CN115219569A - 人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用。该传感器包括捕获电极、循环肿瘤细胞、信号放大器和底物；捕获电极为负载有捕获抗体的电极；信号放大器为人工酶‑检测抗体共轭物，人工酶催化底物得到沉淀物，沉淀物为电子受体且沉积在电极表面，检测抗体和捕获抗体均为循环肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体。上述传感器是基于人工酶的高纳米酶活性催化沉淀、竞争吸收光能和消耗电子供体以及免疫夹心反应，进行光电流信号放大设计，利用上述传感器能够实现检测循环肿瘤细胞，并具有灵敏度高、选择性高、重现性好、稳定性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用。
背景技术
循环肿瘤细胞作为肿瘤转移的细胞起源，是判断癌症发病进程及预后评价的重要生物标志物。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断、化疗药物的快速评估、肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。但其在患者血液中含量极低，大约每100万个血细胞中才有1个肿瘤细胞，捕获难度高。因此，发展简便易行、特异性高、灵敏度高的循环肿瘤细胞检测方法，是目前亟需解决的技术难题。
光电化学生物传感器是近年来新兴的一种生物传感技术，具有灵敏度高、背景信号低、操作简单等诸多优点，广泛地应用于DNA检测、免疫分析等。为提高光电化学生物传感器的灵敏度，许多信号放大技术应运而生。其中，人工酶是具有纳米材料特性和天然酶催化活性的酶模拟物。与天然酶相比，纳米材料具有多种优点，如存储周期长、成本低、稳定性高以及易于表面改性。因此，开发一种高性能的人工酶检测肿瘤细胞传感器是一项非常有价值的研究工作。
发明内容
为了实现简便易行、高特异性、高灵敏度的循环肿瘤细胞检测，本发明提供一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用。
具体地，本发明提供的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，包括捕获电极、循环肿瘤细胞、信号放大器和底物；
所述捕获电极为负载有捕获抗体的电极；
所述信号放大器为人工酶-检测抗体共轭物；
所述人工酶阻碍电子供体到达电极表面且催化底物得到沉淀物，所述沉淀物为电子受体且沉积在电极表面，所述检测抗体和捕获抗体均为循环肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体。
上述传感器中，所述捕获电极为封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，具体是在氧化铟锡电极表面依次负载二氧化钛、壳聚糖、捕获抗体，然后采用封闭剂封闭后得到的。其中，所述氧化铟锡电极可以更换为其它电极，二氧化钛的作用是作为半导体材料，产生传感器的初始光电流信号；所述封闭剂的作用是为了占据所述二氧化钛纳米颗粒上的活性位点，封闭剂具体可以采用牛血清白蛋白。
上述传感器中，所述人工酶为Co3O4@MnO2@CDs多面体，该人工酶是在Co3O4多面体上依次生长MnO2和CDs制备得到的，所述Co3O4多面体由ZIF-67分解氧化而成。
上述传感器中，所述底物为过氧化氢和4-氯-1-奈酚，所述沉淀物为4-氯-1-奈醌。
上述传感器中，所述循环肿瘤细胞为A549细胞。当循环肿瘤细胞为A549细胞时，捕获抗体和检测抗体为A549细胞表面上的抗原上皮细胞粘附分子(EpCAM)的特异性抗体。当选择A549细胞外的其他目标循环肿瘤细胞时，可更换对应的捕获抗体和检测抗体。
上述人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备方法，包括如下步骤：
制备人工酶-检测抗体共轭物；
制备捕获电极；具体实施时，可以先制备人工酶-检测抗体共轭物，然后制备捕获电极，也可以先制备捕获电极，然后制备人工酶-检测抗体共轭物；
将捕获电极、目标循环肿瘤细胞进行混合孵育，加入人工酶-检测抗体共轭物，通过免疫夹心引入人工酶，然后加入底物反应，人工酶催化底物得到沉淀物沉积在电极表面，即得所述的传感器。
具体制备过程如下：
制备人工酶-检测抗体共轭物，包括：
(1)制备Co3O4@MnO2@CDs多面体：
首先合成了金属有机框架材料衍生物Co3O4多面体。具体的，将六水合硝酸钴(2.9103g)和2-甲基咪唑(3.2840g)分别溶解于甲醇(250mL)中。再将2-甲基咪唑溶液加入硝酸钴溶液中搅拌10min，然后将制备好的混合溶液在室温下老化24h。沉淀物(金属有机框架材料)经甲醇多次洗涤，除去未反应的试剂，在60℃真空干燥箱中干燥过夜。然后将金属有机框架材料放置于管式炉中，加热速率为5℃/min，氩气氛围下维持350℃30min，以更好地保留与金属有机框架材料相似的形貌。然后将氩气关断，在空气中继续反应30min，Co3O4多面体由金属有机框架材料分解氧化而成；优选地，所述金属有机框架材料为ZIF-67。
天平预热后，在称量纸上分别称量0.01g高锰酸钾、0.02g制备的Co3O4多面体。将高锰酸钾倒入30mL、0.1mol/L的KOH溶液中，充分搅拌使之分散均匀，随后加入Co3O4多面体粉末，超声30min。得到的混合液静置12h，静置过程中产物逐渐沉积在烧杯底部。待反应完成后，将固体物质离心分离，随后在60℃下真空干燥，所得产物即为Co3O4@MnO2多面体。
采用水热法制备了水溶性CDs，0.42g柠檬酸和0.536mL乙二胺溶解在10mL水中，装入30mL高压反应釜中。然后将高压反应釜放入200℃干燥箱中保持5h，产品经0.22μm过滤膜过滤后即可使用。
取2mg/mL上述所制备的Co3O4@MnO2多面体溶液加入4mL过滤后的CDs溶液，室温温和振摇12h，离心分离，制备Co3O4@MnO2@CDs多面体。
(2)制备Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物：
将目标检测抗体加入Co3O4@MnO2@CDs多面体溶液，并进行室温振摇孵育和离心处理，使得所述目标检测抗体和所述Co3O4@MnO2@CDs多面体通过共价键结合，制得Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物溶液；其中，所述目标检测抗体用Ab2表示。
制备捕获电极，包括以下步骤：
(1)制备二氧化钛/氧化铟锡电极：
配制二氧化钛纳米颗粒悬浮液(1.5mg/mL)；将所述二氧化钛纳米颗粒悬浮液滴加到氧化铟锡电极上，制得二氧化钛/氧化铟锡电极。
(2)制备捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极：
将壳聚糖(0.5％，m/v)修饰在所述二氧化钛/氧化铟锡电极上，以氨基化二氧化钛纳米颗粒，再用戊二醛(2.5％，m/v)作为交联剂将捕获抗体通过共价键结合在所述壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极表面上，制得捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极。
(3)制备封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极：
将封闭剂占据所述二氧化钛纳米颗粒上的活性位点，清洗得到封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极。
制备传感器：
将所述封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极与目标循环肿瘤细胞进行混合孵育处理，目标循环肿瘤细胞与捕获抗体特异性结合使目标循环肿瘤细胞捕获在所述封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上；将Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物与所述孵育目标循环肿瘤细胞后的封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极反应，通过免疫夹心反应使得Co3O4@MnO2@CDs多面体引入传感器，然后催化过氧化氢氧化4-氯-1-奈酚产生沉淀沉积在电极表面，制得人工酶检测肿瘤细胞的传感器。
本发明还提供一种上述人工酶检测肿瘤细胞的传感器在检测癌症标志物方面的应用，所述应用不以疾病诊断和治疗为目的。
上述应用具体是将所述人工酶检测肿瘤细胞的传感器置于含0.1M pH 7.4的抗坏血酸的Tril-HCl缓冲溶液中，进行光电化学检测。
基于上述应用，将目标循环肿瘤细胞捕获到所述封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上的时间为30～120min，人工酶Co3O4@MnO2@CDs多面体催化过氧化氢氧化4-氯-1-奈酚产生沉淀的时间为10～40min。优选地，将目标循环肿瘤细胞捕获到所述封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上的时间为90min，人工酶Co3O4@MnO2@CDs多面体催化过氧化氢氧化4-氯-1-奈酚产生沉淀的时间为20min。
基于上述应用，A549细胞的浓度范围为1×103至1×106cells/mL时，构建的线性回归方程是I＝-3.70logCA549–18.59(R2＝0.9905)，检测下限600cells/mL；其中，I是利用所述人工酶检测肿瘤细胞的传感器检测出的光电流信号，CA549代表A549细胞的浓度。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的人工酶检测肿瘤细胞的传感器是一种光电化学生物传感器，基于多功能信号放大器中的人工酶如Co3O4@MnO2@CDs多面体，拓展人工酶策略在光电化学生物传感器中的应用与发展。
上述人工酶检测肿瘤细胞的传感器基于多功能信号放大器中的人工酶如Co3O4@MnO2@CDs多面体的高纳米酶活性催化沉淀、竞争吸收光能和消耗电子供体以及免疫夹心反应，进行光电流信号放大设计，不仅放大了光电流信号的读出，使得生物传感器检测结果更为准确，提高检测灵敏度，而且人工酶的使生物相容性较好、费用降低；因此，利用本发明提供的上述传感器能够实现人工酶检测循环肿瘤细胞，并具有灵敏度高、选择性高、重现性好、稳定性高等优点，还可以实现准确低浓度循环肿瘤细胞的检测，光电化学生物分析提供了一条新的途径，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备流程图。
图2是本发明实施例1提供的传感器采用的人工酶Co3O4@MnO2@CDs多面体的表征图。
其中，该图中的图A是ZIF-67的扫描电镜图。图B是Co3O4多面体的扫描电镜图。图C为Co3O4@MnO2多面体的扫描电镜图。图D为Co3O4@MnO2@CDs多面体的透射电镜图。
图3是本发明实施例1提供的传感器的组装步骤表征图。
其中，该图中的图A为不同修饰电极的阻抗图，图B为不同修饰电极的光电流响应图。其中图A中的曲线分别代表以下修饰电极：曲线a代表二氧化钛/氧化铟锡电极，曲线b代表捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，曲线c代表封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，曲线d代表循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，曲线e代表Co3O4@MnO2@CDs-Ab2/循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，曲线f代表Co3O4@MnO2@CDs-Ab2/循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极与过氧化氢和4-氯-1-奈酚反应后的电极。
图4是本发明实施例1提供的传感器的制备条件优化图。
其中，图A是本发明实施例1提供的传感器在制备过程中循环肿瘤细胞捕获时间与光电流的关系图。图B是本发明实施例1提供的传感器在制备过程中催化4-氯-1-奈酚反应沉积时间与光电流的关系图。
图5是本发明实施例2提供的传感器检测A549细胞的线性关系图。
其中，该图中的图A是传感器检测不同浓度的A549细胞的光电流响应图，其中a→g表示A549细胞分别在1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5×105和1×106cells/mL浓度下的光电流信号。图B是传感器检测A549细胞浓度与光电流响应的线性拟合图。
图6是利用本发明实施例2提供的传感器构建的检测方法的选择性实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明主要依据金属框架材料的优势设计多功能信号放大器中的人工酶如Co3O4@MnO2@CDs多面体，结合靶向诱导人工酶Co3O4@MnO2@CDs多面体催化沉淀、竞争吸收光能和消耗电子供体以及免疫夹心反应，进行光电流信号放大设计，构建一种低成本、高选择性、超灵敏检测循环肿瘤细胞的光电化学生物传感器，为研究循环肿瘤细胞在癌症发生发展中的作用提供技术支撑。
下面以A549细胞作为循环肿瘤细胞，对本发明提供的人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用做进一步阐述。
本发明实施例采用的原料试剂：A549细胞、HeLa细胞和CCRF-CEM细胞来自中国科学院细胞库，上皮细胞粘附分子(EpCAM)的特异性捕获抗体和检测抗体来自美国Abcam(Cambridge，MA)公司；牛血清白蛋白来自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；二氧化钛纳米颗粒购自德国Degussa公司。
六水合硝酸钴、2-甲基咪唑、高锰酸钾、氢氧化钾、柠檬酸、乙二胺、壳聚糖、无水甲醇、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、抗坏血酸、铁氰化钾和亚铁氰化钾、氯化钠均为分析纯AR，来自国药集团化学试剂有限公司。
本发明实施例采用的实验仪器：
所有水溶液均使用来自Milli-Q过滤系统(MilliporeCorp.,USA)的超纯水制备。扫面电镜图由S4800扫描电子显微镜(日本)表征。透射电镜图、高分辨电镜图和高角度暗扫描场透射电镜图由JEOL JEM 2100F场发射透射电子显微镜(日本)表征。X射线光电子能谱是在多功能成像电子光谱仪(Thermo ESCALAB 250XI)上获得的。使用DS5紫外-可见分光光度计(DS5，英国)测试紫外-可见光谱。
装有420nm截止滤光片的氙灯(PLS-SXE 300)用作光源(波长>420nm)，光电化学和电化学阻抗谱测量是由带有氧化铟锡电极的CHI 660E电化学工作站完成。电化学阻抗谱测量在5mM(1:1)[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行，该溶液含有0.1M KCl，频率范围为0.1Hz至100kHz，振幅为5mV。本发明实施例采用的电化学和光电化学测试均使用三电极体系：直径为5.6mm的氧化铟锡(珠海凯为光电科技有限公司)导电玻璃为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极。
实施例1
请参阅图1，本发明实施例1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备，包括以下步骤：制备Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物；制备二氧化钛/氧化铟锡电极、捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极、制备封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极和制备传感器。
一、制备Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物
ZIF-67衍生的Co3O4多面体：将六水合硝酸钴(2.9103g)和2-甲基咪唑(3.2840g)分别溶解于甲醇(250mL)中，再将2-甲基咪唑溶液加入硝酸钴溶液中搅拌10min，然后将制备好的混合溶液在室温下老化24h。沉淀物(ZIF-67)经甲醇多次洗涤，除去未反应的试剂，在60℃真空干燥箱中干燥过夜。然后将ZIF-67放置于管式炉中，加热速率为5℃/min，氩气氛围下维持350℃30min，以更好地保留与金属有机框架材料相似的形貌。然后将氩气关断，在空气中继续反应30min，得到Co3O4多面体；Co3O4多面体由ZIF-67分解氧化而成。
Co3O4@MnO2多面体：天平预热后，在称量纸上分别称量0.01g高锰酸钾、0.02g制备的Co3O4多面体。将高锰酸钾倒入30mL、0.1mol/L的KOH溶液中，充分搅拌使之分散均匀，随后加入Co3O4多面体粉末，超声30min。得到的混合液静置12h，静置过程中产物逐渐沉积在烧杯底部。待反应完成后，将固体物质离心分离，随后在60℃下真空干燥，所得产物即为Co3O4@MnO2多面体；
CDs：采用水热法制备了水溶性CDs，具体的，将0.42g柠檬酸和0.536mL乙二胺溶解在10mL水中，装入30mL高压反应釜中。然后将高压反应釜放入200℃干燥箱中保持5h，产品经0.22μm过滤膜过滤后即得CDs溶液；
Co3O4@MnO2@CDs多面体的制备：取2mg/mL上述所制备的Co3O4@MnO2多面体溶液加入4mL过滤后的CDs，室温温和振摇12h，离心分离，制备Co3O4@MnO2@CDs多面体。
该步骤的ZIF-67、Co3O4多面体、Co3O4@MnO2多面体和Co3O4@MnO2@CDs多面体采用扫面电镜和透射电镜分别表征其形貌和尺寸，如图2A所示的ZIF-67具有菱形十二面体形状，平均尺寸约为550nm，将其在空气中碳化后，得到的Co3O4多面体(图2B)保持了相似的形貌，但Co3O4多面体的平均尺寸减小到ZIF-67的一半，且其表面发生一定程度的凹陷，这是由于脱氧条件下有机成分脱水引起的收缩，与现有技术报道的有机物碳化结果一致。MnO2生长后的形貌如图2C所示，与Co3O4多面体相比，Co3O4@MnO2多面体表面仍具有凹面，但边缘棱框部位会显得更加圆润。为了清晰观察Co3O4@MnO2@CDs多面体的形成，对其结构采用透射电镜对其进行表征，透射电镜图2D中，除中心较厚的部位外，Co3O4@MnO2多面体的框架结构几乎是全透明的，内部有许多颗粒镶嵌在其中。
制备Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物：将目标检测抗体加入Co3O4@MnO2@CDs多面体溶液，并进行室温振摇孵育和离心处理，使得所述目标检测抗体和所述Co3O4@MnO2@CDs多面体通过共价键结合，制得Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物溶液；其中，所述目标检测抗体用Ab2表示。
二、制备二氧化钛/氧化铟锡电极
将二氧化钛纳米颗粒分散于超纯水中，制得浓度为1.5mg/mL二氧化钛纳米颗粒悬浮液；将25μL、1.5mg/mL二氧化钛纳米颗粒悬浮液滴加在清洗干净的氧化铟锡工作电极上，然后空气中自然干燥，制得二氧化钛/氧化铟锡电极。
三、制备捕获抗体//壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极
将20μL 0.5％(m/v)壳聚糖溶液滴加在二氧化钛/氧化铟锡电极表面过夜干燥，再用20μL2.5％(m/v)戊二醛修饰，然后将20μL 2μg/mL的捕获抗体通过共价键结合在所述壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极表面上，清洗得到捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极。所述捕获抗体为上皮细胞粘附分子(EpCAM)的特异性捕获抗体。
四、制备封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极
用20μL 1％(m/v)封闭剂占据二氧化钛纳米颗粒上的活性位点，清洗得到封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极。所述封闭剂为牛血清白蛋白。
四、制备传感器
将所述封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极与20μL不同浓度目标循环肿瘤细胞进行混合孵育处理，目标循环肿瘤细胞与捕获抗体特异性结合使目标循环肿瘤细胞捕获在所述封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上；将Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物与孵育目标循环肿瘤细胞后的封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极反应，通过免疫夹心反应使得Co3O4@MnO2@CDs多面体引入传感器，然后催化过氧化氢氧化4-氯-1-奈酚产生沉淀4-氯-1-萘醌沉积在电极表面，制得人工酶Co3O4@MnO2@CDs多面体检测肿瘤细胞的传感器。所述循环肿瘤细胞为A549细胞。
(1)传感器的表征
试验条件：分别以本发明实施例中制备的二氧化钛/氧化铟锡电极、捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极、封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极、循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极、Co3O4@MnO2@CDs-Ab2/循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极、Co3O4@MnO2@CDs-Ab2/循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极与过氧化氢和4-氯-1-奈酚反应后的电极，置于含0.1M抗坏血酸的Tril-HCl缓冲溶液(pH 7.4，0.1M)中进行光电化学测试，测试结果如图3所示。
从图3A中可以看出：采用阻抗表征研究电极制备过程，曲线a所示的二氧化钛/氧化铟锡电极有一个小的Rct值(50.9Ω)。然而，逐步组装壳聚糖和捕获抗体后，由于抗体的差导电性质，捕获抗体在二氧化钛/氧化铟锡电极表面的固定有效地阻碍[Fe(CN)6]3-/4-离子和电极之间的电子转移过程，导致电荷转移的电阻增强，故曲线b显示捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极的Rct值增加到64.8Ω。当封闭剂占据剩余位置之后，曲线c所示的封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极Rct值进一步增加(76.0Ω)。曲线d显示循环肿瘤细胞被封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极特异性捕获之后，由于细胞的差导电性导致循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极的Rct值增加(89.2Ω)。曲线e所示电极在孵育Co3O4@MnO2@CDs-Ab2溶液之后，循环肿瘤细胞和Co3O4@MnO2@CDs-Ab2中的检测抗体特异性结合，将Co3O4@MnO2@CDs-Ab2引入传感器，由于半导体Co3O4@MnO2@CDs多面体的位阻效应和检测抗体的差导电性，产生一个增加的Rct值(96.6Ω)。曲线f显示得到的电极与过氧化氢和4-氯-1-奈酚的混合溶液进行孵育，Rct值增加(100.9Ω)，这主要是因为不溶性4-氯-1-奈醌沉积在电极上阻碍[Fe(CN)6)]3-/4-的电子转移到电极表面。阻抗结果表明所设计的人工酶检测肿瘤细胞的传感器已成功制备。
从图3B中可以看出：曲线a所示的二氧化钛/氧化铟锡电极有一个明显的光电流。曲线b显示经过壳聚糖与捕获抗体修饰形成的捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极的光电流减弱，这是由于该电极表面修饰的捕获抗体差导电性，阻碍了光生电子的产生，从而减弱阳极光电流信号。曲线c进一步用封闭剂封闭之后，蛋白的差导电性减弱封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极的光电流信号。曲线d显示：当目标循环肿瘤细胞与捕获抗体特异性结合后，循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极的光电流信号进一步减弱。曲线e显示：Co3O4@MnO2@CDs-Ab2的捕获导致光电流减少，原因可能如下：Co3O4@MnO2@CDs多面体不仅阻碍了电子供体(抗坏血酸)到达电极表面(位阻效应)，而且由于光能和电子供体(抗坏血酸)的竞争消耗，也可以作为一个猝灭剂有效地减弱电极的光电流。曲线f显示：将所制备的Co3O4@MnO2@CDs-Ab2/循环肿瘤细胞/封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极与过氧化氢和4-氯-1-奈酚反应混合溶液进一步孵育后，光电流明显降低，说明Co3O4@MnO2@CDs多面体(模拟过氧化物酶)具有良好的催化活性，可以催化过氧化氢将4-氯-1-奈酚快速氧化成4-氯-1-奈醌。沉淀物4-氯-1-奈醌不仅作为电子受体提高Co3O4@MnO2@CDs多面体的淬灭能力，而且作为不溶性析出物阻碍抗坏血酸(电子供体)到达电极表面。这些结果表明，基于Co3O4@MnO2@CDs多面体的光电化学生物传感平台已成功地研制，可用于循环肿瘤细胞的检测分析。
对于本发明实施例提供的人工酶检测肿瘤细胞的传感器，影响其光电流信号的主要因素有两个：一个是制备传感器中的循环肿瘤细胞的捕获反应时间，另一个是制备传感器步骤中的4-氯-1-奈酚的催化沉积时间。下面就该两个因素做进一步分析。
循环肿瘤细胞捕获时间的影响
实验条件：参照上述实施例1提供的方法根据循环肿瘤细胞捕获时间的不同制备出对应的传感器，其中，“制备传感器”步骤中，循环肿瘤细胞的捕获时间分别为0、30、60、90、120min，“制备传感器”步骤中4-氯-1-奈酚的催化沉积时间为20min，其它步骤与实施例1相同。利用制备出的上述传感器参照前述“(1)传感器的表征”部分的实验条件进行光电化学测试，测试结果如图4所示。
从图4A中可以看出：在循环肿瘤细胞捕获时间为0～90min时，封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极的光电响应逐渐减弱，这可能是由于循环肿瘤细胞捕获反应时间越长，固定在电极上的循环肿瘤细胞也就越多，对二氧化钛纳米颗粒上光生电子-空穴的产生和转移的阻碍增强，但实验发现，在吸附时间超过90min之后，光电响应减弱的趋势渐趋于平缓，如此说明封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上可固定的循环肿瘤细胞量已经基本达到饱和，因此，优选90min作为循环肿瘤细胞在封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上的捕获反应时间。
4-氯-1-奈酚催化沉积时间的影响
实验条件：“制备传感器”步骤中4-氯-1-奈酚的催化沉积时间为0、10、20、30、40min。实验结果如图4B所示。
从图4B中可以看出：在4-氯-1-奈酚催化沉积时间为0～40min时，传感电极产生的光电流随着4-氯-1-奈酚催化沉积时间的延长而降低，且在20min之后电流响应变化几乎趋于平缓。因此，优选20min作为4-氯-1-奈酚的最佳催化沉积时间。
实施例2
本实施例提供一种实施例1提供的人工酶检测肿瘤细胞的传感器在检测循环肿瘤细胞方面的应用。
具体地，实施例1提供的上述传感器在制备过程中，循环肿瘤细胞在封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上的捕获时间为90min，人工酶Co3O4@MnO2@CDs多面体在过氧化氢的帮助下催化4-氯-1-奈酚沉积的时间为20min。将实施例1制备的生物传感器置于0.1M抗坏血酸的Tril-HCl缓冲溶液(pH 7.4，0.1M)中，进行光电化学测试，检测出A549细胞分别在1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5×105和1×106cells/mL浓度下的光电流信号；依据检测结果构建A549细胞的浓度对数和光电流信号之间的线性方程，如图5所示。
从图5中可以看出：随着A549细胞浓度从1×103至1×106cells/mL，光电流逐渐减小，并与A549细胞浓度对数从1×103至1×106cells/mL浓度范围内具有良好的线性，线性回归方程是I＝-3.70logCA549–18.59(R2＝0.9905)；其中，I是利用所述人工酶检测肿瘤细胞的传感器检测出的光电流信号，CA549代表A549细胞的浓度。
检测限
基于公式检测限＝3σ/S(式中σ为校正曲线的标准偏差；S为校正曲线的斜率)计算检测限，得出A549细胞浓度的检测下限为600cells/mL。
选择性实验
本发明实施例选择HeLa细胞和CCRF-CEM细胞作为A549细胞选择性实验的干扰细胞。利用制备的传感器分别测试干扰细胞溶液的光电流信号，测试结果如图6所示。
从图6中可以看出：干扰HeLa细胞和CCRF-CEM细胞溶液引起的光电流响应与空白溶液产生大小相近的光电流响应值。然而，实验发现在上述干扰细胞分别与目标物同样以浓度比1:1混合时，即CHeLa:CA549为1×105cells/mL:1×105cells/mL、CCCRF-CEM:CA549为1×105cells/mL:1×105cells/mL；均产生了与目标物A549细胞相近大小的光电流响应，如此表明本发明实施例提供的利用上述人工酶检测肿瘤细胞的传感器检测A549细胞的方法具有良好的选择性。
重现性实验
在相同实验条件下分别制备五组生物传感器，对1×103cells/mL A549细胞溶液进行检测，得到光电流信号，并计算五组光电流的相对标准偏差。所得相对标准偏差为2.7％。
稳定性实验
本发明实施例提供的生物传感器在4℃冰箱中放置7天后，依次对1×105cells/mL的A549细胞溶液进行测试，得到光电流信号。实验结果表明该传感器的光电流可在7天内保持初始信号的97.5％。
所以，本发明实施例提供的人工酶检测肿瘤细胞的传感器在A549细胞检测中的应用具有如下优点：
1)超灵敏度：本发明实施例将人工酶催化沉淀、竞争吸收光能和消耗电子供体以及免疫夹心反应等有机结合起来，不仅放大了光电流信号的读出，提高检测灵敏度，而且人工酶的使用增加生物相容性、降低成本。在最优实验条件下，实验得出传感器的线性范围为1×103至1×106cells/mL，检出限低至600cells/mL。
2)高选择性：本发明实施例基于多功能信号放大器策略研发的传感器只有在目标识别时，才能改变光电流信号；不同干扰细胞对本检测体系均无明显干扰。
3)好重现性：在相同实验条件下分别制备五组生物传感器，检测1×103cells/mLA549细胞，其相对标准偏差为2.7％。
4)高稳定性：本发明实施例提供的生物传感器在4℃冰箱中放置7天后，对A549细胞检测的光电流约仍保持其初始光电流响应的97.5％。
因此，本发明实施例提供的人工酶检测肿瘤细胞的传感器，整合了人工酶催化沉淀、竞争吸收光能和消耗电子供体以及免疫夹心反应，进行光电流信号放大，是一种低成本、高选择性、超灵敏检测A549细胞的光电化学生物传感器，为A549细胞的分析研究提供新型的技术策略，促进癌症的早期诊断和预后评估。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (10)
1.一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，包括捕获电极、循环肿瘤细胞、信号放大器和底物；
所述捕获电极为负载有捕获抗体的电极；
所述信号放大器为人工酶-检测抗体共轭物；
所述人工酶阻碍电子供体到达电极表面且催化底物得到沉淀物，所述沉淀物为电子受体且沉积在电极表面，所述检测抗体和捕获抗体均为循环肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体。
2.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述捕获电极为封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，该捕获电极是在氧化铟锡电极表面依次负载二氧化钛、壳聚糖、捕获抗体，然后采用封闭剂封闭后得到的；所述封闭剂用以占据二氧化钛纳米颗粒上的活性位点。
3.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述人工酶为Co3O4@MnO2@CDs多面体，该人工酶是在Co3O4多面体上依次生长MnO2和CDs制备得到的，所述Co3O4多面体由ZIF-67分解氧化而成。
4.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述底物为过氧化氢和4-氯-1-奈酚，所述沉淀物为4-氯-1-奈醌。
5.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述循环肿瘤细胞为A549细胞；捕获抗体和检测抗体为A549细胞表面上的抗原上皮细胞粘附分子的特异性抗体。
6.权利要求1所述的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备人工酶-检测抗体共轭物；
制备捕获电极；
将捕获电极、目标循环肿瘤细胞进行混合孵育，加入人工酶-检测抗体共轭物，然后加入底物反应，人工酶催化底物得到沉淀物沉积在电极表面，即得所述的传感器。
7.根据权利要求1所述的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备方法，其特征在于，
制备人工酶-检测抗体共轭物，包括如下步骤：
（1）制备Co3O4@MnO2@CDs多面体：
制备Co3O4多面体：采用金属有机框架材料ZIF-67分解氧化制备Co3O4多面体；
制备Co3O4@MnO2多面体：向高锰酸钾的KOH溶液中加入Co3O4多面体粉末，超声、静置反应，将固体物质离心分离、真空干燥，得到Co3O4@MnO2多面体；
制备水溶性CDs：采用水热法制备水溶性CDs；
制备Co3O4@MnO2@CDs多面体：向Co3O4@MnO2多面体溶液中加入CDs溶液，室温振摇，离心分离，得到Co3O4@MnO2@CDs多面体；
（2）制备Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物：
将目标检测抗体加入Co3O4@MnO2@CDs多面体溶液，并进行室温振摇孵育和离心处理，制得Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物溶液；其中，所述Ab2表示目标检测抗体；
制备捕获电极，包括以下步骤：
（1）制备二氧化钛/氧化铟锡电极：将二氧化钛纳米颗粒悬浮液滴加到氧化铟锡电极上，制得二氧化钛/氧化铟锡电极；
（2）制备捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极：
将壳聚糖修饰在所述二氧化钛/氧化铟锡电极上，再用戊二醛作为交联剂将捕获抗体通过共价键结合在所述壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极表面上，制得捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极；
（3）制备封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极：
将封闭剂占据所述二氧化钛纳米颗粒上的活性位点，清洗得到封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极；
制备传感器：
将所述封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极与目标循环肿瘤细胞进行混合孵育处理，然后将Co3O4@MnO2@CDs-Ab2共轭物与孵育目标循环肿瘤细胞后的封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极反应，通过免疫夹心反应使得Co3O4@MnO2@CDs多面体引入传感器，然后催化过氧化氢氧化4-氯-1-奈酚产生沉淀沉积在电极表面，制得所述的传感器。
8.权利要求1～5任一项所述的人工酶检测肿瘤细胞的传感器在检测癌症标志物方面的应用，所述应用不以疾病诊断和治疗为目的。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述传感器置于含抗坏血酸的Tril-HCl缓冲溶液中，进行光电化学检测，所述传感器制备时，目标循环肿瘤细胞捕获到捕获电极上的时间为30～120 min，人工酶催化底物产生沉淀的时间为10～40 min。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，目标循环肿瘤细胞捕获到封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极上的时间为90 min，人工酶Co3O4@MnO2@CDs多面体催化过氧化氢氧化4-氯-1-奈酚产生沉淀的时间为20 min。
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