で解析することができる。
　前記蛍光プローブは、特に限定されないが、インビトロ及びインビボの両方の蛍光イメージングに好適である観点から、蛍光色素ａを１質量％以上含み、蛍光色素ｂを０．１質量％以上含むことが好ましく、より好ましくは蛍光色素ａを５～９０質量％含み、蛍光色素ｂを１～１０質量％含む。また、蛍光色素ａがポルフィリンであり、蛍光色素ｂがインドシアニングリーンであり、担体分子がポリシロキサンである場合、蛍光プローブにおいて、ポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）の含有量が１質量％以上であることが好ましく、インドシアニングリーンの含有量が０．１質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、ポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）の含有量が５～９０質量％であり、インドシアニングリーンの含有量が１～１０質量％である。本発明において、後述するように、ポリシロキサンとポルフィリンの複合体等の複合体や蛍光プローブの熱重量・示差熱分析により、ポルフィリン等の蛍光色素やシリカポリマーなどの担体分子の含有量を測定することができる。
　前記蛍光プローブは、特に限定されないが、細胞を標識しやすい観点から、平均粒子径が３～２５０ｎｍであることが好ましく、１０～８０ｎｍであることがより好ましい。本発明において、平均粒子径は、動的光散乱法で測定する。
　（蛍光検出方法）
　本発明の蛍光検出方法は、標的細胞を観察するのに用いる。具体的には、標的細胞を蛍光プローブで標識する工程と、蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含む。蛍光プローブとしては、上述した本発明の蛍光プローブを用いる。
　標的細胞の標識は、蛍光プローブを細胞表面に結合させること、あるいは、蛍光プローブを細胞内に取り込ませることで行うことができる。蛍光プローブを細胞表面に結合させる場合、蛍光プローブは細胞表面結合物質を有する。例えば、蛍光プローブが葉酸を有する場合、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞やヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞等の癌細胞の表面に結合してこれらの癌細胞を標識することができる。具体的には、細胞を蛍光プローブ入りの細胞培養培地で培養することで、細胞を蛍光プローブで標識することができる。標的細胞としては、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等が挙げられる。
　蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ａを励起する励起光を照射し、蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等のインビトロ蛍光イメージング装置を用いたインビトロ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察することができる。例えば、波長範囲が３５０～６５０ｎｍの励起光で蛍光色素ａを励起し、４００～８００ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。好ましくは、波長範囲が３８０～５８０ｎｍの励起光で蛍光色素ａを励起し、４５０～６８０ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。
　また、蛍光プローブで標識された標的細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植し、該生体内の蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ｂを励起する励起光を照射し、インビボ蛍光イメージング装置を用いたインビボ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察することができる。例えば、波長範囲が６００～８５０ｎｍの励起光で蛍光色素ｂを励起し、６５０～９２０ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。好ましくは、波長範囲が６３０～７９０ｎｍの励起光で蛍光色素ｂを励起し、６８０～９１０ｎｍ波長範囲の蛍光を観察する。本発明において、生体は、蛍光観察を行うことができる動物であれば特に限定は無い。好ましくは哺乳動物である。特に好ましくは、マウス、ラット等のげっ歯類の哺乳動物である。なお、マウス等の生体内への蛍光プローブで標識された標的細胞の移植は、後述するとおりに行うことができる。
　本発明の蛍光プローブを用いることで、インビトロ及びインビボのいずれにおいても、蛍光プローブで標識された標的細胞を観察することができる。
　（蛍光プローブの使用方法）
　本発明の蛍光プローブの使用方法は、細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、蛍光プローブによって標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって確認して選別する工程と、選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する工程と、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含む。
　まず、細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する。細胞の標識は、蛍光プローブを細胞表面に結合させること、あるいは、蛍光プローブを細胞内に取り込ませることで行うことができる。蛍光プローブを細胞表面に結合させる場合、蛍光プローブは細胞表面結合物質を有する。例えば、蛍光プローブが葉酸を有する場合、ヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞やヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞等の癌細胞の表面に結合してこれらの癌細胞を標識することができる。具体的には、細胞を蛍光プローブ入りの細胞培養培地で培養することで、細胞を蛍光プローブで標識することができる。細胞としては、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等が挙げられる。
　次に、蛍光プローブによって標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーターによって選別する。フローサイトメーター又は蛍光顕微鏡による蛍光標識細胞の確認・選別は、蛍光色素ａ由来の蛍光を検出することで行う。具体的には、蛍光プローブによって蛍光標識操作を行った後の細胞をフローサイトメーターに供給し、蛍光色素ａの励起する波長の励起光で蛍光色素ａを励起し、励起された蛍光色素ａからの蛍光を検出することで、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞を選別することができる。フローサイトメーターによる観察は、例えば、励起波長３５０～６４０ｎｍ、蛍光波長６３０～７８０ｎｍの条件下で行うことができる。或いは、蛍光プローブによって蛍光標識操作を行った後の細胞を蛍光顕微鏡に供給し、蛍光色素ａの励起する波長の励起光で蛍光色素ａを励起し、励起された蛍光色素ａからの蛍光を検出することで、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞を選別することができる。蛍光顕微鏡による観察は、例えば、励起波長３５０～６４０ｎｍ、蛍光波長６３０～７８０ｎｍの条件下で行うことができる。従来は、蛍光プローブによって蛍光標識操作を行った後の細胞をそのままマウス等の生体内に移植していたが、本発明の蛍光プローブを用いることで、蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞のみをフローサイトメーターによって選別してマウス等の生体内に移植することができる。
　次に、選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する。選別した蛍光標識細胞の生体内への移植は、例えば、皮下、静脈、腹腔等からの投与によって行うことができる。例えば、マウスの場合、蛍光標識細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、シリンジを用いて蛍光標識細胞の懸濁液をマウスの尾静脈に注射することで、蛍光標識細胞をマウス体内に移植する。
　次に、生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する。インビボ蛍光イメージング装置としては、特に限定されず、例えば、倉敷紡績社の蛍光インビボイメージング装置「ＫＵＲＡＶＩＣ　ＫＶ－７００」、パーキンエルマー社のＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭａｅｓｔｒｏTM等を用いることができる。生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、蛍光色素ｂ由来の蛍光を検出することで行う。具体的には、蛍光色素ｂを励起する波長の励起光で蛍光色素ｂを励起し、励起された蛍光色素ｂからの蛍光を検出する。生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、例えば、励起波長６５０～７６０ｎｍ、蛍光波長７６０～８５０ｎｍの条件下で行うことができる。生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察を経時的に行うことで、マウス等の生体内に移植したｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、癌細胞及び肝硬変細胞等の疾患関連細胞等の細胞が移植後、どの位置で分化、生育、転移するかと言った情報を取得することができる。
　従来は、細胞を蛍光プローブで標識を行った後、細胞が実際に蛍光プローブで標識されたか否かを確認せず、マウス等の生体内に移植していたが、本発明の蛍光プローブを用いることで、フローサイトメーターによって蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞のみを選択し、マウス等の生体内に移植し、移植後の蛍光標識細胞の生体内における経過をインビボ蛍光イメージング装置で観察することができる。
　以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
　（試薬）
　テトラキス（４－カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、（３－メルカプトプロピル)トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、マレイミド基が結合したインドシアニングリーン（分子量８５３、以下において、単に「ＩＣＧ-Ｍａｌ」とも記す。）、葉酸とマレイミド基が両末端に結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量３４００、以下において、単に「ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ」とも記す。）は、いずれも、東京化成工業株式会社から入手した。ＭＰＴＭＳ、ＩＣＧ-Ｍａｌ及びＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌの構造式を下記に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　（実施例１）
　（蛍光プローブの作製）
　＜担体分子と蛍光色素ａの複合体の作製＞
（１）ＴＣＰＰをＤＭＦに溶解させたＴＣＰＰのＤＭＦ溶液（３．８ｍＭ、３２ｍＬ）にＡＰＴＥＳ（４６２μｍｏｌ）を加え、続いてＮ，Ｎ´－ジプロピルカルボジイミド（４８０μｍｏｌ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（４８０μｍｏｌ）を加え、５０℃で２４時間撹拌した。
（２）上記で得られたポルフィリン‐シランのＤＭＦ溶液２００μＬ（ポルフィリン‐シラン０．７５μｍｏｌ）を、ＭＰＴＭＳ５μＬ（０．０２７ｍｍｏｌ）と混合した。得られた混合液に、ＤＭＦを５００μＬとアンモニア水（濃度：２８質量％、ｐＨ１１）を３００μＬ加えて、８０℃で２４時間反応を行った。
（３）２４時間後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、生成物を水とエタノールで数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（４）得られた物質は、ポリシロキサンを担体分子とし、ポルフィリンを蛍光色素ａとするポリシロキサンにポルフィリンが共有結合したポリシロキサンとポルフィリンの複合体であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ　ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約４０ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。
　＜担体分子と蛍光色素ａの複合体に蛍光色素ｂを結合させる工程＞
（１）上記で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水分散液１ｍＬに、ＩＣＧ-Ｍａｌの水溶液を６３μＬ(濃度：２ｍｇ/ｍＬ、ＩＣＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ)添加し、３０℃で３時間撹拌して反応させた。
（２）反応後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、水で数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（３）得られた物質は、ポリシロキサンを担体とし、ポルフィリンを蛍光色素ａとし、インドシアニングリーンを蛍光色素ｂとするポリシロキサンにポルフィリン及びインドシアニングリーンが共有結合した複合体（蛍光プローブ）であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約５０ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。
　（実施例２）
　（蛍光プローブの作製）
　＜担体分子と蛍光色素ａの複合体の作製＞
　実施例１と同様にして、ＰＰＳ ＨＮＰｓを得た。
　＜担体分子に蛍光色素ｂ及び細胞表面結合物質を結合させる工程＞
（１）上記で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水分散液１ｍＬに、ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌの水溶液を２５１μＬ（濃度：２ｍｇ／ｍＬ、ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ）と、ＩＣＧ-Ｍａｌの水溶液（濃度：２ｍｇ／ｍＬ、ＩＣＧ-Ｍａｌ：１．４８×１０-4ｍｍｏｌ）を６３μＬ添加し、３０℃で３時間撹拌した。
（２）反応後、生成物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分）で沈殿物として回収し、水で数回洗浄し、最終的に１ｍＬの水に分散させた。
（３）得られた物質は、ポリシロキサンを担体分子とし、ポルフィリンを蛍光色素ａとし、インドシアニングリーンを蛍光色素ｂとし、葉酸を細胞表面結合物質とするポリシロキサンにポルフィリン、インドシアニングリーン及び葉酸が共有結合した複合体（蛍光プローブ）であり、動的光散乱法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製「ＤｅｌｓａＭａｘ　ＰＲＯ」）により測定したところ、平均粒子径が約６５ｎｍの蛍光ハイブリッドナノ粒子（以下において、単に「ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ」とも記す。）であった。
　（フーリエ変換赤外分光法による確認）
　実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓと、原料として用いたＴＣＰＰをフーリエ変換赤外分光光度計（Ｎｉｃｏｌｅｔ社製「ＮＥＸＵＳ４７０」）で解析し、ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＴＣＰＰのＦＴ－ＩＲスペクトルを図１に示した。図１のＦＴ－ＩＲスペクトルから、どちらとも３４３０～３２５０ｃｍ-1にピロール環に由来するピークを示すことが分かった。ＰＰＳ ＨＮＰｓにおいて、ＴＣＰＰの１８００～１６４０ｃｍ-1のカルボン酸（カルボキシル基）のピークが消失し、１７４０～１６２０ｃｍ-1のアミド由来のピークが現れたことから、ＴＣＰＰのカルボキシル基がアミド結合を形成してシロキサンと共有結合した（ポルフィリン‐シランとＭＰＴＭＳの加水分解・縮合により形成された）ポリシロキサンとポルフィリンの複合体が確実に合成されていることが確認された。また、ＰＰＳ ＨＮＰｓの１２６０～１０１０ｃｍ-1（νＳｉ－Ｏ－Ｓｉ）、８７０～７４０ｃｍ-1（νＳｉ－Ｏ－Ｓｉ）、５４０～４１０ｃｍ-1（σＳｉ－Ｏ－Ｓｉ）にシロキサン結合に由来するピークが現れていた。すなわち、ＰＰＳ ＨＮＰｓでは、ポルフィリン‐シラン及びＭＰＴＭＳ（官能基シラン）にてシロキサンネットワークが形成され、ポルフィリンはアミド結合によりシロキサンネットワーク中に組み込まれていることが確認された。
　実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓを29Ｓｉ固体ＮＭＲで構造解析し、ＰＰＳ ＨＮＰｓの29Ｓｉ固体ＮＭＲスペクトルを図２に示した。図２から、－５８及び－６９ｐｐｍにピークが現れることが確認された。－５８ｐｐｍのピークは、下記の化学式で表されるＴ2構造を示し、－６９ｐｐｍのピークは、下記の化学式で表されるＴ3構造を示していると推測される。この結果より、ＰＰＳ ＨＮＰｓには、一部Ｔ2構造のＳｉが存在するものの、ほとんどのＭＰＴＭＳとポルフィリン‐シランが加水分解、重縮合を受けていることが確認された。ポリシロキサンにポルフィリンが共有結合して複合体を形成していることになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　（熱重量・示差熱分析）
　熱分析計（リガク製、ＴＧ８１２０）を用いてＰＰＳ ＨＮＰｓに対して熱重量・示差熱分析（ＴＧ-ＤＴＡ）を行った。図３にＰＰＳ ＨＮＰｓのＴＧ（熱重量）及びＤＴＡ（示唆熱）曲線を示した。解析の結果、１００℃における重量減少は吸着水によるもの、３００℃における重量減少はアミノプロピル部分及びメルカプトプロピル部分の燃焼によるもの、３００～４００℃における重量減少はポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）の分解によるものであり、残りの部分がポリシロキサン部分と推測される。具体的には、ＰＰＳ ＨＮＰｓ中には７重量％の吸着水、２９重量％のアミノプロピル部分及びメルカプトプロピル部分、１７重量％のポルフィリンの４つのピロールの環状構造部分（ポルフィン）、４７重量％のポリシロキサン部分が含まれていると推測される。
　（ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＦＡ-ＰＥＧ及びＩＣＧの定量）
　ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＦＡ-ＰＥＧ及びＩＣＧの量を求めるために、実施例２において、反応終了後の上澄み液（１ｍＬ）の吸収スペクトルを分光光度計（日本分光社製「Ｖ－５７０」）にて測定し、未反応のＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ、ＩＣＧ-Ｍａｌ量を計算した。図４Ａに、上澄み液の吸収スペクトルを示した。ＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌは葉酸の水溶液中の吸光係数が不明であったため、葉酸のピーク波長３７７ｎｍにおける検量線を作成し、そこから濃度を算出した。図４Ｂに葉酸の検量線を示した。図４Ａにおいて３７７ｎｍの吸光度は０．０３２であり、これより求められる上澄み中の葉酸の濃度は１２ｎｍｏｌ／ｍＬである。使用したＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌ量は１４８ｎｍｏｌであるため、９２％のＦＡ-ＰＥＧ-Ｍａｌが反応したことが確認された。次にＩＣＧ-Ｍａｌについては、ＩＣＧの水溶液中の８００ｎｍにおけるモル吸光係数ε８００＝１４７０００Ｌ/ｍｏｌ・ｃｍを用いてランベルト・ベールの式Ａ800＝ε800ｃＬから上澄み中の濃度を計算した結果、０．０９４ｎｍｏｌ/ｍＬであった。使用したＩＣＧ－Ｍａｌ量は１４８ｎｍｏｌであるため、９９．９％のＩＣＧ-Ｍａｌが反応したと見積もることができる。以上の計算結果より９２％のＦＡ-ＰＥＧ、ほぼ１００％のＩＣＧがＰＰＳ ＨＮＰｓに結合していると判断した。同様に、実施例１において、ＰＰＳ ＨＮＰｓに結合したＩＣＧの量を求めたところ、ほぼ１００％のＩＣＧがＰＰＳ ＨＮＰｓに結合していることが確認された。
　（分光法による吸収スペクトルの確認）
　実施例１及び実施例２で得られたＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液及び実施例２で得られたＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液の吸収スペクトルを分光光度計（日本分光社製「Ｖ－５７０」）にて測定し、その結果を下記図５に示した。図５のＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ－ＰＥＧ／ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの吸収スペクトルから、ＰＰＳ ＨＮＰｓにＩＣＧが結合することにより、波長７００～９００ｎｍあたりにＩＣＧに由来するピークが現れることが確認された。また、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓにおいて、ポルフィリンに由来する３８０～６５０ｎｍあたりのピークにはほとんど変化がないことが確認された。
　（蛍光プローブの波長特性確認）
　実施例２で得られたＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの水溶液を用い、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの励起波長スペクトル及び蛍光波長スペクトルを、日本分光社製の分光蛍光光度計ＦＰ－６６００にて解析した。その結果を図６に示した。図６Ａはインビトロ蛍光イメージングに用いる短波長側の波長特性を示し、図６Ｂはインビボ蛍光イメージングに用いる長波長側の波長特性を示している。図６Ａ及び図６Ｂのから、最大励起波長４２５ｎｍ、最大蛍光波長６５５ｎｍの短波長側と、最大励起波長６５０ｎｍ、最大蛍光波長９０５ｎｍの長波長側のどちらにおいてもストークスシフトが大きいことが分かった。ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓは、いずれも、担体分子（ポリシロキサン）に結合した異なる励起波長の２つの蛍光色素（ポルフィリンとＩＣＧ）を有し、且つ２つの蛍光色素の間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光プローブであることが確認された。該蛍光プローブは、インビトロ及びインビボのどちらのイメージングにも用いることができる。さらに、ストークスシフトが大きいため、インビボイメージングにおいては生体の自家蛍光に妨げられることなく、非常に高い有用性が見込める。
　（蛍光顕微鏡による解析）
　（１）細胞
　マウスと同種の細胞であるマウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞、マウスと異種の細胞であるヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞とヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞を用いた。実施例において、細胞及び細胞培養用培地は、シグマーアルドリッチ社から入手した。細胞培養ディッシュは、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製のものを用いた。
　（２）細胞の蛍光プローブ標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径３５ｍｍ）中の細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に播種（０．３ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を蛍光プローブ（３０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、２４時間培養を行った。このとき、ＲＡＷ２６４．７細胞は、蛍光プローブＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換し、ＨｅＬａ Ｓ３細胞とＨＣＴ１１６細胞は、蛍光プローブＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換した。
（ｃ）上清を捨て、培養細胞を２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、和光純薬「Ｄ－ＰＢＳ（－）（０４５－２９７９５）」）で洗浄した。
（ｄ）上清を捨て、培養細胞に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を２ｍＬ添加し、３０分間室温（２０±５℃）で静置した。
（ｅ）上清を捨て、培養細胞に１×ＰＢＳを１ｍＬ加えた。この工程を３回繰り返した。
　（３）蛍光顕微鏡による観察
　ライフテクノロジーズ社の蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて蛍光プローブで標識した蛍光標識細胞を観察した。ポルフィリンの波長特性に合わせ、励起波長は４２２ｎｍ、蛍光波長は６５５ｎｍで観察を行った。その結果を図７に示した。
　図７Ａには、ＲＡＷ２６４．７細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩ（４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ（蛍光プローブ）による蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ａの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＲＡＷ２６４．７細胞において、蛍光プローブによる蛍光は、細胞質にて多く観察され、核は蛍光していないことがわかった。この結果からＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ（蛍光プローブ）が細胞内に取り込まれて、細胞質で留まっていることが確認された。ＲＡＷ２６４．７細胞は、マクロファージ細胞であり、貪食能により蛍光プローブを細胞内に取込み、細胞質に蛍光プローブが集まったと考えられる。
　図７Ｂには、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩを使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブによる蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ｂの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の蛍光プローブの蛍光は、細胞核も含めて細胞全体が蛍光していることがわかった。この結果から蛍光プローブが細胞表面に結合しており、細胞全体が光って観測されていることが明らかになった。がん細胞は細胞表面に葉酸を結合させる受容体を持っており、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）が葉酸を介してがん細胞であるＨｅＬａ Ｓ３細胞の表面に結合したと考えられる。
　図７Ｃには、ＨＣＴ１１６細胞の明視野像（Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ）、蛍光色素ＤＡＰＩを使用した細胞核の蛍光イメージ（ＤＡＰＩ）、ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブによる蛍光イメージング、これら三つの画像を重ねあわせた像（Ｍｅｒｇｅ）が示されている。図７Ｃの明視野像から、細胞が存在していることが分かった。またＤＡＰＩの画像から、ＤＡＰＩによって染色された細胞核が確認された。ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ蛍光プローブの画像から、蛍光プローブによって細胞が標識されていることが分かった。Ｍｅｒｇｅの画像から、ＨＣＴ１１６細胞の蛍光プローブの蛍光は、細胞核も含めて細胞全体が蛍光していることがわかった。この結果から蛍光プローブが細胞表面に結合しており、細胞全体が光って観測されていることが明らかになった。がん細胞は細胞表面に葉酸を結合させる受容体を持っており、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）が葉酸を介してがん細胞であるＨＣＴ１１６細胞の表面に結合したと考えられる。
　（フローサイトメーターによる解析）
　（１）細胞
　マウスと同種の細胞であるマウスのマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞及びマウスと異種の細胞であるヒトの子宮頸癌由来のＨｅＬａ Ｓ３細胞とヒトの大腸がん由来のＨＣＴ１１６細胞を用いた。
　（２）細胞の蛍光プローブ標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径３５ｍｍ）中の細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に下記表１に示す播種量で播種し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を下記表１に示す蛍光プローブ（５０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、さらに４８時間培養を行った。
（ｃ）細胞培養ディッシュから細胞を回収した。このとき、ＨｅＬａ Ｓ３細胞及びＨＣＴ１１６細胞の回収には０．２５％のトリプシン/ＥＤＴＡ溶液を使用した。
（ｄ）回収液を１０００回転にて５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を４００μＬの細胞培養培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に懸濁した。
（ｅ）懸濁液を１０００回転、５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞に４％ＰＦＡを１ｍＬ添加し、３０分間室温（２０±５℃）で静置した。
（ｆ）再懸濁液を１０００回転、５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞に１ｘＰＢＳを１ｍＬ加えた。この工程を３回繰り返した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（３）フローサイトメーターによる観察
　ＢＤ社のフローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０を用いて蛍光プルーブで標識を行った細胞を観察した。励起波長は４０５ｎｍ、蛍光波長は６７０ｎｍで観察を行った。その結果を図８（ＲＡＷ２６４．７細胞）、図９（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）及び図１０（ＨＣＴ１１６細胞）に示した。
　図８、図９及び図１０から分かるように、全ての細胞サンプルで蛍光標識されている細胞と蛍光標識されていない細胞とを分離して観察することができた。光強度としては、１００～１００００倍ほどの差があった。細胞に対して蛍光プローブによる標識を行った後、蛍光標識された細胞と蛍光標識されていない細胞を明確に判別し、分離することができた。フローサイトメーターを用いることで、蛍光プローブで標識された蛍光標識細胞のみを選別し、マウス等の生体内へ移植することができ、蛍光インビボイメージング装置により、マウス等の生体内での蛍光標識細胞の局在をより正確に確認することができる。
　（マウスへの蛍光標識細胞の移植）
　（１）細胞
　ＲＡＷ２６４．７細胞及びＨｅＬａ Ｓ３細胞を用いた。
　（２）細胞の蛍光プローブによる標識
（ａ）細胞を細胞培養ディッシュ（直径６０ｍｍ）中の細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に播種（１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）し、一晩培養した。
（ｂ）培養した細胞を蛍光プローブ（３０μｇ／ｍＬ）入りの細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）に交換し、２４時間培養を行った。このとき、ＲＡＷ２６４．７細胞は、蛍光プローブＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換し、ＨｅＬａ　Ｓ３細胞は、蛍光プローブＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ入りの細胞培養用培地に交換した。
（ｃ）細胞培養ディッシュから細胞を回収した。このとき、ＨｅＬａ Ｓ３細胞の回収にはトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用した。
（ｄ）回収液を１０００回転にて５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を１０００μＬの無血清培地（ＤＭＥＭ培地）に懸濁した。
（ｅ）懸濁液を１０００回転にて５分間遠心分離した後、上清を捨て、１０００μＬの血清培地（１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地）を加え、細胞を懸濁した。
（ｆ）１ｘ１０6細胞を１００μＬの１ｘＰＢＳに懸濁し、シリンジを用いてマウス（ＫＳＮ／Ｓｌｃ、雄、６週零、日本エスエルシー株式会社）の尾静脈に注射した。細胞数については、血球計算盤を用いて測定した。
　（３）マウス体内の蛍光プローブで標識されて蛍光標識細胞の観察
　倉敷紡績社の蛍光インビボイメージング装置「ＫＵＲＡＶＩＣ　ＫＶ－７００」を用いてマウス体内の蛍光標識細胞を観察した。観察は注射直前を０時間として、２４時間まで間隔をあけて撮影を行った。ＩＣＧの波長特性に合わせ、励起波長は７４７ｎｍ、蛍光波長は８５０ｎｍで観察を行った。その結果を図１１（ＲＡＷ２６４．７細胞）及び図１２（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）に示した。
　図１１から、蛍光プローブ（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＲＡＷ２６４．７細胞のマウス体内における２４時間までの動きが確認できた。すなわち、ＲＡＷ２６４．７細胞がマウス体内でどのような動きをしたか確認できた。特に、インビボ観察に適した蛍光波長の選択によって、自家蛍光を捉えることなく、明確にＩＣＧの蛍光のみを捉えることができた。２４時間後の状態としては、ＲＡＷ２６４．７細胞が脾臓や肝臓が多いものの、内臓全体に分布していることが分かった。
　図１２から、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＨｅＬａ Ｓ３細胞のマウス体内における２４時間までの動きが確認できた。すなわち、ＨｅＬａ Ｓ３細胞がマウス体内でどのような動きをしたか確認できた。特に、インビボ観察に適した蛍光波長の選択によって、自家蛍光を捉えることなく、明確にＩＣＧの蛍光のみを捉えることができた。２４時間後の状態としては、細胞が肝臓に特に集積していることが分かった。
　（４）マウス体内の蛍光プローブで標識された細胞の集積の確認
　２４時間経過後のマウスを解剖し、臓器を取り出し、蛍光インビボイメージング装置「ＫＵＲＡＶＩＣ　ＫＶ－７００」により、２４時間後の蛍光プローブで標識された細胞のマウス体内での集積の状態を観察した。その結果を図１３（ＲＡＷ２６４．７細胞）、図１４（ＲＡＷ２６４．７細胞）、図１５（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）及び図１６（ＨｅＬａ Ｓ３細胞）を示した。
　図１３及び図１４から分かるように、２４時間後に、蛍光プローブ（ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＲＡＷ２６４．７細胞は脾臓や肝臓に多く集積されているものの、内臓全体に分布していた。また、図１５及び図１６から分かるように、２４時間後に、蛍光プローブ（ＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ）で標識されたＨｅＬａ細胞は、肝臓に特に多く集積した。
　以上から分かるように、蛍光プローブとしてＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ及びＦＡ-ＰＥＧ/ＩＣＧ-ＰＰＳ ＨＮＰｓ等の担体分子に結合した異なる励起波長の２つの蛍光色素を有し、且つ２つの蛍光色素の間で蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じない蛍光プローブを用いることにより、蛍光プローブで標識された細胞を蛍光顕微鏡やフローサイトメーター等の蛍光インビトロイメージング装置で確認できるとともに、蛍光プローブで標識された細胞を移植した生体内における蛍光標識細胞の時間に伴う局在等を蛍光インビボイメージング装置で確認できる。

Claims (21)

  1. 　担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含む蛍光プローブにおいて、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じないことを特徴とする蛍光プローブ。
  2. 　前記蛍光プローブは、細胞標識用蛍光プローブであり、蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素であり、蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素である請求項１に記載の蛍光プローブ。
  3. 　細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識する請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
  4. 　細胞内部に取り込まれることで細胞を標識する請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
  5. 　蛍光色素ａは、励起波長が３５０～６５０ｎｍの範囲である請求項１～４のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  6. 　蛍光色素ｂは、励起波長が６００～８５０ｎｍの範囲である請求項１～５のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  7. 　蛍光色素ａがポルフィリンである請求項１～６のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  8. 　蛍光色素ｂがインドシアニングリーンである請求項１～７のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  9. 　前記担体分子は、ポリシロキサンである請求項１～８のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  10. 　フローサイトメーターによる蛍光標識細胞の選別に用いる請求項２～９のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
  11. 　標的細胞を検出する蛍光検出方法であって、
    　標的細胞を蛍光プローブで標識する工程と、
    　蛍光プローブで標識された標的細胞に励起光を照射して、蛍光プローブからの蛍光を観察する工程を含み、
    　前記蛍光プローブは、担体分子と、前記担体分子に結合している蛍光色素ａ及び蛍光色素ｂを含み、蛍光色素ａの励起波長と蛍光色素ｂの励起波長は異なり、且つ蛍光色素ａと蛍光色素ｂの間に蛍光共鳴エネルギー移動が生じないことを特徴とする蛍光検出方法。
  12. 　蛍光色素ａは、インビトロ蛍光イメージング用蛍光色素であり、蛍光色素ｂは、インビボ蛍光イメージング用蛍光色素である請求項１１に記載の蛍光検出方法。
  13. 　蛍光プローブで標識された標的細胞に蛍光色素ａを励起する励起光を照射し、インビトロ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察する請求項１１又は１２に記載の蛍光検出方法。
  14. 　蛍光プローブで標識された標的細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植し、該生体に蛍光色素ｂを励起する励起光を照射し、インビボ蛍光イメージングによって蛍光プローブからの蛍光を観察する請求項１１又は１２に記載の蛍光検出方法。
  15. 　前記蛍光プローブは、細胞表面に特異的に結合することで細胞を標識する請求項１１～１４のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
  16. 　前記蛍光プローブは、細胞内部に取り込まれることで細胞を標識する請求項１１～１４のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
  17. 　蛍光色素ａは、励起波長が３５０～６５０ｎｍの範囲である請求項１１～１６のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
  18. 　蛍光色素ｂは、励起波長が６００～８５０ｎｍの範囲である請求項１１～１７のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
  19. 　蛍光色素ａがポルフィリンである請求項１１～１８のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
  20. 　蛍光色素ｂがインドシアニングリーンである請求項１１～１９のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
  21. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の蛍光プローブの使用方法であって、
    　細胞を蛍光プローブによって蛍光標識する工程と、
    　蛍光プローブによって蛍光標識された蛍光標識細胞をフローサイトメーター又は蛍光顕微鏡によって確認して選別する工程と、
    　選別した蛍光標識細胞を生体（ただし、人体を除く）内に移植する工程と、
    　生体内の蛍光標識細胞をインビボ蛍光イメージング装置で観察する工程を含み、
    　前記フローサイトメーター又は蛍光顕微鏡による蛍光標識細胞の選別は、蛍光色素ａ由来の蛍光を検出することで行い、前記生体内の蛍光標識細胞のインビボ蛍光イメージング装置による観察は、蛍光色素ｂ由来の蛍光を検出することで行うことを特徴とする蛍光プローブの使用方法。
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