CN105324668B - 在表面具有反应性官能团的二氧化硅颗粒及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种二氧化硅颗粒，其在表面具有硫醇基，是含有荧光性或吸光性的色素的二氧化硅颗粒，其中，该二氧化硅颗粒满足下述(a)和(b)：(a)粒径为20nm～1000nm；(b)二氧化硅颗粒表面的上述硫醇基的密度为0.002个/nm2～0.2个/nm2；(c)二氧化硅颗粒的表面所存在的硫醇基的量B(个/1颗粒)相对于该二氧化硅颗粒中的硫元素的量A(在每1个二氧化硅颗粒中的硫醇来源的硫元素个数)之比(B/A)为0.10～0.60。

Description

在表面具有反应性官能团的二氧化硅颗粒及其制造方法
技术领域
本发明涉及在表面具有反应性官能团的二氧化硅颗粒及其制造方法。
背景技术
近年来，数nm～1μm左右的微粒被用于各种领域中并受到了注目。例如有用于吸附剂、催化剂等的多孔质二氧化硅颗粒或沸石颗粒，用于颜料的炭黑、金属氧化物颗 粒、无机化合物颗粒，用于导电材料的金属纳米颗粒，用于树脂的增强剂的二氧化硅 颗粒等，上述微粒的材质和用途涉及多个方面。另外，特别是在生物技术的领域中， 期待将半导体纳米颗粒或含有荧光色素的二氧化硅纳米颗粒等作为新型标记用颗粒 的应用。另外，含有高浓度色素的二氧化硅纳米颗粒具有高摩尔吸光系数，因此期待 其作为更高灵敏度的标记用颗粒的应用。
上述标记用颗粒通过使具有与特定目标分子的结合能力的生物体分子(蛋白质或核酸等)结合在其表面，而能够用作可用于目标分子的检测、定量、染色等的标记试 剂。
除了利用物理吸附来进行以外，还可通过藉由标记用颗粒表面所存在的反应性官能团使两者共价结合来进行标记用颗粒与生物体分子的结合。通过利用共价结合，可 得到更强固、稳定的标记生物体分子。作为在二氧化硅颗粒的表面导入反应性官能团 的方法，已知有在含有氨水的溶剂中使具有反应性官能团的有机烷氧基硅烷在二氧化 硅的核颗粒表面发生缩聚的方法(参见例如专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-225381号公报
发明内容
在二氧化硅颗粒表面导入反应性官能团时，通常采取将具有该官能团的硅烷偶联剂与作为核的二氧化硅颗粒在酸性或碱性的水溶液中进行混合的方法。由此，利用水 溶液中的水分将硅烷偶联剂水解，接着与二氧化硅颗粒表面的羟基之间发生缩聚反 应，将反应性官能团导入到二氧化硅颗粒表面。但是，在该方法中，不能避免具有反 应性官能团的硅烷偶联剂之间发生缩聚。因此，在核颗粒表面的来源于具有反应性官 能团的硅烷偶联剂的壳层形成得较厚，大量的反应性官能团处于被埋在该壳层中的状 态。即，在现有的方法中，反应性官能团向颗粒表面的导入为低效率的。
本发明的课题在于提供一种二氧化硅颗粒，其是在表面以特定密度具有硫醇基的纳米尺寸二氧化硅颗粒，其中，提高了该颗粒表面所存在的硫醇基在该颗粒所具有的 硫醇基的总量中所占有的比例。
另外，本发明的课题在于提供一种生物体分子复合颗粒，其是在上述二氧化硅颗粒表面藉由上述硫醇基结合生物体分子而成的。
另外，本发明的课题在于提供一种免疫层析方法，该方法中使用结合有抗体或抗原作为生物体分子的生物体分子复合颗粒。
此外，本发明的课题在于提供一种二氧化硅颗粒的制造方法，该方法能够更为有效地在表面导入特定的反应性官能团。
本发明人发现，若将二氧化硅颗粒以在其表面具有结合水的状态分散在有机溶剂中并在该有机溶剂中混合具有硫醇基等反应性官能团的硅烷偶联剂，则能够有效地在 该二氧化硅颗粒表面导入该反应性官能团。也即发现，由于利用上述结合水仅在颗粒 表面进行上述硅烷偶联剂的水解和缩聚反应，因而上述硅烷偶联剂彼此之间不容易发 生缩聚反应，其结果可大幅抑制具有反应性官能团的壳层的厚度。
另外发现，在将这样得到的在二氧化硅颗粒的表面藉由该反应性官能团结合生物体分子并用作免疫层析法等的标记试剂时，该标记试剂的非特异性吸附受到抑制、背 景信号降低，由此信噪比增大，可进行更高灵敏度的分析。
本发明是基于这些技术思想而完成的。
本发明的课题是通过下述手段达成的。
[1]
一种二氧化硅颗粒，其在表面具有硫醇基，其中，该二氧化硅颗粒满足下 述(a)、(b)和(c)：
(a)粒径为20nm～1000nm；
(b)二氧化硅颗粒表面的上述硫醇基的密度为0.002个/nm2～0.2个/nm2；
(c)二氧化硅颗粒的表面所存在的硫醇基的量B(个/1颗粒)相对于该二氧化硅颗粒 中的硫元素的量A(在每1个二氧化硅颗粒中的硫醇来源的硫元素个数)之比(B/A)为0.10～0.60。
[2]
如[1]中所述的二氧化硅颗粒，其中，上述二氧化硅颗粒含有荧光性或吸光性的色素。
[3]
如[1]或[2]中所述的二氧化硅颗粒，其中，上述硫醇基藉由亚烷基或亚烷基氧基结合在二氧化硅颗粒表面。
[4]
一种生物体分子复合颗粒，其是在[1]～[3]任一项所述的二氧化硅颗粒的表面藉由上述硫醇基结合生物体分子而成的。
[5]
如[4]中所述的生物体分子复合颗粒，其中，上述生物体分子为抗体或抗原。
[6]
一种免疫层析方法，其使用[5]中所述的生物体分子复合颗粒。
[7]
一种二氧化硅颗粒的制造方法，该二氧化硅颗粒在表面具有羟基以外的反应性官能团，其中，该方法包括：
将在表面具有结合水的二氧化硅颗粒与具有羟基以外的反应性官能团的硅烷偶联剂在有机溶剂中混合，利用该结合水将该硅烷偶联剂水解。
[8]
如[7]中所述的制造方法，其中，上述的羟基以外的反应性官能团为选自由硫醇基、氨基、羧基、卤原子、乙烯基、环氧基、异氰酸酯基以及异硫氰酸酯基中的至少 1种。
[9]
如[7]或[8]任一项所述的制造方法，其中，上述有机溶剂为极性非质子性溶剂或碳原子数为2以上的醇。
[10]
如[7]～[9]任一项所述的制造方法，其中，上述在表面具有结合水的二氧化硅颗粒含有荧光性或吸光性的色素。
[11]
如[7]～[10]任一项所述的制造方法，其中，上述在表面具有结合水的二氧化硅颗粒在与上述硅烷偶联剂混合前利用亲水性有机溶剂实施了清洗处理。
本发明的二氧化硅颗粒在表面以特定密度具有硫醇基，该颗粒表面的硫醇基在该颗粒所具有的硫醇基的总量中所占有的比例大幅增高。
本发明的生物体分子复合颗粒是在本发明的二氧化硅颗粒表面藉由硫醇基结合生物体分子而成的，可有效地抑制用于分析试剂时的非特异性的吸附，可进一步提高 检测灵敏度。
本发明的免疫层析方法使用本发明的生物体分子复合颗粒作为标记试剂，能够高灵敏度地检测生物体分子所结合的目标物质。
利用本发明的制造方法，能够更为有效地在二氧化硅颗粒表面导入特定的反应性官能团。
本发明的上述以及其它特征和优点可适当地参照所附的附图由下述记载进一步得以明确。
附图说明
图1示意性地示出实施例中所使用的免疫层析装置的试条的结构。图1中(A)表示俯视图、(B)表示纵截面图。
具体实施方式
下面基于本发明的优选实施方式对其进行详细说明。
本发明的二氧化硅颗粒是粒径为20nm～1000nm的二氧化硅颗粒，在其表面以特定密度具有硫醇基，并且在该颗粒所具有的硫醇基的总量中，在该颗粒表面存在的硫 醇基的比例增高至特定的水平。
另外，本发明的制造方法包括：将在表面具有结合水的二氧化硅颗粒与具有羟基以外的反应性官能团的硅烷偶联剂在有机溶剂中混合，利用该二氧化硅颗粒表面的结 合水将该硅烷偶联剂水解。
下面首先对本发明制造方法的优选实施方式进行详细说明。
[本发明的制造方法]
(在表面具有结合水的二氧化硅颗粒)
在表面具有结合水的二氧化硅颗粒(下文中有时称为“核颗粒”)只要在表面具 有羟基、能够与后述的具有反应性官能团的硅烷偶联剂发生缩聚反应就没有特别限 制。在使用二氧化硅颗粒作为标记试剂的情况下，可以含有荧光性或吸光性的色素或 者放射性物质等标记物质。核颗粒优选含有荧光性或吸光性的色素，更优选含有荧光 性色素。
对核颗粒的优选实施方式进行说明。
含有荧光性或吸光性的色素的核颗粒可以如下进行制备：使该色素与硅烷偶联剂通过共价结合、离子结合及其它化学结合或者物理吸附进行结合，得到生成物(结合 有荧光性或吸光性的色素的有机烷氧基硅烷)，使该生成物与1种或2种以上的硅烷化 合物(硅氧烷成分)在例如含有氨水的溶剂中发生水解·缩聚从而形成硅氧烷键，由此 来制备该核颗粒。另外，并不限于色素，含有放射性物质等其它标记物质的核颗粒也 可以使用结合有标记物质的硅烷偶联剂同样地进行制备。
另外，在二氧化硅颗粒中不含有标记物质的情况下，可以仅将上述硅烷化合物作为原料，在含有氨水的溶剂中进行水解·缩聚，得到核颗粒。
作为上述含有氨水的溶剂，例如可以在水/乙醇以体积比计为1/10～1/1的混合液中按照氨浓度为0.2～3wt％加入例如28％左右的氨水，使用所得到的溶液。
对于上述硅烷化合物(硅氧烷成分)没有特别限制，优选使用四乙氧基硅烷(TEOS)、四甲氧基硅烷之类的四烷氧基硅烷，其中可以优选使用TEOS。
在使标记物质与硅烷偶联剂共价结合的情况下，例如可以使用具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基、马来酰亚胺基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、醛基、对硝基苯基、 二乙氧基甲基、环氧基、氰基等活性基团的标记物质、以及具有可与这些活性基团发 生反应的官能团(例如氨基、羟基、硫醇基等)的硅烷偶联剂。
作为具有NHS酯基的标记物质为荧光分子的情况下的优选例，可以举出5-(和-6)-羧基四甲基若丹明-NHS酯(商品名、emp Biotech GmbH社制造)、下式所表示的 DY550-NHS酯、下式所表示的DY630-NHS酯(均为商品名、Dyomics GmbH社制造) 等具有NHS酯基的荧光色素化合物，但本发明中并不限于这些。
【化1】
【化2】
在标记物质具有琥珀酰亚胺基的情况下，可以与具有氨基的硅烷偶联剂结合。作为具有氨基的硅烷偶联剂的具体例，可以举出γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷等。其中可以优选使用APS。
如上所述制备的含有标记物质或者不含有标记物质的二氧化硅颗粒的形状优选长轴与短轴之比为2以下的球状。另外，平均粒径优选为1nm～950nm、更优选为 18nm～495nm、进一步优选为28nm～298nm。
在本说明书中，粒径是指平均粒径。平均粒径可如下计算出：利用图像处理装置，由从透射型电子显微镜(TEM)、扫描型电子显微镜(SEM)等的图像中随机选择的50个 颗粒的合计投影面积求出颗粒的合计占有面积，该合计占有面积除以所选择的复合颗 粒的个数(50个)，计算出与所得到的面积相当的圆的直径(平均圆相当直径)，将其作 为平均粒径。上述平均粒径不包括一次颗粒凝集而成的二次颗粒的粒径。
所期望的平均粒径的二氧化硅纳米颗粒可以通过使用YM-10、YM-100(均为商品名、Millipore社制造)等超滤膜的超滤来得到。另外，也可利用适当的重力加速度进行 离心分离，回收上清或沉淀，从而得到该二氧化硅纳米颗粒。
导入羟基以外的反应性官能团之前的在表面具有结合水的二氧化硅颗粒还优选利用水、水溶液或有机溶剂或者它们的混合液进行清洗。另外，通过使用水或水溶液 进行清洗，在去除杂质的同时还可以使颗粒表面保持足够的结合水。
关于清洗操作，具体地说，优选循环1～3次进行将二氧化硅颗粒分散在清洗液中、通过离心分离使二氧化硅颗粒沉降、以及除去上清的操作。对清洗液没有特别限制， 例如可以举出水、水溶液、乙醇、丙醇、戊醇、己醇、己醇、N,N-二甲基甲酰胺、二 甲基亚砜等。
在利用水或水溶液进行清洗来除去杂质、同时使二氧化硅颗粒表面保持足够量的结合水之后，还优选利用醇(优选乙醇、丙醇、戊醇、己醇或己醇)等亲水性有机溶剂 进行清洗，除去二氧化硅颗粒表面所存在的结合水以外的多余水分(自由水)，得到在 表面具有结合水的二氧化硅颗粒。
另外，只要是在含有氨水的溶剂中刚刚形成核颗粒之后，通常在核颗粒表面即保持着足够的结合水。从而，可以将在含有氨水的溶剂中形成的核颗粒利用亲水性有机 溶剂进行清洗，除去二氧化硅颗粒表面所存在的自由水，得到在表面具有结合水的二 氧化硅颗粒。
接下来，对于在表面具有结合水的二氧化硅纳米颗粒上导入羟基以外的反应性官能团(下文中称为“官能团(I)”)的方法进行说明。在本发明的制造方法中，官能团(I) 优选为选自硫醇基、氨基、羧基、卤基、乙烯基、环氧基、异氰酸酯基以及异硫氰酸 酯基中的至少一种。通过采用这样的反应性官能团，能够藉由这些反应性官能团进行 生物体分子等的结合。
(官能团(I)的导入)
本发明的制造方法包括下述工序：将上述得到的在表面具有结合水的二氧化硅颗粒与具有官能团(I)的硅烷偶联剂在有机溶剂中混合，利用该结合水将该硅烷偶联剂水解。
上述被水解的具有官能团(I)的硅烷偶联剂通过该水解位点的羟基与二氧化硅纳米颗粒表面的羟基的缩聚而结合在二氧化硅纳米颗粒表面。由于该缩聚反应放出水分 子，因而结合水的量在缩聚反应前后无变化。
作为上述有机溶剂，可以举出二甲基亚砜、环丁砜、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、 N-环己基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、醇(优选碳原子数为2 以上、更优选碳原子数为3～10、进一步优选碳原子数为4～8的醇)。其中优选选自N,N- 二甲基甲酰胺和碳原子数为4～8的醇的溶剂，更优选选自碳原子数为4～8的醇的溶 剂，进一步优选选自戊醇、己醇和庚醇的溶剂。
在具有上述官能团(I)的硅烷偶联剂中，官能团(I)与硅原子的连结优选藉由连接基 团。作为该连接基团，优选为亚烷基或亚烷基氧基。该亚烷基或亚烷基氧基的碳原子 数优选为2～10、更优选为2～5、进一步优选为2～4。利用连接基团与有机溶剂之间 的溶剂化，能够使官能团有效地朝向二氧化硅颗粒的表面外侧配置。
作为具有上述官能团(I)的硅烷偶联剂的具体例，可以举出3-巯基丙基三甲氧基硅 烷、γ-巯基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-硫氰酸根合丙基三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、3-异硫氰酸根合丙基三乙氧基硅烷、 3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷、(3-氯丙基三甲氧基硅烷、乙烯基 甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基 硅烷、N-苯基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-脲基丙基三乙氧基硅烷、双(三乙氧基甲 硅烷基丙基)四硫醚等，但本发明中并不限于这些。
通过利用上述方法将官能团(I)导入到二氧化硅颗粒，能够大幅抑制具有官能团(I) 的硅烷偶联剂之间的缩聚反应。其结果，能够将具有官能团(I)的壳层进一步薄膜化。该壳层的薄膜化当使用二氧化硅颗粒作为分析试剂的标记颗粒时可抑制被测物中存 在的成分等的非特异性吸附，可进行灵敏度和精度优异的分析。
另外，由于壳层可进行薄膜化，因而能够相应地增加核颗粒的比例。其结果，可 以增加每1颗粒的标记物质(色素等)的量，致使作为分析试剂使用时的灵敏度进一步 提高。
导入有官能团(I)的含有功能性分子的二氧化硅纳米颗粒的Zeta(ζ)电位的绝对值 优选为20mV～70mV。ζ电位的绝对值为上述范围内的颗粒凝集受到抑制，分散性进 一步提高。
ζ电位例如可使用Zetasizer Nano(商品名、Malvern社制造)、ELS-Z1(商品名、大塚电子社制造)、NICOMP 380ZLS(商品名、IBC社制造)进行测定。
利用本发明的制造方法，能够提高二氧化硅颗粒表面所存在的官能团(I)在二氧化 硅颗粒所具有的官能团(I)的总量中所占的比例。
如上所述制备的在表面具有官能团(I)的二氧化硅颗粒的形状是长轴与短轴之比为2以下的球状。在实施本发明时，为了进行表面修饰所需要的溶剂置换，能够对二 氧化硅颗粒进行离心分离这一点是必要的。在粒径(平均粒径)小于20nm的情况下，难 以通过离心分离进行沉降，因而优选粒径为20nm以上。另外，在粒径大于1000nm的 情况下，在反应中颗粒会发生沉降。因此，粒径优选为1000nm以下。从而，粒径优 选为20nm～1000nm、更优选为20nm～500nm、进一步优选为30nm～300nm。
在本发明的制造方法中，官能团(I)优选为硫醇基。下面对官能团(I)为硫醇基的情 况下所得到的二氧化硅颗粒进行说明。
在官能团(I)为硫醇基的情况下，具有硫醇基的二氧化硅颗粒的表面所存在的硫醇 基的量B(个/1颗粒)相对于该具有硫醇基的二氧化硅颗粒中的硫元素的量A(在每1个二氧化硅颗粒中的硫醇来源的硫元素个数)之比(B/A)优选为0.10～0.60、更优选为 0.15～0.60、进一步优选为0.20～0.60。
此处所说的在每1个颗粒中(在每1颗粒中)是指规定量的二氧化硅颗粒所具有的硫元素量或者硫醇基的量除以该颗粒数所得到的值(即为平均值)。此处，规定量的二 氧化硅颗粒的颗粒数通过将该规定量的二氧化硅颗粒的总质量除以每1个二氧化硅颗 粒的质量来求得。每1个二氧化硅颗粒的质量可使用二氧化硅颗粒的平均体积与二氧 化硅颗粒的相对密度(2.0g/cm3)来计算出。二氧化硅颗粒的平均体积可以如下计算出： 通过图像处理，由10000倍的SEM照片中求出视野中的规定个数(通常为200个左右)的 各个二氧化硅颗粒的粒径(长径与短径的平均)，使用该求出的粒径，假设各个二氧化 硅颗粒为球体，计算出体积(体积＝4π×(二氧化硅颗粒的粒径的一半)3/3)，基于此求出 总体积，将总体积除以上述视野中的规定个数(颗粒数)，由此求出该平均体积。
上述的比(B/A)与在二氧化硅颗粒表面露出的硫元素的重量相对于二氧化硅颗粒的硫元素的总重量的比例为相同含义。
另外，在官能团(I)为硫醇基的情况下，二氧化硅颗粒表面的硫醇基的密度优选为0.002个/nm2～0.2个/nm2、更优选为0.002个/nm2～0.1个/nm2。另外，可以为0.002个 /nm2～0.05个/nm2、可以为0.003个/nm2～0.02个/nm2、也可以为0.003～0.01。
通过使二氧化硅颗粒表面的硫醇基的密度为0.002个/nm2以上，能够结合足够量的生物体分子，在应用于例如免疫层析等免疫测定中时能够进一步提高检测灵敏度。
另外，通过使二氧化硅颗粒表面的硫醇基的密度为0.2个/nm2以下，能够有效地抑制颗粒的凝集。另外，在使其结合生物体分子用作分析试剂时，可进一步抑制非特 异性吸附，更不容易产生假阳性。
需要说明的是，在官能团(I)为硫醇基时，在向颗粒表面导入硫醇基之前的核颗粒具有硫元素的情况下(例如，在色素与硅烷偶联剂的连结部存在硫元素等)，核颗粒中 的硫元素的量不包括在二氧化硅颗粒中的硫元素的量A中。即，上述A为以硫醇基形 态在颗粒中存在的硫元素的总量。向颗粒表面导入硫醇基之前的核颗粒优选不具有硫 元素。
上述的在表面具有硫醇基的二氧化硅颗粒中的硫元素的量A(每1个该具有硫醇基的二氧化硅颗粒中的的量)可通过燃烧法测定。具体地说，在Ni胶囊等金属胶囊中装 入5μg～50μg的二氧化硅纳米颗粒，对燃烧产生的二氧化硫(SO2)的量进行定量，从而 可测定出硫元素的量。
上述的在表面具有硫醇基的二氧化硅颗粒中的在颗粒表面存在的硫醇基的量B可使用DNTB(5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸))作为试剂来测定。使用DNTB的硫醇基定量 法例如记载于Archives of Biochemistry and Biophysics,1959,vol.82,p.70中。作为具体方法的一例，可以将溶解在磷酸缓冲液(pH7.0)中的10mM的DNTB溶液20μL与制备成 200mg/mL的二氧化硅颗粒胶体2.5mL混合，在1小时后测定412nm的吸光度，使用γ- 巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)作为标准物质制作校正曲线，由该校正曲线将在颗粒表 面存在的硫醇基量定量。
由本发明的制造方法得到的在表面具有硫醇基的二氧化硅颗粒可以藉由该硫醇基结合生物体分子，制成生物体分子复合颗粒。关于生物体分子的结合在下文叙述。
另外，在本发明的制造方法中，在二氧化硅颗粒所具有的官能团(I)为氨基、羧基、乙烯基、环氧基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基的情况下，也可以利用常规方法在所得 到的二氧化硅颗粒表面结合生物体分子。这些方法例如可参照日本特开 2009-274923(氨基)号公报、日本特开2009-162537(羧基)号公报、日本特开 2010-100542(环氧基、异氰酸酯基)号公报等的记载。
[本发明的二氧化硅颗粒]
本发明的二氧化硅颗粒在其表面具有硫醇基，(a)其粒径为20nm～1000nm，(b) 颗粒表面的上述硫醇基的密度为0.002个/nm2～0.2个/nm2，进而(c)二氧化硅颗粒的表 面所存在的硫醇基的量B(个/1颗粒)相对于该二氧化硅颗粒中的硫元素的量A(在每1 个二氧化硅颗粒中的硫醇来源的硫元素个数)之比(B/A)为0.10～0.60。本发明的二氧 化硅颗粒通常在其表面均匀地存在硫醇基。
对于本发明的二氧化硅颗粒的制备方法没有特别限制，例如，可通过在上述本发明的制造方法中采用硫醇基作为官能团(I)来得到。
本发明的二氧化硅颗粒的优选形态与在上述本发明的制造方法中采用硫醇基作为官能团(I)的情况下所得到的二氧化硅颗粒的优选形态相同。从而，本发明的二氧化 硅颗粒的粒径更优选为20nm～500nm、进一步优选为30nm～300nm。另外，二氧化硅 颗粒表面的硫醇基的密度优选为0.002个/nm2～0.1个/nm2，可以为0.002个/nm2～0.05 个/nm2、也可以为0.003个/nm2～0.02个/nm2。另外，本发明的二氧化硅颗粒的上述比 (B/A)优选为0.15～0.60、更优选为0.20～0.60。
本发明的二氧化硅颗粒也可以不含有标记物质，但优选含有标记物质。通过含有标记物质，能够适当地用作标记试剂。标记物质优选为荧光性或吸光性的色素、更优 选为荧光性色素。该色素优选在导入硫醇基之前的颗粒(核颗粒)中含有。即，可以制 备含有标记物质的核颗粒，在其表面通过例如本发明的制造方法导入硫醇基，从而可 得到含有标记物质的形态的本发明的二氧化硅颗粒。核颗粒的制备如上所述。在上述 核颗粒中优选不含有硫元素。
[本发明的生物体分子复合颗粒]
本发明的生物体分子复合颗粒为上述本发明的二氧化硅颗粒藉由其表面所具有的硫醇基结合生物体分子而成的形态的颗粒。
对生物体分子没有特别限制，可广泛使用蛋白质、核酸、糖等。这些生物体分子 可以进一步被化学修饰，另外，一部分结构也可以被化学改变。其中，生物体分子优 选具有与所期望的目标物质特异性结合的能力。作为该生物体分子与目标物质的组合 的示例，可以举出抗体与其抗原、抗原与其抗体、核酸(DNA或RNA等)与具有与该核 酸互补的序列的核酸、受体与其配体、配体与其受体、凝集素与糖链、适体与特异性 结合至该适体的分子等。生物体分子优选为抗体或抗原，更优选为抗体。
在上述生物体分子为抗体的情况下，本发明的生物体分子复合颗粒可以作为用于检测抗原的免疫测定试剂使用。
作为上述抗体，包括免疫球蛋白(全抗体)、将其酶分解而得到的F(ab’)2或Fab、藉由连接序列将重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)串联连结而成的scFv或sc(Fv)2、由2 个藉由连接序列将VH与VL连结而成的单元形成的二聚体、人工化学合成的含有VH 和VL的聚氨基酸、将大肠菌或酵母等用作表达系统而制作的含有VH和VL的重组蛋白 质或重组聚氨基酸。即，本发明中的“抗体”是指具有VH和VL的分子或单元，只要 具有VH和VL，则对其形态并无限定。
本发明的二氧化硅颗粒上的生物体分子的结合优选使在颗粒表面存在的硫醇基与生物体分子进行共价结合。该共价结合可利用常规方法进行。例如，使本发明的二 氧化硅颗粒与具有马来酰亚胺基和羧基的连接分子在非质子性溶剂中共存，由此在颗 粒表面的硫醇基与上述马来酰亚胺基之间形成硫醚键，得到结合有连接分子的二氧化 硅颗粒。接着，使上述的结合有连接分子的二氧化硅颗粒与碳化二亚胺及具有氨基的 生物体分子在水系溶剂中共存，从而在利用上述碳化二亚胺进行了活性酯化的上述羧 基与上述生物体分子所具有的氨基之间形成酰胺键。由此可得到生物体分子藉由硫醇 基结合而成的生物体分子复合颗粒。
另外，还可以使在表面具有硫醇基的二氧化硅颗粒与具有马来酰亚胺基和氨基的连接分子在溶剂中共存，从而使具有硫醇基的二氧化硅颗粒的该硫醇基与上述马来酰 亚胺基之间形成硫醚键，接下来得到结合有连接分子的二氧化硅颗粒，接着使上述结 合有连接分子的二氧化硅颗粒与碳化二亚胺及抗体在水系溶剂中共存，在上述连接分 子所具有的氨基与上述抗体所具有的羧基之间形成酰胺键。
利用本发明的制造方法制造的生物体分子复合颗粒的粒径(平均粒径)优选为20nm～1000nm、更优选为20nm～500nm、进一步优选为30nm～300nm。
对本发明的生物体分子复合颗粒的用途没有特别限制。例如，作为生物体分子使用抗体或抗原时，可以用作各种免疫学检査(免疫测定)的标记试剂。作为该免疫测定， 可以用作免疫层析法、酶联免疫测定(EIA、例如酶联免疫吸附测定(ELISA)等)、荧光 免疫测定(FIA)、放射免疫测定(RIA)等的标记颗粒。
另外，还可用于免疫凝集法(将结合有抗体或抗原的颗粒与被测物混合，通过与被测物所含有的抗原或抗体的抗原抗体反应使颗粒凝集的检査方法)、免疫比浊法(将 结合有抗体或抗原的颗粒与被测物混合，形成通过与被测物所含有的抗原或抗体的抗 原抗体反应而产生的抗原-抗体复合体的沉降物，对该凝集块照射光，利用分光光度 计测量由于散射所致的照射光的衰减，以对被测物所含有的抗原量进行测定的检査方 法)、免疫浊度法(免疫比ろう法)(将结合有抗体或抗原的颗粒与被测物混合，形成通 过与被测物所含有的抗原或抗体的抗原抗体反应而产生的抗原-抗体复合物，对该复 合物的分散液照射光，对散射的光进行测定，以对被测物所含有的抗原或抗体进行定 量的检査方法)、CLEIA法(化学发光酶免疫测定法；将结合有抗体的颗粒和酶标记抗 体与含有抗原的被测物混合，形成颗粒-抗原-酶标记抗体的复合体，除去未反应物后， 添加发光试剂，对其发光量进行测定，以对检测对象物进行定量的检査方法)等。
此外，本发明的生物体分子复合颗粒还可用作流式细胞术中的标记颗粒或各种生物芯片等中的标记颗粒。
[本发明的免疫层析方法]
对本发明的免疫层析方法(Immunochromatography)的优选实施方式进行说明。
(试条)
本发明的免疫层析方法使用特定的试条来实施。该试条优选为下述(1)、(2)、(3)中的部件按照相互产生毛细管现象的方式进行串联连结而成的结构：
(1)试样添加用部件(样品垫)与含有标记抗体(二氧化硅颗粒为例如含有荧光性或 吸光性色素的生物体分子复合颗粒、该生物体分子为抗体)而成的部件(结合垫)；
(2)上述结合垫与固定化有用于捕捉含有目标物质及标记抗体的复合体的抗体的膜(捕捉抗体固定化膜)；以及
(3)上述捕捉抗体固定化膜和吸收垫。
上述捕捉抗体分子为在含有目标物质和标记抗体的复合体中能够结合在目标物质上的、结合有标记抗体的部位以外的部位的抗体。
参照图1(A)和图1(B)对上述试条的优选实施方式进行说明，但本发明并不限定于此。
图1(A)示出了上述试条的一个优选实施方式的俯视图，图1(B)示出了图1(A)所示的上述试条的纵截面图。
上述试条1优选由样品垫2、结合垫3、捕捉抗体固定化膜4、吸收垫5形成。上述 各构成部件优选被带有粘合剂的衬板6支持。
在上述捕捉抗体固定化膜4中的捕捉抗体固定化部设有用于判断目标物质的有无、即用于判断阳性/阴性的固定有抗体的判断部41。在捕捉抗体固定化膜4中优选含 有控制线42，该控制线42固定有与标记抗体结合的分子。
下面对上述各部件进行说明。
(样品垫2)
样品垫2为滴加含有目标物质的液体试样的构成部件。
(结合垫3)
结合垫3为含有标记抗体的构成部件，其是由样品垫2通过毛细管现象移动过来的液体试样所含有的目标物质通过特异性分子识别反应与标记抗体在液相中结合而开 始复合体形成的部分。
(捕捉抗体固定化膜4)
捕捉抗体固定化膜4是含有上述复合体的溶液通过毛细管现象移动过来的构成部件，其具有捕捉抗体固定化部(判断部)，该捕捉抗体固定化部(判断部)将含有目标物 质与标记抗体的复合体捕捉到固定化抗体上。
作为上述膜中的上述捕捉抗体固定化部(判断部)的形状，只要使捕捉用抗体局部固定化就没有特别限制，可以举出线状、圆状、带状等，优选为线状，通常为宽0.5mm～1.5mm的线状。
通过上述复合体形成反应，结果使标记抗体在捕捉抗体固定化部(判断部)浓缩。其结果，可通过荧光信号等含色素二氧化硅颗粒所具有的色素量的程度对目标物质的 量进行定性或定量。
对上述捕捉抗体固定化部(判断部)中的捕捉抗体固定化量没有特别限制，在形状为线状的情况下，优选每单位长度(cm)为0.1μg～5μg。作为固定化方法，可以举出将 捕捉抗体溶液涂布、滴加或喷雾后进行干燥，通过物理吸附进行固定化的方法等。捕 捉分子在膜上可以直接被固定化，也可以藉由其它分子间接地被固定化。
在上述的捕捉抗体固定化后，为了防止由于非特异性吸附所致的对测定的影响，优选对上述捕捉抗体固定化膜整体实施所谓的封闭处理。例如可以通过在含有白蛋 白、酪蛋白、聚乙烯醇等封闭剂的缓冲液中浸渍适当的时间浸渍后进行干燥来进行封 闭。作为市售的上述封闭剂，例如可以举出脱脂乳(DIFCO社制造)、4％Block ACE(明 治乳业社制造)等。
(吸收垫5)
吸收垫5是用于对通过毛细管现象在膜中移动过来的溶液进行吸收并产生一定流动的构成部件。
作为这些各构成部件的材料没有特别限制，可以使用在免疫层析用试条中通常使用的部件，作为样品垫和结合垫优选Glass Fiber Conjugate Pad(商品名、MILLIPORE 社制造)等玻璃纤维垫，作为膜优选Hi-Flow Plus120膜(商品名、MILLIPORE社制造) 等硝酸纤维素膜。另外，作为吸收垫优选Cellulose Fiber Sample Pad(商品名、 MILLIPORE社制造)等纤维素膜。
作为上述带粘合剂的衬板可以举出AR9020(商品名、Adhesives Research社制造)等。
作为上述试条的制作法，可以如下来制作：按照样品垫、结合垫、捕捉抗体固定 化膜、吸收垫的排列顺序，为了使各部件间容易产生毛细管现象，使这些各部件的两 端与相邻的部件重叠1mm～5mm左右来进行粘贴(优选粘贴在衬板上)，由此来制作该 试条。
(检测方法)
接着对免疫层析法中的检测方法进行说明。
将可含有目标物质的液体试样滴加至上述试条的样品垫2，从而透过了样品垫2的该液体试样渗透至结合垫3并与之接触，保持在该结合垫3的标记抗体与该液体试样 中的目标物质的结合反应开始进行。液体试样通过上述结合反应形成含有标记抗体与 该目标物质的复合体，同时通过毛细管现象依次移动到捕捉抗体固定化膜4、吸收垫5， 在试样中含有目标物质的情况下，如上所述标记抗体在检测线上浓缩。对于该浓缩的 标记抗体所含有的色素的吸光(等离子共振)通过目视进行检测、或者对于色素的荧光 使用荧光检测器进行检测，从而可对目标物质的存在进行检测。本发明中的“检测” 为包括定性检测和定量检测这两方面的概念。
所滴加的液体试样的量可根据试条的构成进行适当的调节。
在本发明中，对可含有目标物质的试样没有特别限制，可以举出临床被测物、食品被测物、环境采样被测物等。
作为上述临床被测物，可以举出血液、血浆、血清、淋巴液、尿、唾液、胰腺液、 胃液、咳痰、由鼻或咽等粘膜采取的拭子液等体液或便等，但并不限定于这些，只要 为可含有作为目的的目标物质的试样即可。
作为上述食品被测物，可以举出液体饮料、半固形食品、固形食品等。
作为环境采样被测物，可以举出土壤、河川、海水等自然界的样品；此外还可以 举出由设置在工厂内的生产线或洁净室的空气采样器得到的采样被测物或擦拭被测 物等。
若试样为液体，则可以直接用于本发明的方法；在为半固形或固体物质等的情况下，也可以在实施稀释或提取等处理后用于本发明。
本发明的免疫层析方法优选于5℃～40℃的温度进行。
将本发明的生物体分子复合颗粒作为免疫层析法的标记抗体使用时，不容易产生被测物中存在的目标物质以外的成分对标记抗体的非特异性吸附。其结果，能够更高 灵敏度且高精度地进行分析。
【实施例】
[实施例1]在表面具有反应性官能团的含色素二氧化硅颗粒的制备
经过下述工序(i)～(iv)制备在表面具有作为反应性官能团的硫醇基的含色素二氧 化硅颗粒。
-工序(i)：核颗粒的制备-
将14％的氨水进一步用乙醇进行5倍稀释，制备含有氨水的有机溶剂3.5ml。在该含有氨水的有机溶剂中分别添加相对于该含有氨水的有机溶剂100体积％为0.86体积 ％的TEOS、以及相对于该TEOS100体积％为53体积％的羧基若丹明6G-APS的DMF溶 液，于40℃的温度进行搅拌。此处，上述羧基若丹明6G-APS是通过上述羧基若丹明 6G-NHS酯与APS的反应得到的。另外，上述DMF溶液中的羧基若丹明6G-APS浓度为 10mM。
-工序(ii)：壳层的形成-
在由上述工序(i)形成的含色素二氧化硅颗粒的分散液中追加添加上述羧基若丹明6G-APS和TEOS，于40℃反应30分钟，形成壳层。
上述羧基若丹明6G-APS的追加添加量相对于上述工序(i)中的羧基若丹明 6G-APS的添加量100体积％为67体积％，TEOS的追加添加量与上述工序(i)中的TEOS 添加量相同。
反复进行该操作来进行壳层的层积，制备具有2层壳层的含色素二氧化硅颗粒。需要说明的是，第2次的羧基若丹明6G-APS的追加添加量相对于上述工序(i)中的羧基 若丹明6G-APS的添加量100体积％为33体积％，TEOS的追加添加量相对于上述工序(i) 中的TEOS添加量100体积％也为33体积％。
-工序(iii)：自由水的除去-
对于上述工序(ii)中得到的具有2层壳层的含色素二氧化硅颗粒的分散液进行离心分离(10000rpm、10分钟)，使颗粒沉降后，立即除去上清。将所得到的沉淀物再分 散到乙醇中，再次进行离心分离(10000rpm、10分钟)，使颗粒沉降，接下来除去上清。
-工序(iv)：反应性官能团的导入-
将上述工序(iii)中得到的在表面具有结合水的含色素二氧化硅颗粒再分散在下述 表1所示的各种溶剂3.5mL中(条件1～条件5)。此处，条件1为比较例、条件2～条件5 为本发明例。接下来，为了在颗粒表层导入硫醇基，在颗粒分散液中投入3-巯基丙基 三甲氧基硅烷(MPMS)，于40℃反应20分钟，得到在表层具有羟基和硫醇基的二氧化 硅纳米颗粒。关于MPMS的投入量，在条件1～4中相对于上述工序(i)中的TEOS和羧 基若丹明6G-APS的总投入量100体积％为33体积％，在条件5中相对于上述工序(i)中的 TEOS和羧基若丹明6G-APS的总投入量100体积％为10体积％。
【表1】
溶剂
条件1 水+氨水+乙醇(与工序(a)为同溶剂)
条件2 乙醇
条件3 己醇
条件4 N,N-二甲基甲酰胺
条件5 己醇
在反应终止后，进行离心分离(10000rpm、10分钟)使颗粒沉降，之后立即除去上清。将所得到的沉淀物再分散在乙醇中，再次进行离心分离(10000rpm、10分钟)，使 颗粒沉降。进一步进行1次同样的乙醇清洗操作，除去未反应的TEOS等。接着，除了 不使用上述乙醇而使用蒸馏水以外，与上述同样地进行4次清洗操作，除去游离色素 等。如此得到反应溶剂不同的5种导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒。
(ζ(Zeta)电位测定与硫醇基的定量)
对于上述得到的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒进行清洗，进行平均粒径、ζ电位测定的测定、基于燃烧法的硫元素量测定(颗粒中所含有的硫量)、以及基于 DNTB的硫醇基定量。
所得到的结果列于下表2。
【表2】
上述条件1～5中得到的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒的表面的硫醇基的密度依次为0.0033个/nm2、0.0053个/nm2、0.0071个/nm2、0.0053个/nm2、0.0071个/nm2。
如上述表2所示，本发明例中制备的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒(条件 2～5)中，B/A显著增高。即，与在比较例中制备的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗 粒(条件1)中的MPMS缩聚所形成的壳层相比，在本发明例中制备的导入有硫醇基的含 色素二氧化硅颗粒中的MPMS缩聚所形成的壳层特别薄。
该结果显示出，通过在有机溶剂中使具有反应性官能团的硅烷偶联剂在颗粒表面发生缩聚，能够将硫醇基特别有效地导入到颗粒表面。
[实施例2]抗体向具有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒的导入
在工序(iv)中得到的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒的分散液(浓度 25mg/mL、分散介质：蒸馏水)40μL中加入DMF 460μL，于15000×g的重力加速度进行 10分钟的离心分离。除去上清，加入DMF 500μL进行离心分离，除去上清。再次加入 DMF 500μL，使导入有硫醇基的荧光二氧化硅纳米颗粒分散。向其中加入作为连接分 子的3-马来酰亚胺苯甲酸1mg，混合30分钟，由此在上述连接分子的马来酰亚胺基与 导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒的硫醇基之间形成硫醚键。
将该反应液于15000×g的重力加速度进行10分钟离心分离，除去上清后，加入蒸馏水90.6μL，使颗粒分散。接着加入0.5M MES(2-吗啉代乙烷磺酸)(pH6.0)100μL、 50mg/mLNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)230.4μL、19.2mg/mL EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙 基)碳化二亚胺)75μL并进行混合。向其中加入抗A型流感核蛋白抗体(6.2mg/ml、小鼠 来源、HyTest社制造)4.0μL，混合10分钟。
于15000×g的重力加速度进行10分钟离心分离，除去上清。加入10mM KH2PO4(pH7.5)400μL，使颗粒分散。接着于15000×g的重力加速度进行10分钟离心分 离，除去上清。再次加入10mM KH2PO4(pH7.5)400μL，使颗粒分散，得到胶体。
接着向上述胶体中加入10％BSA10μL，进行10分钟混合。于15000×g的重力加速度进行10分钟离心分离，除去上清。加入10mM KH2PO4(pH7.5)500μL，使颗粒分散， 于15000×g的重力加速度进行10分钟离心分离，除去上清。再次加入10mM KH2PO4(pH7.5)400μL，使颗粒分散，得到胶体，该胶体分散有结合了抗A型流感核蛋 白抗体的含色素二氧化硅颗粒(生物体分子复合颗粒)。
[试验例1]免疫层析试验(流感核蛋白的迅速判断)
(免疫层析法用试条的制作)
通过下述方法制作使用了抗体固定化膜的试条。
在距离膜(长25mm、商品名：Hi-Flow Plus120膜、MILLIPORE社制造)的一端约 6mm的位置以0.75μL/cm的涂布量涂布含有兔源抗A型流感核蛋白抗体(多克隆抗体、 本申请人制造)1mg/mL的溶液((50mMKH2PO4,pH7.0)+5％蔗糖)，设置宽约1mm的A型 流感用检测线。
接着，以0.75μL/cm的涂布量涂布含有山羊源抗小鼠IgG抗体(AKP Goat anti-mouse IgG Antibody、BioLegend社制造)1mg/mL的溶液((50mMKH2PO4、pH7.0) 无糖)，设置宽约1mm的控制线。其后于50℃干燥30分钟。需要说明的是，检测线与 控制线的间隔为3mm。
将上述抗体固定化膜、样品垫(Glass Fiber Conjugate Pad(GFCP)、MILLIPORE社制造)以及吸收垫(Cellulose Fiber Sample Pad(CFSP)、MILLIPORE社制造)在衬板(商品名AR9020，Adhesives Research社制造)上进行组装。需要说明的是，膜按照A型流感 用检测线为样品垫侧、控制线为吸收垫侧的朝向来构成。
(检测装置)
制作检测装置，该检测装置具有由光源、滤光片以及光电倍增管(PMT)构成的检测单元，该检测单元具备利用马达以一定速度进行直线移动的机构，具备每隔50μ秒 对PMT的受光强度进行记录的记录机构。需要说明的是，检测单元的光源是532nm的 激光器二极管，检测单元具有如下的机构：将激光器二极管照射至样品，使反射光透 过仅透过550nm以上波长的光的的滤光片后，利用光电子增倍管(PMT)接受光的机构。
(免疫层析试验)
制备表3所示浓度的A型流感核蛋白的溶液。将该溶液100μL与上述胶体 (2.5mg/mL)2μL的混合液滴加到试条的样品垫部分，该胶体分散有结合了抗A型流感 核蛋白抗体的含色素二氧化硅颗粒。15分钟后进行目视检査。另外，将利用上述检测 装置测定的检测线的荧光强度数值化。结果列于表3和表4。
需要说明的是，在下述表3和表4中，对于结合了抗A型流感核蛋白抗体的含色素二氧化硅颗粒的制备中使用的各导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒，记载了硫醇的 导入中使用的溶剂。另外，表3中，“-”意指不能检测、“+”意指可检测。
【表3】
目视检査的结果
【表4】
基于检测器的检测线的荧光强度测定结果
与使用在含有水的溶剂中导入硫醇基而得到的二氧化硅颗粒的情况(条件1)相比，在使用在有机溶剂中导入硫醇基而得到的二氧化硅颗粒的情况下(条件2～5)，目 视观察中的检测灵敏度提高(表3)，在荧光检测中，荧光强度也进一步提高，检测灵 敏度优异(表4)。
上述表4示出了将A型流感核蛋白为0ng/ml的荧光强度设为0的情况下的荧光强度。尽管表4中未示出，但与使用采用本发明例(条件2～5)的导入有硫醇基的含色素 二氧化硅颗粒制备的结合了抗A型流感核蛋白抗体的含色素二氧化硅颗粒的情况相 比，在使用采用比较例(条件1)的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒制备的结合了 抗A型流感核蛋白抗体的含色素二氧化硅颗粒时，A型流感核蛋白为0ng/ml时的荧光 强度(背景信号)增高。
上述表3和表4的结果的结果显示出，在使用采用本发明例的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒制备的结合了抗A型流感核蛋白抗体的含色素二氧化硅颗粒时，信噪 比(S/N比)增大，检测灵敏度优异。
作为使用本发明例的导入有硫醇基的含色素二氧化硅颗粒的情况下得到优异的检测灵敏度的理由，据认为是：1)本发明例中制备的导入有硫醇基的含色素二氧化硅 颗粒中的MPMS壳层薄(上述表2)，由其得到的生物体分子复合颗粒的非特异性吸附被 抑制、背景信号降低；以及2)由于硫醇基溶剂化效果，所导入的硫醇基向着颗粒的外 侧配置，与该硫醇基结合的抗体容易与抗原结合。特别是若使用在疏水性强的己醇中 导入硫醇基而得到的二氧化硅颗粒(条件3和5)，则可进一步提高B/A、检测灵敏度的 提高更为显著。
尽管将本发明与其实施方式一并进行了说明，但只要申请人未特别指定，则说明中的任何细节均不会对本发明进行限定，应当在不违反所附权利要求书中所示的发明 的精神和范围的情况下宽泛地解释本发明。
本申请要求2013年8月12日向日本提交的日本特愿2013-167902的优先权，本文中参照该优先权的内容并将其内容作为本说明书记载的一部分引入。
符号的说明
1 试条
2 样品垫
3 结合垫
4 抗体固定化膜
41 判断部(检测线)
42 控制线
5 吸收垫
6 衬板

Claims (11)

1.一种二氧化硅颗粒，其在表面具有硫醇基，其中，该二氧化硅颗粒满足下述(a)、(b)和(c)：
(a)粒径为20nm～1000nm；
(b)二氧化硅颗粒表面的上述硫醇基的密度为0.002个/nm2～0.2个/nm2；
(c)二氧化硅颗粒的表面所存在的硫醇基的量B相对于该二氧化硅颗粒中的硫元素的量A之比也即B/A为0.10～0.60，该量B的单位为“个/1颗粒”，该量A为在每1个二氧化硅颗粒中的硫醇来源的硫元素个数。
2.如权利要求1所述的二氧化硅颗粒，其中，上述二氧化硅颗粒含有荧光性或吸光性的色素。
3.如权利要求1或2所述的二氧化硅颗粒，其中，上述硫醇基藉由亚烷基或亚烷基氧基结合在二氧化硅颗粒表面。
4.一种生物体分子复合颗粒，其是生物体分子藉由上述硫醇基结合在权利要求1～3任一项所述的二氧化硅颗粒的表面而成的。
5.如权利要求4所述的生物体分子复合颗粒，其中，上述生物体分子为抗体或抗原。
6.一种免疫层析方法，其使用权利要求5所述的生物体分子复合颗粒。
7.一种权利要求1所述的二氧化硅颗粒的制造方法，该二氧化硅颗粒在表面具有羟基以外的反应性官能团，其中，该方法包括：
将在表面具有结合水的二氧化硅颗粒与具有羟基以外的反应性官能团的硅烷偶联剂在有机溶剂中混合，利用该结合水将该硅烷偶联剂水解。
8.如权利要求7所述的制造方法，其中，上述羟基以外的反应性官能团为选自由硫醇基、氨基、羧基、卤原子、乙烯基、环氧基、异氰酸酯基以及异硫氰酸酯基中的至少1种。
9.如权利要求7或8所述的制造方法，其中，上述有机溶剂为极性非质子性溶剂或碳原子数为2以上的醇。
10.如权利要求7或8所述的制造方法，其中，上述在表面具有结合水的二氧化硅颗粒含有荧光性或吸光性的色素。
11.如权利要求7或8所述的制造方法，其中，上述在表面具有结合水的二氧化硅颗粒在与上述硅烷偶联剂混合前利用亲水性有机溶剂实施了清洗处理。
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