CN109799273A - 一种基于纳米Co3O4模拟酶催化作用的信号双放大的玉米赤霉烯酮阻抗传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于纳米Co₃O₄模拟酶催化作用的信号双放大的玉米赤霉烯酮阻抗传感器。首先利用透明质酸功能化的TiO₂介晶作为传感平台，利用透明质酸捕获大量的一抗（Ab₁），然后在传感界面上依次识别上玉米赤霉烯酮抗原，和Co₃O₄标记的二抗（Ab₂）。生成的免疫复合物阻碍电子传递，电化学阻抗信号增大。纳米Co₃O₄作为一种无机金属氧化物，具有良好的过氧化物模拟酶的性质，稳定性更好，催化活性高，催化氧化产生大量生物沉淀在测试电极表面，使得检测信号进一步放大。基于检测信号的双放大，构建了一个灵敏度高、稳定性好、检测限低的阻抗传感器，实现了对玉米赤霉烯酮的超灵敏检测。

Description

一种基于纳米Co3O4模拟酶催化作用的信号双放大的玉米赤霉 烯酮阻抗传感器

技术领域

本发明属于新型的无机功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于纳米Co₃O₄模拟酶催化的信号双放大的玉米赤霉烯酮阻抗传感器的制备方法及应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮 (zearalenone，ZEA ) 是一种广泛分布的杂菌真菌毒素，通常存在于发霉腐败的玉米，水稻等谷物中，主要是各种镰刀菌属 ( Fusarium ) 的菌侏，如黄色镰孢 ( f.culmorum )、半裸镰孢 ( f.cericiisand )、木贼镰孢 ( f.equiseti )等菌种。研究表明ZEA 对人类和动物的健康都有很大危害，含有少量甚至是微量ZEA的食物被误食，往往会引起严重的疾病，如卵巢功能障碍、胚胎发育不良及生殖器官功能异常等疾病。因此发展一种灵敏度高，准确性好，重现性好的检测方法来实现对ZEA的灵敏检测具有重大的意义。现有的方法有高效液相色谱，荧光，等离子体共振等，这些方法虽然都能实现对ZEA的灵敏检测，但都需要复杂昂贵的仪器，繁琐的前期处理工作，一定程度上限制了它们的广泛应用。因此，发展一种分析速度快快速、操作简便、准确度高灵敏和低成本的ZEA的检测方法有着巨大的研究意义。

双抗夹心法，一般是利用固定在电极表面的一抗，待测抗原和被标记的二抗，三者之间形成夹心结构，因此也常被形象地称作“三明治法”。在检测体系中，其被标记二抗的量和一抗的量相对于检测抗原是过量的，因此形成的免疫复合物的量是取决于待测物中抗原的量。由于被标记信号分子的二抗具有一定的电化学信号、发光信号或者催化作用等，待检抗原量的变化都会引起检测信号的改变，据此可以实现对检测物的定量分析。电化学阻抗免疫传感器，利用抗原与抗体之间的特异性结合的一类电化学免疫生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点，具有良好的应用前景。本发明制备了一种基于Co₃O₄模拟酶催化的信号双放大阻抗传感器，并实现对玉米赤霉烯酮（ZEN）的高灵敏检测。

Co₃O₄ 作为一种金属多价态化合物，展现出模拟酶的性质Co₃O₄ 的晶体属于 AB₂O₄尖晶石结构，其中 Co(Ⅱ)为四配位，占据晶格中的四面体空隙，Co(Ⅲ)为六配位，填充于八面体空隙，氧以立方紧密堆积方式排列。Co₃O₄ 具有特殊的结构，显示出催化、导电和储能等性质，使其广泛应用于多个领域。为了克服传统生物酶易变性、稳定性差、催化活性易受环境（pH、温度、气压）等影响的缺点，无机金属氧化物Co₃O₄作为一种新型的纳米酶材料具有广阔的前景和重要的实际意义。本实验利用Co₃O₄过氧化物模拟酶的作用，将其标记在二抗上，在含有4-氯-1-萘酚（4-CN）和过氧化氢（H₂O₂）的水溶液中，生成大量不溶性的沉淀沉积于电极表面，电化学阻抗信号增大。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于纳米Co₃O₄模拟酶催化的信号双放大玉米赤霉烯酮阻抗免疫传感器及其制备方法和应用。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

1. 一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒电化学发光竞争型免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）玻碳电极依次用50纳米和30纳米的氧化铝粉末在湿润的麂皮上进行机械打磨抛光，然后用二次蒸馏水和无水乙醇进行多次冲洗，直至电极表面干净光亮；

（2）移取5 μL浓度为 3mg/L的透明质酸功能化的TiO₂介晶溶液（TiO₂@Hya）滴加至洁净的玻碳电极的表面，放至在红外灯箱内烘干，取出，冷却至室温，由此制备出TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（3）滴加体积比为2:1的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液于步骤（2）中制得的电极表面活化羧基30min,然后用二次蒸馏水进行冲洗，在室温下晾干备用；

（4）滴加5 μL浓度为50 μg/mL的玉米赤霉烯酮的单克隆抗体（Ab₁）溶液至步骤（3）所得的电极表面，并在室温条件(25°C)下孵育50min,用二次蒸馏水冲洗除去多余的物理吸附，室温下晾干，制得Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（5）滴加3μL浓度为 1.0 wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液于步骤（4）制得的电极表面，并在室温条件下孵育30min，以此来封闭电极表面的非特异性活性位点，用二次蒸馏水进行冲洗，洗去表面物理吸附，晾干备用；

（6）取不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEA）标准溶液滴加至步骤（5）制得的电极表面，并在室温条件下孵育40min,孵育完成后用二次蒸馏水进行冲洗除去电极表面的非特异性吸附，制得ZEA/Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极，在室温下晾干备用；

（7）移取所制备的Co₃O₄@ Ab₂溶液5μL滴至实验步骤（6）制备好的电极表面，用二次蒸馏水冲洗表面的物理吸附，晾干，得到Co₃O₄@ Ab₂/ZEA/Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（8）将步骤（7）中的修饰电极浸没在含有10mg/mL 4-氯-1-萘酚水溶液和10wt%H₂O₂的溶液中，在电极表面生成生物沉积，25min后取出晾干，于三电极系统中测量其阻抗大小的变化；

2.所述的TiO₂介晶的制备方法如下：0.5g的十二烷基苯磺酸钠 （SDBS）溶解于25 mL的2.2 mol/L的HNO₃溶液中，持续搅拌震荡数十分钟后加入500 µL的钛酸异丙酯（TIP），然后将上述混合物在48 °C 条件下持续震荡24小时，随后混合物用去离子水和无水乙醇冲洗数次，在60°C条件下干燥过夜。干燥后在400 °C下煅烧60min，以充分去除残余的有机物，得到最终产物。将所得产物分散在去离子水中，储存在4°C冰箱中备用。

3.所述的功能化的TiO₂介晶溶液的制备方法如下:将500μL浓度为5mg/mL的透明质酸溶液和500μL浓度为5mg/mL的TiO₂介晶在室温中混合震荡1h,随后离心洗涤数次，重新分散在二次蒸馏水中。

4.所述的Co₃O₄和玉米赤霉烯酮抗体（Ab₂）复合溶液（Co₃O₄@ Ab₂）由下述方法制备：1）0.776 g 的六水合硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）作为前驱体溶液溶解在5mL的无水乙醇溶液中，持续搅拌30min后加入0.2g 的KIT-6 模板，持续搅拌至无水乙醇完全蒸发。将得到的产物在400 °C下煅烧4h,得到最终产物K-Co₃O₄，将其分散在去离子水中，得到5mg/mL的 Co₃O₄溶液。2) 150μL浓度为5mg/L的3-巯基乙酸溶液和300μL浓度为5mg/mL的 Co₃O₄溶液在室温下充分混合，并在摇匀机上混匀4h，得到被羧基化的Co₃O₄，离心，洗涤，反复进行三次，并将其重新分散在二次蒸馏水溶液中。3) 50μL体积比为2:1的EDC/NHS溶液加至上述溶液中，混合震荡，活化羧基。4）随后将300 μL浓度为50 μg/mL的 Ab₂溶液加至上述溶液，混合震荡4h,利用被功能化的Co₃O₄上的羧基和Ab₂上的氨基之间的结合，制备了Co₃O₄@ Ab₂溶液。5）将得到的Co₃O₄@ Ab₂溶液离心，洗涤，重新分散在pH等于7.4的磷酸缓冲溶液中，放至4°C的冰箱冷藏备用。

5.上述方法制备的一种基于四氧化三钴模拟酶催化作用的信号双放大阻抗传感器。

6.玉米赤霉烯酮（ZEA）的检测步骤：

（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以上述的一种基于四氧化三钴模拟酶催化的阻抗免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，选用的电化学方法是交流阻抗法，在Fe²⁺/Fe³⁺氧化还原电子对溶液中进行测试；

（2）交流阻抗方法中，采用的偏压是0.199V，初始频率为100000Hz，终止频率为0.1 Hz，对不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液进行检测，通过电化学工作站来采集数据，得到不同的阻抗数据。通过电化学阻抗值与玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（3）待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮（ZEA）标准溶液进行检测，检测的结果可由绘制出的标准工作曲线查得。

本发明的显著优点为：

（1） 双抗夹心法：一般是利用固定在电极表面的一抗，待测抗原和被标记的二抗，三者之间形成夹心结构，因此也常被形象地称作“三明治法”。在检测体系中，其被标记的二抗的量和一抗的量相对于检测抗原是过量的，因此形成的免疫复合物的量是取决于待测物中抗原的量。由于被标记信号分子的二抗具有一定的电化学信号、发光信号或者催化作用等，待检抗原量的变化都会引起检测信号的改变，据此可以实现对检测物的定量分析。

（2）Co₃O₄模拟酶: Co₃O₄作为一种无机金属氧化物，具有良好的生物相容性，并且具有模拟过氧化物酶的作用。相较于传统的生物酶，其稳定性更高，催化活性更好，在本实验体系中，能够催化产生更多不溶性的沉淀沉积在电极表面，使得电化学阻抗信号得到很大程度的改变。

（3）透明质酸作为功能化TiO₂介晶的功能化试剂，具有大量的羧基，可以尽可能多的捕获Ab₁，为实现对ZEA的超灵敏检测提供可能。

（4）检测信号的双放大：能够实现对ZEA标准溶液及其测试样品的灵敏检测主要来源于检测信号的两次放大。一次是夹心型免疫复合物的形成，其较弱的导电性和较大的空间阻碍效应，阻碍了电子的转移，使得阻抗信号增大。第二次是在电极表面形成的不溶性的沉积物，明显的抑制了电子从溶液中的氧化还原电子对向电极界面扩散的能力，使得电化学阻抗信息得以进一步的增大。

附图说明

图1为k- Co₃O₄的电镜图，其中A扫描电镜（SEM），B透射电镜图（TEM）。

图2为k- Co₃O₄作为模拟酶催化氧化TMB的紫外吸收图（其中a:TMB, b:TMB+H₂O₂,c:TMB+H₂O₂+Co₃O₄）。

图 3为所构制的免疫传感器的阻抗信号图。

图 4为玉米赤霉烯酮 ( ZEA )标准溶液浓度的线性关系图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

1.一种基于纳米Co₃O₄模拟酶催化作用的信号双放大的玉米赤霉烯酮阻抗传感器的制备方法，其特征在于，其制备方法主要有以下步骤：

（1）玻碳电极依次用50纳米和30纳米的氧化铝粉末在湿润的麂皮上进行机械打磨抛光，然后用二次蒸馏水和无水乙醇进行多次冲洗，直至电极表面干净光亮。

（2）移取5 μL浓度为 3mg/L的透明质酸功能化的TiO₂介晶溶液（TiO₂@Hya）滴加至洁净的玻碳电极的表面，放至在红外灯箱内烘干，取出，冷却至室温，由此制备出TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（3）滴加体积比为2:1的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液于步骤（2）中制得的电极表面活化羧基30min,然后用二次蒸馏水进行冲洗，在室温下晾干备用；

（4）滴加5 μL浓度为50 μg/mL的玉米赤霉烯酮的单克隆抗体（Ab₁）溶液（购自百奥森食品安全科技有限公司）至步骤（3）所得的电极表面，并在室温条件下孵育50min,用二次蒸馏水冲洗除去多余的物理吸附，室温下晾干，制得Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（5）滴加3μL浓度为 1.0 wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液于步骤（4）制得的电极表面，并在室温条件下孵育30min，以此来封闭电极表面的非特异性活性位点，用二次蒸馏水进行冲洗洗去表面物理吸附，晾干备用；

（6）取不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEA）标准溶液滴加至步骤（5）制得的电极表面，并在室温条件下孵育40min,孵育完成后用二次蒸馏水进行冲洗除去电极表面的非特异性吸附，制得ZEA/Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极，在室温下晾干备用；

（7）移取所制备的Co₃O₄@ Ab₂溶液5μL滴至实验步骤（6）制备好的电极表面，用二次蒸馏水冲洗表面的物理吸附，晾干，得到Co₃O₄@ Ab₂/ZEA/Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（8）将步骤（7）中的修饰电极浸没在含有10mg/mL 4-氯-1-萘酚的水溶液（购自梯希爱上海化成工业发展有限公司）和10wt%H₂O₂的溶液中，在电极表面生成生物沉积，25min后取出晾干，于三电极系统中测量其阻抗大小的变化。

实施例2

上述实施例1所用的透明质酸功能化的TiO₂介晶溶液由下述方法制备：

1）0.5g的十二烷基苯磺酸钠 （SDBS）溶解于25 mL的2.2 mol/L的HNO₃溶液中，持续搅拌震荡数十分钟后加入500 µL的钛酸异丙酯（TIP），然后将上述混合物在48 °C 条件下持续震荡24小时，随后混合物用去离子水和无水乙醇冲洗数次，在60°C条件下干燥过夜。干燥后在400 °C下煅烧60min，以充分去除残余的有机物，得到最终产物。将所得产物分散在去离子水中，储存在4°C冰箱中备用。

2）透明质酸功能化的TiO₂介晶溶液由下述方法制备的:将500μL浓度为5mg/mL的透明质酸溶液和500μL浓度为5mg/mL的TiO₂介晶在室温中混合震荡1h,随后离心洗涤数次，重新分散在二次蒸馏水中制得。

实施例3

上述实施例1所用的k- Co₃O₄由下述方法制备：

1）6g聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物溶解在217g去离水和11.8g的35%的盐酸混合溶液中，35°C条件下，6g丁醇加入到上述溶液中，持续搅拌1h后，在35°C条件下，加入12.9g的聚四甲氧基硅烷，随后持续搅拌24h。随后将上述混合物加热100°C，保温24h,水热处理后得到的固体产物100°C条件下过滤干燥。得到的产物在乙醇和盐酸的混合物中提取，于550°C条件下煅烧，冷却，由此制的KIT-6 模板。

2）0.776 g 的六水合硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）作为前驱体溶液溶解在5mL的无水乙醇溶液中，持续搅拌30min后加入0.2g 步骤（1）所制得的KIT-6 模板，持续搅拌至无水乙醇完全蒸发。将得到的产物在400 °C下煅烧4h,得到最终产物K-Co₃O₄，将其分散在去离子水中，得到5mg/mL的 Co₃O₄溶液。

实施例4

上述实施例1所用的Co₃O₄@ Ab₂溶液下述方法制备：150μL浓度为5mg/L的3-巯基乙酸溶液和300μL浓度为5mg/mL实施例3制备的 Co₃O₄溶液在室温下充分混合，并在摇匀机上混匀4h，得到被羧基化的Co₃O₄，离心，洗涤，反复进行三次，并将其重新分散在二次蒸馏水溶液中。50μL体积比为2：1的EDC/NHS溶液加至上述溶液中，混合震荡，活化羧基。随后将300 μL浓度为50 μg/mL的 Ab₂溶液加至上述溶液，混合震荡4h,利用被功能化的Co₃O₄上的羧基和Ab₂上的氨基之间的结合，制备了Co₃O₄@ Ab₂溶液。将得到的Co₃O₄@ Ab₂溶液离心，洗涤，重新分散在pH等于7.4的磷酸缓冲溶液中，放至4°C的冰箱冷藏备用。

实施例5

玉米赤霉烯酮 ( ZEA )的检测步骤：

（1） 使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以实施例1所制得的一种基于四氧化三钴模拟酶催化的阻抗免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，选用的电化学方法是交流阻抗法，在Fe²⁺/Fe³⁺氧化还原电子对溶液中进行测试；

（2）交流阻抗方法中，采用的偏压是0.199V，初始频率为100000Hz，终止频率为0.1 Hz，对不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液进行检测，通过电化学工作站来采集数据，得到不同的阻抗数据,通过电化学阻抗值与玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（3）待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮（ZEA）标准溶液进行检测，检测的结果可由绘制出的标准工作曲线查得。

Claims (6)

1.一种基于纳米Co₃O₄模拟酶催化作用的信号双放大的玉米赤霉烯酮阻抗传感器的制备方法，其特征在于，以下步骤：

（1）玻碳电极依次用50纳米和30纳米的氧化铝粉末在湿润的麂皮上进行机械打磨抛光，然后用二次蒸馏水和无水乙醇进行多次冲洗，直至电极表面干净光亮；

（2）移取5 μL浓度为 3mg/L的透明质酸功能化的TiO₂介晶溶液（TiO₂@Hya）滴加至洁净的玻碳电极的表面，放至在红外灯箱内烘干，取出，冷却至室温，由此制备出TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（3）滴加体积比为2：1的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液于步骤（2）中制得的电极表面活化羧基30min,然后用二次蒸馏水进行冲洗，在室温下晾干备用；

（4）滴加5 μL浓度为50 μg/mL的玉米赤霉烯酮的单克隆抗体（Ab₁）溶液至步骤（3）所得的电极表面，并在室温条件下孵育50min,用二次蒸馏水冲洗除去多余的物理吸附，室温下晾干，制得Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（5）滴加5μL浓度为 1.0 wt.%的牛血清白蛋白（BSA）溶液于步骤（4）制得的电极表面，并在室温条件下孵育30min，以此来封闭电极表面的非特异性活性位点，用二次蒸馏水进行冲洗洗去表面物理吸附，晾干备用；

（6）取不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEA）标准溶液滴加至步骤（5）制得的电极表面，并在室温条件下孵育40min,孵育完成后用二次蒸馏水进行冲洗除去电极表面的非特异性吸附，制得ZEA/Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极，在室温下晾干备用；

（7）移取所制备好的Co₃O₄和玉米赤霉烯酮抗体（Ab₂）复合溶液（Co₃O₄@Ab₂）5μL滴至实验步骤（6）制备好的电极表面，用二次蒸馏水冲洗表面的物理吸附，晾干，得到Co₃O₄@Ab₂/ZEA/Ab₁/ TiO₂@Hya修饰的玻碳电极；

（8）将步骤（7）中的修饰电极浸没在含有10mg/mL 4-氯-1-萘酚的水溶液和10wt%H₂O₂的溶液中，在电极表面生成生物沉积，25min后取出晾干，于三电极系统中测量其阻抗大小的变化。

2.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的TiO₂介晶由下述方法制备的：0.5g的十二烷基苯磺酸钠 （SDBS）溶解于25 mL的2.2 mol/L的HNO₃溶液中，持续搅拌震荡数十分钟后加入500 µL的钛酸异丙酯（TIP），然后将上述混合物在48 °C 条件下持续震荡24小时，随后混合物用去离子水和无水乙醇冲洗数次，在60°C条件下干燥过夜；干燥后在400 °C下煅烧60min，以充分去除残余的有机物，得到最终产物；将所得产物分散在去离子水中，储存在4°C冰箱中备用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的透明质酸功能化的TiO₂介晶溶液由下述方法制备的:将500μL浓度为5mg/mL的透明质酸溶液和500μL浓度为5mg/mL的TiO₂介晶在室温中混合震荡1h,随后离心洗涤数次，重新分散在二次蒸馏水中制得。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Co₃O₄和玉米赤霉烯酮抗体（Ab₂）复合溶液（Co₃O₄@ Ab₂）由下述方法制备的：1）0.776 g 的六水合硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）作为前驱体溶液溶解在5mL的无水乙醇中，持续搅拌30min后加入0.2g 的KIT-6 模板，持续搅拌至无水乙醇完全蒸发，将得到的产物在400 °C下煅烧4h,得到最终产物K-Co₃O₄，将其分散在去离子水中，得到5mg/mL的 Co₃O₄溶液；2) 150μL浓度为5mg/L的3-巯基乙酸溶液和300μL浓度为5mg/mL的 Co₃O₄溶液在室温下充分混合，并在摇匀机上混匀4h，得到被羧基化的Co₃O₄，离心，洗涤，反复进行三次，并将其重新分散在二次蒸馏水溶液中；3) 50μL的体积比为2:1的EDC/NHS溶液加至上述溶液中，混合震荡，活化羧基；4）随后将300 μL浓度为50 μg/mL的Ab₂溶液加至上述溶液，混合震荡4h,利用被功能化的Co₃O₄上的羧基和Ab₂上的氨基之间的结合，制备了Co₃O₄@ Ab₂溶液；5）将得到的Co₃O₄@ Ab₂溶液离心，洗涤，重新分散在pH等于7.4的磷酸缓冲溶液中，放至4°C的冰箱冷藏备用。

5.权利要求1-4任一所述的方法制备的一种基于四氧化三钴模拟酶催化的信号双放大阻抗传感器。

6.权利要求5所述的基于四氧化三钴模拟酶催化作用的信号双放大阻抗免疫传感器，其特征在于，用于玉米赤霉烯酮（ZEA）检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以权利要求5所述的一种基于四氧化三钴模拟酶催化的阻抗免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，选用的电化学方法是交流阻抗法，在含有Fe²⁺/Fe³⁺氧化还原电子对的溶液中进行测试；

（2）交流阻抗方法中，采用的偏压是0.199V，初始频率为100000Hz，终止频率为0.1 Hz，对不同浓度的玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液进行检测，通过电化学工作站来采集数据，得到不同的阻抗数据，通过电化学阻抗值与玉米赤霉烯酮 ( ZEA ) 标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（3）待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮（ZEA）标准溶液进行检测，检测的结果可由绘制出的标准工作曲线查得。