CN111796012A - 一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法 - Google Patents

一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法：清洗氧化铟锡电极ITO切片：先将ITO切片依次放在丙酮、乙醇、超纯水溶液中超声处理；再用乙醇棉球擦拭后用超纯水冲洗干净，将ITO一面朝上放置在培养皿中退火，最后将ITO切片取出进行等离子体和臭氧处理；在处理后的ITO切片上旋涂钛酸四异丙酯、钛酸丁酯或钛酸乙酯前驱体，随后，将旋涂后的ITO基片退火，得到ITO/TiO2电极；将ITO/TiO2电极冷却至室温后，进行原位金纳米颗粒负载，得ITO/TiO2/Au NPs光阳极。该光电化学传感器具有高效、均一、稳定、制备重复性高的、结构简单、贮存稳定性好、检测重复性好、对miRNA‑21具有敏感性和特异性等优点，用于miRNA的检测。

Description

一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电 化学传感器制备方法
技术领域
本发明涉及光电化学传感器制备方法，特别涉及一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法。
背景技术
miRNAs是一类非编码的短(ca 18～25核苷酸)RNAs，参与了多种生物学过程，尤其是肿瘤患者miRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，可为临床应用提供有用的线索。近年来，miRNAs已成为重要疾病的生物标志物，所以开发简单、快速、可靠、灵敏的miRNAs检测方法具有重要意义。传统的miRNA检测方法有实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、杂交、基因芯片和分光光度法。然而，这些技术具有太耗时、需要昂贵的设备、不可移植性、低灵敏度和/或低选择性的个缺点。
最近，光电化学(PEC)传感器已被证明是快速、高通量生物分析中不可或缺的手段，并成为miRNA检测中其他常规分析方法的高效替代方法。利用常规电化学方法和光激发的结合，PEC分析具有成本低、仪器方便、易于小型化等独特优点。此外，激发源(光)和检测(光电流)之间的分离具有固有的高灵敏度和低背景噪声，与荧光、化学发光、电化学发光等光学检测方法相比，PEC传感器不需要使用复杂昂贵的光学成像设备和复杂的图像识别软件，仅需要电子检测使用的光电化学仪器，具有设备简单、成本低、信号识别易读等优势。
众所周知，电极材料在构建用于检测目标分析物的高性能PEC传感平台方面发挥着关键作用。在理想的PEC传感系统中，增强的光电流强度和减少的电子-空穴复合都是高灵敏度检测所需要的。为实现这一目标，PEC传感器通过将两个或更多其他敏化剂与基本的光活性材料(如TiO2)相结合而合理设计。例如，Zhu等人，用两种不同尺寸的CdTe量子点(QDs)对TiO2/CdS：Mn杂化结构进行超灵敏光电化学DNA检测(Fan G C，Han L，Zhang J R，et al.Analytical Chemistry，2014，86(21)：10877-10884.)。同样，Xu等人，开发了一种将银纳米颗粒(NPs)与CdS量子点(QDs)连接起来的光电化学系统，用于激发激子-等离子体相互作用(EPI)和一个刚性DNA间隔基(Zhao W W，Yu P P，ShanY，et al.AnalyticalChemistry，2012，84(14)：5892-5897.)。迄今为止，已经开发了多种基于该策略、并具有更高传感灵敏度的PEC传感器用于DNA分析，但是，很少有人致力于制造一种可靠的PEC传感器来检测miRNA。另一方面，TiO2的具有化学稳定性和良好的半导体性能，在成功地被应用于光电化学电池和染料敏化太阳能电池后，各种形貌的结晶TiO2被应用于光电化学基底材料。通常，ITO/TiO2光电阳极是通过将锐钛矿相或金红石相TiO2纳米颗粒溶液涂覆到ITO导电玻璃上获得。众所周知，ITO/TiO2光阳极初始光电流会极大影响敏化后电极在检测和传感性能，从而决定了基于这些ITO/TiO2电极的PEC传感器的性能。尽管对ITO/TiO2光阳极的PEC传感器传感策略不断改进，相应的PEC传感器在生物大分子分析检测、传感应用已经取得很多成果，但是，在优化TiO2层方面，尚未系统地开展大量工作。特别是，目前TiO2层主要是通过滴涂TiO2会，但是造成光阳极基底的不均匀、批次差异较大、电极重复性差等不良影响，因此，非常有必要开发出高效、均一、稳定可靠的ITO/TiO2光电化学电极。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法。
技术方案：本发明提供一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法，包括如下步骤：
(1)清洗氧化铟锡电极ITO切片：先将ITO切片依次放在丙酮、乙醇、超纯水溶液中超声处理；再用乙醇棉球擦拭后用超纯水冲洗干净，将ITO一面朝上放置在培养皿中退火，最后将ITO切片取出进行等离子体和臭氧处理，以增加ITO表面的功函数，同时形成的表面结构很容易被溶液旋涂有机化合物附着；
(2)在处理后的ITO切片上旋涂钛酸四异丙酯、钛酸丁酯或钛酸乙酯前驱体，随后，将旋涂后的ITO基片退火，得到ITO/TiO2电极；
(3)将ITO/TiO2电极冷却至室温后，进行原位金纳米颗粒负载，得ITO/TiO2/Au NPs光阳极。
进一步地，所述步骤(3)中原位金纳米颗粒负载的方法为：将30-150nm的金纳米粒子滴涂在ITO/TiO2电极上，形成金纳米粒子层，在室温下干燥ITO/TiO2/Au NPs阳极，最后，氮气气氛下，退火，再次干燥、活化电极，冷却至室温后形成稳定致密的ITO/TiO2/Au NPs光阳极。
进一步地，所述步骤(3)中原位金纳米颗粒负载的方法为：在TiO2薄膜上原位电化学沉积金纳米粒子，待电沉积结束，以纯净水清洗电极后，将生长金纳米颗粒的电极，在室温下干燥，最后，氮气气氛下，退火，再次干燥、活化电极，冷却至室温后形成稳定致密的ITO/TiO2/Au NPs光阳极。
进一步地，所述ITO/TiO2/AuNPs光阳极用于miRNA的检测。
进一步地，所述检测方法为：
(1)将含巯基发夹NH2-DNA-SH滴涂在ITO/TiO2/Au NPs电极上，摇瓶中孵育；
(2)孵育完成后，用Tris-HCl缓冲液冲洗ITO/TiO2/Au NPs电极，从基底上清除未共价连接的发夹NH2-DNA-SH，得到ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA电极；
(3)将N-羟基丁二酰亚胺(NHS)加入到巯基乙酸或巯基丙酸修饰的CdTe量子点(CdTe-COOH QDs)中，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；
(4)将步骤(3)活化的CdTe-COOH量子点溶液滴涂在ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA电极上，摇瓶中孵育，随后，用PBS缓冲液冲洗电极，再用6-巯基己醇(MCH)孵育电极，以封闭电极上的非特异性结合位点，防止假阳性信号的产生；
(5)用Tris-HCl缓冲液冲洗后，所得传感器即为miRNA特异性检测的光电化学传感器，并在不同浓度的靶miRNA孵育，最后，用SSC冲洗电极去除非杂交miRNA并用于PEC测量。
上述miRNA的检测，其响应原理如下：在高效稳定氧化钛基光阳极的光电探测器中巯基发夹NH2-DNA-SH在ITO/TiO2/Au NPs光阳极上起连接作用，其胺基与CdTe-COOH结合。在PEC传感器“关”状态，CdTe-COOH量子点靠近ITO/TiO2/AuNPs光阳极表面，在光照下产生一个光响应信号。当靶miRNA与PEC传感器杂交后，由于发夹DNA与待检测靶miRNA-21互补配对，发夹DNA将被展开，CdTe-COOH量子点与Au-NPs之间的距离将增加，此时，PEC传感器处于其“开启”阶段，在相同的辐照下会产生另一个光响应信号。通过比较这两种光响应信号变化，参考已知浓度靶miRNA确定的工作曲线，可以确定靶miRNA的浓度。
有益效果：本发明具有放大信号的共增感策略的PEC-miRNA分析方法。其中，TiO2是一种宽能带隙半导体材料，而AuNPs具有较窄的能带隙，因此在ITO片上连续沉积TiO2和Au NPs，形成ITO/TiO2/Au NPs光电阳极，可以明显扩大吸收范围，提高光能利用率，提高光电流强度。本发明中该传感器使用的光阳极，具有高效、均一、稳定、制备重复性高的、结构简单、贮存稳定性好、检测重复性好、对miRNA-21具有敏感性和特异性等优点，为其他光电化学生物传感器的设计提供了参考。
附图说明
图1为本发明中所用CdTe-COOH量子点溶液的HRTEM图像(比例尺，5nm)、紫外可见光谱和荧光光谱以及动态光散射(DLS)图；
图2为本发明ITO/TiO2电极上电沉积金纳米粒子的i-t剖面和沉积Au NPs的SEM图像；
图3为本发明中沉积的ITO/TiO2/AuNPs的SEM图像(比例尺，2μm)，以及氧(b)、钛(c)和金(d)的元素映射图像；
图4为本发明光电化学传感器与(a)互补miRNA杂交后的光电流变化、(b)单碱基错配miRNA、(c)非互补miRNA以及PEC生物传感器，与0和100pM的靶miRNA在含有0.1M AA的0.1M PBS(pH 7.4)中，在5s的光开关间隔下孵育后的稳定性和再现性结果图；
图5为本发明光电化学传感器的结构示意图，其中最后一层为QDs、NHS和EDC的混合物，体积比为2∶1∶1。
具体实施方式
实施例1
本实施例的基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法，包括三大部分：(一)高效稳定二氧化钛/纳米金光阳极的原位制备；(二)miRNA识别单元的构建与连接；(三)光化学传感器的miRNA检测应用。
(一)高效稳定二氧化钛/纳米金光阳极的原位制备
(1)清洗ITO切片：先将ITO切片依次放在丙酮、乙醇、超纯水溶液中各超声15-20min；再用乙醇棉球擦拭2-3遍后，用超纯水冲洗干净，将带有ITO一面朝上放置在培养皿中120℃退火2-4h；最后ITO切片取出进行等离子体和臭氧处理，以增加ITO表面的功函数，同时形成的表面结构很容易被溶液旋涂有机化合物附着。
(2)在ITO切片上旋涂适量的钛酸四异丙酯(或者钛酸丁酯、钛酸乙酯)前驱体。转速1200-2500转/分，加速度600-1000转/s，开机时间35-55s。随后，将旋涂钛酸酯的ITO基片在380-450℃下热退火1.5-3.0h，得到ITO/TiO2电极。
(3)将ITO/TiO2电极冷却至室温后，使用以下两种方式进行原位金纳米颗粒负载：
a.将30-150纳米的金纳米粒子滴涂在所制备的ITO/TiO2电极上，形成一层金纳米粒子，在室温下20-30℃在空气中干燥ITO/TiO2/AuNPs阳极。最后，氮气气氛下，在马弗炉中350℃下退火1-1.5h，进一步干燥、活化电极，待冷却至室温，形成稳定致密的ITO/TiO2/AuNPs光阳极。
b.在TiO2薄膜上原位电化学沉积金纳米粒子：电沉积电位为0.3V，沉积时间为3600s，电解质溶液为0.2-0.3mM的HAuCl4溶液。待电沉积结束，以纯净水清洗电极后，将生长金纳米颗粒的电极，在室温下20-30℃在空气中干燥ITO/TiO2/AuNPs阳极。最后，氮气气氛下，在马弗炉中350℃下退火1-1.5h，进一步干燥、活化电极，待冷却至室温，形成稳定致密的ITO/TiO2/Au NPs光阳极。
(二)miRNA识别单元的构建与连接
(1)将20-40μL含巯基发夹NH2-DNA-SH(2.0-4.0μM)滴涂在前述方法制备的ITO/TiO2/Au NPs电极上，使其在25℃的摇瓶中孵育培养8-12h。
(2)孵育完成后，用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH＝7.4)冲洗ITO/TiO2/Au NPs电极，以从基底上清除未共价连接的发夹NH2-DNA-SH，从而制备得到ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA电极。
(3)将5-10μL的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(40mM)加入到10-20μL巯基乙酸或巯基丙酸修饰的CdTe量子点(CdTe-COOH QDs)(4mM)中，并加入5-10uL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)。QDs、NHS和EDC的体积比为2∶1∶1。
(4)然后，将20μL活化的CdTe-COOH量子点溶液滴涂在ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA电极上。使其在25℃的摇瓶中孵育培养2-8h，随后，用PBS缓冲液冲洗电极。再用20-40μL 6-巯基己醇(MCH，10mM)孵育电极，以封闭电极上的非特异性结合位点，从而防止假阳性信号的产生。
(5)用Tris-HCl缓冲液冲洗后，所得传感器即为miRNA特异性识别的光电化学传感器，并在37℃下与20uL不同浓度的靶miRNA孵育2-3h。最后，用1×SSC冲洗电极以去除非杂交miRNA并准备用于PEC测量。
(三)光化学传感器的miRNA检测应用
ITO/TiO2/Au NPs光阳极含巯基发夹NH2-DNA-SH序列包含与待检测miRNA序列互补配对链段，用于miRNA的检测。
在高效稳定氧化钛基光阳极的光电探测器中巯基发夹NH2-DNA-SH在ITO/TiO2/AuNPs光阳极上起连接作用，其胺基与CdTe-COOH结合。在PEC传感器“关”状态，CdTe-COOH量子点靠近ITO/TiO2/AuNPs光阳极表面，在光照下产生一个光响应信号。当靶miRNA与PEC传感器杂交后，由于发夹DNA与待检测靶miRNA-21互补配对，发夹DNA将被展开，CdTe-COOH量子点与Au-NPs之间的距离将增加，此时，PEC传感器处于其“开启”阶段，在相同的辐照下会产生另一个光响应信号。通过比较这两种光响应信号变化，参考已知浓度靶miRNA确定的工作曲线，可以确定靶miRNA的浓度。
实施例2
本实施例提供了CdTe-COOH量子点溶液的HRTEM图像(比例尺，5nm)、紫外可见光谱、荧光光谱以及动态光散射图(DLS)，如图1所示。CdTe-COOH的水溶性量子点作为PEC传感器的增敏剂，对其物理性质有一个基本的了解是很重要的。图1的A图显示CdTe-COOH量子点的HRTEM图像。动态光散射(DLS)剖面描述了这些量子点在去离子水中的尺寸分布(图1的C图)，平均直径约为3.0±0.8nm，分布较为均匀。如图1的B图所示，CdTe-COOH量子点的紫外可见吸收光谱在481nm处显示吸收峰，吸收边为530nm。此外，CdTe量子点的荧光发射光谱在526nm处出现发射峰。MPA修饰的CdTe-COOH量子点在PBS缓冲液和去离子水中具有良好的溶解性，有利于在GHS和EDC条件下与NH2-DNA的反应。
本实施例对制备的电极进行了SEM测试，如图2所示。图2的A图表示AuNPs在TiO2膜上电化学沉积的典型i-t曲线。沉积电位为0.3v(电流约为20uA)，沉积时间为3600s。很明显，沉积过程是在一个非常稳定的电流下进行的，这意味着ITO/TiO2衬底处于良好的条件并产生了非常均匀的沉积结果。如图2的B图所示，可以看到电沉积的金纳米颗粒均匀分布在(直径为ca 3.5μm)的TiO2的光滑表面上。该结果表明，该方法是优异的电极制造方法。
此外，本实施例也提供了沉积的ITO/TiO2/AuNPs的SEM图像，如图3所示。图3的a图显示了由大量金纳米粒子组成的大型金团簇的高倍图像。在TiO2薄膜上还存在一些小且孤立金纳米粒子。与图3的a图所示样品对应的O(图3的b图)、Ti(图3的c图)和Au(图3的d图)的EDS分析表明，AuNPs已成功沉积在TiO2表面。图3的d图显示了几个孤立的Au信号，表明存在一些孤立的小AuNPs，这与图3的a图和图2的B图所示的观察结果非常一致。因此，不仅较大的金纳米团簇，而且这些小的AuNPs可以作为巯基发夹NH2-DNA与该光电阳极结合的锚定点，保证了探针DNA的生物结合效率。
实施例2
miRNA识别的准确性和灵敏度也是miRNA-PEC生物传感器的一个重要参数。为了验证我们的PEC传感器的检测特异性，本实施例提供了ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA/CdTe生物传感器对三个序列(包括靶miRNAs(a))、单基错配miRNA(b)和完全错配miRNA(c))检测性能的比较。测量的光电流变化(ΔI)定义为在分析物存在和不存在分析物的情况下测量的光电流之间的差异。如图4的A图所示，靶miRNA(a)的光电流变化(ΔIa)约为单基失配miRNA(b)的(ΔIb)的两倍，约为完全失配miRNA(c)的(ΔIc)的15倍。实验结果表明，该传感器具有良好的检测特异性。
所研制的PEC生物传感器在含0.1MAA的0.1M PBS(pH 7.4)中进行稳定性试验，而0和100pM浓度的靶miRNA均与PEC生物传感器一起孵育。如图4的B图和C图所示，在光开关间隔5s的28个周期中，辐照打开和关闭时，没有观察到光电流响应的显著变化(无靶miRNA和有靶miRNA的PEC传感器的RSD分别为1.5％和1.7％)。这些结果表明ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA/CdTe生物传感器具有良好的稳定性、重复性和快速的光子电流响应率。
为了评价这种光电化学检测方法的适用性，对其进行了人血清miRNA的检测，如表1所示。为了制备血清样品，miRNA被正常人血清稀释以模拟真实样品中的环境。作为对照，将0.1mPBS(pH＝7.4)中的miRNA稀释至与人血清中相同的浓度。将稀释后的miRNAs样品与ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA/CdTe孵育后，同时记录光电流响应信号的变化。如下正常人血清miRNA-21恢复力的检测表所示，每个样品的平均回收率在96.3％到106％之间，相对标准误差在3.5％到7.7％之间。这些结果表明，所制备的光电化学传感器具有良好的可靠性，在生物样品中具有检测miRNA的潜力。
表1为正常人血清样中miRNA-21加入回收检测结果
Figure BDA0002508334970000071
所有测试结果表明，本实施例所涉及的一种顺序沉积策略，以获得可靠的基本光活性矩阵。利用所制备的光电阳极，展示了一种具有光电流导通特性的光电化学传感器。由于其可靠性、灵敏度、特异性和重现性，所提出的PEC生物传感器在检测微量miRNA方面显示出巨大的潜力。本实施例的光活性基质的PEC传感器，可以为其它的PEC分析在未来的生物和医学研究开辟新的道路。

Claims (5)

1.一种基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)清洗ITO切片：先将ITO切片依次放在丙酮、乙醇、超纯水溶液中超声处理；再用乙醇棉球擦拭后用超纯水冲洗干净，将ITO一面朝上放置在培养皿中退火，最后将ITO切片取出进行等离子体和臭氧处理；
(2)在处理后的ITO切片上旋涂钛酸四异丙酯、钛酸丁酯或钛酸乙酯前驱体，随后，将旋涂后的ITO基片退火，得到ITO/TiO2电极；
(3)将ITO/TiO2电极冷却至室温后，进行原位金纳米颗粒负载，得ITO/TiO2/Au NPs光阳极。
2.根据权利要求1所述的基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中原位金纳米颗粒负载的方法为：将30-150nm的金纳米粒子滴涂在ITO/TiO2电极上，形成金纳米粒子层，在室温下干燥ITO/TiO2/Au NPs阳极，最后，氮气气氛下，退火，再次干燥、活化电极，冷却至室温后形成稳定致密的ITO/TiO2/Au NPs光阳极。
3.根据权利要求1所述的基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中原位金纳米颗粒负载的方法为：在TiO2薄膜上原位电化学沉积金纳米粒子，待电沉积结束，以纯净水清洗电极后，将生长金纳米颗粒的电极，在室温下干燥，最后，氮气气氛下，退火，再次干燥、活化电极，冷却至室温后形成稳定致密的ITO/TiO2/Au NPs光阳极。
4.根据权利要求1所述的基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法，其特征在于：所述ITO/TiO2/AuNPs光阳极用于miRNA的检测。
5.根据权利要求4所述的基于高效稳定原位生长二氧化钛/纳米金光阳极的光电化学传感器制备方法，其特征在于：所述检测方法为：
(1)将含巯基发夹NH2-DNA-SH滴涂在ITO/TiO2/Au NPs电极上，摇瓶中孵育；
(2)孵育完成后，用Tris-HCl缓冲液冲洗ITO/TiO2/Au NPs电极，从基底上清除未共价连接的发夹NH2-DNA-SH，得到ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA电极；
(3)将N-羟基丁二酰亚胺(NHS)加入到巯基乙酸或巯基丙酸修饰的CdTe量子点(CdTe-COOH QDs)中，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；
(4)将步骤(3)活化的CdTe-COOH量子点溶液滴涂在ITO/TiO2/AuNPs-NH2-DNA电极上，摇瓶中孵育，随后，用PBS缓冲液冲洗电极，再用6-巯基己醇(MCH)孵育电极，以封闭电极上的非特异性结合位点，防止假阳性信号的产生；
(5)用Tris-HCl缓冲液冲洗后，所得传感器即为miRNA特异性检测的光电化学传感器，并在不同浓度的靶miRNA孵育，最后，用SSC冲洗电极去除非杂交miRNA并用于PEC测量。
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