CN106324260B - 一种牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用，该制备方法采用廉价的原硅酸四乙酯为原料，使原硅酸四乙酯在氨水的作用下水解合成纳米级的二氧化硅粒子；随后利用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷在二氧化硅粒子的表面键合上氨基,得到NH2‑SiO2；再然后将BSA键合到NH2‑SiO2上，得到BSA‑SiO2。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。利用BSA‑SiO2来检测BSA的该检测方法，利用了抗原与抗体的特异性结合反应，同时利用HRP来标记抗体，实现可视化检测，特异性强，灵敏度高。

Description

一种牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫分析领域，具体而言，涉及一种牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用。
背景技术
在培养细胞生产疫苗的过程中，牛血清是培养基的主要成分。由于牛血清中常常含有牛血清白蛋白，因此对疫苗中残留的牛血清白蛋白(BSA)的检测是非常重要的，它直接关系到生物制品使用的安全性。但目前的检测方法都需要高昂的仪器，同时检测步骤繁琐、费时、检测条件苛刻，且检测时所使用试剂的毒性较大。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种牛血清白蛋白检测探针，这种检测探针的粒径小、结构稳定、容易保藏。这种牛血清白蛋白检测探针，检测BSA时操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的BSA进行有效检测。
本发明的第二目的在于提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，这种制备方法步骤简单、反应条件不苛刻，容易实现，适合工业大生产，且该法所用到的溶剂对环境友好，同时通过这种方法所制备的牛血清白蛋白检测探针的粒径是纳米级的，对BSA检测的灵敏度高。
本发明的第三目的在于提供一种牛血清白蛋白检测探针的应用，即用探针来检测待测样品中牛血清白蛋白的含量。检测BSA时操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的BSA进行有效检测。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其包括：
步骤Ⅰ：将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合后再缓慢加入原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h，再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，于20-30℃下搅拌16-24h，于40-55℃下干燥，得到氨基修饰的二氧化硅纳米粒子(NH2-SiO2)；
步骤Ⅱ：将牛血清白蛋白与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，于20-30℃下搅拌1-3h；随后与氨基修饰的二氧化硅纳米粒子混合，于20-30℃下搅拌1-3h，得到牛血清白蛋白检测探针(BSA-SiO2)。
一种牛血清白蛋白检测探针的应用，其包括：
步骤a：用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗牛血清白蛋白(aBSA)，得到辣根过氧化物酶标记的抗体(HRP-aBSA)；
步骤b：将待测样品与辣根过氧化物酶标记的抗体混合，震荡反应4-8min；随后，再与牛血清白蛋白检测探针混合，震荡反应4-8min，离心，得到结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针(HRP-aBSA-BSA-SiO2)；
步骤c：在结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针中加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
牛血清白蛋白检测探针的制备方法中，采用廉价的原硅酸四乙酯(TEOS)为原料，使原硅酸四乙酯在氨水的作用下水解合成纳米级的二氧化硅粒子；随后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在二氧化硅粒子的表面键合上氨基，得到NH2-SiO2；再然后将BSA键合到NH2-SiO2上，得到BSA-SiO2。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。
用牛血清白蛋白检测探针来检测样品中的BSA的原理是：
在待测样品中加入一定量的HRP-aBSA后，一部分的HRP-aBSA与待测样品中的BSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA复合物，另一部分的HRP-aBSA游离在待测样品液中；随后，在待测样品中加入BSA-SiO2，BSA-SiO2与待测样品液中游离的那部分HRP-aBSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA-SiO2复合物；离心、洗涤后，在所得到的HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB。TMB为HRP的底物，在与HRP-aBSA-BSA-SiO2作用后形成的产物呈蓝色，随后用H2SO4终止反应后，TMB的产物由蓝色变为黄色。采用比色法测反应液在445-455nm处的吸光度，将其数值带入由系列标准BSA溶液采用同样检测方法所得的标准曲线中，即可得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。
上述标准曲线为反比例曲线，即当待测样品中的BSA浓度越低，游离的HRP-aBSA的量就越多，用比色法所测得的吸光度值也就越高，由此可见，该吸光度值与待测样品中的BSA浓度呈反比。
该检测方法利用了抗原与抗体的特异性结合反应，特异性强，同时利用HRP来标记抗体，实现特异性的可视化检测，特异性强，灵敏度高。由于牛血清白蛋白检测探针为白色的，在一定的范围内，对待测样品中是否含有牛血清白蛋白能够实现快速的肉眼可见的可视化分析。
该牛血清白蛋白检测探针的稳定性强、粒径小，在溶液中的分散性好。在利用该牛血清白蛋白检测探针检测待测样品中的BSA时，操作过程简单、迅速，所需要的仪器设备仅为紫外分光光度计，检测成本低，简单易行。该方法的适用广泛、使用性强，可快速检测疫苗等生物样品中BSA的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为BSA-SiO2的合成路线图；
图2为利用BSA-SiO2检测待测样品的BSA的步骤图；
图3为BSA-SiO2和NH2-SiO2的TEM图(A图为NH2-SiO2；B图为BSA-SiO2)；
图4为BSA-SiO2和NH2-SiO2的热重分析图(a线为NH2-SiO2，b线为BSA-SiO2)；
图5为实验例1中的线性拟合标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本实施方式提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，如图1所示，其包括：
步骤Ⅰ：将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合后再缓慢加入原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h，再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，于20-30℃下搅拌16-24h，于40-55℃下干燥，得到NH2-SiO2。
原硅酸四乙酯在氨水的作用下，水解生成SiO2纳米粒子。随后再与3-氨基丙基三乙氧基硅(APTES)作用，在SiO2的表面键合氨基，得到NH2-SiO2。缓慢加入TEOS乙醇溶液是为了控制反应速度，使得生成的SiO2纳米粒子的粒径小。通过本发明提供的合成方法，所得到的SiO2为纳米级的，进一步使牛血清白蛋白检测探针的粒径小，有利于提高检测的灵敏度和准确性。
在本发明较佳的实施例中，为了使反应更好的进行，上述TEOS乙醇溶液为TEOS与无水乙醇按体积比1：2-3混合后的溶液。
在本发明较佳的实施例中，为了在SiO2表面键合较多数量的氨基，上述APTES与TEOS的体积比为1：12-17。进一步优选为APTES与TEOS的体积比为1：15。SiO2表面键合氨基的数量越多，每个SiO2表面最终键合的BSA的量就会越多，能够大幅提高检测的灵敏度。
为了形成粒径更小的纳米级的SiO2粒子，在本发明较佳的实施例中，先将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合，于20-30℃下搅拌，在45-55min内，将TEOS乙醇溶液缓慢加入上述无水乙醇与氨水混合的溶液中。将TEOS乙醇溶液的缓慢加入的时间控制在45-55min内，优选为50分钟内，形成的SiO2粒子的性状和粒径最佳。
为了更好的形成SiO2粒子，更进一步的优选为，上述缓慢加入为逐滴加入。上述搅拌为磁力搅拌，转速为450-550rpm/min。
步骤Ⅱ：将BSA与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，于20-30℃下搅拌1-3h；随后与NH2-SiO2混合，于20-30℃下搅拌1-3h，得到BSA-SiO2。
EDC和NHS均为羧基活化试剂，将BSA与EDC和NHS混合，使BSA中的羧基活化，进一步与NH2-SiO2中的氨基发生缩合反应，得到BSA-NH2-SiO2复合物，即为牛血清白蛋白检测探针，简称BSA-SiO2。
为了使NH2-SiO2上的NH2都能与BSA键合，使反应充分进行，在本发明较佳的实施例中，上述NH2-SiO2与BSA的质量比为1：4-6。优选为NH2-SiO2与BSA的质量比为1：5。
为了使BSA中的羧基完全活化，提高BSA与NH2-SiO2的合成速率，在本发明较佳的实施例中，上述EDC与BSA的质量比为1：8-12。优选为，EDC与BSA的质量比为1：10。上述NHS与BSA的质量比为1：8-12。优选为，NHS与BSA的质量比为1：10。
本实施方式还提供一种牛血清白蛋白检测探针的应用，其包括：
步骤a：用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗牛血清白蛋白(aBSA)，得到HRP-aBSA。
HRP能够将其底物TMB水解成有颜色的产物，用HRP标记aBSA，便于采用比色法检测aBSA，进而对待测样品中微量的BSA进行分析。
步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应4-8min；随后，再与BSA-SiO2混合，震荡反应4-8min，离心，得到HRP-aBSA-BSA-SiO2。
aBSA与BSA之间的键合，是基于抗原与抗体之间的特异性反应，反应速度快、特异性强。因此，得到的HRP-aBSA-BSA-SiO2复合物中，各个基团之间都是通过共价键连接的，结构稳定。
在本发明较佳的实施例中，上述方法中，震荡反应表示：反应容器位于震荡反应器上，反应时的震荡反应器的转速为500-1500rpm。
步骤c：在HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中BSA的含量。
在本发明较佳的实施例中，上述步骤c为：在HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中BSA的含量。
用牛血清白蛋白检测探针来检测样品中的BSA的原理是：
在待测样品中加入一定量的HRP-aBSA后，一部分的HRP-aBSA与待测样品中的BSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA复合物；另一部分的HRP-aBSA游离在待测样品液中；随后，在待测样品中加入BSA-SiO2，BSA-SiO2与待测样品液中游离的那部分HRP-aBSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA-SiO2复合物；离心、洗涤后，在所得到的HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB。TMB为HRP的底物，在与HRP-aBSA-BSA-SiO2作用后形成的产物呈蓝色，随后用H2SO4终止反应后，TMB产物由蓝色变为黄色。采用比色法测反应液在445-455nm处的吸光度，将其数值带入由系列标准BSA溶液采用同样检测方法所得的标准曲线中，即可得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。
上述标准曲线为反比例曲线，即当待测样品中的BSA浓度越低，游离的HRP-aBSA的量就越多，用比色法所测得的吸光度值也就越高，由此可见，该吸光度值与待测样品中的BSA浓度呈反比。
实施例1
本实施例提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，如图1所示，其包括：
先将原硅酸四乙酯与无水乙醇按体积比1：2混合形成原硅酸四乙酯乙醇溶液；再将无水乙醇与氨水按照体积比2：1混合；随后缓慢加入上述制得的原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h。再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，其中，3-氨基丙基三乙氧基硅与原硅酸四乙酯的体积比为1：12；上述溶液于20-30℃下搅拌16h，于55℃下干燥，得到NH2-SiO2。
将BSA与EDC和NHS混合，其中三者的质量比BSA：EDC：NHS为8：1：1；上述混合溶液于20-30℃下搅拌3h。随后与NH2-SiO2混合，其中NH2-SiO2与BSA的质量比为1：4；上述溶液于20-30℃下搅拌3h，得到BSA-SiO2。
实施例2
本实施例提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其包括：
先将原硅酸四乙酯与无水乙醇按体积比1：3混合形成原硅酸四乙酯乙醇溶液；再将无水乙醇与氨水按照体积比3：1混合；随后缓慢加入上述制得的原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h。再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，其中，3-氨基丙基三乙氧基硅与原硅酸四乙酯的体积比为1：14；上述溶液于20-30℃下搅拌20h，于50℃下干燥，得到NH2-SiO2；
将BSA与EDC和NHS混合，其中三者的质量比BSA：EDC：NHS为10：1：1；上述混合溶液于20-30℃下搅拌2h。随后与NH2-SiO2混合，其中NH2-SiO2与BSA的质量比为1：5；上述溶液于20-30℃下搅拌2h，得到BSA-SiO2。
实施例3
本实施例提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其包括：
先将原硅酸四乙酯与无水乙醇按体积比1：2混合形成原硅酸四乙酯乙醇溶液；再将无水乙醇与氨水按照体积比4：1混合；随后缓慢加入上述制得的原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h。再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，其中，3-氨基丙基三乙氧基硅与原硅酸四乙酯的体积比为1：17；上述溶液于20-30℃下搅拌24h，于40℃下干燥，得到NH2-SiO2；
将BSA与EDC和NHS混合，其中三者的质量比BSA：EDC：NHS为12：1：1；上述混合溶液于20-30℃下搅拌1h。随后与NH2-SiO2混合，其中NH2-SiO2与BSA的质量比为1：6；上述溶液于20-30℃下搅拌1h，得到BSA-SiO2。
实施例4
本实施例提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其包括：
先将原硅酸四乙酯与无水乙醇按体积比1：3混合形成原硅酸四乙酯乙醇溶液；再将无水乙醇与氨水按照体积比3：1混合；在20-30℃下进行磁力搅拌，转速为450-550rpm/min，在50min内，将上述制备的原硅酸四乙酯乙醇溶液逐滴加入上述无水乙醇与氨水混合的溶液中。上述溶液于20-30℃下搅拌1h。再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，其中，3-氨基丙基三乙氧基硅与原硅酸四乙酯的体积比为1：14；上述溶液于20-30℃下搅拌20h，于55℃下干燥，得到NH2-SiO2。
将BSA与EDC和NHS混合，其中三者的质量比BSA：EDC：NHS为10：1：1；上述混合溶液于20-30℃下搅拌2h。随后与NH2-SiO2混合，其中NH2-SiO2与BSA的质量比为1：5；上述溶液于20-30℃下搅拌2h，得到BSA-SiO2。
实施例5
本实施例提供一种牛血清白蛋白检测探针的应用，即将上述实施例1-4制备的BSA-SiO2应用于检测待测样品中的BSA，如图2所示，其包括下述：
步骤a：用HRP标记羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；
步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应8min；随后，再与BSA-SiO2混合，震荡反应4min，离心，得到HRP-aBSA-BSA-SiO2；
步骤c：在HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB溶液，静置18min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于445nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。
实施例6
本实施例提供一种牛血清白蛋白检测探针的应用，即将上述实施例1-4制备的BSA-SiO2应用于检测待测样品中的BSA，其包括下述：
步骤a：用HRP标记羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；
步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应6min；随后，再与BSA-SiO2混合，震荡反应6min，离心，得到HRP-aBSA-BSA-SiO2；
步骤c：在HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB溶液，静置15min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于450nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。
实施例7
本实施例提供一种牛血清白蛋白检测探针的应用，即将上述实施例1-4制备的BSA-SiO2应用于检测待测样品中的BSA，其包括下述：
步骤a：用HRP标记羊抗牛血清白蛋白aBSA，得到HRP-aBSA；
步骤b：将待测样品与HRP-aBSA混合，震荡反应4min；随后，再与BSA-SiO2混合，震荡反应8min，离心，得到HRP-aBSA-BSA-SiO2；
步骤c：在HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB溶液，静置12min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。
实验例1
本实验例提供了一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，及其在检测狂犬疫苗中BSA含量中的应用。
一、牛血清白蛋白检测探针的制备：
(1)取81ml无水乙醇于250ml烧杯中，向中加入24ml氨水，混匀，转入250ml圆底烧瓶中。
(2)取20ml无水乙醇于100ml烧杯中，向中加入9ml原硅酸四乙酯，混匀。
(3)将(1)中圆底烧瓶置于磁力搅拌器上室温下500rpm搅拌。在50min中内将(2)中的原硅酸四乙酯逐滴加入到圆底烧瓶内。
(4)将0.5ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷迅速的加入到上述溶液中，于室温下搅拌24h。
(5)将制得的纳米粒子于4000rpm离心20min，弃去上清。随后用无水乙醇和纯水各洗涤沉淀三次，于45℃下烘干得NH2-SiO2。
(6)取0.25g牛血清白蛋白溶于50ml、pH 7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，随后加入40mg的EDC和30mg的NHS溶解，室温下温和搅拌1h。随后加入75mg的NH2-SiO2，室温下温和搅拌3h。然后于3500rpm下离心洗涤三次。然后减压干燥，得BSA-SiO2，即牛血清白蛋白检测探针。
将上述制得的NH2-SiO2与BSA-SiO2的材料进行如下表征：
a.透射电子显微镜分析
如图3所示，其中，A图为NH2-SiO2的电镜图；B图为BSA-SiO2的电镜图。对比A图和B图可以看出，B图中BSA-SiO2在其黑色的内核(SiO2)的表面附着有很多明显的凸起，该凸起即为BSA，说明BSA成功的键合到NH2-SiO2粒子的表面。
b.热重分析
如图4所示，其中图中a线为NH2-SiO2，b线为BSA-SiO2。该热重分析图中，在温度小于100℃时，a线和b线重合，这是由于样品中的水分被挥干所致；随着温度的逐渐身高，b线比a线损失的重量多，这是BSA-SiO2中的生物大分子在高温下被烧结所致，由此也说明BSA成功的键合到NH2-SiO2粒子的表面。
二、HRP-aBSA的制备：
(1)取HRP 10mg溶于1ml 1.25％戊二醛溶液中，在室温下静置过夜。随后将反应后的酶液过Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，收集棕色液体并浓缩至1ml。
(2)将0.5ml 10mg/ml的aBSA与0.5ml生理盐水混合，并加入0.1ml、1M的碳酸盐缓冲溶液(pH9.5)，混匀。随后逐滴加入上述收集的棕色液体，于室温下搅拌3h。
(3)将0.1ml、0.2M的赖氨酸加入上述溶液中，室温下放置3h。随后加入等体积的饱和硫酸铵，40℃下静置1h。随后，于3000rpm下离心30min，弃去上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤两次，最后溶于2ml、0.01M的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中。
(4)将上述溶液装入透析膜中，0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析24h，浓缩至2ml，即得HRP-aBSA。
三、检测狂犬疫苗中的BSA的含量：
(1)配制下列浓度的BSA的标准溶液：10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml。本实验中的待测样品为四种购自勃林格殷格翰集团的狂犬疫苗。共有10个实验组，其中四组为狂犬疫苗；6组为BSA标准溶液，同时进行下述平行实验。
(2)取2ml的样品溶液，向其中加入1ml的HRP-aBSA，此HRP-aBSA是由上述制得的HRP-aBSA稀释1000倍而得，再混匀，振摇5min，使样品中的BSA充分与HRP-aBSA结合。
(3)将15mg的BSA-SiO2分散于上述溶液中，振摇5min，使溶液中游离的HRP-aBSA充分结合到BSA-SiO2纳米粒子上。
(4)将上述液体于3500rpm下离心10min，弃去上清。随后将沉淀离心洗涤三次，即得HRP-aBSA-BSA-SiO2复合物。随后加入2mlTMB溶液静置15min显色，溶液呈蓝色，然后加入2ml的1.25mol/L的H2SO4终止显色，溶液呈黄色。然后将上述液体采用比色法进行分析，测量其在450nm处的吸光度。
(5)由BSA的标准溶液(10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml)测得的吸光度值与其BSA浓度做线性模拟，得到标准曲线；再将由四种狂犬疫苗所测得的吸光度值代入标准曲线，即可得出每种狂犬疫苗中BSA的含量。
结果分析：
由BSA的标准溶液测得的吸光度值与其BSA浓度做线性模拟，得到标准曲线：Y＝-0.008X+0.871(r2＝0.999)，如图5所示。
将四种狂犬疫苗的实验组在450nm处测得的吸光度值代入标准曲线的方程式：Y＝-0.008X+0.871(r2＝0.999)中，即可测出狂犬疫苗中BSA的含量，结果如表1所示。
表1.狂犬疫苗中BSA含量的检测
狂犬疫苗 疫苗1 疫苗2 疫苗3 疫苗4
BSA的浓度(ng/mL) 10.3 6.74 11.79 8.41
由表1可知，这四种狂犬疫苗中的BSA的浓度均小于15ng/mL。WHO规定的疫苗中的BSA的含量不超过50ng/mL。由此可知，这四种狂犬疫苗中的BSA均符合WHO的标准。说明该方法能够快速有效的对疫苗中BSA的含量进行检测。
实验例2
本实验例采用加样回收法，来测试采用本发明提供的牛血清白蛋白检测探针来检测BSA的这种检测方法的准确度。
本实验例中采用的牛血清白蛋白检测探针及其检测方法与实验例1一致。待测样品为狂犬疫苗加样溶液，即在狂犬疫苗中添加不同浓度的BSA蛋白(分别为6.5ng/mL、8.1ng/mL、97ng/mL)。然后按实验例1中的步骤进行分析，结果如表2所示：
表2加样回收法检测结果
表2中，疫苗中原有的BSA，为采用实验例1的方法重复检测三次的结果。
回收率＝检测到的BSA/(疫苗中原有的BSA+添加的BSA)×100％
由表2可以看出，采用该方法检测BSA的回收率均大于93％，说明该检测方法的准确度高，能够对样品中的BSA进行准确的测定。
实验例3
本实验例通过配制一系列不同浓度的BSA的待测溶液，其中BSA的浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、0.75ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL。采用实验例1中的方法对各待测溶液中的BSA的浓度进行测量，确定本发明提供的牛血清白蛋白检测探针来检测BSA的这种检测方法的最低检测线，并与文献中记载的现有技术的最低检测线进行比较，如表3所示：
表3本发明检测BSA的方法与现有技术的比较
由表3可知，相比于现有技术中BSA的检测方法，本发明提供的方法的检测线低、操作简单、特异性高，且所使用的材料容易合成、检测成本低廉。
综上所述，牛血清白蛋白检测探针的制备方法中，采用廉价的原硅酸四乙酯为原料，使原硅酸四乙酯在氨水的作用下水解合成纳米级的二氧化硅粒子；随后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在二氧化硅粒子的表面键合上氨基,得到NH2-SiO2；再然后将BSA键合到NH2-SiO2上，得到BSA-SiO2。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。
用牛血清白蛋白检测探针检测待测样品中BSA的含量的方法，利用了抗原与抗体的特异性结合反应，特异性强，同时利用HRP来标记抗体，实现特异性的可视化检测，特异性强，灵敏度高。由于牛血清白蛋白检测探针为白色的，在一定的范围内，对样品中是否含有牛血清白蛋白能够实现快速的肉眼可见的可视化分析。
该牛血清白蛋白检测探针的稳定性强、粒径小，在溶液中的分散性好。在利用该牛血清白蛋白检测探针检测待测样品中的BSA时，操作过程简单、迅速，所需要的仪器设备仅为紫外分光光度计，检测成本低，简单易行。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.一种牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，其包括：
步骤a：用辣根过氧化物酶标记羊抗牛血清白蛋白，得到辣根过氧化物酶标记的抗体；
步骤b：将待测样品与所述辣根过氧化物酶标记的抗体混合，震荡反应4-8min；随后，再与所述牛血清白蛋白检测探针混合，震荡反应4-8min，离心，得到结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针；
步骤c：在所述结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针中加入四甲基联苯胺溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出所述待测样品中牛血清白蛋白的含量；
其中，所述牛血清白蛋白检测探针的制备方法包括：
步骤Ⅰ：将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合后再缓慢加入原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h后，再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，于20-30℃下搅拌16-24h，于40-55℃下干燥，得到氨基修饰的二氧化硅纳米粒子；
步骤Ⅱ：将牛血清白蛋白与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，于20-30℃下搅拌1-3h；随后与所述氨基修饰的二氧化硅纳米粒子混合，于20-30℃下搅拌1-3h，得到牛血清白蛋白检测探针。
2.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，所述原硅酸四乙酯乙醇溶液为原硅酸四乙酯与无水乙醇按体积比1：2-3混合后的溶液。
3.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，所述3-氨基丙基三乙氧基硅与所述原硅酸四乙酯的体积比为1：12-17。
4.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，在所述步骤Ⅰ中，先将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合，于20-30℃下搅拌，在45-55min内，将所述原硅酸四乙酯乙醇溶液缓慢加入上述无水乙醇与氨水混合的溶液中。
5.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，在所述步骤Ⅰ中，所述缓慢加入为逐滴加入。
6.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，在所述步骤Ⅱ中，所述氨基修饰的二氧化硅纳米粒子与所述牛血清白蛋白的质量比为1：4-6。
7.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，在所述步骤Ⅱ中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与所述牛血清白蛋白的质量比为1：8-12，所述N-羟基琥珀酰亚胺与所述牛血清白蛋白的质量比为1：8-12。
8.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的应用，其特征在于，所述步骤c为在所述结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针中加入四甲基联苯胺溶液，静置15min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于450nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出所述待测样品中牛血清白蛋白的含量。
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