CN108802015A - 一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮无毒电化学发光传感器的制备 - Google Patents
一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮无毒电化学发光传感器的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮无毒电化学发光传感器的制备。该传感器是以聚乙烯吡咯烷酮辅助合成的TiO2介晶(ps‑TiO2 MC)和壳聚糖(CS)为传感平台,利用ps‑TiO2 MC大的比表面积及CS特有的官能团来固定化玉米赤霉烯酮抗体(Ab);以巯基乙胺功能化的镍铁纳米管作为支架,其大的比表面积可以为发光试剂钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)提供更多的吸附位点,也能够固定大量的具有模拟玉米赤霉烯酮作用的肽。基于以上优点,构造了一种无毒竞争型电致化学发光免疫传感器,实现对玉米赤霉烯酮的高灵敏检测,该传感器具有灵敏度高、稳定性好等优点,在临床应用方面具有较重要的应用价值及实际意义。
Description
技术领域
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域,具体涉及一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮 (zearalenone,ZEA ) 被认为是最广泛分布的杂菌真菌毒素,它主要是各种镰刀菌属 ( Fusarium ) 的菌侏,如黄色镰孢 ( f.culmorum )、半裸镰孢 (f.cericiisand )、木贼镰孢 ( f.equiseti )等菌种。ZEA 对人类和动物都有潜在的健康危害,即使及其微量的含有ZEA的食物被动物和人类食用,也会引发各种严重的甚至致命的疾病,如造成卵巢功能障碍、胚胎发育不良及破坏生殖器官等。虽然已有一系列用于检测ZEA的方法,如荧光偏振免疫法 ( FPI )、荧光、荧光免疫分析法 ( FlISA ),但这些检测方法往往需要精密的仪器、繁冗的前期准备,一定程度上限制了它们的应用。因此,发展一种快速、简便、灵敏和低成本的ZEA的检测方法有着巨大的研究意义。
电化学发光免疫传感器,利用抗原与抗体之间的特异性结合的一类生物传感器,具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点,但传统的基于电化学发光免疫传感器对ZEA 的检测过程中,不可避免会使用ZEA抗原标准溶液,会对操作者的身体造成严重的伤害,因此一程度上限制了此类方法的广泛应用。幸运地是,目前已有研究者发现有一种序列为DAVILLM 的肽链具有模拟玉米赤霉烯酮抗原的功能,该肽链可以和玉米赤霉烯酮抗体进行特异性识别,与传统的玉米赤霉烯酮抗原相比,肽链具有无毒性、价格低廉、环境友好等优点。
本实验中,借助连接剂戊二醛 ( GA ), 将具有模拟玉米赤霉烯酮的肽链与制得的Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物成功连接制得peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物,将其作为电化学发光探针。 其中,镍铁纳米管( NiFe2O4 NTs ) 具有大的比表面积可以为发光试剂钌联吡啶( Ru(bpy)3 2+ )提供更多的吸附位点,与此同时,能够固定大量的具有模拟玉米赤霉烯酮抗原作用的肽链,此外,由于NiFe2O4 NTs 四面体位上的 Fe3+ 与八面体位上的Ni2+的反平行自旋磁矩的作用,使得合成的NiFe2O4 NTs具有优异的导电性,将不同浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液与制得探针溶液混合成孵化液,然后将该含有玉米赤霉烯酮标准溶液与肽链的孵化液固定在anti-ZEA/ps-TiO2 MC/CS修饰的玻碳电极上,竞争结合抗体,其中以聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 ( ps-TiO2 MC )具有较大的比表面积,可以固定化大量的ZEA 抗体使两种抗原充分竞争结合。基于以上优点所制得的竞争型免疫传感器具有灵敏度高、稳定性好、检出限低等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器及其应用。
为实现发明目的,本发明采用如下技术方案:
1. 一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器的制备方法:
(1)玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依序用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2)滴加5 μL 浓度为4 mg/ml 的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 (ps-TiO2 MC ) 与 100 μL 0.1wt.% 的壳聚糖 ( CS )混合液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极;
(3) 滴加5 μL浓度为5.0 wt.%的戊二醛 ( GA ) 溶液与步骤 ( 2 ) 所制得的修饰电极表面活化40 min , 用去离子水去除多余的戊二醛试剂,并在室温下晾干;
(4)取5 μL 浓度为50 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗体 ( anti-ZEA ) 溶液于步骤 ( 3 )修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育 1 h, 用去离子水洗去物理吸附的anti-ZEA,在室温下晾干,制得anti-ZEA/ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极;
(5)取3 μL 浓度为 5.0 wt.% 的BSA 滴加到步骤 ( 4 ) 所制得的修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min, 以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(6)取体积比为 1:1 的20 mmol/L巯基乙胺 ( cysteamine ) 溶液与镍铁纳米管 (NiFe2O4 NTS ) 溶液在室温下混合震荡6 h, 洗涤、离心制得 cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物溶液并将其重新分散在去离子水中;然后将体积比为 1:1 的 0.05% 的Nafion与 1.0×10-3 mol/L 钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)的混合液加入到上述制得的复合物溶液中,混合震荡5 h, 经离心、洗涤、再分散制得 Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物; GA作为肽与制得的复合物之间的连接剂,先将200 μL 5.0 wt.% GA加入到Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 混合溶液中,混合震荡 2 h, 洗涤、离心,去除多余的GA试剂,再向该溶液中加入100 μL肽(序列为DAVILLM),轻微摇动5 h, 经离心、洗涤、再分散得到peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin复合物混合液;最后在上述溶液中加入 50μL 5.0 wt.% 的BSA封闭非特异性吸附位点,之后用去离子水洗涤反应混合物数次,离心之后重新分散于去离子水中制得电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs)复合物溶液,储存在4°C冰箱中备用;
(7)取不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液加入到步骤 ( 6 ) 所制得的电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs)溶液中得到新的孵化液,然后将该孵化液滴加到步骤 ( 5 ) 获得的修饰电极上,在4°C冰箱中孵育60 min,用去离子水冲洗电极表面,制得ZEA/peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin/ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极,并保存在4 °C冰箱中备用。
1.上述的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 ( ps-TiO2 MC ) 由下述方法制备的: 将1克聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 溶解于100 ml 4.2 mol/L 硝酸 ( HNO3)溶液中,接着将4g十二烷基硫酸钠 ( SDS ) 加入到上述溶液中,在超声作用下搅拌几分钟,然后再加入2 mL异丙氧基钛 ( titanium(IV) isopropoxide (TIP) ),70 °C下搅拌48h,经过离心得到的样品再依次用蒸馏水和乙醇清洗后,再在60 °C温度下干燥一夜;最后,在氩气气氛中,分别在400℃煅烧120 min,600℃煅烧180 min,最终制得得ps-TiO2 MC。
2. 上述的电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin@ NiFe2O4NTs )由下述方法制备的:1)体积比为 1:1 的20 mmol/L巯基乙胺 ( cysteamine ) 溶液与4 mg/mL镍铁纳米管 ( NiFe2O4 NTS ) 溶液在室温下混合震荡6 h, 洗涤、离心制得cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物溶液并将其重新分散在去离子水中; 2)将体积比为 1:1的 0.05% wt.%的Nafion与 1.0×10-3 mol/L 钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)的混合液加入到上述制得的复合物溶液中,混合震荡 5 h, 经离心、洗涤、再分散制得 Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物; 3) 先将200 μL 5.0 wt.% GA加入到Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 混合溶液中,混合震荡 2 h, 洗涤、离心,去除多余的GA试剂,再向该溶液中加入100 μL 50ug/ml肽(序列为DAVILLM)溶液,轻微摇动5 h, 经离心、洗涤、再分散得到peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin复合物混合液;最后在上述溶液中加入 50 μL5.0 wt.% 的BSA封闭非特异性吸附位点。
3. 玉米赤霉烯酮 ( ZEA )的检测步骤:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以上述的竞争型免疫传感器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用电位范围0 V-1.6 V,扫描速率0.05 V/s电位窗口,电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA )标准溶液进行检测,通过电致化学发光设备采集1.1 V的ECL信号强度,通过ECL信号强度与玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
本发明的显著优点为:
(1)竞争免疫法,一种常用的分析方法,利用固相抗原与异相抗原去竞争结合一定量标记抗体,因此固相吸附的标记抗体与待测抗原的含量成反比,已被广泛应用在荧光、电致化学发光、光电和电化学等领域。相比其他分析技术,电致化学发光具有灵敏度高、简单、快速反应等优点,为生物传感器的发展提供了更广阔的应用前景。
(2)具有大比表面积的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 ( ps-TiO2MC )作为生物传感器传感平台可以承载大量的生物分子,同时,戊二醛 ( GA )作为一种连接剂可以将anti-ZEA紧密结合到电极表面,得到一个稳定的ECL信号。
(3)具有大比表面积及优异电子传递功能的NiFe2O4 NTs纳米材料作为生物传感器探针平台可以承载大量的生物分子及信号探针,同时,戊二醛 ( GA )作为一种连接剂可将模拟ZEA的肽链与Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 复合物紧密结合制得电化学信号探针。
(4)通过引入可模拟玉米赤霉烯酮的肽链作为抗原与标准溶液进行竞争反应,为玉米赤霉烯酮的无毒检测提供了平台。
附图说明
图1中的A为二氧化钛 ( TiO2 ) 的透射电镜图 ( TEM ),图1中的B为二氧化钛( TiO2 ) 的扫描电镜图 ( SEM ) ,图1中的C为N2 吸附-脱附等温线图。
图2中的A为 镍铁纳米管 (NiFe2O4 NTs ) 扫描电镜图 ( SEM )、图2中的B透射电镜图 ( TEM ) 和图2中的C为X-射线衍射图 ( XRD )。
图3为免疫传感电极的电致化学发光响应信号与玉米赤霉烯酮 ( ZEA )标准溶液浓度的线性关系图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明,但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
1. 一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器的制备方法:
(1)玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依序用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2)滴加5 μL 浓度为4 mg/ml 的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 与100 μL 0.1wt% 的壳聚糖 ( CS )混合液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极;
(3)滴加5 μL浓度为5.0 wt.%的戊二醛 ( GA ) 溶液与步骤 ( 2 ) 所制得的修饰电极表面活化40 min , 用去离子水去除多余的戊二醛试剂,并在室温下晾干;
(4)取5 μL 浓度为50 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗体 ( anti-ZEA ) 溶液于步骤 ( 3 )修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育 1 h, 用去离子水洗去物理吸附的anti-ZEA,在室温下晾干,制得anti-ZEA/ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极;
(5)取3 μL 浓度为 5.0 wt.% 的BSA 滴加到步骤 ( 4 ) 所制得的修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min, 以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(6)取体积比为 1:1 的20 mmol/L巯基乙胺 ( cysteamine ) 溶液与镍铁纳米管 (NiFe2O4 NTS,购自泰盛科技有限公司,南昌) 溶液在室温下混合震荡6 h, 洗涤、离心制得cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物溶液并将其重新分散在去离子水中;然后将体积比为 1:1的 0.05% 的Nafion与 1.0×10-3 mol/L 钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)的混合液加入到上述制得的复合物溶液中,混合震荡 5 h, 经离心、洗涤、再分散制得 Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物; GA作为肽与制得的复合物之间的连接剂,先将200 μL5.0 wt.% GA加入到Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 混合溶液中,混合震荡2 h, 洗涤、离心,去除多余的GA试剂,再向该溶液中加入100 μL 50ug/ml序列为DAVILLM的肽溶液,轻微摇动5 h, 经离心、洗涤、再分散得到peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin复合物混合液;最后在上述溶液中加入 50 μL 5.0 wt.% 的BSA封闭非特异性吸附位点,之后用去离子水洗涤反应混合物数次,离心之后重新分散于去离子水中制得电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs)复合物溶液,储存在4°C冰箱中备用;
(7)取不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液加入到步骤 ( 6 ) 所制得的电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs)复合溶液中得到新的孵化液,然后将该孵化液滴加到步骤 ( 5 ) 获得的修饰电极上,在4°C冰箱中孵育60min,用去离子水冲洗电极表面,制得ZEA/peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin/ps-TiO2MC/CS修饰玻碳电极,并保存在4 °C冰箱中备用。
实施例2
上述实施例1所用的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 ( ps-TiO2 MC )由下述方法制备的: 将1克聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 溶解于100 ml 4.2 mol/L 硝酸 (HNO3)溶液中,接着将4g十二烷基硫酸钠 ( SDS ) 加入到上述溶液中,在超声作用下搅拌几分钟,然后再加入2ml异丙氧基钛 ( titanium(IV) isopropoxide (TIP) ),70 °C下搅拌48 h,经过离心得到的样品再依次用蒸馏水和乙醇清洗后,再在60 °C温度下干燥一夜;最后,在氩气气氛中,分别在400℃煅烧120 min,600℃煅烧180 min,最终制得得ps-TiO2MC,见图1中的A为二氧化钛 ( TiO2 ) 的透射电镜图 ( TEM ),图1中的B为二氧化钛 (TiO2 ) 的扫描电镜图 ( SEM ) ,图1中的C为N2 吸附-脱附等温线图。
实施例3
上述实施例1所用的电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin )由下述方法制备的:1)体积比为 1:1 的20 mmol/L巯基乙胺 ( cysteamine ) 溶液与镍铁纳米管 ( NiFe2O4 NTS ) 溶液在室温下混合震荡6 h, 洗涤、离心制得 cysteamine@ NiFe2O4NTs复合物溶液并将其重新分散在去离子水中; 2)将体积比为 1:1 的 0.05% 的Nafion与1.0×10-3 mol/L 钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)的混合液加入到上述制得的复合物溶液中,混合震荡 5 h, 经离心、洗涤、再分散制得 Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物;3) 先将200 μL 5.0 wt.% GA加入到Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 混合溶液中,混合震荡 2 h, 洗涤、离心,去除多余的GA试剂,再向该溶液中加入100 μL50 μg/mL肽,轻微摇动5 h, 经离心、洗涤、再分散得到peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin复合物混合液;最后在上述溶液中加入 50 μL5.0 wt.% 的BSA封闭非特异性吸附位点,图2中的A为 镍铁纳米管 (NiFe2O4 NTs ) 扫描电镜图 ( SEM )、图2中的B透射电镜图 ( TEM ) 和图1中的C为X-射线衍射图 ( XRD )。
实施例4
上述实施例1所用的钌联吡啶衍生物(Ru(dcbpy)3 2+)购买于上海化学科技有限公司;Nafion购买于美国西格玛公司;玉米赤霉烯酮抗体 ( anti-ZEA )、肽(序列为DAVILLM)为市售产品。
实施例5
玉米赤霉烯酮 ( ZEA )的检测步骤:
(1)使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以实施例1所制得的竞争型免疫传感器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)采用电位范围0 V-1.6 V,扫描速率0.05 V/s电位窗口,电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA )标准溶液进行检测,通过电致化学发光设备采集1.1 V的ECL信号强度,通过ECL信号强度与玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线见图3;
(3)待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
Claims (5)
1.一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)玻碳电极(GCE)首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光,用二次水洗去表面残留粉末,再移入超声水浴中清洗,直至清洗干净,最后依序用乙醇,稀酸和水彻底洗涤;
(2)滴加5 μL 浓度为4 mg/mL 的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 (ps-TiO2 MC ) 与壳聚糖(CS)混合液于干净的玻碳电极表面,红外灯下烘干,冷却至室温,制得ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极;
(3)滴加5 μL浓度为5.0 wt.%的戊二醛 ( GA ) 溶液与步骤 ( 2) 所制得的修饰电极表面活化40 min, 用去离子水去除多余的试剂,并在室温下晾干;
(4)取5 μL 浓度为50 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗体 ( anti-ZEA ) 溶液于步骤 ( 3 )修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育 1 h, 用去离子水洗去物理吸附的anti-ZEA,在室温下晾干,制得anti-ZEA/ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极;
(5)取3 μL 浓度为 5.0 wt.% 的BSA 滴加到步骤 ( 4 ) 所制得的修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min, 以封闭电极表面上非特异性活性位点,用去离子水冲洗电极表面以洗去物理吸附,并保存在4°C冰箱中;
(6)取体积比为 1:1 的20 mmol/L巯基乙胺 ( cysteamine ) 溶液与镍铁纳米管 (NiFe2O4 NTS ) 溶液在室温下混合震荡6 h, 洗涤、离心制得 cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物溶液并将其重新分散在去离子水中;然后将体积比为 1:1 的 0.05 wt.% 的Nafion与1.0×10-3 mol/L 钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)的混合液加入到上述制得的复合物溶液中,混合震荡 5 h, 经离心、洗涤、再分散制得 Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物;GA作为肽与制得的Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物之间的连接剂,先将200 μL 5.0 wt.% GA加入到Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 混合溶液中,混合震荡 2 h, 洗涤、离心,去除多余的GA试剂,再向该溶液中加入100 μL 50 μg/mL肽,轻微摇动5 h, 经离心、洗涤、再分散得到peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin复合物混合液;最后在上述溶液中加入 50 μL 5.0 wt.% 的BSA封闭非特异性吸附位点, 再用去离子水洗涤反应混合物数次,经离心后重新分散于去离子水中制得电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs)复合物溶液,储存在4°C冰箱中备用;
(7)取不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液加入到步骤 ( 6 ) 所制得的电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs)溶液中得到新的孵化液,然后将该孵化液滴加到步骤 ( 5 ) 获得的修饰电极上,在4°C冰箱中孵育60 min,用去离子水冲洗电极表面,制得ZEA/peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin/ps-TiO2 MC/CS修饰玻碳电极,并保存在4 °C冰箱中备用。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 辅助合成的TiO2介晶 ( ps-TiO2 MC ) 由下述方法制备的: 将1克聚乙烯吡咯烷酮 ( PVP ) 溶解于100 ml 4.2 mol/L 硝酸 ( HNO3)溶液中,接着将4g十二烷基硫酸钠 ( SDS ) 加入到上述溶液中,在超声作用下搅拌几分钟,然后再加入2ml异丙氧基钛 ( titanium(IV)isopropoxide (TIP) ),70 °C下搅拌48 h,经过离心得到的样品再依次用蒸馏水和乙醇清洗后,再在60 °C温度下干燥一夜;最后,在氩气气氛中,分别在400℃煅烧120 min,600℃煅烧180 min,最终制得得ps-TiO2 MC。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的电化学发光探针( peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/ cysteamine@ NiFe2O4 NTs) 复合物溶液由下述方法制备的:1)体积比为 1:1 的20 mmol/L巯基乙胺 ( cysteamine ) 溶液与4 mg/mL镍铁纳米管 ( NiFe2O4NTS ) 溶液在室温下混合震荡6 h, 洗涤、离心制得 cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物溶液并将其重新分散在去离子水中;2)将体积比为 1:1 的 0.05% 的Nafion与 1.0×10-3 mol/L 钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)的混合液加入到上述制得的复合物溶液中,混合震荡 5 h, 经离心、洗涤、再分散制得 Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs复合物;3) 先将200 μL 5.0 wt.% GA加入到Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamine@ NiFe2O4 NTs 混合溶液中,混合震荡 2 h, 洗涤、离心,去除多余的GA试剂,再向该溶液中加入100 μL 50 μg/mL肽(序列为DAVILLM),轻微摇动5 h, 经离心、洗涤、再分散得到peptide/Nafion-Ru(bpy)3 2+/cysteamin复合物混合液;最后在上述溶液中加入 50 μL 5.0 wt.% 的BSA封闭非特异性吸附位点。
4.权利要求1-3任一所述的方法制备的一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器。
5.权利要求4所述的竞争型免疫传感器,其特征在于,用于玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 检测,检测步骤如下:
(1) 使用电化学工作站采用三电极体系进行测定,以权利要求4所述的竞争型免疫传感器为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为辅助电极,在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试;
(2) 采用电位范围0 V-1.6 V,扫描速率0.05 V/s电位窗口,电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液进行检测,通过电致化学发光设备采集1.1 V的ECL信号强度,通过ECL信号强度与玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(3)待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液进行检测,检测的结果可通过工作曲线查得。
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