CN110702757A - 一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110702757A
CN110702757A CN201910831897.5A CN201910831897A CN110702757A CN 110702757 A CN110702757 A CN 110702757A CN 201910831897 A CN201910831897 A CN 201910831897A CN 110702757 A CN110702757 A CN 110702757A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sdna
nps
solution
apt
electrochemical
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910831897.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110702757B (zh
Inventor
由天艳
申秀丽
刘�东
朱成喜
李玉叶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN201910831897.5A priority Critical patent/CN110702757B/zh
Publication of CN110702757A publication Critical patent/CN110702757A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110702757B publication Critical patent/CN110702757B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/305—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells optically transparent or photoresponsive electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物传感检测技术领域，涉及一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用。具体为首次提出一种基于电化学和光电化学两种方法的新型双比率适配体传感器用于链霉素(STR)的特异性检测。步骤如下：步骤1、金纳米粒子(Au NPs)的制备及杂交链式反应中各核苷酸链碱基的设计；步骤2、基于电化学和光电化学双比率适配体传感器的构建。本发明构建的基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器，为减小外界环境影响、链霉素的准确及宽范围检测提供有效途径。

Description

一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方 法及应用
技术领域
本发明属于生物传感检测技术领域，涉及基于一种电化学(EC)和光电化学(PEC)双比率传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB)体系的链霉素双比率传感器的制备方法及应用。
背景技术
链霉素(STR)，是一种氨基糖苷类抗生素，由于其杀菌效果好，价格低廉，因此，其用药频繁、超量用药等滥用问题日益突出，造成药物残留在农作物、水体和土壤中。长期摄入含有链霉素残留的瓜果、蔬菜、农产品等会直接或间接威胁人、畜健康，研究还表明农用链霉素具有潜在致畸作用。因此，对链霉素的检测很有必要。
采用两种检测方法同时对目标物进行分析，可得到双信号输出，更精准检测目标物，适用于残留检测分析。采用比率方法对目标物进行分析，使用两个信号的比值实现对目标物的定量检测，可以有效降低环境干扰。将双检测方法与比率方法结合构建传感器进行检测还未见报道。
发明内容
本发明旨在耦合电化学比率和电化学-光电化学比率传感技术，构筑一种基于Fc和MB体系的STR双比率适配体传感器。具体涉及基于Fc和MB体系的链霉素双比率适配体传感器的制备及应用。
一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)金纳米粒子(Au NPs)的制备
首先，配制0.1mol·L-1氯金酸溶液和100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液。取200μL0.1mol·L-1氯金酸溶液和25mL超纯水置于三颈烧瓶中,油浴加热至其沸腾完全。然后加入0.25mL 100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液，继续反应15min，自然冷却至室温，避光放置于4℃冰箱中备用。
(2)氧化铟锡玻璃电极的预处理：将氧化铟锡玻璃电极在1mol/L NaOH溶液中煮沸10-20min,依次在无水乙醇和超纯水中超声后在空气中干燥，其中，氧化铟锡玻璃电极的直径为6毫米(d＝6mm ITO)。
(3)杂交链式反应中各核苷酸链的碱基的设计：
sDNA的5’端标记巯基(-SH)，以与Au NPs结合从而实现sDNA的固定，
Fc-Apt的3’端标记Fc，以监测链霉素适配体的离去过程，
Fc-rp-Fc的5’端和3’端分别标记Fc，以增强Fc的信号强度，
根据链霉素适配体的已知序列及碱基互补配对原则设计sDNA、Fc-rp-Fc、Fc-Apt、HP1和HP2的碱基对序列如下：
sDNA:5’-SH-TTT TTT TCA GCG GCA GAA ACA AAG CAG AAC ACC AGA C-3’
Fc-rp-Fc:5’-Fc-CTGCCGCTGAAAA-Fc-3’
Fc-Apt:5’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTTTCTGTCGGGTCGT-Fc-3’
HP1:5’-GCAGAACACCAGAGCTAGTGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTC-3’
HP2:5’-TCGTAGCTCTGGTGTTCTGCGAACAAAGCAGAACACCAGA-3’
将核苷酸链sDNA、Fc-rp-Fc和Fc-Apt进行等物质的量混合，在95～105℃下退火处理3-10min形成稳定的杂化结构Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA；
将核苷酸链HP1和HP2在90～100℃退火处理3～10min形成稳定的发夹结构，处理后的HP1和HP2溶液等物质的量混合形成HP1和HP2发夹结构的混合溶液。
(4)将5-20μL 2-7nmol/L的Au NPs的水溶液修饰到步骤(2)制备的氧化铟锡玻璃电极表面，并在空气中干燥；此时，产品标记为Au NPs/ITO。
(5)在4℃条件下，将10-20μL步骤(3)制备的Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA杂化结构在步骤(4)修饰好的电极上作用6-10h，通过金巯键的作用固定在电极表面，此时，产品标记为Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(6)将步骤(5)得到的产品Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO修饰5-15μL1mmol/L巯基己醇(MCH)，孵育30-60min，以封闭Au NPs未结合的特异性位点；继续修饰10-20μL 1.0×10-15-1.0×10-2mol/L STR溶液中，室温下孵育30-90min,之后用pH为7.0-8.0的PBS对产品进行清洗，此时，产品标记为Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(7)将10-20μL步骤(3)制备的HP1和HP2发夹结构的混合溶液在步骤(6)修饰好的电极上，室温下孵育1.5-3h，此时，得到的产品标记为HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(8)将步骤(7)制得的产品HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO分别修饰10-20μL 1-5μmol/L的MB溶液，室温下孵育5-10min,之后用pH为7.0-8.0的PBS对产品进行清洗，得到链霉素的电化学和光电化学双比率适配体传感器。
将本发明制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由CHI 660E电化学工作站记录电化学信号，PLS-SXM 300/300UV氙灯和CHI 660E电化学工作站检测和记录光电化学信号。在0.1M PBS(pH＝6.0-8.5)缓冲溶液中进行测试。外加偏置电压范围0.0-0.5V。利用微分脉冲伏安法和电流-时间曲线法检测工作电极相应的电化学峰信号和光电化学峰信号，以MB的光电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号和MB的电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号分别为纵坐标，对应链霉素浓度的log取值为横坐标，分别建立相应的标准曲线用于实际样品中链霉素浓度的检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次将电化学比率与电化学-光电化学双方法比率相结合，使得传感器兼具电化学方法灵敏度高和光电化学方法背景噪音小的优点的同时，具备比率方法精准度高的优点。
(2)引入链霉素适配体作为特异性识别元件，可提高链霉素适配体传感器的选择性，降低了与链霉素STR有类似结构试剂的干扰，实现对水体中链霉素STR的特异性分析。
(3)引入杂交链式反应，基于发生杂交链式反应后的DNA双链可吸附更多的MB，实现MB的信号放大，拓宽对STR的检测范围。
(4)本发明构建的双比率适配体传感器用于链霉素STR的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽，为1.0×10-11–1.0×10-4mol·L-1。
附图说明
图1是双比率适配体传感器制备工艺过程图。
图2(A)STR孵育时间的优化；(B)杂交链式反应发生时间的优化。
图3(A)不同浓度STR对数所对应MB的电化学信号和Fc的电化学信号，STR浓度：a-g的浓度依次为1.0×10-11,1.0×10-10,1.0×10-9,1.0×10-8,1.0×10-7和1.0×10-6,1.0×10-5mol/L；(B)MB电化学信号和Fc电化学信号(IFc-EC)的比值与不同浓度链霉素STR对数与之间构建的线性关系。
图4(A)不同浓度STR对数所对应的MB的光电化学和Fc的电化学信号，STR浓度：a-f的浓度依次为1.0×10-9,1.0×10-8,1.0×10-7,1.0×10-6和1.0×10-5,1.0×10-4mol/L；(B)MB光电化学信号(IMB-PEC)和Fc电化学信号(IFc-EC)的比值与不同浓度链霉素STR对数与之间构建的线性关系。
图5(A)电化学比率适配体传感器的选择性能，图中干扰物质为环丙沙星，卡那霉素和庆大霉素；(B)电化学比率适配体传感器不同电极间的稳定性。
图6(A)电化学-光电化学双方法比率适配体传感器的选择性能，图中干扰物质为环丙沙星，卡那霉素和庆大霉素；(B)电化学-光电化学双方法比率适配体传感器不同电极间的稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
实施例1
按照图1所述的制备工艺：
(1)Au NPs的制备
首先，配制0.1mol·L-1氯金酸溶液和100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液。取200μL0.1mol·L-1氯金酸溶液和25mL超纯水置于三颈烧瓶中,油浴加热至其沸腾完全。然后加入0.25mL 100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液，继续反应15min，自然冷却至室温，避光放置于4℃冰箱中备用。
(2)氧化铟锡玻璃电极的预处理：将氧化铟锡玻璃电极在1mol/L NaOH溶液中煮沸10min,依次在无水乙醇和超纯水中超声后在空气中干燥，其中，氧化铟锡玻璃电极的直径为6毫米(d＝6mm ITO)。
(3)杂交链式反应中各核苷酸链的碱基的设计，sDNA的5’端标记巯基(-SH)以与AuNPs结合从而实现sDNA的固定，Fc-Apt的3’端标记Fc以监测链霉素适配体的离去过程，Fc-rp-Fc的5’端和3’端分别标记Fc以增强Fc的信号强度、根据链霉素适配体的已知序列及碱基互补配对原则设计sDNA、Fc-rp-Fc、HP1和HP2的碱基对序列如下：
sDNA:5’-SH-TTT TTT TCA GCG GCA GAA ACA AAG CAG AAC ACC AGA C-3’
Fc-rp-Fc:5’-Fc-CTGCCGCTGAAAA-Fc-3’
Fc-Apt:5’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTTTCTGTCGGGTCGT-Fc-3’
HP1:5’-GCAGAACACCAGAGCTAGTGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTC-3’
HP2:5’-TCGTAGCTCTGGTGTTCTGCGAACAAAGCAGAACACCAGA-3’
将核苷酸链sDNA、Fc-rp-Fc和Fc-Apt进行等物质的量混合，在95℃下退火处理3min形成稳定的杂化结构(Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA)；将核苷酸链HP1和HP2在90℃退火处理3min形成稳定的发夹结构，处理后的HP1和HP2溶液等物质的量混合形成HP1和HP2发夹结构的混合溶液。
(4)将5μL 2nmol/L的Au NPs的水溶液修饰到步骤(2)制备的氧化铟锡玻璃电极表面，并在空气中干燥。此时，产品标记为Au NPs/ITO。
(5)在4℃条件下，将10μL步骤(3)制备的Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA杂化结构在步骤(4)修饰好的电极上作用6h，通过金巯键的作用固定在电极表面，此时，产品标记为Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(6)将步骤(5)得到的产品Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO修饰5μL 1mmol/L巯基己醇(MCH)，孵育30min，以封闭Au NPs未结合的特异性位点；继续修饰10μL1.0×10-15-1.0×10-2mol/L STR溶液中，室温下孵育30-90min,之后用pH为7.0的PBS对产品进行清洗，此时，产品标记为Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(7)将10μL步骤(3)制备的HP1和HP2发夹结构的混合溶液在步骤(6)修饰好的电极上，室温下孵育1.5h，此时，得到的产品标记为HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(8)将步骤(7)制得的产品HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO分别修饰10μL1μmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液，室温下孵育5min,之后用pH为7.0的PBS对产品进行清洗，得到链霉素的电化学和光电化学双比率适配体传感器。
将本实施例制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由CHI 660E电化学工作站记录电化学信号，PLS-SXM 300/300UV氙灯和CHI 660E电化学工作站检测和记录光电化学信号。在0.1M PBS(pH＝6.0)缓冲溶液中进行测试。外加偏置电压范围0.0V。利用微分脉冲伏安法和电流-时间曲线法检测工作电极相应的电化学峰信号和光电化学峰信号，以MB的光电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号和MB的电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号分别为纵坐标，对应链霉素浓度的log取值为横坐标，分别建立相应的标准曲线用于实际样品中链霉素浓度的检测。
实施例2
(1)Au NPs的制备
首先，配制0.1mol·L-1氯金酸溶液和100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液。取200μL0.1mol·L-1氯金酸溶液和25mL超纯水置于三颈烧瓶中,油浴加热至其沸腾完全。然后加入0.25mL 100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液，继续反应15min，自然冷却至室温，避光放置于4℃冰箱中备用。
(2)氧化铟锡玻璃电极的预处理：将氧化铟锡玻璃电极在1mol/L NaOH溶液中煮沸15min,依次在无水乙醇和超纯水中超声后在空气中干燥，其中，氧化铟锡玻璃电极的直径为6毫米(d＝6mm ITO)。
(3)杂交链式反应中各核苷酸链的碱基的设计，sDNA的5’端标记巯基(-SH)以与AuNPs结合从而实现sDNA的固定，Fc-Apt的3’端标记Fc以监测链霉素适配体的离去过程，Fc-rp-Fc的5’端和3’端分别标记Fc以增强Fc的信号强度、根据链霉素适配体的已知序列及碱基互补配对原则设计sDNA、Fc-rp-Fc、HP1和HP2的碱基对序列如下：
sDNA:5’-SH-TTT TTT TCA GCG GCA GAA ACA AAG CAG AAC ACC AGA C-3’
Fc-rp-Fc:5’-Fc-CTGCCGCTGAAAA-Fc-3’
Fc-Apt:5’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTTTCTGTCGGGTCGT-Fc-3’
HP1:5’-GCAGAACACCAGAGCTAGTGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTC-3’
HP2:5’-TCGTAGCTCTGGTGTTCTGCGAACAAAGCAGAACACCAGA-3’
将核苷酸链sDNA、Fc-rp-Fc和Fc-Apt进行等物质的量混合，在95℃下退火处理3min形成稳定的杂化结构(Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA)；将核苷酸链HP1和HP2在90℃退火处理3min形成稳定的发夹结构，处理后的HP1和HP2溶液等物质的量混合形成HP1和HP2发夹结构的混合溶液。
(4)将10μL 5nmol/L的Au NPs的水溶液修饰到步骤(2)制备的氧化铟锡玻璃电极表面，并在空气中干燥。此时，产品标记为Au NPs/ITO。
(5)在4℃条件下，将15μL步骤(3)制备的Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA杂化结构在步骤(4)修饰好的电极上作用8h，通过金巯键的作用固定在电极表面，此时，产品标记为Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(6)将步骤(5)得到的产品Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO修饰10μL 1mmol/L巯基己醇(MCH)，孵育45min，以封闭Au NPs未结合的特异性位点；继续修饰15μL1.0×10-15-1.0×10-2mol/L STR溶液中，室温下孵育60min,之后用pH为7.5的PBS对产品进行清洗，此时，产品标记为Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(7)将15μL步骤(3)制备的HP1和HP2发夹结构的混合溶液在步骤(6)修饰好的电极上，室温下孵育2h，此时，得到的产品标记为HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(8)将步骤(7)制得的产品HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO分别修饰15μL2μmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液，室温下孵育8min,之后用pH为7.5的PBS对产品进行清洗，得到链霉素的电化学和光电化学双比率适配体传感器。
将本实施例制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由CHI 660E电化学工作站记录电化学信号，PLS-SXM 300/300UV氙灯和CHI 660E电化学工作站检测和记录光电化学信号。在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试。外加偏置电压范围0.2V。利用微分脉冲伏安法和电流-时间曲线法检测工作电极相应的电化学峰信号和光电化学峰信号，以MB的光电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号和MB的电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号分别为纵坐标，对应链霉素浓度的log取值为横坐标，分别建立相应的标准曲线用于实际样品中链霉素浓度的检测。
实施例3
(1)Au NPs的制备
首先，配制0.1mol·L-1氯金酸溶液和100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液。取200μL0.1mol·L-1氯金酸溶液和25mL超纯水置于三颈烧瓶中,油浴加热至其沸腾完全。然后加入0.25mL 100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液，继续反应15min，自然冷却至室温，避光放置于4℃冰箱中备用。
(2)氧化铟锡玻璃电极的预处理：将氧化铟锡玻璃电极在1mol/L NaOH溶液中煮沸20min,依次在无水乙醇和超纯水中超声后在空气中干燥，其中，氧化铟锡玻璃电极的直径为6毫米(d＝6mm ITO)。
(3)杂交链式反应中各核苷酸链的碱基的设计，sDNA的5’端标记巯基(-SH)以与AuNPs结合从而实现sDNA的固定，Fc-Apt的3’端标记Fc以监测链霉素适配体的离去过程，Fc-rp-Fc的5’端和3’端分别标记Fc以增强Fc的信号强度、根据链霉素适配体的已知序列及碱基互补配对原则设计sDNA、Fc-rp-Fc、HP1和HP2的碱基对序列如下：
sDNA:5’-SH-TTT TTT TCA GCG GCA GAA ACA AAG CAG AAC ACC AGA C-3’
Fc-rp-Fc:5’-Fc-CTGCCGCTGAAAA-Fc-3’
Fc-Apt:5’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTTTCTGTCGGGTCGT-Fc-3’
HP1:5’-GCAGAACACCAGAGCTAGTGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTC-3’
HP2:5’-TCGTAGCTCTGGTGTTCTGCGAACAAAGCAGAACACCAGA-3’
将核苷酸链sDNA、Fc-rp-Fc和Fc-Apt进行等物质的量混合，在95℃下退火处理3min形成稳定的杂化结构(Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA)；将核苷酸链HP1和HP2在90℃退火处理3min形成稳定的发夹结构，处理后的HP1和HP2溶液等物质的量混合形成HP1和HP2发夹结构的混合溶液。
(4)将20μL 3nmol/L的Au NPs的水溶液修饰到步骤(2)制备的氧化铟锡玻璃电极表面，并在空气中干燥。此时，产品标记为Au NPs/ITO。
(5)在4℃条件下，将20μL步骤(3)制备的Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA杂化结构在步骤(4)修饰好的电极上作用10h，通过金巯键的作用固定在电极表面，此时，产品标记为Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(6)将步骤(5)得到的产品Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO修饰15μL 1mmol/L巯基己醇(MCH)，孵育60min，以封闭Au NPs未结合的特异性位点；继续修饰20μL1.0×10-15-1.0×10-2mol/L STR溶液中，室温下孵育90min,之后用pH为8.0的PBS对产品进行清洗，此时，产品标记为Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(7)将20μL步骤(3)制备的HP1和HP2发夹结构的混合溶液在步骤(6)修饰好的电极上，室温下孵育3h，此时，得到的产品标记为HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(8)将步骤(7)制得的产品HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO分别修饰20μL5μmol/L的亚甲基蓝(MB)溶液，室温下孵育10min,之后用pH为8.0的PBS对产品进行清洗，得到链霉素的电化学和光电化学双比率适配体传感器。
将本实施例制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由CHI 660E电化学工作站记录电化学信号，PLS-SXM 300/300UV氙灯和CHI 660E电化学工作站检测和记录光电化学信号。在0.1M PBS(pH＝8.5)缓冲溶液中进行测试。外加偏置电压范围0.5V。利用微分脉冲伏安法和电流-时间曲线法检测工作电极相应的电化学峰信号和光电化学峰信号，以MB的光电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号和MB的电化学峰信号比上Fc的电化学峰信号分别为纵坐标，对应链霉素浓度的log取值为横坐标，分别建立相应的标准曲线用于实际样品中链霉素浓度的检测。
图2(A)中，可以看出，30–50min内，随链霉素孵育时间的增加，Fc的电化学信号不断减小，证明Fc标记的链霉素适配体的离去过程；60min以后，随链霉素孵育时间的增加，Fc的电化学信号基本不变，证明适配体的基本全部离去。因而选择60min作为链霉素的孵育时间。
图2(B)中，可以看出，60–90min内，随杂交链式反应发生时间的增加，MB的电化学信号不断增加，证明杂交链式反应中DNA链的不断生长；120min以后，随杂交链式反应发生时间的增加，MB的电化学信号基本不变，证明杂交链式反应不在发生进一步增长。因而选择120min作为杂交链式反应发生的时间。
从图3(A)中，可以看出，随着链霉素STR浓度的增加(a-g的浓度依次为1.0×10-11,1.0×10-10,1.0×10-9,1.0×10-8,1.0×10-7和1.0×10-6,1.0×10-5mol/L)，Fc的电化学信号逐渐降低，MB的电信号逐渐增强，这应归因于链霉素STR与其适配体的特异性结合。
从图3(B)中，可以看出，MB电化学信号与Fc电化学信号的比值(IMB-EC/Fc-EC)与链霉素STR浓度的对数值(logC)绘制的标准曲线为IMB-EC/Fc-EC＝4.51+0.25logC(R2＝0.9980),线性范围为1.0×10-11–1.0×10-5mol/L，检测限为3.3×10-12mol/L。
从图4(A)中，可以看出，随着链霉素STR浓度的增加(a-f的浓度依次为1.0×10-9,1.0×10-8,1.0×10-7,1.0×10-6和1.0×10-5,1.0×10-4mol/L)，Fc的电化学信号逐渐降低，MB的光电化学信号逐渐增强，这应归因于链霉素STR与其适配体的特异性结合。
从图4(B)中，可以看出，MB光电化学信号与Fc电化学信号的比值(IMB-PEC/Fc-EC)与链霉素STR浓度的对数值(logC)绘制的标准曲线为IMB-PEC/Fc-EC＝1.46+0.12logC(R2＝0.9987),线性范围为1.0×10-9–1.0×10-4mol/L，检测限为3.3×10-10mol/L。
从图5(A)中，可以看出，与链霉素STR具有类似结构的干扰物质(环丙沙星，卡那霉素和庆大霉素)引起的电化学比率改变值可以忽略不计，证明该传感器的电化学比率方法具有优异的选择性。
从图5(B)中，可以看出，六个电极对链霉素STR的电化学比率检测结果基本一致，六个电极测定结果的相对标准偏差仅为1.40％，证明该传感器的电化学比率方法具有较好的重现性。
从图5(A)中，可以看出，与链霉素STR具有类似结构的干扰物质(环丙沙星，卡那霉素和庆大霉素)引起的电化学-光电化学双方法比率改变值可以忽略不计，证明该传感器的电化学-光电化学双方法比率具有优异的选择性。
从图5(B)中，可以看出，六个电极对链霉素STR的电化学-光电化学双方法比率检测结果基本一致，六个电极测定结果的相对标准偏差仅为1.40％，证明该传感器的电化学-光电化学双方法比率具有较好的重现性。

Claims (10)

1.一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备金纳米粒子(Au NPs)水溶液，备用；
(2)氧化铟锡玻璃(ITO)电极经预处理后，备用；
(3)设计杂交链式反应中各核苷酸链的碱基：sDNA，Fc-rp-Fc，Fc-Apt，HP1和HP2；
然后，将sDNA、Fc-rp-Fc和Fc-Apt进行混合，在一定温度下退火处理一定时间形成稳定的杂化结构Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA；
将HP1和HP2分别在一定温度下退火处理一定时间形成稳定的发夹结构，处理后的HP1和HP2溶液等物质的量混合形成HP1和HP2发夹结构的混合溶液；
(4)将步骤(1)制备的Au NPs水溶液修饰到步骤(2)预处理后的氧化铟锡玻璃电极表面，并在空气中干燥，此时，产品标记为Au NPs/ITO；
(5)在一定温度下，将步骤(3)制备的Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA杂化结构在步骤(4)修饰好的电极上作用一定时间，通过金巯键的作用固定在电极表面，此时，产品标记为Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(6)将步骤(5)得到的产品Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO修饰一定量的巯基己醇(MCH)，孵育一定时间，以封闭Au NPs未结合的特异性位点；继续修饰不同浓度STR溶液，室温下孵育一定时间,之后用PBS对产品进行清洗，此时，产品标记为Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(7)将步骤(3)制备的HP1和HP2发夹结构的混合溶液在步骤(6)修饰好的电极上，室温下孵育一定时间，此时，得到的产品标记为HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO；
(8)将步骤(7)制得的产品HP2/HP1…/Fc-rp-Fc/sDNA/Au NPs/ITO修饰一定浓度的亚甲基蓝(MB)溶液，室温下孵育一定时间,之后用PBS对产品进行清洗，得到链霉素的电化学和光电化学双比率适配体传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，制备Au NPs水溶液的步骤为：首先，配制0.1mol·L-1氯金酸溶液和100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液；取200μL 0.1mol·L-1氯金酸溶液和25mL超纯水置于三颈烧瓶中,油浴加热至其沸腾完全；然后加入0.25mL100mg·mL-1柠檬酸三钠溶液，继续反应15min，自然冷却至室温，避光放置于4℃冰箱中备用。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，氧化铟锡玻璃电极的预处理步骤为：将氧化铟锡玻璃电极在1mol/L NaOH溶液中煮沸10-20min,依次在无水乙醇和超纯水中超声后在空气中干燥，其中，氧化铟锡玻璃电极的直径为6毫米。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，sDNA、Fc-rp-Fc，Fc-Apt，HP1和HP2的序列分别为：
sDNA:5’-SH-TTT TTT TCA GCG GCA GAA ACA AAG CAG AAC ACC AGA C-3’；
Fc-rp-Fc:5’-Fc-CTGCCGCTGAAAA-Fc-3’；
Fc-Apt:5’-GGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTTTCTGTCGGGTCGT-Fc-3’；
HP1:5’-GCAGAACACCAGAGCTAGTGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTC-3’；
HP2:5’-TCGTAGCTCTGGTGTTCTGCGAACAAAGCAGAACACCAGA-3’；
将核苷酸链sDNA、Fc-rp-Fc和Fc-Apt等物质的量进行混合，作用温度为95～105℃，作用时间为3～10min；
将核苷酸链HP1和HP2分别在90～100℃进行退火处理，作用时间为3～10min，退火处理后将HP1和HP2等物质的量混合形成HP1和HP2发夹结构的混合溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，Au NPs溶液的浓度为2-7nmol/L，修饰量为5-20μL。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，Fc-Apt/Fc-rp-Fc/sDNA杂化结构的用量为10-20μL，作用时间为6-10h，作用温度为4℃。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，MCH溶液的浓度为1mmol/L,修饰量为5-15μL，孵育时间为30-60min；链霉素STR溶液的修饰量为10-20μL，浓度为1.0×10-15-1.0×10-2mol/L；孵育时间为30-90min，PBS的pH为7.0-8.0。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，HP1和HP2发夹结构的混合溶液用量为10-20μL，孵育时间为1.5-3h。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，MB的浓度为1-5μmol/L，修饰量为10-20μL，孵育时间为5-10min；PBS的pH为7.0-8.0。
10.将权利要求1～9任一项所述的制备方法制得的电化学和光电化学双比率适配体传感器用于检测链霉素中的用途。
CN201910831897.5A 2019-09-04 2019-09-04 一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用 Active CN110702757B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910831897.5A CN110702757B (zh) 2019-09-04 2019-09-04 一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910831897.5A CN110702757B (zh) 2019-09-04 2019-09-04 一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110702757A true CN110702757A (zh) 2020-01-17
CN110702757B CN110702757B (zh) 2022-02-15

Family

ID=69194131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910831897.5A Active CN110702757B (zh) 2019-09-04 2019-09-04 一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110702757B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112540073A (zh) * 2020-11-13 2021-03-23 江苏大学 一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用
CN113466305A (zh) * 2021-07-23 2021-10-01 江苏大学 一种基于自增强发光材料和亚甲基蓝的双信号同时获取的比率适配体传感器的构建方法
CN114487054A (zh) * 2022-01-19 2022-05-13 江苏大学 一种基于光电-电化学协同检测展青霉素的比率传感器的制备方法
CN114524453A (zh) * 2022-01-26 2022-05-24 江苏大学 一种ZIF-8衍生的ZnO/g-C3N4的制备方法及其在土霉素传感器中的应用
CN115201296A (zh) * 2022-07-21 2022-10-18 山东理工大学 一种比率型电化学适配体传感器的制备方法
CN115219579A (zh) * 2022-07-29 2022-10-21 江苏大学 一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法及其应用
CN115219576A (zh) * 2022-07-29 2022-10-21 江苏大学 一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法及其应用
CN115219579B (zh) * 2022-07-29 2024-06-07 江苏大学 一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014027964A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Nanyang Technological University Universal biosensing and bioassay devices
CN106066358A (zh) * 2016-05-30 2016-11-02 济南大学 一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用
CN109100407A (zh) * 2018-08-24 2018-12-28 江苏大学 一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备
CN109870497A (zh) * 2019-03-25 2019-06-11 天津科技大学 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法
CN109991290A (zh) * 2019-03-22 2019-07-09 河南大学 以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014027964A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Nanyang Technological University Universal biosensing and bioassay devices
CN106066358A (zh) * 2016-05-30 2016-11-02 济南大学 一种高灵敏链霉素电化学适配体传感器的制备方法及应用
CN109100407A (zh) * 2018-08-24 2018-12-28 江苏大学 一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备
CN109991290A (zh) * 2019-03-22 2019-07-09 河南大学 以异质结和金纳米粒子间能量共振转移为机理的光电化学适配体传感器的构建方法
CN109870497A (zh) * 2019-03-25 2019-06-11 天津科技大学 一种检测黄曲霉毒素b1电化学适配体传感器的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANGYAO ZHANG等: "Novel 3D Printed Device for Dual-Signaling Ratiometric Photoelectrochemical Readout of Biomarker Using λ‑Exonuclease Assisted Recycling Amplification", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
ZHENLI QIU等: "Dual-Channel Photoelectrochemical Ratiometric Aptasensor with up-Converting Nanocrystals Using Spatial-Resolved Technique on Homemade 3D Printed Device", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112540073A (zh) * 2020-11-13 2021-03-23 江苏大学 一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用
CN112540073B (zh) * 2020-11-13 2022-06-21 江苏大学 一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用
CN113466305A (zh) * 2021-07-23 2021-10-01 江苏大学 一种基于自增强发光材料和亚甲基蓝的双信号同时获取的比率适配体传感器的构建方法
CN114487054A (zh) * 2022-01-19 2022-05-13 江苏大学 一种基于光电-电化学协同检测展青霉素的比率传感器的制备方法
CN114487054B (zh) * 2022-01-19 2023-08-29 江苏大学 一种基于光电-电化学协同检测展青霉素的比率传感器的制备方法
CN114524453A (zh) * 2022-01-26 2022-05-24 江苏大学 一种ZIF-8衍生的ZnO/g-C3N4的制备方法及其在土霉素传感器中的应用
CN114524453B (zh) * 2022-01-26 2024-04-09 江苏大学 一种ZIF-8衍生的ZnO/g-C3N4的制备方法及其在土霉素传感器中的应用
CN115201296A (zh) * 2022-07-21 2022-10-18 山东理工大学 一种比率型电化学适配体传感器的制备方法
CN115201296B (zh) * 2022-07-21 2024-04-05 山东理工大学 一种比率型电化学适配体传感器的制备方法
CN115219579A (zh) * 2022-07-29 2022-10-21 江苏大学 一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法及其应用
CN115219576A (zh) * 2022-07-29 2022-10-21 江苏大学 一种基于光调控灵敏度的比率电化学适配体传感器的构建方法及其应用
CN115219579B (zh) * 2022-07-29 2024-06-07 江苏大学 一种基于交替光激发调控亚甲基蓝电子传递的电化学传感器的构建方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110702757B (zh) 2022-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110702757B (zh) 一种基于电化学和光电化学的双比率适配体传感器的制备方法及应用
US10605761B2 (en) Electrochemical biosensor based on aptamer/nano silver probe and EXO I enzyme
Mahato et al. Clinically comparable impedimetric immunosensor for serum alkaline phosphatase detection based on electrochemically engineered Au-nano-Dendroids and graphene oxide nanocomposite
Wang et al. A novel hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized on colloidal Au modified ITO electrode
CN110618177B (zh) 一种链霉素电化学-光电化学双方法比率适配体传感器的制备方法及应用
Chauhan et al. Immobilization of lysine oxidase on a gold–platinum nanoparticles modified Au electrode for detection of lysine
Qian et al. A novel label-free and enzyme-free electrochemical aptasensor based on DNA in situ metallization
CN106404863B (zh) 一种活体在线检测植物玉米素的微电极生物传感器及其应用
Wu et al. A novel signal-on DNAzyme-based electrochemiluminescence, sensor for Pb2+
He et al. Electrochemical aptameric sensor based on the Klenow fragment polymerase reaction for cocaine detection
CN109856212B (zh) 一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用
Josypčuk et al. Flow electrochemical biosensors based on enzymatic porous reactor and tubular detector of silver solid amalgam
CN104764790A (zh) 基于核酸适配体检测链霉素的生物传感器及其制备方法
CN105466980A (zh) 一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法
CN113447552A (zh) 一种无酶葡萄糖电化学传感器及制备方法
Lović et al. Glucose sensing using glucose oxidase-glutaraldehyde-cysteine modified gold electrode
CN105259231A (zh) 用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法
CN113155917A (zh) 一种用于检测赭曲霉毒素a或黄曲霉毒素b1的光助双极自供能传感器的构建方法
Yang et al. Electrochemical determination of trace promethazine hydrochloride by a pretreated glassy carbon electrode modified with DNA
CN105758912A (zh) 一种纳米TiO2-MoS2光电Saos-2 cell细胞传感器的制备及其应用
CN114295703B (zh) 一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器
CN111879836B (zh) 一种检测尿酸及尿酸氧化酶的电化学方法及其应用
CN105784687A (zh) 一种基于自发光激发的过氧化氢光电化学传感器的制备方法及应用
Jin et al. A sensitive thrombin aptasensor based on target circulation strategy
CN105784993B (zh) 一种莱克多巴胺电化学生物免疫传感器的制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant