CN110204735A - 一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法及应用 - Google Patents

一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用于测定动物源食品中痕量大环内酯类抗生素残留量的高选择性磁核‑中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体及其制备方法。以介孔硅为牺牲支撑模板、甲基丙烯酸为功能单体、螺旋霉素作为模板分子，采用热引发聚合法制备中空多孔型分子印迹聚合物(HPMIPs)；采用溶剂热法制备四氧化三铁磁性纳米粒子(Fe3O4NPs)。利用多巴胺自聚合性质，制备聚多巴胺包被的四氧化三铁磁性纳米粒(Fe3O4@polyDA)，在其表面接枝HPMIPs，得到本发明合成的磁性中空多孔型分子印迹聚合物(Fe3O4@polyDA‑HPMIPs)，将其作为磁性分散固相萃取吸附剂，选择性富集和分离大环内酯类药物，结合HPLC‑MS/MS检测，效果理想。本发明制备的材料具有亲和性强，吸附容量高，磁响应效果好等优点，在食品检测等领域有广阔的应用前景。

Description

一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物 卫星组装体的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及分析化学前处理领域，具体说是应用于测定动物源食品中大环内酯类抗生素残留量的高选择性分离的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法及应用。
背景技术
从链霉菌培养液中分离出的大环内酯类抗生素是一类弱极性、碱性分子，是脱氧糖与14～16个碳原子形成的大环内酯通过糖苷键构成，由于大环内酯类抗生素对大多数革兰氏阳性细菌、一些革兰氏阴性细菌、支原体具有强烈抗菌活性，这类抗生素已成为临床治疗中最常用的四种抗感染药物之一。此外，由于可预防疾病和促进生长，它也被广泛用作饲料添加剂，可能通过食物链在人体内积聚，对消费者产生抗菌性和毒副作用，如胃肠道反应，局部刺激，过敏反应和肝毒性。为了确保人类健康，大多数国家和监管机构制定了法规，并对各种食品中的大环内酯类抗生素含量设定了最大残留限量。大环内酯类抗生素用作饲料添加剂和生长促进剂尽管在欧盟被禁止使用，但在其他地方很常见。因此开发有效的分析方法来检测和监测动物源性食品中的大环内酯类抗生素残留具有重要意义。
由于大环内酯类抗生素结构中缺乏发色团，化合物的紫外响应非常弱。随着分析仪器的快速发展，可以使用高效液相色谱-串联质谱分析大环内酯类抗生素痕量。然而，食物样本(动物组织，牛奶，鸡蛋和蜂蜜等)的基质非常复杂，如蛋白质和脂肪，不仅会污染分析仪器，导致灵敏度降低，还会影响目标分析物的分离。为了消除基质干扰和改善化合物的紫外响应，适当的样品处理措施是必不可少的。目前有许多预处理方法可用于提取食品中的大环内酯类抗生素，包括固相萃取，限进材料，加压液体萃取等。然而，这些样品预处理程序费力、耗时。并且，由于缺乏选择性，传统的吸附剂如C18，亲水亲油平衡吸附剂和强阳离子交换剂，经常受到共存组分的干扰，降低了提取效率。因此，开发用于同时分析复杂样品中多种大环内酯类抗生素的快速且有效的微型化预处理技术是非常值得关注的。
分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymers，MIPs)是指模板分子与功能单体先通过共价键或非共价键作用预组装，再与交联剂共聚制备得到的聚合物。其对模板分子具有特定识别能力，可以特异性从复杂样品中选择性地“锁定”并富集目标化合物，与之相互作用强烈，而且制备方法简单、性能稳定、环境适应性强，因此特别适用于痕量化合物的选择性富集和食品安全分析。同时，磁性纳米粒子的磁性分散固相微萃取技术已被应用于生物样品中靶标的分离和富集。均匀分散在生物样品中的磁性纳米粒子可以有效地吸附靶标，并在外部磁场的控制下快速完成洗涤，洗脱。除了操作简便外，该技术还具有样品和溶剂用量少，材料用量少，环境友好，吸附剂表面与分析物相互作用高的优点，使其非常适用于痕量化合物的提取和净化。基于磁性分散固相微萃取技术和分子印迹聚合物二者的优点，组合应用可以解决上述问题。
因此，本发明提出了一种制备Fe3O4@polyDA-HPMIPs复合材料的方法，即用HPMIPs接枝在Fe3O4@polyDA纳米颗粒的表面，并将其应用于分散固相萃取和富集动物源性食品中多种大环内酯类抗生素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，该分子印迹聚合物对具有的十四至十六元内酯环结构的大环内酯类抗生素均有良好的识别性能。
本发明技术方案如下：
一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
(1)步骤1、Fe3O4@polyDA颗粒的制备：将2～6g FeCl3·6H2O和0.5～3g表面改性剂溶解在50～100mL乙二醇中，再加入3～6g乙酸钠并搅拌。然后，将得到的混合物密封在不锈钢高压釜中，并在200℃下加热10～20h，得到Fe3O4NPs。称量10～60mg Fe3O4NPs分散在10～20mL多巴胺三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH 6～9，10mM Tris-HCl缓冲液)中，在室温下搅拌6～15h。用磁铁分离所得产物，随后进行多次洗涤去除过量的多巴胺，得到Fe3O4@polyDA颗粒。
(2)步骤2、中空多孔印迹材料的合成：量取15～90mL乙腈和2～30mL甲醇组成混合溶剂。称取0.2～1.3mmol模板分子溶于上述过程制备的混合溶剂中，所述的模板分子为螺旋霉素，加入1～5mmol功能单体，所述的功能单体为非共价化合物，在室温下超声，使二者充分混合；然后加入5～45mmol交联剂，所述的交联剂为多烯或烯酸酯类结构化合物，再加入介孔硅微球0.4～2.6g和热引发剂偶氮二异腈100～750mg，超声混匀、氮气脱氧，将反应液在水浴中搅拌加热10～30h，得到中空多孔印迹材料(HPMIPs)。所得淡黄色的产物经离心水洗、醇洗后，溶于装有体积比为8∶1的甲醇-乙酸混合液的锥形瓶中，振荡洗脱聚合物中的模板分子，乙醇洗涤，干燥至恒重，得到螺旋霉素表面印迹聚合物(MMIPs)。取其20～100mL于聚四氟乙烯离心管中，加入5～25％浓氢氟酸-乙醇溶液直到浸没为止，涡旋后静置10～20h。
(3)步骤3、Fe3O4@polyDA-HPMIPs复合材料的制备：称取100～250mg Fe3O4@polyDA颗粒分散在50～180mL的2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 5～6)中，超声处理。同时称取20～100mg HPMIPs颗粒分散在50～180mL的2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 5～6)中，依次加入10～100mg N-乙基-N′-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)和20～50mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)并均匀混合，同时逐滴加入上述得到的Fe3O4@polyDA颗粒溶液，随后将混合物避光搅拌10～20h，得到一次涂覆的Fe3O4@polyDA-HPMIPs，上述反应步骤可以重复几次，其它合成条件不变。通过n次涂覆Fe3O4@polyDA，得到的纳米粒称之为Fe3O4@polyDA-HPMIPs(cycle n)。
所述的表面改性剂为表面修饰剂己二胺、聚丙烯酸钠、戊二醛、柠檬酸二钠中的一种。
所述的功能单体为4-乙烯基吡啶丙烯酰胺、甲基丙烯酸或4-乙烯基吡啶的任一种。
所述的交联剂为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯或者三羟甲基丙烷三丙烯酸酯的任一种。
所述的Fe3O4NPs粒径范围为100～500nm。
所述的步骤(3)中n次重复处理HPMIPs和Fe3O4@polyDA，以得到不同涂覆次数的Fe3O4@polyDA-HPMIPs。
所述的多巴胺三羟甲基氨基甲烷溶液浓度范围为1～5mg/mL。
所述的步骤(2)中的介孔硅微球为MCM-41、MCM-48、MCM-50的有序介孔材料中的一种。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
1.中空多孔型分子印迹材料传质速度快，单位质量对目标化合物吸附容量大。
2.磁性分子印迹聚合物可以有效地吸附靶标，并在外部磁场的控制下快速完成洗涤、洗脱，操作简便，且对具有十四至十六元内酯环结构的大环内酯类抗生素均有良好的识别性能，萃取效率和回收率高。
3.与传统的核-壳磁性分子印迹材料相比，该分子印迹聚合物形成了磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体结构，可以在磁核上连接更多的中空多孔型分子印迹聚合物，从而显著提高了其对目标化合物的吸附容量。
4.由于该分子印迹聚合物对目标化合物的吸附容量取决于其磁核上印迹材料的涂覆次数，即吸附容量随着涂覆次数的增加而增加。因此，通过控制中空多孔印迹材料的涂覆次数，从而实现吸附容量的可控。
附图说明
图1为Fe3O4@polyDA(A)，HPMIPs(B)和Fe3O4@polyDA-HPMIPs(C)(D)的电镜照片
图2为Fe3O4@PolyDA-HPMIPs(cycle1)、Fe3O4@PolyDA-HPMIPs(cycle2)、Fe3O4@PolyDA-HPMIPs(cycle3)、Fe3O4@PolyDA-HPNIPs(cycle2)对螺旋霉素的静态吸附图
图3为Fe3O4@PolyDA-HPMIPs和Fe3O4@PolyDA-HPNIPs对六种大环内酯类抗生素的吸附量图
图4为摘要附图
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。实施例中的试验步骤和试验所用产品及试验器材，若无特别说明均为本领域常规技术手段、市购常规产品及公知仪器。
实施例1.一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法
(1)步骤1、Fe3O4@polyDA颗粒的制备：将2～6g FeCl3·6H2O和0.5～3g柠檬酸钠二水合物溶解在50～100mL乙二醇中，后加入3～6g乙酸钠并搅拌。然后，将得到的混合物密封在不锈钢高压釜中，并在200℃下加热10～20h，得到Fe3O4NPs。称量10～60mg Fe3O4NPs分散在10～20mL多巴胺三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH 6～9，10mM Tris-HCl缓冲液)中，在室温下搅拌6～15h。用磁铁分离所得产物，随后进行多次洗涤去除过量的多巴胺，得到Fe3O4@polyDA颗粒。
(2)步骤2、中空多孔印迹材料的合成：量取15～90mL乙腈和2～30mL甲醇组成混合溶剂。称取0.2～1.3mmol模板分子溶于上述过程制备的混合溶剂中，所述的模板分子为螺旋霉素，加入1～5mmol功能单体，所述的功能单体为非共价化合物，在室温下超声，使二者充分混合；然后加入5～45mmol交联剂，所述的交联剂为多烯或烯酸酯类结构化合物，再加入MCM-41介孔硅微球0.4～2.6g和热引发剂偶氮二异腈100～750mg，超声混匀、氮气脱氧，将反应液在水浴中搅拌加热10～30h。所得淡黄色的产物经离心水洗、醇洗后，溶于装有体积比为8∶1的甲醇-乙酸混合液的锥形瓶中，振荡洗脱聚合物中的模板分子，乙醇洗涤，干燥至恒重，得到螺旋霉素表面印迹聚合物(MMIPs)。取其20～100mL于聚四氟乙烯离心管中，加入5～25％浓氢氟酸-乙醇溶液直到浸没为止，涡旋后静置10～20h。
(3)步骤3、Fe3O4@polyDA-HPMIPs复合材料的制备：称取100～250mg Fe3O4@polyDA颗粒分散在50～180mL的2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 5～6)中，超声处理。同时称取20～100mg HPMIPs颗粒分散在50～180mL的2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 5～6)中，依次加入10～100mg N-乙基-N′-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)和20～50mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)并均匀混合，同时逐滴加入上述得到的Fe3O4@polyDA颗粒溶液，随后将混合物避光搅拌10～20h，得到Fe3O4@polyDA-HPMIPs。上述反应步骤可以重复几次，其它合成条件不变，以得到不同涂覆次数的Fe3O4@polyDA-HPMIPs。
实施例2.用于分析大环内酯类抗生素的Fe3O4@polyDA-HPMIPs吸附剂的效果验证
(1)Fe3O4@polyDA(A)，HPMIPs(B)和Fe3O4@polyDA-HPMIPs(C)(D)的电镜图片如图1所见。图1A中可以看到平均尺寸约为210nm的近球形Fe3O4纳米颗粒，在Fe3O4纳米粒子表面具有厚度约12nm的薄膜，表明polyDA薄膜通过氧化聚合成功沉积在Fe3O4纳米粒子表面。图1B显示成功合成了具有中空介孔结构的HPMIPs，因其具有较大的比表面积和孔径体积，从而有较高的吸附容量和吸附速率。图1C和图1D显示Fe3O4@polyDA的表面与HPMIPs连接，表明HPMIPs成功地接枝在Fe3O4@polyDA表面上，形成了磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体结构。
(2)为了验证制备的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体对大环内酯类抗生素吸附容量的可控性，分别以不同涂覆次数的Fe3O4@PolyDA-HPMIPs和Fe3O4@PolyDA-HPNIPs(cycle2)作为分散固相萃取吸附剂，以5～10mL分别溶有1～100g/mL的螺旋霉素溶液样品为萃取溶液进行饱和吸附容量的平行对比实验，剩余液用液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法进行分析检测。结果如图2所示，在实验的浓度范围内，磁性中空多孔型分子印迹材料(Fe3O4@PolyDA-HPMIPs)的萃取量要比磁性无模板中空多孔型分子印迹材料(Fe3O4@PolyDA-HPNIPs)高，Fe3O4@PolyDA-HPMIPs的涂覆次数越多，吸附容量越大。
(3)我们还研究了在相同条件下，Fe3O4@polyDA-HPMIPs/Fe3O4@polyDA-HPNIPs对两种大环内酯类抗生素(AZI和SPI)和四个参考化合物(SDA，STR，ENR和OTC)的吸附容量，结果如图3所示。大环内酯类抗生素(AZI和SPI)和非大环内酯参比化合物(SDA，STR，ENR和OTC)的IF分别为2.36，3.16，1.03，0.72，0.98和1.12。显然，Fe3O4@polyDA-HPMIPs对SPI及其类似物(AZI)的吸附量高于Fe3O4@polyDA-HPNIPs。然而，这两种吸附材料对参比化合物的吸附量没有明显差异。可见，Fe3O4@polyDA-HPMIPs对SPI及其结构类似物的具有非常好的选择性。
实施例3.Fe3O4@polyDA-HPMIPs材料检测市售蜂蜜
(1)称量2～5g蜂蜜于聚丙烯离心管中，加入5～10mL不同浓度的大环内酯类抗生素缓冲液，用10～20mL K2HPO4缓冲液(20mM，pH 8.0)提取分析物，涡旋混合、离心后将上清液进行进一步的分散固相萃取(DSPE)净化，并对其加标分析。
(2)将样品溶液加入聚丙烯离心管中，加入10～20mg Fe3O4@polyDA-HPMIPs后恒温振荡10～20min。在强磁场下快速分离吸附有大环内酯类抗生素的Fe3O4@polyDA-HPMIPs，用去离子水冲洗。最后，使用1～5％氨的甲醇溶液，通过超声处理Fe3O4@polyDA-HPMIPs以洗脱捕获的分析物。解吸后，将洗脱的级分通过N2流蒸发至干燥，然后用200μL流动相重构进行高效液相色谱串联质谱分析。
(3)结果
基于制备的Fe3O4@polyDA-HPMIPs的M-μ-DSPE-HPLC-MS/MS方法成功用于测定从当地杂货购买的五种蜂蜜样品中的七种大环内酯类抗生素残留物。如表1所示，所有大环内酯类抗生素的检测量均低于中国对蜂蜜产品的限制。表明该方法可适用于实际样品中痕量大环内酯类抗生素的测定。
表1 所提出的蜂蜜样品方法的结果
n.d.为未检测到
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
(1)步骤1、Fe3O4@polyDA颗粒的制备：将2～6g FeCl3·6H2O和0.5～3g表面改性剂溶解在50～100mL乙二醇中，后加入3～6g乙酸钠并搅拌。然后，将得到的混合物密封在不锈钢高压釜中，并在200℃下加热10～20h，得到Fe3O4NPs。称量10～60mg Fe3O4NPs分散在10～20mL多巴胺三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH 6～9，10mM Tris-HCl缓冲液)中，在室温下搅拌6～15h。用磁铁分离所得产物，随后进行多次洗涤去除过量的多巴胺，得到Fe3O4@polyDA颗粒。
(2)步骤2、中空多孔印迹材料的合成：量取15～90mL乙腈和2～30mL甲醇组成混合溶剂。称取0.2～1.3mmol模板分子溶于上述过程制备的混合溶剂中，所述的模板分子为螺旋霉素，加入1～5mmol功能单体，所述的功能单体为非共价化合物，在室温下超声，使二者充分混合；然后加入5～45mmol交联剂，所述的交联剂为多烯或烯酸酯类结构化合物，再加入介孔硅微球0.4～2.6g和热引发剂偶氮二异腈100～750mg，超声混匀、氮气脱氧，将反应液在水浴中搅拌加热10～30h。所得淡黄色的产物经离心水洗、醇洗后，溶于装有体积比为8∶1的甲醇-乙酸混合液的锥形瓶中，振荡洗脱聚合物中的模板分子，乙醇洗涤，干燥至恒重，得到螺旋霉素表面印迹聚合物(MMIPs)。取其20～100mL于聚四氟乙烯离心管中，加入5～25％浓氢氟酸-乙醇溶液直到浸没为止，涡旋后静置10～20h。
(3)步骤3、Fe3O4@polyDA-HPMIPs复合材料的制备：称取100～250mg Fe3O4@polyDA颗粒分散在50～180mL的2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 5～6)中，超声处理。同时称取20～100mg HPMIPs颗粒分散在50～180mL的2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲溶液(pH 5～6)中，依次加入10～100mg N-乙基-N′-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)和20～50mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)并均匀混合，同时逐滴加入上述得到的Fe3O4@polyDA颗粒溶液，随后将混合物避光搅拌10～20h，得到Fe3O4@polyDA-HPMIPs。上述反应步骤可以重复几次，其它合成条件不变。通过n次涂覆Fe3O4@polyDA，得到的纳米粒称之为Fe3O4@polyDA-HPMIPs(cycle n)。
2.根据专利要求1任一所述的一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于所述的表面改性剂为表面修饰剂己二胺、聚丙烯酸钠、戊二醛、柠檬酸二钠中的一种。
3.根据专利要求1任一所述的一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于所述的功能单体为4-乙烯基吡啶丙烯酰胺、甲基丙烯酸或4-乙烯基吡啶的任一种。
4.根据专利要求1任一所述的一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于所述的交联剂为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯或者三羟甲基丙烷三丙烯酸酯的任一种。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于所述的Fe3O4NPs粒径范围为100～500nm。
6.根据专利要求1任一所述的一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于步骤(3)中HPMIPs和Fe3O4@polyDA的反应步骤可以重复，以得到不同涂覆次数的Fe3O4@polyDA-HPMIPs。
7.根据专利要求1任一所述的一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于所述的多巴胺三羟甲基氨基甲烷溶液浓度范围为1～5mg/mL。
8.根据专利要求1任一所述的一种大环内酯类抗生素的磁核-中空多孔型分子印迹聚合物卫星组装体的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的介孔硅微球为MCM-41、MCM-48、MCM-50的有序介孔材料中的一种。
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