CN109100407A - 一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明属于光电化学生物传感器构建领域,涉及一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备。本发明利用银二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶氮化碳纳米片修饰电极,然后用壳聚糖处理修饰了Ag/TiO2/3DNGH材料的表面,再修饰黄曲霉毒素B1适配体溶液,孵育,用磷酸缓冲溶液冲洗,然后用牛血清白蛋白封闭未结合的活性位点,再用磷酸缓冲溶液冲洗,得到基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器。银二氧化钛三维氮杂石墨烯复合材料展现了很好的光电活性和稳定性并且构建的基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器大大减小了外界和内部各种因素的干扰,提高了检测的准确性,通过太阳光驱动,更加方便快捷,能够在室外进行即时检测。
Description
技术领域
本发明属于光电化学生物传感器构建领域,涉及一种具有高灵敏度、高选择性的新型电位可析比率光电化学生物传感的方法,设计了一种由阳光驱动,笔记本电脑、USB型电化学工作站及三电极体系组成的便携式电化学传感器件。
背景技术
近年来,由于光电化学传感器(PEC)的优异特性(如:成本低、操作简单等)越来越受到人们的关注,并被广泛的应用于生物医学、食品科学、环境科学等领域。其基本原理是:利用被测物质与激发态的光电材料之间发生了电子传递而引起光电材料的光电流变化进行测定。另外,也可以根据待测物质本身的光电流对其进行定量分析。
然而,光电传感器(PEC)的定量检测通常依赖于目标物与光电活性材料或生物探针之间反应引起的光电流强度的变化。但是光电流本身可能受到其他因素的干扰。例如,光源和电极之间相对距离的变动,光源长期工作中因为散热或电压波动引起的光强的变化,缓冲液的离子强度、pH值的变化都可能会带来光电流的变化。相似地,这一问题同样存在于其他的检测技术中,例如荧光、电化学及电致化学发光传感器。为了提高传感器检测的可靠性,排除与目标物无关的环境因素的影响,近年来研究人员开发出了一系列比率荧光检测、比率电化学传感器以及比率电致化学发光传感器。而到目前为止,关于PEC比率传感的研究很少。此外,由于传统的PEC方法大多是在室内操作,具有大体积的仪器,需要提供固定的光源等缺点,于是结合以上所述并基于我们前期的工作,设计了一种便携式的电位可析比率光电化学传感器件。
我们都知道黄曲霉毒素B1(AFB1)对包括人和若干动物具有强烈的毒性,其毒性作用主要是对肝脏的损害。此外,AFB1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品,且以南方高温、高湿地区受污染最为严重,其耐热,且在280℃才可裂解,故一般烹调加工温度下难以破坏。因为在天然食物中以AFB1最为多见,危害性也最强,所以国家质检总局规定AFB1是大部分食品的必检项目之一。然而目前,传统的AFB1检测方法,包括薄层色谱法(TLC)、酶联免疫法(ELISA)以及液相色谱串联质谱法,成本高,处理时间长,并且需要一定的操作技术和复杂的设备要求。因此,开发一种快速、简单、灵敏、操作简便的方法是非常有必要的。
发明内容
本发明旨在发明一种集操作简单、灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强等优点为一体的基于比率原理阳光驱动的便携式光电化学传感器件应用于AFB1的检测。
一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备银二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料和氮化碳纳米片CNNS,备用;
首先将100mg甘氨酸、0.24g硫酸钛、30mg硝酸银和2mg氧化石墨水溶液超声混合,超声溶解后得混合溶液A,然后将混合溶液A加入到不锈钢高压釜180℃灼烧12h;冷却至室温,放置2天,多次换水清洗除去未反应的物质;最后,冷冻干燥2天即可,从而制备了 Ag/TiO2/3DNGH。
将2g的白色三聚氰胺粉末转移到高温炉中,然后将炉的温度升至520℃,并在氩气条件下以约3℃/min的升温速率保持4小时,最后得到黄色的粉末。紧接着将以上获得的黄色粉末转移至研钵中研磨至细腻的粉末,最后称取100mg研磨后的粉末分散于100mL的的超纯水中,超声处理18h,从而制备了CNNS。
(2)首先制作具有两个工作区域的氧化铟锡电极,分别在这两个工作电极表面修饰 Ag/TiO2/3DNGH溶液和CNNS溶液,待晾干后在修饰了Ag/TiO2/3DNGH材料的表面使用壳聚糖处理,再修饰黄曲霉毒素B1适配体溶液,孵育一段时间后用磷酸缓冲溶液冲洗数次,然后用牛血清白蛋白封闭未结合的活性位点,再用磷酸缓冲溶液冲洗数次,得到电位可析比率光电化学传感器。
步骤(2)中,所述Ag/TiO2/3DNGH溶液的浓度为2mg/mL,CNNS溶液的浓度为 1.5mg/mL,壳聚糖的浓度为0.5wt%,黄曲霉毒素B1适配体溶液的浓度为2μmol/L,牛血清白蛋白的浓度为0.1%。
步骤(2)中,所述Ag/TiO2/3DNGH溶液、CNNS溶液、壳聚糖、黄曲霉毒素B1适配体溶液和牛血清白蛋白的用量比例为20μL:20μL:10μL:10μL:10μL。
步骤(2)中,所述磷酸缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲溶液,浓度为0.1mol/L, pH为7.4。
步骤(2)中,黄曲霉毒素B1适配体的序列为:5’-NH2-C6-GTT GGG CAC GTG T TGTCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCACA-3’。
将本发明制得的基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器用于检测黄曲霉毒素B1 的用途,具体步骤为:
(1)确定Ag/TiO2/3DNGH的临界电位为-0.235V,CNNS的临界电位为0.15V;
(2)引入一个新的参比电极,以及基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器均与 USB型电化学工作站连接;
(3)配制不同浓度的黄曲霉毒素B1;在太阳光驱动下,将已知浓度的黄曲霉毒素B1在CNNS的临界电位0.15V下获得一个光电流I2,该光电流的产生主要来自于修饰了黄曲霉毒素B1适配体的Ag/TiO2/3DNGH;与此同时在Ag/TiO2/3DNGH的临界电位-0.235V下获得一个光电流I1,此时光电流的产生主要来自于CNNS,通过两者光电流的比值获得检测结果,依据在0.15V下获得的光电流I2与在-0.235V下获得的光电流I1的比值和黄曲霉毒素B1浓度对数的关系绘制出黄曲霉毒素B1的标准检测线性曲线I2/I1=-2.001+0.170lg (CAFB1/ng·mL-1);
(4)将待测黄曲霉毒素B1在CNNS的临界电位0.15V下获得一个光电流I2,在 Ag/TiO2/3DNGH的临界电位-0.235V下获得一个光电流I1,获得比值I2/I1,带入步骤(3) 得出的标准检测线性曲线,即可获得待测黄曲霉毒素B1的浓度。
本发明的有益效果:
(1)本发明设计的基于比率原理的阳光驱动便携式光电化学传感器件便于携带,可以在室外操作,从而达到即时检测的效果;
(2)结合比率的方法,构建的光电化学生物传感器,为减少外界(特别是气候和光强的干扰)和自身的干扰提供了有效方法;
(3)直接利用太阳光的照射,而不需要提供额外的固定光源,更方便、快捷,且节约了成本;
(4)本发明所提出的光电化学生物传感器,实现了对黄曲霉毒素B1更简单有效的检测。
附图说明
图1为基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的示意图;
图2为Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料的典型扫描电子显微镜图像(A)和透射电镜图像 (B),(C)Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料的元素映射图(EMI),(D)从扫描电镜图获得的Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料的能谱图;
图3为Ag/TiO2/3DNGH纳米复合物的X射线衍射谱图;
图4为TiO2/3DNGH(a),Ag/TiO2/3DNGH(b)的拉曼光谱图;
图5为Ag/TiO2/3DNGH纳米复合物的X射线光电子能谱;
图6为适配体浓度(A)和黄曲霉毒素B1与适配体的结合时间(B)对光电化学传感器光电流强度的影响;
图7为CNNS(A)和Ag/TiO2/3DNGH(B)在不同电位下的光电流图;Ag/TiO2/3DNGH(a),CNNS(b)及CNNS和Ag/TiO2/3DNGH双修饰(c)在-0.235V(C)和0.15V(D)下的光电流图;
图8检测黄曲霉毒素B1的光电流图(A)和线性图(B)。
具体实施方式
具体实施中:进一步对适配体浓度及反应时间进行优化;经过实验发现,当适配体浓度以及反应时间分别为2μM和40min时光电化学传感器的效果最佳。然后在最优条件下对黄曲霉毒素B1进行光电化学检测,其浓度对数与在两种临界电位下光电流强度比值呈良好线性,这充分体现了本发明的优势。
实施例一:
1)银二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶(Ag/TiO2/3DNGH)和氮化碳纳米片(CNNS)制备
首先,将100mg甘氨酸、240mg硫酸钛和30mg硝酸银溶解在10mL氧化石墨烯中以形成均匀的溶液。然后,将制备好的溶液转移到高压釜中,并在180℃加热12小时,然后自然冷却至室温以获得银二氧化钛三维氮杂石墨烯纳米复合材料。最后将得到的纳米复合材料冷冻干燥48h。氮化碳纳米片是由2g白色三聚氰胺粉末转移到高温炉中,然后将炉温升高到520℃并在氩气条件下保持4.0小时,升温速率约为3℃/分钟获得的黄色粉末,再将该黄色粉末研磨细腻并称取100mg分散于100mL超纯水中经超声处理18h后制得。
2)适配体浓度优化
分别配不同浓度的适配体溶液(0.25μM、0.5μM、0.75μM、1μM、1.5μM、2μM和3μM) 进行检测。
3)光电化学性能测试
(a)反应溶液中包含0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4及0.1M NaOH,以氧化铟锡透明导电玻璃(ITO)电极为工作电极,Pt丝为对电极,Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极进行I-t测试;
(b)然后,将20μL(2mg/mL)Ag/TiO2/3DNGH复合材料修饰在ITO电极表面,待晾干后再将10μL适配体溶液修饰于材料表面,插入反应溶液中。进行光电流随时间变化(I-t) 测试。当适配体浓度为2μM时,可得到变化值最大的光电流(表示最优光电效果)之后随着浓度增加光电流变化值趋于稳定;
实施例二:
1)银二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶(Ag/TiO2/3DNGH)和氮化碳纳米片(CNNS)制备
首先,将100mg甘氨酸、240mg硫酸钛和30mg硝酸银溶解在10mL氧化石墨烯中以形成均匀的溶液。然后,将制备好的溶液转移到高压釜中,并在180℃加热12小时,然后自然冷却至室温以获得银二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶纳米复合材料。最后将得到的纳米复合材料冷冻干燥48h。氮化碳纳米片是由2g白色三聚氰胺粉末转移到高温炉中,然后将炉温升高到520℃并在氩气条件下保持4.0小时,升温速率约为3℃/分钟获得的黄色粉末,再将该黄色粉末研磨细腻并称取100mg分散于100mL超纯水中经超声处理18h后制得。
2)适配体与目标物结合时间优化
取浓度为1ng/mL的黄曲霉毒素B1溶液,分别与适配体反应15min、25min、35min、40min、 45min和50min后进行检测。
3)光电化学性能测试
(a)反应溶液中包含0.1M Na2HPO4、0.1M NaH2PO4及0.1M NaOH,以氧化铟锡透明导电玻璃(ITO)电极为工作电极,Pt丝为对电极,Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极进行I-t测试;
(b)然后,将20μL(2mg/mL)Ag/TiO2/3DNGH复合材料修饰在ITO电极表面,待晾干后再将10μL(1μM)适配体溶液修饰于材料表面,最后将检测物黄曲霉毒素B1修饰于上述所制ITO上,插入反应溶液中。进行光电流随时间变化(I-t)测试。当适配体与检测物反应时间为40min时,可得到变化值最大的光电流(表示最优光电效果)之后随着结合时间增加光电流变化趋于稳定;
实施例三:
1)1)银二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶(Ag/TiO2/3DNGH)和氮化碳纳米片(CNNS)制备
首先,将100mg甘氨酸、240mg硫酸钛和30mg硝酸银溶解在10mL氧化石墨烯中以形成均匀的溶液。然后,将制备好的溶液转移到高压釜中,并在180℃加热12小时,然后自然冷却至室温以获得三维石墨烯水凝胶负载的碳点纳米复合材料。最后将得到的纳米复合材料冷冻干燥48h。氮化碳纳米片是由2g白色三聚氰胺粉末转移到高温炉中,然后将炉温升高到520℃并在氩气条件下保持4.0小时,升温速率约为3℃/分钟获得的黄色粉末,再将该黄色粉末研磨细腻并称取100mg分散于100mL超纯水中经超声处理18h后制得。
2)光电检测黄曲霉毒素B1
在同一块ITO相邻两个区域分别修饰上述制备的两种纳米材料,然后在修饰了Ag/TiO2/3DNGH纳米复合物的区域修饰适配体,再分别修饰浓度为1*10-3,1*10-2,1*10-1,1,1*101,1*102,1*103cfu/mL的黄曲霉毒素B1,阳光驱动下分在0.15V和-0.235V下进行光电性能测试。当电压为0.15V时,光电流强度随着检测物浓度的增加而减小;当电压为-0.235V时,光电流强度不随检测物浓度的改变而变化。此外,检测同一浓度黄曲霉毒素B1,两种临界电位下光电流的比值与浓度的对数成良好的线性关系,这充分展现了本发明具有良好的抗干扰性和灵敏性。
图1为基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的整体装置示意图,其由笔记本电脑、USB型电化学工作站和三电极体系组成,从中可以看出,相比较通用的传感器装置,该传感器的装置简单且易于携带;
图2A为Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料的典型扫描电子显微镜图像,可明显看出三维交联孔状结构;B图透射电镜图像可观察到半径约10-25nm的Ag和TiO2纳米粒子锚定在该三维结构表面。再通过(C)Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料的元素映射图(EMI)和(D)从扫描电镜图获得的Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料的能谱图初步证明该三维材料的成功制备;
图3为Ag/TiO2/3DNGH纳米复合物的X射线衍射谱图由于(101),(004),(200),(105), (211),(204),(116),(220),(215)和(224)TiO2的晶面衍射(JCPDS No.21-1272)可观察到在 25.4°,37.9°,48.3°,54.1°,55.1°,62.9°,68.8°,70.4°,75.2°和82.9°处显示出一些明显的衍射峰(2θ),而在38.1°,44.5°,64.7°和77.5°出现的峰,分别对应于 Ag0(JCPDS No.65-2871)的立方结构的(111),(200),(220)和(311)晶面,从而进一步证明该三维材料的成功制备;
图4通过TiO2/3DNGH(a)与Ag/TiO2/3DNGH(b)拉曼光谱图的对比,有两个峰分别出现在1348和1593cm-1处,这是D和G带的特征峰且比值分别为0.96和1.14,这表明该三维材料的无序程度比较大,且由于锐钛矿型TiO2的存在,在145(Eg),399(B1g),519(A1g+B1g) 和639cm-1(Eg)出现了四个额外的峰,这也证明了该三维材料的成功制备;
图5为Ag/TiO2/3DNGH纳米复合物的X射线光电子能谱可观察到在285.4,368.0,401.5, 459.1and 531.6eV处Ag/TiO2/3DNGH纳米复合物的C 1s,Ag 3d,N1s,Ti 2p and O1s的峰进而更充分证明了材料的成功制备;
图6为适配体浓度(A)和黄曲霉毒素B1与适配体的结合时间(B)对光电化学传感器光电流强度的影响;图A中可观察到光电流强度随着适配体浓度的增加而增加,当浓度达到2μM之后趋于稳定,相似的随着黄曲霉毒素B1与适配体的结合时间的增加光电流也增加,40min后趋于稳定,以此选取2μM的适配体浓度和40min的结合实践为该过程的最优条件;
图7为CNNS(A)在0V,0.05V,0.1V,0.15V,0.2V,0.25V和Ag/TiO2/3DNGH(B)在-0.3V, -0.25V,-0.24V,-0.235V,-0.23V,-0.2V的光电流图;(C)Ag/TiO2/3DNGH(a),CNNS(b)及CNNS& Ag/TiO2/3DNGH(c)在-0.235V和(D)CNNS(a),Ag/TiO2/3DNGH(b)及CNNS& Ag/TiO2/3DNGH(c)在0.15V下的光电流图;
图8(A)分别在-0.235V(V1)和0.15V(V2)下检测黄曲霉毒素B1的光电流图和(B)在V2和 V1下光电流比值与黄曲霉毒素B1浓度对数的线性图。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
Claims (7)
1.一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备银二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶Ag/TiO2/3DNGH纳米复合材料和氮化碳纳米片CNNS,备用;
(2)首先制作具有两个工作区域的氧化铟锡电极,分别在这两个工作电极表面修饰Ag/TiO2/3DNGH溶液和CNNS溶液,待晾干后在修饰了Ag/TiO2/3DNGH材料的表面使用壳聚糖处理,再修饰黄曲霉毒素B1适配体溶液,孵育一段时间后用磷酸缓冲溶液冲洗数次,然后用牛血清白蛋白封闭未结合的活性位点,再用磷酸缓冲溶液冲洗数次,得到基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述Ag/TiO2/3DNGH溶液的浓度为2mg/mL,CNNS溶液的浓度为1.5mg/mL,壳聚糖的浓度为0.5wt%,黄曲霉毒素B1适配体溶液的浓度为2μmol/L,牛血清白蛋白的浓度为0.1%。
3.根据权利要求1所述的一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述Ag/TiO2/3DNGH溶液、CNNS溶液、壳聚糖、黄曲霉毒素B1适配体溶液和牛血清白蛋白的用量比例为20μL:20μL:10μL:10μL:10μL。
4.根据权利要求1所述的一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述磷酸缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲溶液,浓度为0.1mol/L,pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,黄曲霉毒素B1适配体的序列为:5’-NH2-C6-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCACA-3’。
6.将权利要求1~5任一项所述制备方法制得的基于比率原理阳光驱动便携式光电化学传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途。
7.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,具体步骤为:
(1)确定Ag/TiO2/3DNGH的临界电位为-0.235V,CNNS的临界电位为0.15V;
(2)引入一个新的参比电极,以及基于比率原理的阳光驱动光电化学传感器均与USB型电化学工作站连接;
(3)配制不同浓度的黄曲霉毒素B1;在太阳光下,将已知浓度的黄曲霉毒素B1在CNNS的临界电位0.15V下获得一个光电流I2,该光电流的产生主要来自于修饰了黄曲霉毒素B1适配体的Ag/TiO2/3DNGH;与此同时在Ag/TiO2/3DNGH的临界电位-0.235V下获得一个光电流I1,此时光电流的产生主要来自于CNNS,通过两者光电流的比值获得检测结果,依据在0.15V下获得的光电流I2与在-0.235V下获得的光电流I1的比值和黄曲霉毒素B1浓度对数的关系绘制出黄曲霉毒素B1的标准检测线性曲线I2/I1=-2.001+0.170lg(CAFB1/ng·mL-1);
(4)至此可即时将待测黄曲霉毒素B1通过阳光驱动在CNNS的临界电位0.15V下获得一个光电流I2,在Ag/TiO2/3DNGH的临界电位-0.235V下获得一个光电流I1,获得比值I2/I1,带入步骤(3)得出的标准检测线性曲线,即可获得待测黄曲霉毒素B1的浓度。
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