CN109991290A

CN109991290A - 以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法

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Publication number: CN109991290A
Application number: CN201910222221.6A
Authority: CN
Inventors: 刘小强; 唐云飞; 李乐乐; 杨立威
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: CN109991290B

Abstract

本发明涉及一种以Ce‑TiO₂@MoSe₂异质结和金纳米粒子（AuNPs）间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法，具体为：首先采用简单的水热法将稀土金属铈掺杂于TiO₂纳米块中得到Ce‑TiO₂，然后再次采用溶剂热法将MoSe₂纳米片生长于Ce‑TiO₂表面，形成Ce‑TiO₂@MoSe₂异质结，并将其作为支架用于负载黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的适配体；随后将AuNPs标记的且与AFB1适配体互补的DNA序列（AuNPs‑cDNA）引入电极表面构成三明治结构，实现Ce‑TiO₂@MoSe₂异质结和金纳米粒子（AuNPs）间的能量共振转移。采取该方法所制备的光电化学适配体传感器能够快速地测定AFB1，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。

Description

以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法

技术领域

本发明属于光电化学适配体传感器构建技术领域，具体涉及一种以Ce-TiO₂@MoSe₂异质结和金纳米粒子（AuNPs）间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法，该光电化学适配体传感器可用于定量检测黄曲霉毒素B1（AFB1）。

背景技术

由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生的多芳香族真菌次级代谢产物——黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），是一种普遍存在的、对人类和动物具有遗传毒性和致癌性的剧毒污染物。由于其诱变、致畸、免疫抑制和致癌作用，国际癌症研究机构将AFB1列为I类致癌物质。在花生、玉米、谷物等农产品的生长、储存、运输和消耗过程中都可以检测到黄曲霉毒素B1的存在。许多国家对食品中黄曲霉毒素的量进行了限制，如中国和美国规定的最大允许量为20 ng/mL；韩国的最大允许量为5 μg/kg；欧盟国家规定了大米中的最大允许量为5 ng/mL，花生、谷物、坚果、干果中的最大允许量为2 ng/mL。目前检测AFB1的方法有高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用以及酶联免疫吸附试验法，但在这些方法中存在着一定的局限性，如复杂的样品前处理、成本费用高、分析时间长等等。因此，开发一种用于高灵敏度监测人类食物中痕量AFB1的检测方法具有非常重要的意义。

近年来，光电化学（PEC）生物传感器由于稳定性高、设备简单、成本低廉、仪器小型化等优点已被发展成为一种新型的、潜在的分析技术。它反映的是在光照射下，光电压/光电流的变化与靶分析物浓度之间的关系。由于激发（光）和检测（电流）能量形式不同，光电化学具有超灵敏的能力，被广泛应用于检测不同的分析物。然而，超高的氧化能力导致该检测方法的选择性差。相比于传统的抗原-抗体间特异性反应，适配体（通过指数富集（SELEX）配体系统选择的人工单链核酸）具有高特异性、高亲和力、稳定性好、重现性好、成本低廉等优点，可以弥补PEC分析技术的不足。另外，在金（Au）和半导体材料之间设计能量共振转移是进行生物分析检测的一种强有力的手段，其中金作为能量受体，半导体材料作为能量供体。这一策略要求金的吸收光谱与能量供体的发射光谱有较宽的波长重叠时，能量共振转移就可以实现。

良好的光电活性材料对于构建PEC生物传感器起着关键性的作用。硒化钼（MoSe₂）是一种类似石墨一样的、具有Se-Mo-Se层状结构的、典型过渡金属硫族化合物。由于其具有窄的禁带宽度（1.33-1.72 eV）和高抗光腐蚀能力被广泛应用于能量储存、催化剂、光电子学等领域。据文献报道，单层的MoSe₂为直接带隙，在可见光下具有高的光催化活性，而多层的为间接带隙容易遭到自聚集。幸运的是，选择一个合适的共催化剂与其结合可以大大减小MoSe₂的自聚集现象。

众所周知，TiO₂纳米材料是一种良好的光催化和光电化学材料，由于其化学稳定性强、比表面积大、易于制备、无毒、资源丰富和生物相容性好，已广泛应用于传感器、光催化降解、太阳能电池、光催化制氢等各个领域。然而它的缺点是对可见光的吸收效率低、光生电子-空穴对极易复合，这可通过掺杂元素或与窄带隙材料形成异质结的方式来改善。掺杂金属或非金属元素可以缩小TiO₂的禁带宽度，即在TiO₂的导带和价带之间引入新的能级，拓宽了TiO₂对可见光的吸收，从而提高了TiO₂的光催化活性。构建异质结结构可以抑制光生电子空穴对的复合，延长了载流子的寿命。因而我们在本申请中，首先将稀土金属铈掺杂于TiO₂中引入一个新的能级，其中，铈作为捕获陷阱在材料表面产生强氧化性的·O₂ ^-，通过氧化溶液中抗坏血酸放大电流信号；然后将其与MoSe₂复合得到Ce-TiO₂@MoSe₂异质结，既改善了Ce-TiO₂对可见光的吸收，又减少了MoSe₂纳米片的团聚，并将这一具有优异光电性能的复合材料用于构建适配体传感器的支架。

发明内容

本发明目的在于研制一种以Ce-TiO₂@MoSe₂异质结和金纳米粒子（AuNPs）间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法，该光电化学适配体传感器可用于定量检测黄曲霉毒素B1（AFB1），且灵敏度较高、线性范围较宽、检测限较低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有异质结的Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极的制备方法，其具体包括如下步骤：

①Ce-TiO₂@MoSe₂异质结的制备：

Ce-TiO₂的制备：将5~10 mL冰醋酸、100~300 μL [bmim][BF₄]（1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐）、10~30 μL超纯水与一定量六水硝酸铈、100~300 μL异丙醇钛混合后，于高压反应釜中在200±5℃条件下反应24±2h，自然冷却至室温，离心分离，沉淀经洗涤、干燥后，研磨至粉末，记为Ce-TiO₂，备用；其中Ce与Ti原子比为0.5~10%；

Ce-TiO₂@MoSe₂复合物的制备：0.15~0.20g Ce-TiO₂分散于5~20 mL的水和乙醇的混合液中形成均一悬浮液；然后加入1~3 mL 0.1 M的十二烷基苯磺酸钠、0.15~0.20 g Na₂MoO₄•2H₂O、0.10~0.13 g的Se粉及0.15~0.20g NaBH₄，并调节6≤pH≤7，搅拌1~2 h后，在冰水浴中超声振荡20~40 min，转入高压反应釜中在200±5℃条件下反应48±2h；自然冷却至室温，离心分离，沉淀经洗涤、干燥后，研磨至粉末，记为Ce-TiO₂@MoSe₂复合物，备用；

②修饰电极的制备：

将1~3 mg 步骤①制备所得Ce-TiO₂@MoSe₂复合物均匀分散于1~5mL的1%壳聚糖醋酸溶液获得悬浮液，然后将悬浮液旋涂在洁净的ITO玻璃片导电面上，1~5℃环境中自然晾干，即得到Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极。

上述具有异质结的Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极的制备方法，具体的，步骤①中，所述冰醋酸、[bmim][BF₄]、超纯水、异丙醇钛的体积比优选为400:10:1:10；Ce-TiO₂与Na₂MoO₄•2H₂O的摩尔比优选为3:1；NaBH₄与Na₂MoO₄•2H₂O的摩尔比优选为7:2。

本发明提供了采用上述制备方法制备得到的Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极。

此外，本发明还提供了利用上述Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极构建以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的方法，其具体包括如下步骤：

1）AuNPs的制备及标记HS-cDNA：

AuNPs的制备：将1~3 mL 0.01 M的HAuCl₄•3H₂O溶液和1~3 mL 0.01 M的柠檬酸钠溶液均匀分散到15~20 mL的超纯水中形成均一溶液；然后在冰水浴下加入1~3 mL 0.1 M的新制NaBH₄溶液，室温下搅拌20~50 min，静置过夜，离心分离，洗涤，干燥即得AuNPs；

AuNPs-cDNA：取20~40 μL 50 μM的HS-cDNA与10~20 μL 10 mM的三（2-羧乙基）膦盐酸盐溶液在室温下孵育20~40 min以去除二硫键；然后加入过量含AuNPs的水悬浮液至HS-cDNA的终浓度为1 μM，随后在室温黑暗条件下振荡摇晃16 h，离心分离以除去未结合的AuNPs，沉淀物储存在含有0.1 M KCl的0.1 M PBS中，记为AuNPs-cDNA；

2）光电化学适配体传感器的构建：

先将10~30 μL 2.5%的戊二醛溶液旋涂于Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极表面，孵育20~40min后超纯水冲洗，自然晾干；再旋涂10~30 μL 2.5 μM氨基化的AFB1适配体溶液，1~3 h后PBS缓冲溶液清洗，随后浸泡在3%的牛血清蛋白中以封闭未结合的活性位点，然后用PBS缓冲液洗掉过量的BSA，记为BSA|aptamer|Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极；

本发明提供了利用上述方法构建获得的以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器。

本发明还提供了上述以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器在定量检测黄曲霉毒素B1中的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明构建了一种以Ce-TiO₂@MoSe₂异质结和金纳米粒子（AuNPs）间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器，用于定量灵敏检测食品中的AFB1。本发明首先采用水热法将铈掺杂于TiO₂纳米块中得到Ce-TiO₂，然后进一步采用溶剂热法将MoSe₂包裹在Ce-TiO₂表面，形成Ce-TiO₂@MoSe₂异质结结构，这一复合物不仅提高了TiO₂对可见光的光活性，而且阻止了MoSe₂的自聚集现象，大大提高了其比表面积，从而提高了传感器的灵敏度。其次本发明将Ce-TiO₂@MoSe₂复合物作为支架修饰于ITO电极表面固定氨基化的AFB1适配体构建光电化学适配体传感器；然后与AuNPs-cDNA杂交形成三明治结构，在AuNPs和Ce-TiO₂@MoSe₂复合物之间发生能量共振转移，妨碍光生电子空穴对的分离，减小了光电流响应；当AFB1存在时，破坏三明治结构，猝灭能量共振转移，光电流信号得到恢复。光电流响应随AFB1浓度的增大而增加，可进行定量检测。相比于现有技术中存在的仪器设备庞大、样品预处理过程繁琐、成本高且耗时长等缺点，且本发明构建的PEC适配体传感器表现出优越的分析性能，具有较宽的线性范围、较低的检测限以及良好的稳定性。

附图说明：

图1为不同材料的场发射扫描电镜SEM图：其中A为TiO₂纳米块；B图为Ce-TiO₂纳米块；C图为TiO₂掺杂前后的对比，掺杂前（左），掺杂后（右）；D图为MoSe₂纳米片；E和F图为不同放大倍数下的Ce-TiO₂@MoSe₂复合物；

图2为不同材料的XPS图谱，其中A为TiO₂纳米块的XPS全谱图；B为Ce-TiO₂纳米块的XPS全谱图；C为Ce-TiO₂@MoSe₂的XPS全谱图；D，E，F，G，H分别为Ti 2p, O 1s, Mo 3d, Se 3d和Ce 3d的XPS高分辨图谱；

图3为不同掺杂量的x%Ce-TiO₂的荧光光谱分析；

图4为不同材料的X-射线粉末衍射XRD图谱：其中a为Ce-TiO₂纳米块；b为MoSe₂纳米粒子；c为Ce-TiO₂@MoSe₂复合物；

f为SH-cDNA|BSA|aptamer|Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO；

g为AuNPs-cDNA|BSA|aptamer|Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO；

图6为适配体浓度对本发明光电适配体传感器光电流的影响；

图7为AFB1的孵育时间对光电适配体传感器光电流的影响；

图8为不同浓度下的AFB1（从a到i依次为: 0, 0.1, 1.0, 5.0, 10, 20, 50, 100,200ng mL^-1）对光电适配体传感器光电流的影响；

图9为光电流变化与AFB1浓度对数之间的线性关系；

图10为不同干扰物对光电适配体传感器的光电流变化。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，所用到的黄曲霉毒素B1购自于MedChemExpress；氨基化的AFB1适配体（5′-NH₂-(CH₂)₆-GTTGG GCACG TGTTG TCTCT CTGTG TCTCG TGCCC TTCGC TAGGCCCACA-3′）和巯基化互补链（5′-HS-(CH₂)₆-TTTTT GTGGG CCTAG-3′，即HS-cDNA）均购自于生工生物工程上海股份有限公司。

实施例1：

一种以Ce-TiO₂@MoSe₂异质结和金纳米粒子（AuNPs）间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法，其具体包括如下步骤。

1）Ce-TiO₂@MoSe₂异质结的制备：

Ce-TiO₂的制备：将8 mL冰醋酸(CH₃COOH)加入到含有200 μL的1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[bmim][BF₄]）和20 μL的超纯水混合液中，搅拌5 min；边搅拌边向其加入六水硝酸铈，10 min后，迅速加入200 μL的异丙醇钛（TTIP），并持续搅拌30 min，转入20 mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中在200℃下反应24 h。待反应釜自然冷却至室温后，离心分离，将下层的白色沉淀用无水乙醇离心洗涤3~4次以除去杂质。所得样品在60℃下干燥12 h，并研磨至粉末，记为Ce-TiO₂，备用；其中Ce与Ti原子比为3%（即Ce的掺杂量为3%）；

Ce-TiO₂@MoSe₂复合物的制备：0.1714 g Ce-TiO₂溶解于10 mL的水和乙醇的混合液中（v/v=1:1），激烈超声搅拌1 h形成均一悬浮液；然后向其加入1 mL 0.1 M的十二烷基苯磺酸钠搅拌5 min；接着再加入0.1645 g的Na₂MoO₄•2H₂O和0.1074 g的Se粉搅拌10 min；然后将0.1789 g的NaBH₄作为还原剂加入上述溶液，并调节6≤pH≤7，搅拌1 h后，在冰水浴中超声振荡30 min，转入20 mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中在200℃下反应48 h。待反应釜自然冷却至室温后，离心分离，将下层黑色沉淀分别用超纯水、无水乙醇各离心洗涤3~4次以除去杂质。所得样品在60℃真空干燥箱中干燥过夜，并研磨至粉末，记为Ce-TiO₂@MoSe₂复合物，备用。

2）修饰电极的制备：

首先，依次用甲苯、丙酮、无水乙醇和超纯水各超声清洗ITO玻璃片20 min，在N₂氛围下晾干，获得洁净的ITO玻璃片备用；

其次，将2mg步骤①制备所得的Ce-TiO₂@MoSe₂复合物分散于1 mL浓度1%（w/v）的壳聚糖醋酸溶液中，振荡摇晃1 h以获得均匀悬浮液。然后取20 μL均匀悬浮液旋涂修饰在洁净的ITO玻璃片导电面上（修饰面积为0.5cm²），置于4℃环境中自然晾干，即得到Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极，备用。

同时为了对比，参照上述方法制备TiO₂|ITO、Ce-TiO₂|ITO和MoSe₂|ITO电极。

此外，为了研究Ce掺杂量对Ce-TiO₂的影响，本发明在制备Ce-TiO₂时，分别按照Ce的掺杂量为0%（即不掺杂Ce，纯TiO₂）、0.5%、1%、2%、5%和10%；制备了不同Ce掺杂量的Ce-TiO_2，并对其进行荧光性能测试。

3）AuNPs的制备以及AuNPs-cDNA的过程：

AuNPs的制备：1 mL 0.01 M的HAuCl₄•3H₂O溶液和1 mL 0.01 M的柠檬酸钠溶液加入到18 mL的超纯水中，搅拌5 min以形成均一溶液。然后在冰水浴下（0-4℃）20 min内加入1 mL0.1 M的新制NaBH₄溶液，室温下搅拌30 min，静置过夜，离心分离，收集固体，分别用超纯水、乙醇洗涤3~4次，60℃干燥8h，获得AuNPs；

AuNPs-cDNA的过程：取30 μL 50 μM的HS-cDNA与15 μL 10 mM的三（2-羧乙基）膦盐酸盐溶液在室温下孵育30 min以去除二硫键。然后加入过量含AuNPs的水悬浮液至HS-cDNA的终浓度为1 μM，随后在室温黑暗条件下振荡摇晃16 h，接着将其在10000 rpm下离心以去除未结合的过量AuNPs，将沉淀物储存在含有0.1 M KCl的0.1 M PBS（pH 7.0）中，记为AuNPs-cDNA。

4）光电化学适配体传感器的构建：

先将20 μL 2.5%的戊二醛溶液旋涂于步骤2）所得Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极表面，孵育30 min使其与壳聚糖中的氨基充分结合，随后将其用超纯水冲洗1 min以除去电极表面未结合的戊二醛，自然晾干。再取20 μL 2.5 μM氨基化的AFB1适配体溶液（将氨基化的AFB1适配体用1TE Buffer稀释获得）旋涂于电极表面以使其与戊二醛中的醛基形成C=N双键结构，修饰2 h后用0.1 M PBS（pH=7.4）缓冲溶液清洗2 min以完全洗去物理吸附的适配体；随后浸泡在3%的牛血清蛋白（BSA）中10 min以封闭未结合的活性位点，再用PBS缓冲液洗掉过量的BSA，记为BSA|aptamer|Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极；

Ce-TiO₂@MoSe₂复合物的表征：

以实施例1为例，图1给出了不同材料的场发射扫描电镜SEM图，用于表征材料的形貌特征：图A为纯TiO₂纳米块，图中可以看出纯TiO₂纳米块表面光滑、分散均匀、大小均一，直径大约为~300 nm。图B为掺杂3%Ce后的Ce-TiO₂纳米块，由于Ce⁴⁺ (0.092 nm)和Ce³⁺ (0.103 nm)离子半径大于Ti⁴⁺ (0.065 nm)的，Ce很难掺杂于TiO₂的内部，在TiO₂表面有小颗粒存在。从图C可以看出，TiO₂（左）和Ce-TiO₂（右）表面有明显的不同。图D为纯的MoSe₂纳米片，从图中可以看到MoSe₂片的自聚集现象特别严重。图E、F为不同放大倍数的Ce-TiO₂@MoSe₂复合物，图中可以看出MoSe₂纳米片的自聚集得到了明显的改善，提高了Ce-TiO₂的比表面积，同时证明了Ce-TiO₂@MoSe₂复合物的成功合成。

以实施例1为例，图2给出了不同材料的XPS图谱，其中A为TiO₂纳米块的XPS全谱图，图中呈现了Ti，O，C的峰，表明纯的TiO₂被合成。图B为Ce-TiO₂的XPS全谱图，呈现了Ti，O，Ce，C的峰，证明Ce成功掺杂了TiO₂，并且没有杂质生成。图C为Ce-TiO₂@MoSe₂复合物的XPS全谱图，图谱中有Ti，O，Mo，Se，Ce，C的峰，证明了高纯度的Ce-TiO₂@MoSe₂异质结合成。图D为Ti2p的高分辨率图谱，两个不对称峰分布在结合能为458~459 eV和464~465 eV，分别归属于Ti 2p3/2和Ti 2p1/2。曲线a为掺杂TiO₂前的Ti峰，峰位置位于458.78和464.48 eV，证明了Ti在TiO₂中主要以Ti⁴⁺的形成存在。掺杂后，Ti峰向低结合能方向移动并在459.28 eV处出现了一个较弱的峰（曲线b），归因于Ce的电负性小于Ti，同时证明了Ce成功掺杂了TiO₂。曲线c为Ce-TiO₂@MoSe₂复合物的Ti峰，Ti 2p又向结合能高的方向移动，证明在Ce-TiO₂和MoSe₂之间形成了异质结结构。图E为O 1s的高分辨率图谱，在~529 eV处的峰归属于[Ti-O₆]晶格氧的峰，在~531 eV处的峰归属于表面羟基氧-OH的峰，对比掺杂前后，掺杂后（曲线b；曲线a为掺杂前）具有更多的吸附氧和羟基氧，这是因为存在电荷转移和电荷不平衡现象。形成异质结后（曲线c），氧的结合能向高的结合能方向偏移。图F为Mo 3d的高分辨率图谱，在228.98和232.18 eV处的峰分别归属于Mo 3d5/2 和Mo 3d3/2，证明了Mo在复合物中的以Mo⁴⁺的形式存在。图G为Se的高分辨率图谱，54.48和55.38 eV分别对应Se 3d5/2和Se 3d3/2。图H为Ce 3d的高分辨率图谱，在884.98和902.98 eV处的峰证明了Ce⁴⁺的存在，在887.48和906.68 eV处的峰证明了Ce³⁺的存在，因此Ce以两种形式存在于复合物中。

图3给出了不同Ce掺杂量的Ce-TiO₂的荧光光谱（PL）图谱，反映了光生电荷的复合效率，PL强度越大，证明光生电荷越易复合。从图中可以看到在所有的样品中，纯TiO₂的PL强度最大，说明了TiO₂的光生电子空穴对易复合。随着Ce掺杂量的增加，PL强度有所下降，但当掺杂量为5%、10%的Ce-TiO₂时，其PL大于3%掺杂量的Ce-TiO₂，表明在5%、10%掺杂量的Ce-TiO₂中可能存在复合中心。因此3%Ce掺杂量的Ce-TiO₂为本发明的最优掺杂量，并简写为Ce-TiO₂。

以实施例1为例，图4为不同材料的X-射线粉末衍射XRD图谱，表征了材料的晶型结构：其中a为Ce-TiO₂纳米块；b为MoSe₂纳米粒子；c为Ce-TiO₂@MoSe₂复合物。曲线a中的衍射峰在25.20°，37.89°，47.82°，53.95°，54.86°，62.61°，68.81°，70.01°，75.00°，分别对应于锐钛矿TiO₂的（101），（004），（200），(105)，（211），（204）,（116），（220）和（215）晶面，从图中可以看到TiO₂的衍射峰高而尖锐，表明合成的TiO₂晶型较好，没有出现CeO₂的峰，这是因为Ce的掺杂量过小不能够被XRD检测到。曲线b是MoSe₂纳米片的XRD图谱，在12.21°, 31.82°,38.26°, 56.36°处的衍射峰分别归属于MoSe₂的（002），（100），（103），和（110）晶面。在曲线c中，Ce-TiO₂和MoSe₂的衍射峰都可以明显看到，并且峰位置没有发生大的偏移，这表明了MoSe₂纳米片成功负载于Ce-TiO₂纳米块表面。

测试过程：

测试前，分别将20 μL不同浓度的AFB1在适配体传感器上孵育2 h，然后用PBS缓冲溶液冲洗2 min；随后将三电极（被修饰的ITO电极为工作电极，Ag|AgCl（3.0 M KCl）为参比电极，铂丝为辅助电极）置于50 mL pH=7.4 0.1 M PBS缓冲液[含有0.1 M的KCl和0.1 M抗坏血酸（作为电子供体，被氧化，用来放大光电流信号）]中，采用间歇式可见光激发进行时间-电流曲线扫描测试，以定量测定AFB1。

光电流曲线图表征复合材料和光电化学适配体传感器的光电性能：

图5不同材料修饰电极在光照下的光电流响应，证实了在光照射下材料的光电性能和构建PEC适配体传感器检测AFB1的可行性：曲线a为纯TiO₂的光电流响应，有微弱的光电流产生大约为4.8 μA，这是因为TiO₂的光生空穴对易复合，导致其对可见光的响应较差，不易被激发。曲线b为Ce-TiO₂|ITO电极，从图中可以看出，在光照射下其值约为5.8 μA，对比纯TiO₂的光电流响应，增大了20%左右。曲线c为MoSe₂|ITO电极，光电流值为~7.2 μA。虽然MoSe₂的禁带宽度小，对可见光的吸收效率高，但MoSe₂为间接带隙，激发能力弱，因而光电流信号较小。Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO（曲线d）表现出较大的光电流响应，这是因为在Ce-TiO₂和MoSe₂之间能级匹配，形成了异质结结构。当AFB1的适配体（BSA|aptamer|Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO）修饰于电极表面后（曲线e），由于生物分子的位阻效应，光电流减小。当SH-cDNA与适配体杂交后产生了位阻效应，光电流相应地减小（曲线f）。而AuNPs-cDNA与适配体杂交形成三明治结构后（曲线g），在AuNPs和Ce-TiO₂@MoSe₂之间发生了能量共振转移，抑制了Ce-TiO₂@MoSe₂的光生电荷的分离，因此光电流大大地减小。当AFB1存在时（曲线h），由于适配体与AFB1的结合能力要强于与AuNPs-cDNA的结合，打破了这种三明治结构，能量共振转移消失，因此光电流得到了恢复。同时证明了本发明构建的光电化学适配体传感器方法是可行的。

光电化学适配体传感器检测条件的优化：

图6为适配体浓度对本发明光电适配体传感器光电流的影响。适配体的浓度是PEC适配体传感器检测过程中的一个重要参数。从图中可以看出，随着适配体浓度从0.5 μM到2.5 μM的增加，光电流响应随之减少，这是因为适配体阻碍了抗坏血酸到达电极表面，同时它能够捕获更多的AuNPs-cDNA产生更多的能量共振转移效应，当适配体浓度超过2.5 μM再继续增加时，光电流几乎不变，说明负载适配体的量达到了饱和状态。因此，2.5 μM的适配体是本发明传感器的最佳浓度。

图7为AFB1的孵育时间对光电适配体传感器光电流的影响。随着孵育时间的增长，光电流响应逐渐增加，这是因为浓度一定下，有更多的AFB1和适配体结合来中断AuNPs和Ce-TiO₂@MoSe₂之间的能量共振转移。当孵育时间超过60 min后，光电流几乎不再发生变化，因此，60 min为AFB1的最佳孵育时间。

定量检测AFB1：

在最佳的实验条件下，对本发明所提出的PEC适配体传感器通过定量检测AFB1进行了性能分析。如图8所示，为不同浓度的AFB1对光电适配体传感器光电流的影响。从图中可以看到，光电流的响应随着待测物AFB1浓度（从a到i依次为: 0, 0.1, 1.0, 5.0, 10, 20,50, 100, 200ng mL^-1）的增加而增加，由此可以得到光电流变化与AFB1浓度对数之间的校准曲线（图9）。由图9可知，光电流变化与AFB1浓度对数之间有良好的线性关系，线性范围为0.1- 200ng mL^-1，相关系数为0.986。在信噪比为3（S/N=3）时，其检测限为0.05 ng mL^-1。

本发明所制备的传感器相比于已报道的其他类型传感器表现出更优越的性能，这归因于Ce-TiO₂@MoSe₂复合物中具有的极大比表面积促进了更多生物分子的负载、卓越的生物相容性保留了生物分子的生物活性以及良好的可见吸收性能使得BSA|aptamer|Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO表现出较宽的线性范围和较低的检测限。

光电化学适配体传感器稳定性的、重现性和特异性测定：

从图8中可以看到，经过5次循环光电流几乎保持不变，表明了PEC适配体传感器有着良好的短期稳定性。将制得的传感器在4℃的环境下存放两周后再次测试，其光电流比原来初始值降了8.9%，证明了所制备的传感器具有长期的稳定性。

在相同条件下，将本发明实施例1制备的6个相同的传感器测试同一浓度的AFB1，得到的相对标准偏差RSD为4.6%，表明了本发明所构建的传感器具有较好的再现性，适用于AFB1的定量分析检测。

为了测试所制备传感器的选择性，进行干扰测试实验。分别测试了20ng mL^-1的AFB1、黄曲霉毒素M1（AFM1）、赭曲霉毒素A（OTA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），从图10可以看出，AFB1测试前后的光电流变化较大，远远大于其他三种的干扰物，表明了传感器具有良好的选择性。

本发明采用简单的水热法将稀土金属铈掺杂于TiO₂纳米块中得到Ce-TiO₂，然后再次采用溶剂热法将MoSe₂纳米片生长于Ce-TiO₂表面，形成Ce-TiO₂@MoSe₂异质结，并将其作为支架用于负载黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的适配体；随后将AuNPs标记的且与AFB1适配体互补的DNA序列（AuNPs-cDNA）引入电极表面构成三明治结构，实现Ce-TiO₂@MoSe₂异质结和金纳米粒子（AuNPs）间的能量共振转移。综上可以看出：采取本发明方法所制备的光电化学适配体传感器能够快速地测定AFB1，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> 以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构

建方法

<130> none

<140> 2019102222216

<141> 2019-03-22

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 1

gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 2

tttttgtggg cctag 15

Claims

1.一种具有异质结的Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

①Ce-TiO₂@MoSe₂异质结的制备：

Ce-TiO₂的制备：将5~10 mL冰醋酸、100~300 μL [bmim][BF₄]、10~30 μL超纯水与一定量六水硝酸铈、100~300 μL异丙醇钛混合后，于200±5℃条件下反应24±2 h，自然冷却至室温，离心分离，沉淀经洗涤、干燥后，研磨至粉末，记为Ce-TiO₂，备用；其中Ce与Ti原子比为0.5~10%；

Ce-TiO₂@MoSe₂复合物的制备：0.15~0.20g Ce-TiO₂分散于5~20 mL的水和乙醇的混合液中形成均一悬浮液；然后加入1~3 mL 0.1 M的十二烷基苯磺酸钠、0.15~0.20 g Na₂MoO₄•2H₂O、0.10~0.13 g的Se粉及0.15~0.20g NaBH₄，并调节6≤pH≤7，搅拌1~2 h后，在冰水浴中超声振荡20~40 min，转入反应釜中在200±5℃条件下反应48±2 h；自然冷却至室温，离心分离，沉淀经洗涤、干燥后，研磨至粉末，记为Ce-TiO₂@MoSe₂复合物，备用；

②修饰电极的制备：

将1~3 mg 步骤①制备所得Ce-TiO₂@MoSe₂复合物均匀分散于1~5 mL的1%壳聚糖醋酸溶液获得悬浮液，然后将悬浮液旋涂在洁净的ITO玻璃片导电面上，1~5 ℃环境中自然晾干，即得到Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极。

2.如权利要求1所述具有异质结的Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极的制备方法，其特征在于，步骤①中，所述冰醋酸、[bmim][BF₄]、超纯水、异丙醇钛的体积比为400:10:1:10；Ce-TiO₂与Na₂MoO₄•2H₂O的摩尔比为3:1；NaBH₄与Na₂MoO₄•2H₂O的摩尔比为7:2。

3.采用权利要求1或2所述制备方法制备得到的Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极。

4.利用权利要求3所述Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极构建以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）AuNPs的制备及标记HS-cDNA：

AuNPs的制备：将1~3 mL 0.01 M的HAuCl₄•3H₂O溶液和1~3 mL 0.01 M的柠檬酸钠溶液均匀分散到15~20 mL的超纯水中形成均一溶液；然后在冰水浴下加入1~3 mL 0.1 M的NaBH₄溶液，室温下搅拌20~50 min，静置过夜，离心分离，洗涤，干燥即得AuNPs；

2）光电化学适配体传感器的构建：

先将10~30 μL 2.5%的戊二醛溶液旋涂于Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极表面，孵育20~40 min后超纯水冲洗，自然晾干；再旋涂10~30 μL 2.5 μM氨基化的AFB1适配体溶液，1~3 h后PBS缓冲溶液清洗，随后浸泡在3%的牛血清蛋白中以封闭未结合的活性位点，然后用PBS缓冲液洗掉过量的BSA，记为BSA|aptamer|Ce-TiO₂@MoSe₂|ITO电极；

5.利用权利要求4所述方法构建获得的以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器。

6.权利要求5所述以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器在检测黄曲霉毒素B1中的应用。